Αφηρημένο

Το μονοκλωνικό αντίσωμα IgM PAT-SM6 που προέρχονται από ανθρώπινους όγκους επάγει την απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα και θεωρείται ένας δυνητικός αντικαρκινικός παράγοντας. Ένα πρωταρχικό στόχο για PAT-SM6 είναι η ξεδιπλωμένη ρυθμιστή απόκρισης πρωτεΐνη GRP78, υπερ-εκφράζεται εξωτερικά στην κυτταρική επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων. Μικρές γωνία σκέδασης ακτίνων-Χ (SAXS) μελέτες της ανθρώπινης GRP78 έδειξε αλτήρα σχήμα μονομερούς δύο τομέων, ενώ SAXS ανάλυση του PAT-SM6 αποκάλυψε ένα πιατάκι δομή σχήματος υποδοχή πέντε φορές συμμετρία, σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες των σχετικών πρωτεϊνών. ανάλυση ταχύτητα καθίζησης των μειγμάτων GRP78 και PAT-SM6 έδειξε σχηματισμό αδύναμο συγκρότημα χαρακτηρίζεται από σταθερές διάστασης στο υψηλό μικρογραμμομοριακή περιοχή συγκέντρωσης. Σε αντίθεση, ενζυμικής ανοσοπροσροφητικής δοκιμασίες (ELISA) έδειξε ισχυρή και ειδική αλληλεπιδράσεις μεταξύ PAT-SM6 και ακινητοποιήθηκε GRP78. Η φαινόμενη σταθερά δέσμευσης εκτιμήθηκε από μια καμπύλη κορεσμού PAT-SM6 συσχετίζεται έντονα με τη συγκέντρωση του GRP78 χρησιμοποιείται για την επικάλυψη ο δίσκος μικροτιτλοδότησης. Πειράματα με τη χρήση πολυκλωνικών αντισωμάτων antiGRP78 IgG ή ένα μονοκλωνικό παράγωγο IgG του PAT-SM6 δεν έδειξε παρόμοια εξάρτηση. πειράματα ανταγωνισμού με διαλυτό GRP78 έδειξε πιο αποτελεσματική αναστολή της PAT-SM6 δεσμευτική σε χαμηλές συγκεντρώσεις επίστρωση GRP78. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν έναν απληστία που βασίζεται μηχανισμό πρόσδεσης που εξαρτάται από την προσκόλληση πολλαπλών σημείων του PAT-SM6 να GRP78 συγκεντρωμένα στην επιφάνεια του δίσκου. Η ανάλυση των δεδομένων ELISA σε συγκεντρώσεις επίστρωσης υψηλής GRP78 έδωσε μία φαινόμενη σταθερά διαστάσεως περίπου 4 ηΜ. Προτείνουμε ότι η βιολογική δράση του PAT-SM6 στην απόπτωση των καρκινικών κυττάρων μπορεί να εξαρτάται από τη φύση του πολυσθενούς PAT-SM6 και την υψηλή απληστία της αλληλεπίδρασης του με πολλαπλά μόρια GRP78 συγκεντρωμένα στην επιφάνεια των κυττάρων του όγκου

Citation.: Rosenes Ζ, Mulhern TD, Hatters DM, Ilag LL, Υδραυλικό BE, Hosking C, et al. (2012) Το Anti-Cancer IgM μονοκλωνικό αντίσωμα PAT-SM6 συνδέεται με μεγάλη απληστία με το ανοιγμένο Πρωτεΐνη Response Ρυθμιστής GRP78. PLoS ONE 7 (9): e44927. doi: 10.1371 /journal.pone.0044927

Επιμέλεια: Salvatore V. Pizzo, του Πανεπιστημίου Duke Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 Ιουνίου 2012? Αποδεκτές: 9 του Αυγ 2012? Δημοσιεύθηκε: 19 Σεπ του 2012

Copyright: © Rosenes et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από το Αυστραλιανό Συμβούλιο Έρευνας (LP100100392) με πρόσθετη υποστήριξη που παρέχεται από Patrys Ltd. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου.

Ανταγωνιστικά συμφέροντα : Αυτή η εργασία υποστηρίζεται μερικώς από Patrys Ltd, μια εταιρεία που διεξάγει επί του παρόντος κλινικές δοκιμές PAT-SM6 ως δυνητική αντικαρκινική θεραπεία

Εισαγωγή

Φυσικό IgM αντισώματα παίζουν σημαντικό ρόλο στην. έμφυτη ανοσοαπόκριση όπου εμπλέκονται στην έγκαιρη ανίχνευση των ξένων σωματιδίων καθώς επίσης και στην ανίχνευση των τροποποιημένων αυτο-δομών, περιλαμβανομένων χημικά τροποποιημένων πρωτεϊνών και αμυλοειδή ινίδια [1], [2], [3]. IgM αντισώματα συμμετέχουν επίσης στην αναγνώριση και την απομάκρυνση των μετασχηματισμένων κυττάρων ως μια σημαντική άμυνα κατά του καρκίνου [4]. Η πρόσφατη ανάπτυξη της τεχνολογίας ανθρώπινου υβριδώματος [5] έχει οδηγήσει στην απομόνωση ενός μεγάλου αριθμού μονοκλωνικών αντισωμάτων της κατηγορίας IgM από τους όγκους των ασθενών με καρκίνο [6]. Ένας αριθμός από αυτά τα αντισώματα σκοτώνουν ειδικά κακοήθη κύτταρα με διέγερση αποπτωτικών οδών [7], τονίζοντας την πιθανή χρήση των μονοκλωνικών αντισωμάτων IgM στην ανάπτυξη νέων θεραπειών κατά του καρκίνου.

Το ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα IgM, PAT-δΜ6 , επάγει το θάνατο των καρκινικών κυττάρων μέσω ενός αποπτωτικό μονοπάτι που συνοδεύεται από ενδοκυτταρική συσσώρευση λιπιδίων [8]. PAT-SM6 στοχεύει κύτταρα όγκου, με σύνδεση προς την πρωτεΐνη GRP78 οποία υπερεκφράζεται εξωτερικά στην κυτταρική επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων [9]. GRP78, επίσης γνωστό ως (πρωτεΐνη πρόσδεσης βαρείας αλυσίδας ανοσοσφαιρίνης) ΒίΡ, είναι ένα μέλος της πρωτεΐνης θερμικού σοκ 70 (HSP70) οικογένεια που αποτρέπει την επαγόμενη από στρες απόπτωση. PAT-SM6 επίσης συνδέει λιποπρωτεΐνη χαμηλής πυκνότητας (LDL) και της οξειδωμένης LDL [8] που οδηγεί σε ένα μοντέλο εργασίας για το όγκο-ειδικό αποπτωτική δραστικότητα PAT-SM6 οπότε PAT-SM6 παραδίδει περίσσεια λιπιδίου, με τη μορφή του δεσμευμένου LDL ή οξειδωμένης LDL σε όγκων με σύνδεση προς τροποποιημένους GRP78 παρόντα στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων [8].

(Α) GRP78 εκφράστηκε και καθαρίστηκε από το

E.coli

κύτταρα, και υποβλήθηκε σε φασματοσκοπία κυκλικού διχρωισμού. Ένα αντιπροσωπευτικό φάσμα για 0,15 mg /mL καθαρισμένης GRP78 στους 25 ° C (ανοικτοί κύκλοι) και την τακτοποίηση από Dichroweb χρησιμοποιώντας φίλτρο που sp175 (συνεχής γραμμή) παρουσιάζεται. ανάλυση ταχύτητα (Β) Καθίζηση της GRP78 διεξήχθη με φυγοκέντρηση 0.4 mg /mL από GRP78 στις 28.000 rpm σε αναλυτική υπερφυγόκεντρο. Τα προκύπτοντα καθιζάνον όρια απορρόφησης παρακολουθήθηκαν στα 280 nm και αντιπροσωπευτικά δεδομένα φαίνονται ως ανοικτοί κύκλοι. Ταιριάζει με τα πειραματικά δεδομένα χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο καθίζησης C (S) παρουσιάζονται ως συμπαγείς γραμμές. Για λόγους σαφήνειας, μόνο κάθε 10η σάρωση δείχνεται. (C) οικόπεδα κατανομή μεγέθους για 1,2 mg /mL του GRP78 (συνεχής γραμμή) ή 0,6 mg /mL του GRP78 (διακεκομμένη γραμμή) που υπολογίζεται από την τοποθέτηση των δεδομένων που εκπροσωπούνται στο (Β) σε εναλλασσόμενο (S) μοντέλο καθίζησης.

προ-κλινικά μοντέλα ανθρώπινου καρκίνου δείχνουν PAT-SM6 αναστολή της ανάπτυξης του όγκου [8], γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή θεραπεία για την αντιμετώπιση του καρκίνου. Η ασφάλεια και η ανεκτικότητα της PAT-SM6 όπως ένα αντίσωμα αντι-καρκίνου για τη θεραπεία του μελανώματος έχει τεκμηριωθεί σε μια πρόσφατη κλινική δοκιμή Φάσης Ι [10]. Η περαιτέρω ανάπτυξη των PAT-SM6 ως αποτελεσματικός παράγοντας κατά του καρκίνου θα πρέπει να επικουρείται από πιο λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με τη διαρθρωτική βάση και τη δύναμη των αλληλεπιδράσεων των PAT-SM6 με αντιγόνα στόχους. Αυτή η γνώση είναι απαραίτητη για την ενημερωθεί πρόβλεψη των ανεπιθύμητων παρενεργειών που σχετίζονται με τη θεραπευτική χρήση του PAT-SM6 μόνη, ή σε θεραπείες συνδυασμού με άλλους παράγοντες. Στην παρούσα μελέτη έχουμε εξετάσει την δομή και τις αλληλεπιδράσεις των καθαρίστηκε PAT-SM6 με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη GRP78 που εκφράζεται και καθαρίζεται από τα βακτηρίδια. Χρησιμοποιώντας την ανάλυση ταχύτητας καθίζησης και ανοσορροφητικές δοκιμασίες συνδεδεμένου με ένζυμο (ELISA) που δείχνουν ότι, ενώ PAT-SM6 έχει σχετικά χαμηλή συγγένεια για μεμονωμένα μόρια GRP78, η αλληλεπίδραση του PAT-SM6 με μόρια GRP78 συγκεντρωμένα στην επιφάνεια μιας πλάκας μικροτιτλοδότησης είναι πολύ ισχυρότερη και χαρακτηρίζεται από φαινόμενες σταθερές συγγένειας στο εύρος χαμηλή συγκέντρωση νανομοριακή.

Υλικά και Μέθοδοι

το ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα PAT-SM6 και ένα τροποποιημένο εξαμερής παράγωγο, PAT-SM6-hex, λείπει ένα ενώνει J αλυσίδα, εκφράστηκαν και καθαρίστηκαν από σταθερές καλλιέργειες εναιωρήματος μιας ανθρώπινης κυτταρικής σειράς σε μέσα άνευ ορού [11], [12]. Παρόμοιες διαδικασίες χρησιμοποιήθηκαν για την έκφραση και τον καθαρισμό ενός παραγώγου IgG (PAT-SM6 IgG) αποτελείται από τις βαριάς και ελαφριάς αλυσίδας αλληλουχίες PAT-SM6. ισοτυπικού ελέγχου IgM λήφθηκε από Jackson ImmunoResearch Labs, inc, West Grove, ΡΑ. Η κωδικοποιητική αλληλουχία για την πλήρους μήκους, ώριμη ανθρώπινο γονίδιο GRP78 εισήχθη σε έναν φορέα pPOW θερμική επαγωγή, με αποτέλεσμα ένα κατασκεύασμα με μία Ν-τερματική αλληλουχία έκκρισης pelB και C-τερματικό 6xHis-tag [13]. Η πρωτεΐνη εκφράστηκε σε

E. coli

κύτταρα BL21 (DE3) και στη συνέχεια καθαρίζεται από το διαλυτό τμήμα του κυτταρολύματος με χρωματογραφία συγγένειας νικελίου χρησιμοποιώντας 5 ml στήλης-Trap His (GE Healthcare) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Γλυκόζη ισομεράση ελήφθη από το Hampton Research, Aliso Viejo, Καλιφόρνια

Η

Εγκύκλιος Διχρωισμού (CD) Μετρήσεις

φάσματα CD για GRP78 (0,15 mg /ml) και PAT-SM6 (0,15 mg /ml) σε ρυθμισμένο με φωσφορικό άλας αλατούχο ορό (PBS? 20 mM φωσφορικό νάτριο, 140 mM NaCl, ρΗ 7,4) αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Αβίβ Model 62 φασματόμετρο CD DS (Aviv Biomedical, Inc, Lakewood, New Jersey) στους 25 ° C με ένα 1 mm κυψελίδα χαλαζία μήκους διαδρομής, ένα φασματικό εύρος ζώνης του 1 nm, χρόνος μέσου όρου σήματος 2 s και ένα διάστημα δεδομένων των 0,5 nm. Ελλειπτικότητας σε millidegrees διορθώθηκαν για τις μετρήσεις του ρυθμιστικού μόνη της και μετατρέπεται σε μέση ελλειπτικότητας υπολείμματος (MRE) τη χρήση του τύπου MRE = ελλειπτικότητα × MRW /(10 × γ × l) όπου MRW είναι το μέσο βάρος υπολείμματος σε g /mol, c η συγκέντρωση σε mg /ml, και Ι είναι το μήκος διαδρομής σε cm. CD φάσματα αναλύθηκαν για να ληφθούν εκτιμήσεις της δευτερογενούς δομής χρησιμοποιώντας Dichroweb [14].

(Α) Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα SAXS εμφανίζονται ως κύκλοι αντιπροσωπεύουν μέση ένταση

I

(

q

) ως συνάρτηση της μεταφοράς ορμής

q

. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν ± 1 τυπική απόκλιση (σ). Μαύρο χαρακτήρες:

I

(

q

) ≥ σ και γκρι σύμβολα:

I

(

q

) & lt? σ. (Β) Guinier οικόπεδο για αυτά τα δεδομένα SAXS για q.Rg & lt? 1.3. (C) Σύντομη οικόπεδο των δεδομένων SAXS. (D & amp? Ε) οικόπεδα Porod-Debye ως συνάρτηση του

q

3 και

q

4, αντίστοιχα. (F) Το SAXS προερχόμενο

ab initio

σχήμα ανοικοδόμηση (μέσος διηθείται σχήμα από 10 ανακατασκευές) εμφανίζεται επάνω στο ΝΜΚ εξευγενισμένα διευθέτηση τομέα των κρυσταλλογραφική δομές των Ν-και Ο-τελικές περιοχές του βακτηριακή ομόλογο GRP78 DnaK [26].

η

μικρής γωνίας ακτίνων χ (SAXS)

SAXS δεδομένα συλλέχθηκαν στο /WAXS beamline Αυστραλίας Synchrotron SAXS σε συνδυασμό με την εσωτερική χρωματογραφία διήθησης πήγματος γραμμή, όπως περιγράφεται από τους Gunn και τους συνεργάτες του [15]. Οι συγκεντρώσεις φόρτωσης για την στήλη διήθησης πηκτής σε σειρά ήταν 5 mg /mL για SM6 και 5 mg /mL για GRP78. εικόνες Ανιχνευτής αναλύθηκαν ως μέσοι όροι των δέκα διαδοχικών 2 s ανοίγματα χρησιμοποιώντας το λογισμικό SAXS15ID (Αυστραλιανή Synchrotron), τα οποία στη συνέχεια μετατρέπονται σε μεμονωμένους

I

(

q

) προφίλ SAXS.

I

(

q

) είναι η σκεδαζόμενη ένταση ακτίνων Χ ως συνάρτηση του μεγέθους του φορέα μεταφοράς ορμής

q

= (4πsinθ) /λ, όπου ο γωνίας σκέδασης είναι 2θ και το μήκος κύματος ακτίνων Χ είναι λ (1,0332 Α). Η

q

κυμαίνονται πάνω από το οποίο συλλέχθηκαν εντάσεις ήταν 0,0047 – 0,2807 Å

-1. προφίλ SAXS αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το ΑΤΣΑΣ (έκδοση 2.4) σουίτα προγραμμάτων [16]. ανάλυση Guinier διεξήχθη χρησιμοποιώντας AUTORG. Η ένταση σε γωνία μηδέν

I

(0) και η μέγιστη διάσταση (

D

max

) της σκέδασης σωματιδίων εκτιμήθηκαν από το

P

(

r

) συναρτήσεις κατανομής απόσταση διάνυσμα ζευγάρι χρησιμοποιώντας AUTOGNOM. Οι όγκοι των αντίστοιχων σωματιδίων σκέδασης υπολογίστηκαν από την περιοχή κάτω Σύντομη οικόπεδα (

q

2

I

(ιζ) /

(0) vs .

q

) όπως περιγράφεται από Svergun και Fegin [17]? σύμφωνα με την οποία, Σύντομη οικόπεδα εξήχθησαν σε χαμηλές

q

(

q

& lt?

q

min) χρησιμοποιώντας την προσέγγιση Guinier και παρέκταση σε υψηλές

q

(

q

όπου

I

(

q

)

/I

(0) & lt? 0.01) χρησιμοποιώντας την προσέγγιση Porod [18].

ab initio

σχήμα ανακατασκευές από σκέδασης δεδομένων πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση DAMMIF [19] και κατά μέσο όρο φιλτράρεται σχήματα υπολογίζεται από σύνολα των 10 ανακατασκευές χρησιμοποιώντας τη σουίτα DAMAVER των προγραμμάτων [20]. Άκαμπτος εκλέπτυνση σώμα με την προσθήκη του λείπουν τμήματα διεξήχθη χρησιμοποιώντας CORAL [21] για πολλαπλές μοντέλα της αλυσίδας. Θεωρητική προφίλ σκέδασης από δομικά μοντέλα δημιουργήθηκαν και σε σύγκριση με τα πειραματικά δεδομένα SAXS χρησιμοποιώντας CRYSOL [22]. Δομικά μοντέλα και φακέλους σχήμα όπου βέλτιστα επάνω χρησιμοποιώντας SUPCOMB [23]. Στατιστικές συγκρίσεις της καλής προσαρμογής της θεωρητικής προφίλ σκέδασης των διαρθρωτικών μοντέλα με πειραματικά δεδομένα SAXS διεξήχθησαν με υπολογισμό η

F

-statistic για ζευγάρια ταιριάζει και ολοκλήρωση το κατάλληλο

F

-Διανομή [ ,,,0],24].

Καθίζηση Velocity Ανάλυση

πειράματα ταχύτητα καταβύθισης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα XL-Ι αναλυτική υπερφυγόκεντρο (Beckman Coulter, Fullerton, CA) εξοπλισμένο με μια 60-Ti στροφείο στους 20 ° C . Τα δείγματα πρωτεΐνης προστέθηκαν σε διπλά τομέας ΕΡΟΝ-γεμισμένη κεντρικά με 20 mM φωσφορικό νάτριο, ρΗ 7,0, 100 mM NaCl, 55 mM αργινίνη στο διαμέρισμα αναφοράς. Radial δεδομένων απορρόφησης αποκτήθηκαν σε μία ταχύτητα ρότορα των 28.000 rpm, χρησιμοποιώντας ένα μήκος κύματος 280 nm, και με ακτινικές βήματα των 0,003 cm σε τρόπο συνεχούς σάρωσης. Τα όρια καθιζάνον προσαρμόστηκαν σε ένα μοντέλο υποθέτοντας μια κατανομή των συντελεστών καθίζησης για μη αλληλεπιδρώντων ειδών, C (S), χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα SEDFIT [25]. Τα δεδομένα προσαρμόστηκαν χρησιμοποιώντας μια παράμετρο τακτοποίηση του ρ = 0,95 και η αναλογία κυμαινόμενο τριβής.

(Α) 0,15 mg /mL του PAT-SM6 υποβλήθηκε σε φασματοσκοπία κυκλικού διχρωισμού. Ένα αντιπροσωπευτικό φάσμα στους 25 ° C (ανοικτοί κύκλοι) και η προσαρμογή από Dichroweb χρησιμοποιώντας φίλτρο που sp175 (συνεχής γραμμή) παρουσιάζεται. (Β) ανάλυση ταχύτητα Καθίζηση του PAT-SM6 διεξήχθη με φυγοκέντρηση 0.4 mg /mL του PAT-SM6 στις 28.000 rpm σε αναλυτική υπερφυγόκεντρο. Τα προκύπτοντα καθιζάνον όρια απορρόφησης παρακολουθήθηκαν στα 280 nm και αντιπροσωπευτικά δεδομένα φαίνονται ως ανοικτοί κύκλοι. Ταιριάζει με τα πειραματικά δεδομένα χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο καθίζησης C (S) παρουσιάζονται ως συμπαγείς γραμμές. Για λόγους σαφήνειας, μόνο κάθε 3η σάρωση δείχνεται. (C) οικόπεδα κατανομή μεγέθους για πενταμερή PAT-SM6 (συνεχής γραμμή) και εξαμερή PAT-SM6 (διακεκομμένη γραμμή) που υπολογίζεται από την τοποθέτηση των δεδομένων που εκπροσωπούνται στο (Β) σε εναλλασσόμενο (S) μοντέλο καθίζησης.

Η

ενζυμικής ανοσοπροσροφητικής δοκιμασίας (ELISA)

αντιγόνα επιστρώθηκαν σε δίσκους 96 φρεατίων μικροτιτλοδότησης (Nunc Maxisorp) με επώαση όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Οι πλάκες στη συνέχεια πλύθηκαν 3 φορές σε PBS, 3 φορές σε PBS + 0.1% Tween 20, 3 φορές σε PBS και αποκλείστηκαν με 5% (w /v) BSA σε PBS για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, στη συνέχεια πλένεται και πάλι ως ανωτέρω. Όλα τα παρασκευάσματα αντισώματος έγιναν σε 5% (w /v) BSA σε PBS. Για τις έμμεσες πειράματα ELISA, τα αντισώματα εφαρμόστηκαν απευθείας στην πλάκα και επωάστηκαν για 1 ώρα. Για ανταγωνιστική ELISAs, τα αντισώματα επωάστηκαν σε διάλυμα με διάφορες ποσότητες αντιγόνου πριν από την εφαρμογή στην πλάκα μικροτιτλοδότησης. Μετά από πλύσιμο και πάλι όπως παραπάνω, peroxidise-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (IgG αίγας αντι-κουνελιού (Calbiochem), κουνελιού αντι-ανθρώπινης IgG (Calbiochem), ή κουνέλι αντι-ανθρώπινο IgM (Dako), εξαρτάται από την πρωταρχική πηγή αντισώματος και τάξη) ήταν εφαρμόζεται στην πλάκα και επωάστηκαν για 1 ώρα σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από μία τελική πλύση, η δέσμευση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας 100 μL ανά φρεάτιο 3,3 ‘, 5,5’-τετραμεθυλβενζιδίνη διάλυμα υποστρώματος (Sigma) και μετρώντας την αλλαγή χρώματος στα 655 nm αντίσωμα. Η χρονική πορεία για την ανάπτυξη χρώματος ήταν ουσιαστικά γραμμική στην περιοχή οπτική πυκνότητα 0-3. Οι μετρήσεις ελήφθησαν 15 λεπτά μετά την προσθήκη του υποστρώματος. Σε πειράματα ελέγχου, που περιλαμβάνουν απευθείας επίστρωση των πλακών με PAT-SM6, πάνω από την περιοχή συγκέντρωσης 0-2,5 μg /ml, μία συστηματική αύξηση παρατηρήθηκε στο σήμα ELISA με αυξημένη συγκέντρωση επίστρωσης, πράγμα που συνεπάγεται μια άμεση συσχέτιση μεταξύ του σήματος ELISA και η ποσότητα του αντισώματος που συνδέεται με την πλάκα. δεδομένα ELISA για την τιτλοδότηση του πρωτογενούς αντισώματος που συνδέεται προς ακινητοποιημένο GRP78 αναλύθηκε υποθέτοντας μια απλή ισόθερμο δέσμευσης Langmuir που περιγράφεται από τη σχέση Υ = K

α /(1-K

α) όπου το Υ είναι το μέγεθος του σήματος ELISA και Κ

a είναι η φαινόμενη σταθερά δέσμευσης υποθέτοντας μια απλή κατηγορία θέσεων δέσμευσης.

(α) Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα SAXS εμφανίζονται ως κύκλοι αντιπροσωπεύουν μέση ένταση

I

(

q

) ως συνάρτηση της δυναμικής μεταφοράς

q

. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν ± 1 τυπική απόκλιση (σ). Μαύρο χαρακτήρες:

I

(

q

) ≥ σ και γκρι σύμβολα:

I

(

q

) & lt? σ. (Β) Guinier οικόπεδο για αυτά τα δεδομένα SAXS για

q

R

g

& lt?. 1.3. (C) Σύντομη οικόπεδο των δεδομένων SAXS. (D & amp? Ε) οικόπεδα Porod-Debye ως συνάρτηση του

q

3 και

q

4, αντίστοιχα. (F) Το

ab initio

σχήμα ανακατασκευή (μέσος φιλτράρεται σχήμα από 10 ανακατασκευές με ρητή P5 συμμετρία) εμφανίζεται επάνω στο άκαμπτο σώμα εξευγενισμένα μοντέλο SAXS, που παράγονται χρησιμοποιώντας θραύσματα Fab και Fc ενώνονται με ένα ευέλικτο 8-καταλοίπων πολυ-Gly συνδετήρα. Ο προσανατολισμός των τεσσάρων σταθερές Ig περιοχές του κάθε θραυσμάτων Fc ήταν το πρότυπο του κρυσταλλική δομή του IgE και του σχετικού προσανατολισμού Ρο περιορίζεται από απόσταση περιορισμών επιβολή ομόλογα ενδο-αλυσιδικό δισουλφίδιο [33].

Η

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός καθαρισμένα GRP78

Ανθρώπινο GRP78, συνδεδεμένο με ένα pelB Ν-τερματική επέκταση και His-Tag [11] εκφράστηκε και καθαρίστηκε από το

E. coli

. Φασματομετρία μάζας του καθαρισμένου προϊόντος έδωσε μάζα 73270.7 Da σε σύγκριση με μια θεωρητική τιμή με βάση τη σύνθεση του 73269.9 Da. CD φασματοφωτομετρία έδειξε μια διπλωμένη δομή με φάσματα CD χαρακτηρίζεται από ένα διπλό ελάχιστα σε περίπου 208 και 221 nm (Σχήμα 1). Ανάλυση των φασμάτων έδωσε εκτιμήσεις των 22,1% και 29,1% για το Α και β -structure, αντίστοιχα. Αυτές οι τιμές μπορούν να συγκριθούν με τις εκτιμήσεις του 36% Α-έλικα και 27% Α-φύλλο για τη δευτερογενή δομή που καθορίζεται από την τρισδιάστατη δομή της HSP70 ομολόγου βακτηριακής, DnaK [26]. Πρόσθετες αποδείξεις για τη σωστή αναδίπλωση του καθαρισμένου ανθρώπινου GRP78 λήφθηκε με προσδιορισμό της υπολειμματικής δραστικότητας ΑΤΡάσης. Η χρήση ενός ποσοτικού προσδιορισμού κινάσης-γαλακτική αφυδρογονάση συζευγμένο πυροσταφυλικό [27] έδειξε μία ειδική δραστικότητα περίπου 4 nmole ΑΤΡ υδρολύεται ανά δευτερόλεπτο ανά μmole του GRP78.

A. 0.4 mg /mL του PAT-SM6 και 0.4 mg /mL από GRP78 επωάστηκαν μαζί και φυγοκεντρήθηκε στις 28.000 rpm. Τα προκύπτοντα καθιζάνον όρια απορρόφησης παρακολουθήθηκαν στα 280 nm και αντιπροσωπευτικά δεδομένα φαίνονται ως ανοικτοί κύκλοι. Ταιριάζει με τα πειραματικά δεδομένα χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο καθίζησης C (S) παρουσιάζονται ως συμπαγείς γραμμές. Β αντίστοιχη C (S) οικόπεδα κατανομή μεγέθους για τα δεδομένα που παρουσιάζονται στο (Α) για PAT-SM6 (μαύρη διακεκομμένη γραμμή), GRP78 (γκρι διακεκομμένη γραμμή) και το μίγμα των δύο πρωτεϊνών (συνεχής γραμμή). κατανομές C. Radial ελήφθη μετά από φυγοκέντρηση σε 28,000 rpm για 72 λεπτά για την PAT-SM6 (0,4 μΜ? γκρι κύκλοι), GRP78 (10 μΜ? μαύροι κύκλοι) και μίγματος PAT-SM6 (0,4 μΜ) και GRP78 (10 μΜ, στερεά γραμμή). Το στερεό γκρι γραμμή είναι το άθροισμα των ακτινικών κατανομών που λαμβάνονται για την PAT-SM6 και GRP78 μόνο, υποθέτοντας καμία αλληλεπίδραση.

Η

δεδομένα ταχύτητα καθίζησης για καθαρισμό GRP78 έδειξε ένα μόνο μείζον όριο καθίζηση (Σχήμα 1). Ανάλυση των δεδομένων υποθέτοντας μια συνεχή κατανομή μεγέθους των μη αλληλεπιδρώντων ειδών υποδεικνύεται ένα κυρίαρχο είδος χαρακτηρίζεται από ένα συντελεστή καθίζησης, συντελεστή τριβής και μοριακή μάζα συνεπής με την παρουσία του GRP78 μονομερούς (Πίνακας 1). Εκτός από αυτό το σημαντικό είδος, τα δεδομένα που προσδιορίζονται εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση μεγαλύτερα είδη (S20, w περίπου 7,2 S) αποδίδεται στην παρουσία ενός διμερούς σε αργή ισορροπία με τα δεσπόζοντα μονομερή είδη.

δεδομένα SAXS για η GRP78 φαίνονται στο Σχήμα 2Α. Το οικόπεδο Guinier από αυτά τα δεδομένα (Εικόνα 2Β) ήταν γραμμική σε χαμηλές

q

(όπου

q

Rg

& lt?. 1.3) και η ακτίνα περιστροφής (

R

ζ

) αποκτήθηκε από την κλίση ήταν 45,5 ± 2.2. Η μάζα του μονομερούς GRP78 εκτιμήθηκε από την περιοχή κάτω από την πλοκή Σύντομη (Σχήμα 2C) για να είναι 89,5 kDa, η οποία είναι 22% υψηλότερη από τη θεωρητική τιμή του 73,2 kDa. Δεδομένου ότι η εν σειρά χρωματογραφία διήθησης πηκτής μας επέτρεψε να εξαλειφθεί η συνεισφορά σκέδασης από οποιοδήποτε διμερές, η ανάλυση αυτή δίνει μια μονομερική πρωτεΐνη πυκνότητα 0,85 g.cm

-1, η οποία είναι ενδεικτική της διάχυτης πυκνότητος ηλεκτρονίου από ένα ιδιαίτερα ευέλικτο μόριο [28]. Επιθεώρηση των οικοπέδων Porod-Debye (Σχήμα 2D & amp? 2Ε) έδειξαν τα στοιχεία GRP78 SAXS δεν οροπέδιο ως

I

(

q

)

q

. 4 εναντίον

q

4, αλλά έκανε οροπέδιο ως

I

(

q

).

q

3 εναντίον

q

3, η οποία υποστηρίζει περαιτέρω την άποψη ότι GRP78 είναι εξαιρετικά ευέλικτο, αλλά περιέχει σημαντικές διπλωμένο δομή [28]. Ως μάρτυρας, παρόμοια ανάλυση διεξήχθη στα στοιχεία SAXS καταγράφονται από ένα συμπαγές σφαιρική πρωτεΐνη, ισομεράση της γλυκόζης. Οι αναλύσεις έδειξαν ένα οροπέδιο σε δύο

I

(

q

).

q

3 εναντίον

q

3 και

I

(

q

).

q

4 εναντίον

q

4 οικόπεδα και έδωσε μια πυκνότητα 1,32 g.cm

-1, η οποία είναι σε εξαιρετική συμφωνία με προηγούμενες μελέτες του μορίου αυτού [28].

Η συγκέντρωση του GRP78 που χρησιμοποιούνται για την επικάλυψη των φρεατίων ήταν 30 μg /mL. Α: Πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν PAT-SM6 (λωρίδες 1 και 3), αντι-GRP78 (λωρίδα 2) και ισότυπου ελέγχου αντίσωμα IgM (λωρίδα 4). Στην διαδρομή 3 το αρχικό στάδιο επικάλυψης με GRP78 παραλείφθηκε. Β: Το πρώτο αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν PAT-SM6. Οι επωάσεις διεξήχθησαν σε 20 mM ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικού νατρίου χωρίς πρόσθετα NaCl (λωρίδα 5), 140 mM NaCl (λωρίδα 6) και 500 mM NaCl (διαδρομή 7). C: Το πρώτο αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν PAT-SM6. Οι επωάσεις διεξήχθησαν σε 20 mM ρυθμιστικού φωσφορικού νατρίου, 140 mM NaCl σε τιμές ρΗ από 6 (λωρίδα 8), 7.4 (λωρίδα 9) και 8 (διαδρομή 10).

Η

Ab initio

σχήμα μοντελοποίηση GRP78 έγινε μετά από εκτίμηση της συνάρτησης σωματίδιο φορέα διανομής απόσταση

P

(

r

) με έμμεση μετασχηματισμού Fourier. Η μέγιστη διάσταση (

D

max

) από το

P

(

r

) ανάλυση εκτιμάται ότι είναι 134 Å. Το Σχήμα 2F δείχνει το προκύπτον μέσο όγκο διηθείται SAXS μοντέλο επάνω στο ΝΜΚ εξευγενισμένα πλήρους μήκους δομή DnaK [26]. Το συνολικό σχήμα και η μέση σχετικός προσανατολισμός του Ν-πεδίο και C-πεδίο του GRP78 είναι συνεπής με τα δεδομένα NMR για DnaK, περαιτέρω για την ίδρυση της κυρίως μονομερική φύση και σωστή αναδίπλωση της βακτηριακής εκφρασμένου προϊόντος ανθρώπινο GRP78.

Χαρακτηρισμός καθαρισμένα PAT-SM6

Η δομή και η συμπεριφορά διαλύματος καθαρίζεται PAT-SM6 χαρακτηρίστηκε επίσης. CD φάσματα για PAT-SM6 αποκάλυψε ένα μοναδικό ελάχιστο περίπου στα 215 nm, προτείνοντας μια δευτερεύουσα δομή κατά κύριο λόγο β-φύλλου (Σχήμα 3). Τα αποτελέσματα συγκρίνονται ευνοϊκά με προηγούμενες μελέτες CD στη δευτερογενή δομή της IgM αντισωμάτων [29]. Η ανάλυση των δεδομένων CD για την PAT-SM6 αναφέρεται δευτερεύουσα δομή που αποτελείται από περίπου 3,8% α-έλικες, 51% β-κλώνους, 7,7% στροφές και 35,8% μη διατεταγμένη δομή. δεδομένα ταχύτητα καθίζησης για PAT-SM6 έδειξε μια μοναδική μείζονα σύνορο (Σχήμα 3). Η ανάλυση των στοιχείων, υποθέτοντας μια συνεχή κατανομής συντελεστού καθίζησης των ειδών που δεν αλληλεπίδραση, αποκάλυψε την παρουσία ενός κυρίου και ένα έλασσον πληθυσμός χαρακτηρίζεται από μέση συντελεστές καθίζησης των 17 S και 24 S, αντίστοιχα (Πίνακας 1). Αυτά τα αποτελέσματα είναι συνεπή με την παρουσία μονομερών και διμερών ειδών IgM [30]. Η καλύτερη-fit τιμή που λαμβάνεται για το λόγο τριβής, f /fo, χρησιμοποιήθηκε για να αναλύσει το συνολικό σχήμα του μονομερούς PAT-SM6. Τα στοιχεία δείχνουν ένα ασύμμετρο σχήμα που αντιστοιχεί σε ένα πεπλατυσμένο ελλειψοειδές με τις παραμέτρους που παρατίθενται στον Πίνακα 1. Τα δεδομένα ταχύτητα καθίζησης ελήφθη επίσης για μια εξαμερείς παράγωγο PAT-SM6, PAT-SM6-hex, λείπει ένα J αλυσίδα [11]. ανάλυση μεγέθους διανομή των δεδομένων δείχνουν μια μείζονα καθιζάνον είδος χαρακτηρίζεται από S20, w και f /fo τιμές των 17,6 S και 1,95, αντίστοιχα

Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: Α. PAT-δΜ6? Β πολυκλωνικό αντι-GRP78? Γ PAT-SM6-εξάγωνο και Δ PAT-SM6 IgG. Οι συγκεντρώσεις επίστρωσης GRP78 ήταν 30 μg /mL (κλειστοί κύκλοι), 15 μg /mL (ανοικτά ανεστραμμένα τρίγωνα), 7,5 μg /mL (κλειστά τετράγωνα), 3.75 μg /mL (ανοικτά διαμάντια), 1.88 μg /mL (κλειστά τρίγωνα) , 0 μg /mL (ανοικτοί κύκλοι). Οι συνεχείς γραμμές είναι καλύτερα προσαρμοσμένες γραμμές υπολογίζεται για ένα απλό ισοθερμική δεσμευτική.

Η

Α. Οι σταθερές σύνδεσης για PAT-SM6 (κλειστοί κύκλοι) και PAT-SM6-εξ (ανοικτοί κύκλοι). B. σταθερές δεσμεύσεως για PAT-SM6 IgG (μαύροι κύκλοι) και αντι-GRP78 (ανοικτοί κύκλοι).

Η

Τα δεδομένα SAXS για PAT-SM6 παρουσιάζονται στο Σχήμα 4Α. Το οικόπεδο Guinier (Εικόνα 4Β) είναι γραμμική σε χαμηλές

q

(

q

R

g

& lt?. 1.3) και το

R

g

αποκτήθηκε από την κλίση ήταν 122,0 ± 1.4. Η

D

max

εκτιμήθηκε από την ανάλυση

P

(

r

) να είναι -4,2 nm και η μοριακή μάζα που προέρχεται από την περιοχή κάτω από το οικόπεδο Σύντομη ( Εικόνα 4C) ήταν 1,06 × 10

6 Da. Αυτές οι εκτιμήσεις της μάζας,

R

g

και

D

max

τιμές για PAT-SM6 είναι σε καλή συμφωνία με αυτές από προηγούμενες μελέτες SAXS των IgM [31]. Και πάλι, η παρουσία του ένα πλάτωμα στο οικόπεδο των

I

(

q

).

q

3 εναντίον

q

3 (Σχήμα 4D) και η έλλειψη ένα οροπέδιο στο

I

(

q

).

q

4 εναντίον

q

σε οικόπεδο 4 (Σχήμα 4Ε) έδειξε μια διπλωμένη δομή με σημαντική ευελιξία [28].

ab initio

σχήμα μοντελοποίηση PAT-SM6 δεν συγκλίνουν σε σωματικά ρεαλιστικό σχήμα χωρίς την επιβολή ρητών περιορισμών συμμετρίας. Αντί αυθαίρετα επιβολή πενταπλάσια συμμετρία, η καλής προσαρμογής των θεωρητικών προφίλ SAXS των μοντέλων με διαφορετικές συμμετρίες (Ρ2, Ρ3, Ρ4, Ρ5 και Ρ6) με τα δεδομένα SAXS συγκρίθηκαν [24]. Πέντε φορές συμμετρία απέδωσε την καλύτερη εφαρμογή, η οποία ήταν σημαντικά καλύτερα ότι οι ταιριάζει με τέσσερις φορές ή έξι φορές συμμετρία (

P

(

F

) τιμές των 0,036 και 0,004, αντίστοιχα) . Το μέσο μοντέλο σχήμα SAXS του μονομερούς PAT-SM6 με πέντε φορές συμμετρία συμφώνησε καλά με τις συνολικές λειτουργίες που χαρακτηρίζεται από το προηγούμενο μικροσκοπία ηλεκτρονίων, SAXS και μοντελοποίηση ομολογίας μελέτες IgM [31], [32], [33]. Multi-αλυσίδα άκαμπτο σώμα εκλέπτυνση κατά του δεδομένα SAXS διεξήχθη χρησιμοποιώντας κλάσματα Fab εύκαμπτα συνδεδεμένο με θραύσματα Fc με βάση την IgE [34], όπως ανά πρόσφατη μοντελοποίηση EM [33]. P5 συμμετρία επιβλήθηκε και ο σχετικός προσανατολισμός των θραυσμάτων Fc περιορίστηκε από περιορισμούς απόσταση που αντιστοιχεί στην δισουλφιδικών δεσμών ενδο-υπομονάδας [35]. Η SAXS

ab initio

μοντέλο σχήμα παρουσιάζεται με επικάλυψη στο άκαμπτο σώμα εξευγενισμένα μοντέλο SAXS (Σχήμα 4F). Και τα δύο μοντέλα SAXS δείχνουν ασυμμετρία στην σχετική τοποθέτηση των δύο θραύσματα Fab σε καθένα από τα πέντε ζεύγη βαριάς αλυσίδας-ελαφριάς αλυσίδας, η οποία είναι σύμφωνη με τις ανακατασκευές σχήμα ΕΜ [35]. Αυτές οι δομικές μελέτες επιβεβαιώνουν τη σχετική ομοιογένεια του παρασκευάσματος PAT-SM6 και την καταλληλότητα για τις μελέτες λύση σχετικά με τις αλληλεπιδράσεις με ειδικά αντιγόνα.

Α. Η συγκέντρωση του GRP78 χρησιμοποιείται για να επικαλύψει τα φρεάτια ήταν 7,5 μg /mL. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν PAT-SM6 (5 μg /ml, κλειστοί κύκλοι) και πολυκλωνικό αντι-GRP78 (ανοικτοί κύκλοι). Αποτελέσματα παρουσιάζονται επίσης για πειράματα ελέγχου παραλείποντας GRP78 παλτό χρησιμοποιώντας ως πρωτεύοντα αντισώματα PAT-SM6 (5 mg /ml, κλειστά τρίγωνα) ή αντι-GRP78 (ανοιχτά τετράγωνα). Β: Η δέσμευση του PAT-SM6 (5 μg /ml) σε ακινητοποιημένο GRP78 σε διαφορετικές συγκεντρώσεις επίστρωσης GRP78 απουσία (μαύρες μπάρες) ή παρουσία (γκρι ράβδοι) διαλυτού GRP78 (4 mg /ml). C: Διαλυτό GRP78 επαγόμενη αναστολή της PAT-SM6 δέσμευση σε ακινητοποιημένο GRP78 σε διαφορετικές συγκεντρώσεις επίστρωσης GRP78. Οι συγκεντρώσεις του PAT-SM6 και διαλυτές GRP78 που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 5 μg /ml και 4 mg /ml, αντίστοιχα.

Η

Η Αλληλεπίδραση PAT-SM6 με GRP78 στη Λύση

ανάλυση ταχύτητας καθίζησης χρησιμοποιήθηκε για να διερευνήσει την αλληλεπίδραση των PAT-SM6 και GRP78. Οι ακτινικές σαρώνει στο σχήμα 5Α, που λαμβάνονται για ένα μίγμα PAT-SM6 (0,4 μΜ) και GRP78 (10 μΜ), δείχνουν μια αργή και ένα γρήγορα κινούμενο όρια που αντιστοιχούν περίπου στα όρια ταχύτητες που λαμβάνονται για ξεχωριστά δείγματα GRP78 και PAT-SM6 , αντίστοιχα (σχήματα 2 και 4). Ανάλυση συνεχή κατανομή του μεγέθους των δεδομένων που λαμβάνονται για την PAT-SM6-GRP78 μείγμα επιβεβαίωσε δύο μεγάλων πληθυσμών που χαρακτηρίζεται από μέση συντελεστές καθίζησης παρόμοια με τις μέσες τιμές για GRP78 και PAT-SM6. Ανάλυση της περιοχής κάτω από τον πληθυσμό που αντιστοιχεί στο PAT-SM6 έδειξε μία μικρή μείωση στην έκταση περίπου 10%, σύμφωνα με την απώλεια υλικού. Η απώλεια αυτή οφείλεται στο σχηματισμό και την ταχεία εξάντληση των μεγάλων συμπλεγμάτων αντισώματος-αντιγόνου. Περαιτέρω απόδειξη για την απώλεια υλικού λόγω του σχηματισμού συμπλόκου παρέχεται από μια σύγκριση των ακτινικών σαρώσεων που λαμβάνονται σε ένα μόνο χρονικό σημείο για PAT-SM6 μόνο, GRP78 μόνο και το μίγμα των PAT-SM6 και GRP78. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η τιμή πλατώ για την PAT-SM6-GRP78 μείγμα είναι χαμηλότερη από τις συνδυασμένες σαρώνει οπτικής πυκνότητας για τα ξεχωριστά συστατικά, ενδεικτικό του σχηματισμού συμπλόκου. Μια δυσκολία στην ανάλυση των δεδομένων για ασθενής αναστρέψιμος σύμπλοκα είναι η δυναμική φύση των αλληλεπιδράσεων και η πολυπλοκότητα των προσαρμογή των δεδομένων σε συγκεκριμένα μοντέλα [36]. Παρ ‘όλα αυτά, τα δεδομένα στο Σχήμα 5C δείχνουν την απώλεια μόνο μιας μικρής ποσότητας PAT-SM6 ως μεγάλα συγκροτήματα, που αντιστοιχούν στο 10% περίπου των PAT-SM6. Δεδομένου ότι η συνολική συγκέντρωση του PAT-SM6 και GRP78 χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα αυτά ήταν 0.4 μΜ και 10 μΜ, αντίστοιχα, η εκτίμηση αυτή για την αναλογία συμπλόκου απόδοσης και εκτίμηση για το σταθερά διαστάσεως, υποθέτοντας ένα 1:01 συγκρότημα, περίπου 90 μΜ. Αυτή η σχετικά χαμηλή συγγένεια σύνδεσης είναι χαρακτηριστικό των IgM-αντιγόνου αλληλεπιδράσεων σε σύγκριση με τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ της συγγένειας maturated αντισωμάτων IgG και συγγενικά αντιγόνα τους [37].

Ανάλυση ELISA της αλληλεπίδρασης μεταξύ PAT-SM6 και GRP78

Η αλληλεπίδραση του PAT-SM6 με GRP78 ακινητοποιημένο επί μιας πλάκας μικροτίτλου αναλύθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ELISA. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 6 δείχνουν ένα ισχυρό θετικό σήμα με τη χρήση είτε PAT-SM6 ή αντι-GRP78 ως το πρωτογενές αντίσωμα. Πειράματα ελέγχου παραλείποντας το αρχικό διαδικασία επίστρωσης GRP78 ή χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα ελέγχου ισοτύπου IgM έδωσε ένα σήμα το οποίο ήταν κοντά στο παρασκήνιο. Το μέγεθος της θετικό σήμα για την αλληλεπίδραση του PAT-SM6 με ακινητοποιημένο GRP78 ήταν παρόμοια για δείγματα επωάζονται σε 20 mM ρυθμιστικό φωσφορικού νατρίου, ρΗ 7.4 σε σύγκριση με τα δείγματα PAT-SM6 σε PBS ενώ το σήμα μειώθηκε σημαντικά όταν η συγκέντρωση ΝαΟΙ αυξήθηκε έως 500 mM. Η σύνδεση του PAT-SM6 σε ακινητοποιημένο GRP78 ήταν παρόμοια για επωάσεις εκτελούνται σε τιμές ρΗ από 6, 7.4 και 8.

Λόγω του σχετικά ισχυρό σήμα παρατηρείται για την αλληλεπίδραση του PAT-SM6 με GRP78 σε προσδιορισμούς ELISA (Σχήμα 6) σε σύγκριση με τη σχετικά ασθενή αλληλεπίδραση συναχθεί από μελέτες ταχύτητας καθίζησης (Σχήμα 5Β και C) επιπλέον πειράματα για να καθοριστεί η ένταση των αλληλεπιδράσεων που παρατηρήθηκαν υπό συνθήκες ELISA. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 7Α δείχνουν το σήμα ELISA προσδιορίζεται ως συνάρτηση συγκέντρωσης PAT-SM6 για διαφορετικές συγκεντρώσεις επικάλυψη GRP78. Τα αποτελέσματα δείχνουν τυπικές καμπύλες κορεσμού όπου το μέγεθος της ELISA σήματος σε αυξήσεις κορεσμό συστηματικά ως η συγκέντρωση επικάλυψης της GRP78 PAT-SM6 αυξάνεται. Επίσης φαίνεται στο Σχήμα 7 είναι πειράματα ελέγχου χρησιμοποιώντας διαφορετικές συγκεντρώσεις αντι-GRP78, PAT-SM6-εξ και PAT-δΜ6 IgG. Σε κάθε περίπτωση υπάρχει μια συστηματική αύξηση του μεγέθους των καμπυλών κορεσμού με αυξημένη συγκέντρωση επίστρωση GRP78.