Abstract

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα συνεισφέρει στα κακοήθη φαινοτύπους μιας ποικιλίας καρκίνων, αλλά σημειωτές για τον εντοπισμό του καρκίνου του ανθρώπου υποφάρυγγα (HPC) βλαστικά κύτταρα παραμένουν ελάχιστα κατανοητή. Εδώ, αναφέρουμε ότι το CD271

+ πληθυσμού κατατάσσονται από ξένο μόσχευμα κέντρα προμηθειών ανθρωπιστικής διαθέτει μια βελτιωμένη ικανότητα ογκογενή σε ποντίκια με ανοσοανεπάρκεια. Οι όγκοι που δημιουργούνται από το CD271

+ κυττάρων που περιέχονται τόσο CD271

+ και CD271

– κυττάρων, υποδεικνύοντας ότι ο πληθυσμός θα μπορούσε να υποβληθεί σε διαφοροποίηση. Ανοσοϊστολογική αναλύσεις των όγκων αποκάλυψε ότι το CD271

+ κύτταρα εντοπίζεται σε ένα περιαγγειακή κόγχη κοντά CD34

+ αγγείωση, σε επεμβατικές μέτωπα, και στην βασική στιβάδα. Σύμφωνα με αυτά τα χαρακτηριστικά, ένα δείκτη βλαστική ικανότητα,

Nanog

, και

μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs)

, τα οποία εμπλέκονται στην εισβολή του καρκίνου, ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα στο CD271

+ σε σύγκριση με το CD271

– κυτταρικού πληθυσμού. Περαιτέρω, χρησιμοποιώντας δείγματα πρωτογενούς HPC, αποδείξαμε ότι η υψηλή έκφραση CD271 συσχετίστηκε με κακή πρόγνωση για τους ασθενείς. Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι CD271 είναι ένας νέος δείκτης για HPC βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν και για HPC πρόγνωση

Παράθεση:. Imai Τ, Tamai K, Oizumi S, Oyama Κ, Yamaguchi Κ, Sato I, et al. (2013) CD271 Ορίζει ένα βλαστικό κύτταρο-Όπως Πληθυσμός στον Καρκίνο υποφάρυγγα. PLoS ONE 8 (4): e62002. doi: 10.1371 /journal.pone.0062002

Συντάκτης: Vladimir V. Kalinichenko, Ιατρικό Κέντρο Νοσοκομείο Σινσινάτι των παιδιών, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 12, Δεκ 2012? Αποδεκτές: 17 Μάρτη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 23 Απρ 2013

Copyright: © 2013 Imai et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τους αριθμούς JSPs KAKENHI επιχορήγηση 24300326, 21791589, 24592613, JST CREST, και επιχορηγήσεις-σε-βοήθειας από το Υπουργείο Υγείας, Εργασίας και Πρόνοιας, και η Takeda Ιατρικό Ίδρυμα, το Ίδρυμα Ichiro Kanehara. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

πλακώδες καρκίνωμα κεφαλής και τραχήλου (HNSCC) είναι η έκτη πιο κοινή μορφή καρκίνου σε όλο τον κόσμο, με σχεδόν 500.000 νέες περιπτώσεις και εκτιμάται ότι περίπου 300.000 θάνατοι καταγράφονται κάθε χρόνο. Ο όρος αυτός περιλαμβάνει διάφορες ανεξάρτητες καρκίνων, όπως του στόματος, ρινοφαρυγγικό, στοματοφαρυγγική και υποφάρυγγα καρκίνους [1]. καρκίνο του υποφάρυγγα (HPC), η κακοήθεια του υποφάρυγγα, αντιπροσωπεύει περίπου το 10% όλων των HNSCCs. Επιδημιολογικές μελέτες δείχνουν ότι η κατανάλωση καπνού και αλκοόλ συμβάλλει στην καρκινογένεση του [2]. Δυστυχώς, περίπου το 80% των περιπτώσεων HPC προωθούνται κατά τη στιγμή της διάγνωσης, δηλαδή, οι ασθενείς είναι σε στάδιο III ή IV [3], έτσι η θεραπεία είναι δύσκολη. Ριζική χειρουργική επέμβαση όπως η συνολική laryngopharyngoesophagectomy οδηγεί σε απώλεια της φωνής, και ταυτόχρονη χημειοραδιοθεραπεία συχνά προκαλεί παρενέργειες που απειλούν τη ζωή. Καθυστερημένη περιφερειακή μετάσταση λεμφαδένα, απομακρυσμένη μετάσταση, και άλλα πρωτογενή κακοήθειες συμβαίνουν συχνά κατά τη διάρκεια της πορείας της νόσου [3]. Το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών ασθενών ΚΕΚ δεν είναι τίποτα περισσότερο από το 30% [4], γεγονός που υποδηλώνει μια ισχυρή ανάγκη για καινοτόμες στρατηγικές θεραπείας.

Η συσσώρευση αποδείξεις των τελευταίων ετών υποστηρίζει τον καρκίνο βλαστικών κυττάρων (ή την κίνηση των κυττάρων) θεωρία [5], [6]. Σε αυτό το συναρπαστικό σενάριο, οι καρκίνοι που αποτελείται από μια ιεραρχία των κυτταρικών πληθυσμών ετερογενείς, και ξεκίνησε από έναν περιορισμένο υποπληθυσμό των κυττάρων με ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν. Με δραστηριότητα αυτο-ανανέωση τους και η ικανότητα των όγκων-κίνηση, καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) ή καρκίνο έναρξη κύτταρα (CICs) παράγουν μη-καρκινικά βλαστικά κύτταρα ως πληθυσμός «Απόγονοι». Αντίσταση στη χημειοθεραπεία και την ακτινοθεραπεία είναι ένα άλλο χαρακτηριστικό των ΚΕΠ. Έτσι, ΚΕΠ μπορεί να είναι υπεύθυνη για τις αποτυχίες θεραπεία της χημειοθεραπείας και της ακτινοθεραπείας, και η κακή κλινική έκβαση. Προς τον στόχο της ανάπτυξης νέων θεραπειών CSC-στόχευσης, οι ερευνητές προσπάθησαν να εντοπίσουν και να χαρακτηρίσουν δείκτες κυτταρικής επιφάνειας για ΚΕΠ.

Σε HNSCC, CD44

+ κύτταρα έχουν αναγνωριστεί ως ΚΕΠ. Όταν τα κλινικά δείγματα καρκίνου του ξενο-μεταμόσχευσις σε ανοσοανεπαρκή ποντίκια, CD44

+ κύτταρα αλλά όχι CD44

– κύτταρα κινήσεως όγκων, και οι όγκοι που προκύπτουν παράγουν μια ιεραρχία ετερογενείς κυτταρικούς πληθυσμούς [7]. Ωστόσο, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι CD44

– κύτταρα σχηματίζουν σφαίρες, έχουν την ικανότητα όγκου-κίνηση, και είναι στη χημειοθεραπεία, όπως CD44

+ κύτταρα [8]. Έτσι, το ΚΕΠ μπορεί να είναι δυναμική και ετερογενή σε διάφορα μικροπεριβάλλοντα [9], και το CD44

+ κύτταρα δεν μπορούν να αντιπροσωπεύουν καθαρή ΚΕΠ HNSCC. Επιπλέον, η ίδια η HNSCC είναι ετερογενής, αντιπροσωπεύουν διάφορους τύπους καρκίνου, όπως περιγράφεται παραπάνω. Ως εκ τούτου, η στόχευση της έρευνας για κάθε τύπο του καρκίνου μπορεί να οδηγήσει στην ταυτοποίηση επιπρόσθετων δεικτών CSC.

CD271 είναι μία διαμεμβρανική πρωτεΐνη που ανήκει στην υπεροικογένεια υποδοχέα παράγοντα νέκρωσης όγκου. Είναι επίσης ένας υποδοχέας αυξητικού παράγοντα νεύρων (NGFR), και αλληλεπιδρά με νευροτροφίνες, όπως ο NGF, νευροτροφικός παράγοντας προερχόμενος από τον εγκέφαλο (BDNF), νευροτροφίνη-3 (ΝΤ3), και νευροτροφίνη-4 (ΝΤ4), με χαμηλή συγγένεια [10 ]. Προηγούμενες μελέτες δείχνουν ότι τα βλαστικά κύτταρα των ιστών του στόματος [11], του λάρυγγα [12], και του οισοφάγου [13] πλακώδη επιθήλια εκφράζουν CD271. CD271 συνδέεται επίσης με το ΚΕΠ του κακοήθους μελανώματος [14], [15] και οισοφαγικό καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων [16].

Στην παρούσα μελέτη, αποδεικνύει ότι το CD271

+ κυτταρικό πληθυσμό του ΚΕΚ διαθέτει την ικανότητα ογκογενή

in vivo

, και έχει αρκετές CSC-όπως χαρακτηριστικά.

Υλικά και Μέθοδοι

όγκου Εμφύτευση

Μετά την απόκτηση συγκατάθεση, νωπά δείγματα όγκου λήφθηκαν στο Κέντρο Καρκίνου Miyagi (MCC), μεταφέρονται στο εργαστήριο σε ψυχόμενο PBS (-), και υποβάλλονται σε περαιτέρω αναλύσεις. Όλα τα δείγματα όγκων ήταν ανώνυμα, σύμφωνα με το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review MCC. NOD /SCID /IL-2RγC

null (NOG) ποντικοί αγοράστηκαν από το Κεντρικό Ινστιτούτο Πειραματικής Ζώα Ιαπωνία αναισθητοποιήθηκαν με πεντοβαρβιτάλη. Μόλις οι ποντικοί ήταν κοιμισμένος, τομές δέρματος έγιναν, και μικρά κομμάτια του όγκου δείγματα περίπου 50 mm

3 εμφυτεύτηκαν κάτω από το δέρμα του πλευρού και στις δύο πλευρές. σχηματισμός όγκων παρακολουθήθηκε εβδομαδιαία, και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε από τον τύπο: 1/2 χ εύρος κατακόρυφης × οριζόντια σειρά × ύψος. Όταν το αρχικό όγκοι στα ποντίκια ξένο μόσχευμα NOG φτάσει πάνω από 10 mm σε διάμετρο, τα ποντίκια θανατώθηκαν, και οι όγκοι διαιρούνται σε δείγματα για πέψη μονοκύτταροι σχηματισμός σφαίρα, στερέωση με φορμαλίνη για ιστολογική εξέταση, ή σειριακή διέλευση σε ποντικούς. Η φροντίδα των ζώων και πειραματικά πρωτόκολλα έγιναν αυστηρά σύμφωνα με τις διαδικασίες και κατευθυντήριες γραμμές που καθορίζονται από τις MCC διοικητικές επιτροπές για τη φροντίδα των εργαστηριακών ζώων. Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις έγιναν υπό αναισθησία, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Προετοιμασία Single-cell Αναρτήσεις από όγκου ιστών Δείγματα

Υπό άσηπτες συνθήκες, οι όγκοι κόπηκαν σε μικρά κομμάτια, και λεπτοκομμένη με ένα αποστειρωμένο νυστέρι. Μετά από πλύση με PBS (-), ο ιστός του όγκου βυθίστηκε σε ένα διάλυμα που περιέχει PBS (-), 1 mg /ml DNase1 (Roche), και 1 mg /ml κολλαγενάση /δισπάση (Roche), και επωάστηκαν στους 37 ° C για 2 ή 3 ώρες, μέχρι να επέλθει πλήρης πέψη. Τα κύτταρα διήλθαν μέσω ενός νάιλον πλέγματος 40 μm, και πλύθηκαν 3 φορές με PBS (-). Μετά από φυγοκέντρηση, το απόθεμα των μεμονωμένων κυττάρων χωρίστηκε, και τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για αναλύσεις ή καλλιέργεια σφαίρα FACS. Για καλλιέργεια σφαίρα, τα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε ελεύθερο ορού DMEM /F12 συμπληρωμένο με Β27 (Invitrogen), ανθρώπινο ανασυνδυασμένο επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF: 20 ng /μl: Peprotech), και το ανθρώπινο βασικό παράγοντα ανάπτυξης ινοβλαστών (bFGF: 20 ng /. μl: Peprotech) για πιάτα εξαιρετικά χαμηλή κουλτούρα συνημμένο (Corning)

κυτταρομετρίας ροής Ανάλυση και ταξινόμηση κυττάρων

διαχωρισμένα μεμονωμένα κύτταρα ανεστάλησαν σε PBS (-) με 3% FBS. Τα κύτταρα βάφτηκαν με αντι-ανθρώπινα αντισώματα ειδικά για EpCAM (1:10, FITC-συζευγμένο, Miltenyi Biotec), αντι-ανθρώπινα αντισώματα CD271 (1:10, ΑΡΟ-συζευγμένο, Miltenyi Biotec), αντισώματα αντι-ανθρώπινο CD44 (1: 10, APC-συζευγμένο, Becton Dickinson), αντισώματα αντι-ανθρώπινο CD133 (1:10, ΑΡΟ-συζευγμένο, Miltenyi Biotec), και αντι-ποντικού IgG1, κ αντισώματα ελέγχου ισοτύπου (1:20, APC και FITC-συζευγμένο, Biolegend και Becton Dickinson, αντίστοιχα). 7-AAD χρησιμοποιήθηκε για να αποκλείσει τα νεκρά κύτταρα (Sigma, 1 μg /ml). Τα βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν είτε με ένα FACSCanto ™ II (Becton Dickinson) ή με ταξινόμηση με FACSAria ™ II (Becton Dickinson), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

σε πραγματικό χρόνο Αντίστροφη Μεταγραφή (RT) -PCR

Το ολικό RNA καθαρίστηκε από ταξινομημένα μεμονωμένα κύτταρα ή δείγματα ιστών χρησιμοποιώντας ένα κιτ απομόνωσης mirVana ™ miRNA (Ambion), και μεταγράφηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ PrimScript II cDNA Synthesis (Takara Bio). Real-time RT-PCR χρησιμοποιώντας Brilliant ΙΙΙ Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies).

GAPDH

χρησιμοποιήθηκε ως ενός ενδογενούς γονιδίου αναφοράς. Οι αλληλουχίες εναρκτήρα που χρησιμοποιούνται για πραγματικού χρόνου RT-PCR παρατίθενται στον Πίνακα S1.

ανοσοϊστοχημεία (IHC)

εγκλεισμένα σε παραφίνη, σταθεροποιημένα με φορμαλίνη, τμήματα ιστού 3-μm αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο , και επανυδατώθηκαν μέσω αιθανόλη σε απεσταγμένο νερό. Heat-επαγόμενη ανάκτηση επιτόπου διεξήχθη με μικροκύματα τμήματα σε ένα ρΗ διαλύματος ανάκτησης 9,0 στόχου (Dako). Η ενδογενής υπεροξειδάση μπλοκαρίστηκε με 0,3% H

2O

2. Οι τομές επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα σε ανθρώπινη CD271 (1:4000, BD Biosciences) για 20 λεπτά, ή να CD34 (Nichirei Biosciences) ή Ki-67 (1:10, την Santa Cruz Biotechnology) για 60 λεπτά, στους 37 ° C . Τα τμήματα χρωματίστηκαν για CD271 επωάστηκαν για 15 λεπτά με LINKER ποντικού (Dako), τότε δευτερεύοντα αντισώματα και DAB Chromogen (Envision ™ FLEX Kit, Dako) εφαρμόστηκαν όπως περιγράφεται στο πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Για τα τμήματα χρωματίστηκαν για CD34 ή Ki-67, απλή χρώση ΑΡ (Μ) (Nichirei Biosciences) εφαρμόστηκε ως το δευτερεύον αντίσωμα, και η χρώση έγινε ορατή με τη Νέα φουξίνη Υπόστρωμα (Nichirei Biosciences). Για την διπλή χρώση του CD34 ή Ki-67, με CD271, το CD34 ή χρώση Κί-67 διεξήχθη πρώτη, ακολουθούμενη από ότι, για CD271, όπως περιγράφεται παραπάνω.

In vivo

Ογκογένεση δοκιμασία

τα διαχωρισμένα όγκοι ταξινομούνται με βάση την έκφραση ανθρώπινου EpCAM και CD271, όπως EpCAM

+ CD271

+ κύτταρα ή EpCAM

+ CD271

– κύτταρα. Τα ταξινομημένα κύτταρα αιωρήθηκαν σε 200 μΐ Matrigel μήτρας (BD Biosciences) στους 4 ° C, στη συνέχεια υποδορίως στα πλευρά των ποντικιών NOG με ένα 1-ml σύριγγα. Κάθε ποντικός έλαβε CD271

+ κύτταρα στη δεξιά πλευρά, και CD271

– κυττάρων στο αριστερό. σχηματισμός όγκων παρακολουθήθηκε με εβδομαδιαία εξέταση και ψηλάφηση.

In vivo

Chemotherapy Δοκιμασία

Cisplatin (CDDP), ένα φάρμακο κατά του καρκίνου χαρακτηριστεί ως αντιδραστήριο πλατίνα, χορηγήθηκε ενδοφλεβίως ή ενδοπεριτοναϊκώς σε 5 ή 7,5 mg /kg. Μία εβδομάδα αργότερα, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία, και οι όγκοι εκχυλίστηκαν. Οι όγκοι χωρίστηκαν και είτε σταθεροποιήθηκαν με φορμαλίνη για IHC, ή σε διάσταση σε μεμονωμένα κύτταρα και υποβλήθηκαν σε ανάλυση FACS.

Στατιστικά

Οι αναλύσεις των συγκεκριμένων ασθενειών, την επιβίωση και την ελεύθερη υποτροπής επιβίωση διεξήχθησαν με μεθόδους Kaplan-Meier και η δοκιμασία log rank χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η διαφορά μεταξύ των ομάδων. ακριβής δοκιμασία του Fisher χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει δύο ομάδες ( «ισχυρή» έναντι «μέτρια-προς-αδύναμο» έκφραση CD271) σε εκτομή των όγκων από τις 28 περιπτώσεις των ΚΕΚ, και το chi-square test χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τις ίδιες δύο ομάδες στην IHC μελέτη 83 περιπτώσεων HPC. Οι μέσες τιμές των

Nanog

έκφραση μεταξύ των δύο ομάδων αναλύθηκε με t-test του Student. Το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο

σ

& lt?. 0.05

Ηθική

Το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του MCC ενέκρινε το πρωτόκολλο της μελέτης, καθώς και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε θέμα. Το πρωτόκολλο των πειραμάτων σε ζώα εγκρίθηκε από την επιτροπή MCC Animal Care and Use (Αριθμός Άδειας: MCC-AE-2011-8).

Αποτελέσματα

Οι όγκοι HPC Συμπεριλάβετε ένα υποπληθυσμό CD271

+ κύτταρα

Για να διερευνήσουν την έναρξη του όγκου και τον καρκίνο βλαστικών κυττάρων, φρέσκα δείγματα πρωτογενούς όγκου ελήφθησαν από ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση HPC εμφυτεύτηκαν κάτω από το δέρμα του 8-10 εβδομάδων ποντικούς NOG. Τρεις ανεξάρτητες ανθρώπινα δείγματα HPC με παρόμοια κλινικά χαρακτηριστικά χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία πρωτογενούς γραμμές ξενομοσχεύματος (HPCM1-3) (Πίνακας S2). Η ιστολογία του κάθε ξενομοσχεύματος ήταν σύμφωνη με το πρωτογενές δείγμα του (Σχήμα S1).

Για να χαρακτηριστούν οι σειριακά ξενομεταμοσχευμένων γραμμές όγκων, η έκφρασή τους δείκτη κυτταρικής επιφάνειας αναλύθηκε. Κάθε όγκος εξήχθη από τον ξενιστή και παρασκευάζεται ως ένα ενιαίο-κυτταρικό εναιώρημα. Επειδή ΕρΟΑΜ φέρεται να είναι ένας διαγνωστικός δείκτης καρκινικών κυττάρων για HNSCC [17], τα ανθρώπινα EpCAM-θετικά κύτταρα αυστηρά οριοθετημένα για την εξάλειψη των κυττάρων-ξενιστών που προέρχονται από, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Μεταξύ των δεικτών CSC που εξετάστηκαν, τα κύτταρα ήταν αρνητικά για CD133, και 3.4% των καρκινικών κυττάρων ήταν θετικά για CD44 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Απροσδόκητα, παρατηρήσαμε μια CD271

+ υποπληθυσμό μεταξύ των τριών γραμμών HPC που δοκιμάστηκαν (Σχήμα 1Α). Σε επαναλαμβανόμενα πειράματα, το CD271

+ πληθυσμός αντιπροσώπευε 2,99 έως 20,1% των κυττάρων σε HPCM1. Παρόμοια

+ πληθυσμούς CD271 ήταν σαφώς παρόντες στις άλλες δύο γραμμές: 2,90 – 9,54% για HPCM2 και 19,1% για HPCM3. Στη συνέχεια, αναλύσαμε ενσωματωμένες σε παραφίνη τομές των όγκων που προέρχονται από τις γραμμές ξένο μόσχευμα ΚΕΚ για CD271 με IHC (Σχήμα 1Β). Εντός της τυπικής καρκινώματα πλακωδών κυττάρων που σχηματίζεται από τις τρεις γραμμές, CD271

+ κύτταρα ήταν κυρίως παρούσες στη βασική στιβάδα του όγκου, σχεδόν περιορίζεται στην περιφερειακή ζώνη της φωλιάς του όγκου, και σπανίζουν στο κεντρικό τμήμα (Εικόνα 1Β) . Υπό υψηλή μεγέθυνση,

+ κύτταρα CD271 παρατηρήθηκαν δίπλα στο στρώμα (Εικόνα 1Β-d). Αυτές

+ κύτταρα CD271 παρουσίασαν μορφολογικά φαινοτύπους ανώριμα, ενώ το CD271

– κύτταρα στην κεντρική ζώνη της φωλιάς του όγκου είχε πιο ώριμη, πεπλατυσμένη, και κερατινοποιημένα σχήματα (Σχήμα 1Β-e). Για να χαρακτηριστεί περαιτέρω η εντόπιση του CD271

+ κυττάρων εντός του HPC, εμείς βάφονται κυτοκερατίνες (των Ck) σε διαδοχικές τομές (σχήμα S2). CK5 /6 τείνει να εντοπίζεται σε βασικά στρώματα και πολλαπλασιαζόμενα υπερβασικά διαμερίσματα, και το CD271

+ κύτταρα βρίσκονται εντός της CK5 /6-θετική περιοχή. Το CD271

+ κυττάρων ήταν επίσης μετρίως θετικά για Ck8, το οποίο σηματοδοτεί αδιαφοροποίητα κύτταρα SCC. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η CD271

+ πληθυσμός περιλαμβάνεται στο τμήμα βασικής στοιβάδας του CK5 /6-θετική περιοχή και μερικώς επικαλύπτει αδιαφοροποίητα κύτταρα Ck8-θετική.

(Α) Τα κύτταρα που προέρχονται από τρία HPC ξενομεταμοσχευμένων γραμμές χρωματίστηκαν για CD271 και αναλύθηκαν με FACS. ιστούς (Β) Tumor αποκόπηκαν από ποντικούς μεταμοσχεύονται με τις τρεις γραμμές HPC αναλύθηκαν για έκφραση CD271 με IHC. Ανοσοθετικότητα εμφανίζεται καφέ (Α, Β, και C). Οι εικόνες υψηλής μεγέθυνσης που συνδέονται με τις αντίστοιχες εγκλωβιστούμε περιοχές τους με βέλη. bar κλίμακας: 100 μm. Κόκκινη γραμμή δείχνει τα σύνορα του όγκου και στρώματος (δ). Κόκκινη γραμμή υποδεικνύει το σύνορο ενός CD271

+ σύμπλεγμα κυττάρων και CD271

– κυττάρων, και το κόκκινο και το μπλε αιχμές βελών δείχνουν CD271

+ κύτταρα και CD271

– κύτταρα, αντίστοιχα (ε). (Γ) Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα IHC για CD271 σε κλινικά δείγματα. Κανονική βλεννογόνο (α), καρκίνωμα

in situ

. (σι). Αιχμές βελών δείχνουν μια επεμβατική μπροστά, και έντονα θετική έκφραση CD271 (c, d). (D) IHC για CD34 με υπόστρωμα New φουξίνη (α), και διπλή χρώση για CD34 (New Fuchsin) και CD271 (DAB) (β-ε). CD34 ανοσοθετικότητα φαίνεται κόκκινο. Ένθετα δείχνουν εικόνες υψηλής μεγέθυνσης των εγκιβωτισμένες περιοχές. Κόκκινο αιχμές βελών δείχνουν CD34-θετικά μικροαγγείων και καφέ αιχμές βελών δείχνουν CD271

+ κύτταρα. (Ε) σχηματισμού σφαίρας κύτταρα HPCM1, και αυξημένη έκφραση CD271 στην ανάλυση FACS. μπαρ κλίμακας: 25 μm. (F) IHC για την διπλή χρώση του Ki-67 (New Fuchsin) και CD271 (DAB). Ki-67 ανοσοθετικότητα εμφανίζεται κόκκινο στον πυρήνα. Κόκκινο αιχμές βελών δείχνουν Ki-67-θετικά κύτταρα. μπαρ κλίμακα:. 100 μm

Η

Επίσης εξετάσαμε την έκφραση CD271 μέσα σε κλινικά δείγματα τεμαχίζεται HPC. Πρώτον, επιβεβαίωσε ότι CD271

+ κύτταρα ήταν παρόντα στην πιο βασική στιβάδα του φυσιολογικού βλεννογόνου υποφάρυγγα (Εικόνα 1 C-a). Ομοίως, σε ένα καρκίνωμα

in situ

(

CIS

) δείγμα, CD271

+ κύτταρα περιορίζεται στη βασική στοιβάδα, και απουσίαζαν από τα πιο διαφοροποιημένα ανώτερα στρώματα (Σχήμα 1α- σι). Τυπικά, τα περισσότερα από τα καρκινικά κύτταρα που βρίσκονται στο μεταναστευτικό μέτωπο ήταν CD271

+ (Σχήμα 1 C-C, D). Εξετάσαμε επίσης το κατά πόσον + κύτταρα CD271

βρίσκονταν κοντά στο αγγειακό σύστημα εντός των όγκων. Βρήκαμε ότι CD34

+ μικροαγγειακή ενδοθηλιακά κύτταρα (κόκκινο στο σχήμα 1Δ) βρίσκονταν στο CD271

+ κυττάρων περιοχές, και μεγεθύνονται εικόνες έδειξαν ότι ορισμένες

+ και CD271

CD34 + κυττάρων ήταν κοντά σε κάθε άλλα, ή σε άμεση επαφή (Σχήμα 1D-a, b). Αξίζει να σημειωθεί ότι, στις περισσότερες των δειγμάτων, ο CD271

+ κύτταρα σχηματίζονται πυκνές συστάδες που περιβάλλεται από στρώμα, το οποίο περιείχε CD34

+ μικροαγγείων (Σχήμα 1D-γ, δ, ε). Μαζί, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι CD271

+ κύτταρα είναι παρόντα στο μεταναστευτικό μέτωπο και στην περιαγγειακή ζώνη του tumors.It είναι καλά γνωστό ότι τα κύτταρα από διάφορες μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων HNSCC, ότι οι σφαίρες μορφή υπό συνθήκες καλλιέργειας εναιωρήματος περιλαμβάνουν ΚΕΠ [18 ]. Ως εκ τούτου, θα εξεταστεί κατά πόσον ο πολιτισμός σφαίρα-σχηματισμός θα μπορούσε να επηρεάσει την έκφραση CD271. Διαχωρισμένα καρκινικά κύτταρα που παράγονται σφαίρες που επιβίωσαν για 12 ημέρες, και μονά κύτταρα που παρασκευάζονται από αυτούς τους τομείς υποβλήθηκαν σε ανάλυση CD271 (Σχήμα 1 Ε). CD271 εκφράστηκε σε 46,5% αυτών των κυττάρων, σε αντίθεση με τον αρχικό όγκο HPCM1 κύτταρο, στο οποίο 2,99 έως 20,1% των κυττάρων ήταν CD271

+. Αυτό το αποτέλεσμα πρότεινε ότι

in vitro

σχηματισμό σφαίρα προκάλεσε τον εμπλουτισμό του CD271

+ κύτταρα.

Θα εξεταστεί επίσης αν η CD271

+ κύτταρα είναι ένας πληθυσμός πολλαπλασιασμού. Διπλά πειράματα -χρώση με Ki-67 και CD271 έδειξε ότι το CD271

+ κύτταρα ως επί το πλείστον διαμείνει στη βασική στιβάδα, ενώ η Κ-67-θετικά κύτταρα εντοπίζονται κυρίως στις σχετικά διαφοροποιημένες στιβάδες υπερβασικά (Σχήμα 1 F). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η CD271 είναι

+ κύτταρα δεν πολλαπλασιάζονται ενεργά

in vivo

.

CD271

+ κύτταρα είναι Ογκογονικά και διαφοροποιούνται

in vivo

στη συνέχεια εξετάσαμε το

in vivo

ογκογονικότητα του CD271

+ κύτταρα από τις τρεις γραμμές HPC. Τριάντα έως 100.000 CD271

+ ή CD271

– κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως σε κάθε πλευρά του ίδιου του ποντικιού για να αποφευχθούν τυχόν /περιβαλλοντικές διαφορές ξενιστή (Σχήμα 2Α). Η ακρίβεια της διαλογής επιβεβαιώθηκε με ανάλυση FACS (Σχήμα 2Β). Τα αποτελέσματα ξενομεταμόσχευση συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Σε HPCM1, ο CD271

+ κύτταρα ξεκίνησε όγκων σε ένα εξαιρετικά υψηλό ρυθμό, ακόμα και όταν εγχύθηκαν λιγότερα από 300 κύτταρα (αλλά τουλάχιστον 30 κύτταρα). Τριάντα CD271

– κύτταρα που δημιουργούνται ενός όγκου σε ένα μόνο από έξι εμβολιασμούς, και ο όγκος που σχηματίστηκε ήταν πολύ μικρότερες από εκείνες που ξεκίνησε η CD271

+ κύτταρα (Σχήμα 2C). Ομοίως, για HPCM2, όλοι οι όγκοι που σχηματίζονται, εκτός από ένα, προέκυψε από CD271

+ κύτταρα. Αν και το CD271

– κύτταρα σε HPCM3 δημιουργούνται όγκων, παρουσίασαν μεγαλύτερη λανθάνουσα κατάσταση και χαμηλότερη συχνότητα από εκείνες που αναπτύχθηκαν από CD271

+ κύτταρα. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η CD271

+ κύτταρα κατείχαν υψηλότερη ογκογονικότητας από το CD271

-. Κύτταρα

in vivo

Η

(Α) Αντιπροσωπευτική όγκων σε ποντίκια στα οποία ο αριθμός των υποδεικνύεται κύτταρα μεταμοσχεύονται. Κόκκινο αιχμές βελών δείχνουν CD271 sites

+ έγχυση κυττάρων (δεξιά πλευρά), και το μπλε αιχμές βελών δείχνουν CD271

– σημεία της ένεσης κυττάρων (αριστερή πλευρά). Κύκλους και διακεκομμένες κύκλοι δείχνουν θέσεις μεταμόσχευση με αποτέλεσμα την επιτυχία και την αποτυχία σχηματισμού όγκου, αντίστοιχα. (Β) Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των διαλεγμένων κυττάρων (96.8~99.5% CD271

+ ή CD271

– κύτταρα). (C) Τριάντα CD271

+ κύτταρα (δεξιά πλευρά) και CD271

– κύτταρα (αριστερή πλευρά) μεταμοσχεύθηκαν σε ένα ποντίκι, και τα δημιουργούμενα όγκοι αποκόπηκαν. Η ανάπτυξη του όγκου συναρτήσει χρησιμοποιώντας την μέση τιμή. (Δ) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της έκφρασης CD271 των κυττάρων του όγκου που προκύπτει από την έγχυση του CD271

+ κύτταρα. Τομές όγκων χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε). μπαρ κλίμακα:. 100 μm

Η

Μορφολογικά, το CD271

+ κύτταρα που σχηματίζονται όγκοι που μοιάζει με το αρχικό ιστολογικά, με τα τυπικά SCC χαρακτηριστικά: βασικοκυτταρικό καρκίνωμα που μοιάζει με μορφολογία στην περιφερειακή ζώνη , και διαφοροποιημένα κύτταρα στο κεντρικό τμήμα της φωλιάς του όγκου (Σχήμα 2Δ). Τα παραγόμενα όγκοι εξετάσθηκαν επίσης για έκφραση CD271 με κυτταρομετρία ροής. Οι όγκοι που προκύπτουν από την CD271

+ κυττάρων που περιέχονται τόσο CD271

+ και CD271

– κυττάρων (Σχήμα 2D). Έτσι, το CD271

+ πληθυσμός έχει τη δυνατότητα να δημιουργήσει ένα ιεραρχία του CD271 που εκφράζουν και μη εκφράζοντα κύτταρα, καθώς επίσης και την ικανότητα να κινήσει τον καρκίνο.

Γονιδιακής Έκφρασης Προφίλ του CD271

+ κύτταρα αποκαλύπτει ορισμένα χαρακτηριστικά των βλαστική ικανότητα και ικανότητας εισβολής

Είμαστε δίπλα ρώτησε αν το CD271

+ πληθυσμός είχε τα χαρακτηριστικά που σχετίζονται με κακοήθη κύτταρα σε όρους βλαστική ικανότητα και την εισβολή /μετάσταση. Πρώτον, η έκφραση των γονιδίων πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων που σχετίζονται με,

Nanog

,

Sox2

, και

εξετάστηκε Oct-4

. αναλύσεις πραγματικού χρόνου RT-PCR έδειξε ότι το

Nanog

έκφραση ήταν σημαντικά υψηλότερη στην CD271

+ κύτταρα από τις τρεις γραμμές HPC από ό, τι στο CD271

– κύτταρα (Εικόνα 3Α). IHC διαδοχικών τομών έδειξε την ένταξη της CD271

+ κύτταρα στο Nanog θετικά βασική στιβάδα (Σχήμα S3A). Ωστόσο, η έκφραση του

Sox2

και

Oct-4

δεν έδειξαν συνεπή τάση (Σχήμα S4). Στη συνέχεια, η έκφραση των τριών γονιδίων που σχετίζονται με την εισβολή έκκριση τύπου,

ΜΜΡ1

,

ΜΜΡ2

, και

MMP10

εξετάστηκε (Σχήμα 3Β). CD271

+ κύτταρα από τις τρεις γραμμές HPC παρουσίασαν σημαντική αύξηση σε ποσοστό

MMP1

, η οποία κυμαινόταν 2,3 έως 7,3 φορές σε σύγκριση με το CD271

– κύτταρα. Ομοίως,

ΜΜΡ2

αυξήθηκε 3,6-4 φορές στα + κύτταρα CD271

. Ευδιάκριτη

MMP10

πάνω ρύθμιση παρατηρήθηκε στο CD271

+ πληθυσμό HPCM3, σε ένα επίπεδο που ήταν περισσότερο από 40 φορές μεγαλύτερη από ό, τι στο CD271

– κύτταρα. Στη συνέχεια πραγματοποιείται σειριακή χρώση IHC της ΜΜΡ1, ΜΜΡ2, και MMP10, και διαπίστωσε ότι η CD271

+ κύτταρα ήταν θετικά για αυτές τις ΜΜΡ (Σχήμα S3b). Τα επίπεδα mRNA για

ΜΜΡ9, ΜΜΡ 11, και ΜΜΡ14 (ΜΤ1-ΜΜΡ)

ποικίλη μεταξύ των κυτταρικών σειρών, με δύο γραμμές από τις τρεις προβάλλοντας αυξημένη έκφραση της κάθε ΜΜΡ (Σχήμα S5). Λαμβάνοντας υπόψη τον εντοπισμό του CD271

+ κυττάρων σε επεμβατικές μέτωπα, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το CD271 είναι

+ κύτταρα οπλισμένοι με MMPs που επιτρέπουν την εισβολή των ιστών, με διάσπαση της εξωκυττάριας ουσίας.

Nanog

έκφραση (Α) και

MMP1

,

ΜΜΡ2

, και

MMP10

έκφρασης (Β) στο CD271

+ και CD271

– κύτταρα που προέρχονται από τις τρεις γραμμές HPC αναλύθηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Τα επίπεδα μεταγραφής κανονικοποιήθηκαν με εκείνα για

GAPDH

, και η πτυχή μεταβολή του επιπέδου ΜΜΡ έκφραση σε CD271

+ κύτταρα έναντι CD271

– κυττάρων υπολογίστηκε για κάθε δείγμα. Οι τιμές είναι ο μέσος όρος ± SD των πειραμάτων εις τριπλούν.

Η

CD271

+ κύτταρα είναι χημειοθεραπεία

in vivo

Η

Για να προσδιορίσετε αν το CD271

+ πληθυσμός είναι χημειοθεραπεία, η επίδραση της CDDP στα κύτταρα αναλύθηκε. Μας αρχική

in vitro

ανάλυση απέτυχαν, λόγω της δυσκολίας στην διατήρηση καλλιέργειας ιστού, είτε υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας ιστού με ορό ή υπό συνθήκες σφαίρα καλλιέργειας χωρίς ορό (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε ένα

in vivo

μοντέλο αξιολόγησης. Ποντικοί που φέρουν HPCM1 προερχόμενα όγκοι υποβλήθηκαν σε αγωγή με CDDP, και την ημέρα 7, οι όγκοι αποκόπηκαν, τεμαχίστηκαν και εξετάστηκαν με IHC για CD271 (Σχήμα 4Α). Το πεπλατυσμένο και κερατινοποιημένα CD271

– κύτταρα στην κεντρική ζώνη του όγκου ήταν στην διαδικασία του θανάτου, γεγονός που υποδηλώνει ότι η χημειοθεραπεία είχε προκαλέσει μαζική νέκρωση σε αυτά τα κύτταρα (Σχήμα 4Α). Αντιθέτως, όπως ήταν περισσότερο εμφανής στη βασική στιβάδα, CD271

+ κύτταρα επιβίωσαν και περιβάλλονταν από στρώμα. Για να βεβαιωθείτε ότι οι

+ κύτταρα CD271 ήταν ανθεκτικοί σε CDDP, εναιώρημα ξεχωριστών κυττάρων παρασκευάζονται από ένα CDDP επεξεργασμένο όγκου αναλύθηκε με FACS (Σχήμα 4Β). Μετά τη χορήγηση CDDP, το CD271

+ πληθυσμός αυξήθηκε από 16,3% σε 35,2%, γεγονός που υποδηλώνει ότι η CD271

+ κύτταρα ήταν ανθεκτικά σε CDDP. Η αντίσταση σε πολλαπλά φάρμακα του ΚΕΠ αποδίδεται σε αυξημένη έκφραση του ΑΤΡ-δέσμευσης των μεταφορέων [19], για παράδειγμα, ABCC2 συμβάλλει στην εκροή της CDDP και docetaxel, και ABCB5 και ABCG2 συμβάλλουν στην εκροή του 5-FU. Ως εκ τούτου, συγκρίναμε την έκφραση αυτών των τριών μεταφορέων σύνδεσης ΑΤΡ στο CD271

+ και CD271

– κύτταρα HPCM1 (Σχήμα 4C). Η έκφραση του

ABCC2

,

ABCB5

, και

ABCG2

στο CD271

+ κυττάρων ήταν περίπου 2,5 φορές, 4,8 φορές και 2,4 φορές υψηλότερες από ότι στο CD271

– κύτταρα, αντίστοιχα. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το CD271

+ κύτταρα είναι στη χημειοθεραπεία.

(Α) HPCM1- μεταμοσχευμένα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με 7,5 mg /kg CDDP για μια εβδομάδα, τότε οι όγκοι που δημιουργούνται αναλύθηκαν με IHC για CD271. Οι εγκιβωτισμένες περιοχές που συνδέονται με τις αντίστοιχες εικόνες υψηλής μεγέθυνσης τους με οριζόντια βέλη. bar κλίμακας: 100 μm. αναλύσεις (Β) FACS για CD271 σε κύτταρα HPCM1 προέρχονται από ποντίκια με ή χωρίς θεραπεία CDDP. (Γ) έκφραση του

ABCC2

,

ABCB5

, και

ABCG2

στο CD271

+ και CD271

– κύτταρα αναλύθηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR . επίπεδα Απομαγνητοφώνηση ομαλοποιήθηκαν με εκείνες του

GAPDH

, και την πολλαπλάσια αύξηση των κάθε επίπεδο γονιδιακής έκφρασης σε CD271

+ κύτταρα έναντι CD271

– κύτταρα φαίνονται. Οι τιμές είναι ο μέσος όρος ± SD των πειραμάτων εις τριπλούν.

Η

CD271 Έκφραση σε HPC κλινικά δείγματα συσχετίζεται με κακή πρόγνωση

Για να διερευνηθεί αν η έκφραση CD271 έχει συσχετισθεί με οποιοδήποτε προγνωστικούς παράγοντες για την πρωτοβάθμια HPC ασθενείς, 83 κλινικά δείγματα που λαμβάνονται από χειρουργική επέμβαση ή βιοψίας εξετάσθηκαν για CD271. Για την αξιολόγηση αυτή, επειδή ο CD271

+ κύτταρα ετερογενώς βρίσκονται μέσα σε κάθε όγκου, χρησιμοποιήσαμε ένα σύστημα βαθμολόγησης που ταξινομούνται κάθε περίπτωση, είτε ως «ισχυρή», αν είχε περισσότερο από 50% CD271

+ κυττάρων σε ολόκληρο όγκου, ή «μέτρια-προς-αδύναμη,» αν είχαν λιγότερο από 50%. Όλα τα πλακίδια αξιολογήθηκαν ανεξάρτητα από δύο ερευνητές (Ι S. and Κ.Μ.) χωρίς καμία προηγούμενη γνώση των κλινικών πληροφοριών του κάθε ασθενούς. Με IHC χρώση των δειγμάτων ιστού HPC με ένα αντι-CD271 αντίσωμα, 36 από τα 83 περιπτώσεις ταξινομήθηκαν ως ισχυρή, και 47 ήταν μέτρια έως ασθενής (Σχήμα 5Α). Τα κλινικά και παθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών 83 συνοψίζονται στον Πίνακα S3. Ο βαθμός CD271 αναλύθηκε στατιστικά σε σχέση με την κλινική T-στάδιο, Ν-στάδιο, και το στάδιο της νόσου. Τα ποσοστά των καρκίνων στο στάδιο προχωρημένο Τ (Τ3 ή περισσότερο) και το στάδιο προηγμένες Ν (Ν2 ή περισσότερο) ήταν σημαντικά υψηλότερη στην ισχυρή ομάδα CD271 σε σχέση με την μέτρια έως αδύναμη ομάδα (47,2% έναντι 23,4%:

p

= 0,023 και 69,4% έναντι 40,4%:

σ

= 0,009, αντίστοιχα). Ομοίως, οι περιπτώσεις της νόσου σε προχωρημένο (σταδίου III και IV) ήταν συχνότερες στην ισχυρή ομάδα CD271 σε σχέση με την μέτρια έως αδύναμη ομάδα (80,6% έναντι 55,3%:

σ

= 0,016). Στη συνέχεια, το ποσοστό επιβίωσης για συγκεκριμένες ασθένειες συγκρίθηκε χρησιμοποιώντας μεθόδους Kaplan-Meier. Το ποσοστό επιβίωσης των τριών ετών ήταν σημαντικά χαμηλότερη στην ισχυρή ομάδα CD271 σε σύγκριση με την μέτρια έως αδύναμη ομάδα CD271 (54,3% έναντι 83,2%:

σ

= 0,043) (Εικόνα 5Β). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ιστολογική έκφραση του CD271 συνδέεται με κακή κλινική έκβαση.

(Α) Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα IHC αναλύσεις για CD271 σε κλινικά δείγματα που λαμβάνονται από 83 ασθενείς HPC με χειρουργική επέμβαση ή βιοψία. Ανοσοθετικότητα φαίνεται καφέ. Δείγματα με περισσότερο από 50% θετικά κύτταρα σε ολόκληρο όγκου ταξινομήθηκαν ως «ισχυρή» (επάνω), και λιγότερο από 50%, ως «μέτρια-προς-αδύναμο» (κάτω). (Β) ανάλυση Kaplan-Meier για την επιβίωση συγκεκριμένες ασθένειες (3 χρόνια) από τα «ισχυρά» και ομάδες «μέτρια-προς-αδύναμο». * Στατιστικά σημαντική.

Η

εξεταστεί περαιτέρω αν η

CD271

γονιδιακής έκφρασης σε κλινικά δείγματα συνδέθηκε με την πρόγνωση των ασθενών. Για την ανάλυση αυτή, 28 περιπτώσεις HPC που ήταν εντελώς εκτομή, όπως αξιολογείται τόσο χειρουργικά και ιστολογικά, εξετάστηκαν για

CD271

έκφρασης. Αμέσως μετά την εκτομή, κάθε δείγμα διαχωρίστηκε σε όγκο και φυσιολογικό βλεννογόνο υποφάρυγγα. Το σύνολο των RNAs καθαρίστηκαν από αυτά τα αντίστοιχα τους ιστούς, υποβλήθηκαν σε

CD271

ποσοτικοποίηση mRNA. Επειδή η κανονική βλεννογόνος εκφράζει επίσης CD271 (Σχήμα 1C), χρησιμοποιήσαμε ένα «δείκτη CD271-έκφραση,» η τιμή του

CD271

σε όγκο έναντι ότι στην κανονική βλεννογόνο, καθώς το επίπεδο CD271. Κατά τη διάρκεια της μέσης περιόδου παρακολούθησης 20 μηνών, 11 από τις 28 περιπτώσεις υποτροπιάσει. Όλες οι υποτροπές συνέβη μέσα σε 18 μήνες, και η ελεύθερη υποτροπής επιβίωση για 18 μήνες αναλύθηκε χρησιμοποιώντας μεθόδους Kaplan-Meier (Σχήμα 6Α). Χρησιμοποιώντας μια τιμή cut-off για το δείκτη CD271-έκφραση του 1,5, η

CD271

-Υψηλής εκφραστές υποτροπιάσει σημαντικά συχνότερα από ό, τι τα

CD271

-Low περιπτώσεις (41,1% έναντι 80,0% relapse- επιβίωση χωρίς, αντίστοιχα:

σ

= 0,035). Τα δημογραφικά και κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών αυτών φαίνονται στον Πίνακα S4. Για την κατάταξη κλινική νόσο, ρΤ3 ή περισσότερο ήταν σημαντικά πιο συχνή στους CD271-υψηλής περιπτώσεις (CD271-υψηλής 15/17, CD271-χαμηλό 5/11?

σ

= 0,022). Στο σύνολό τους, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση CD271 συνδέεται με κακή κλινική έκβαση όσον αφορά την πρόγνωση και υποτροπής.

(Α) ανάλυση Kaplan-Meier για την επιβίωση ελεύθερη υποτροπής, σύμφωνα με το

CD271

επίπεδο mRNA, σε ιστούς όγκων που προέρχονται από 28 ασθενείς HPC από τη χειρουργική επέμβαση. Real-time RT-PCR αναλύσεις διεξήχθησαν, ομαλοποιημένη στην έκφραση του

GAPDH

, και η πολλαπλή μεταβολή σε

CD271

επίπεδα έκφρασης στον όγκο έναντι φυσιολογικού βλεννογόνου υπολογίστηκε. Η τιμή αποκοπής για το

CD271

-έκφραση δείκτης ήταν 1,5. *Στατιστικά σημαντικό. (Β)

Nanog

έκφρασης εξετάστηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Cut-off τιμή για το

Nanog

δείκτης έκφρασης ήταν 1.5. *Στατιστικά σημαντικό. Κλειστούς κύκλους, CD271 υψηλό?