Αφηρημένο

Η σφιγγοσίνης-1-φωσφορικής (S1P) μεταφορέα Spns2 ρυθμίζει έμφραγμα πρόδρομος της μετανάστευσης στην zebrafish και της διακίνησης των λεμφοκυττάρων σε ποντίκια. Ωστόσο, η λειτουργία του στον καρκίνο δεν έχει διερευνηθεί. Δείχνουμε εδώ ότι η έκφραση έκτοπη Spns2 επαγόμενη απόπτωση και knockdown ενισχυμένη κυτταρική μετανάστευση του σε κύτταρα μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC). Μεταβολικά, η έκφραση Spns2 αύξησε την εξωκυττάρια επίπεδα S1P, ενώ του νοκ ντάουν την ενδοκυτταρική. Η φαρμακολογική αναστολή της σύνθεσης S1P κατάργησε την επαυξημένη κυτταρική μετανάστευση που διαμεσολαβείται από Spns2 knockdown, υποδεικνύοντας ότι η ενδοκυτταρική S1P διαδραματίζει βασικό ρόλο σε αυτή τη διαδικασία. Κυτταρική σηματοδότηση μελέτες έδειξαν ότι η έκφραση Spns2 εξασθενημένη GSK-3β και Stat3 μεσολάβηση μονοπατιών προ-επιβίωσης. Αντίθετα, αυτές οι οδοί ενεργοποιούνται από Spns2 νοκ ντάουν, γεγονός που εξηγεί την αυξημένη μετανάστευση των κυττάρων, δεδομένου ότι είναι επίσης ζωτικής σημασίας για τη μετανάστευση. Μεταβολές των Spns2 βρέθηκαν να επηρεάσει πολλά ένζυμα που εμπλέκονται στο μεταβολισμό S1P, συμπεριλαμβανομένων κινάσες σφιγγοσίνης, φωσφατάσες S1P, και λυάση S1P 1. Γενετικά, επίπεδο Spns2 mRNA βρέθηκε να μειώνεται σε προχωρημένο καρκίνο του πνεύμονα (LC) ασθενείς ως ποσοτικά με τη χρήση ενός μικρού κλίμακα συστοιχία qPCR. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν για πρώτη φορά ότι Spns2 παίζει βασικό ρόλο στη ρύθμιση των κυτταρικών λειτουργιών στα κύτταρα NSCLC, και ότι η ρύθμιση προς τα κάτω της είναι ένας πιθανός παράγοντας κινδύνου για LC

Παράθεση:. Bradley E, Dasgupta S, Jiang Χ, Zhao Χ, Zhu G, Ο Q, et al. (2014) Critical ρόλος Spns2, μιας σφιγγοσίνης-1-φωσφορικού Transporter, σε καρκινικό κύτταρο πνεύμονα επιβίωση και τη μετανάστευση. PLoS ONE 9 (10): e110119. doi: 10.1371 /journal.pone.0110119

Επιμέλεια: Junming Yue, Το Πανεπιστήμιο του Τενεσί Κέντρο Επιστημών Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 του Ιουνίου, 2014? Αποδεκτές: 8 Σεπτεμβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 20 Οκτώβρη του 2014

Copyright: © 2014 Bradley et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά στοιχεία βρίσκονται στο σώμα και Υποστήριξη αρχείων πληροφοριών του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίζεται από μια Τειχών επιχορήγηση από τη Γεωργία Regents του Πανεπιστημίου και ένα βραβείο SDG από American Heart Association (GW). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα (LC) είναι η κύρια αιτία θανάτου που σχετίζονται με τον καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες και σε όλο τον κόσμο [1], [2]. Το 2012, υπάρχουν περισσότερα από 220.000 νέα κρούσματα και περισσότερους από 160.000 θανάτους στις Ηνωμένες Πολιτείες μόνο [1], [3], [4]. LC είναι μια εξαιρετικά ετερογενής νόσος. δύο κύριες μορφές της είναι μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του LC (NSCLC), και μικροκυτταρικό καρκίνο του LC, μεταξύ των οποίων NSCLC είναι η πιο κοινή μορφή, η οποία αντιπροσωπεύει περίπου το 85% των νεοδιαγνωσθέντων περιπτώσεις [1], [4].

γενετικές ανωμαλίες έχουν συνδέσει πολλαπλά γονίδια και σηματοδότηση μονοπατιών στο NSCLC, συμπεριλαμβανομένου του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) οικογένεια, μετατροπέας σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 (Stat3), και φωσφοϊνοσιτίδη 3-κινάσης

–

Akt-mTOR οδών [ ,,,0],1], [2], [4]. Αυτές οι ανακαλύψεις έχουν οδηγήσει σε μοναδικά στοχευμένες θεραπείες με ειδικό αναστολέα φάρμακα όπως erlotinib και gefitinib για μεταλλάξεις στο EGFR [5] ή crizotinib για γονιδιακή μετατόπιση με αποτέλεσμα το ογκογονίδιο EML4-ALK [6]. Επιγενετικές μεταβολές συνδέονται επίσης με NSCLC [7], [8]. Παρά το γεγονός ότι η διάγνωση και η θεραπεία της είναι ταχέως εξελισσόμενη, ουσιαστικές βελτιώσεις στα αποτελέσματα για τους περισσότερους ασθενείς με NSCLC είναι ακόμα άπιαστο [1], [3]. Πολλοί ασθενείς υποτροπή και να σχηματίσουν πιο επιθετική μεταστατικούς όγκους [9]. Έτσι, μια βαθύτερη κατανόηση της προέλευσης και των μοριακών μηχανισμών της μετάστασης της νόσου απαιτείται επειγόντως προκειμένου να βελτιώσουν την πρόληψη και τη θεραπεία.

1-φωσφορικής σφιγγοσίνης (S1P) είναι ένα ισχυρό βιοδραστικό μόριο σηματοδότησης που παίζει ζωτικό ρόλο σε διάφορες φυσιολογικές και παθολογικές διεργασίες, όπως ανοσία και καρκίνος [10], [11], [12], [13]. Προωθεί καρκίνου με τη ρύθμιση κυτταρικού πολλαπλασιασμού /επιβίωσης, τη μετανάστευση, την αγγειογένεση, και λεμφαγγειογένεση [10], [14], [15]. Ένα από τα ένζυμα που παράγει S1P, σφιγγοσινική κινάση 1 (SphK1) (Σχ. 1Α), θεωρείται ως ένα ογκογόνο ένζυμο, του οποίου η δραστηριότητα μπορεί να διεγερθεί από ένα ευρύ φάσμα των αγωνιστών, π.χ. ορμόνες και αυξητικούς παράγοντες [16], [17]. Αντιστρόφως, το ένζυμο που αποδομεί S1P, S1P λυάση 1 (SGPL1) (Σχ. 1Α), ρυθμίζεται προς τα κάτω στον καρκίνο του προστάτη [17]. Αποσιώπηση του SGPL1 ενισχύει την επιβίωση των κυττάρων? και εκτελείται η έκφραση SGPL1 ευαισθητοποιεί κυττάρων σε ακτινοβολία ή χημειοθεραπεία [17]. Επιπλέον, πολλές πτυχές των οδών σήματος S1P είναι στενά συνδεδεμένα με ογκογένεση (Εικ. 1Α) [10], [18]. Εξωκυτταρική S1P ασκεί το μεγαλύτερο μέρος της λειτουργίας του μέσω πέντε επιφανείας κυττάρου πρωτεΐνη G-συζευγμένο-υποδοχέων S1P1-S1P5 [10]. Διεγείρει διαφορετικά μονοπάτια μεταγωγής σήματος σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων, όπως επίσης και μέσα στο ίδιο κύτταρο, ανάλογα με τους υποδοχείς που εκφράζονται. Για παράδειγμα, S1P1 συνδέεται αποκλειστικά

μέσω

Gi πρωτεϊνών για την ενεργοποίηση Ras, μιτογόνο ενεργοποιημένη πρωτεΐνη κινάση (ΜΑΡΚ), ΡΙ3Κ /Akt, και φωσφολιπάση μονοπάτια C [10], [19]. Η ενδοκυτταρική S1P, από την άλλη πλευρά, προωθεί εξέλιξη του καρκίνου με ένα τρόπο υποδοχέα-ανεξάρτητη [11], [12], είτε με τη μεσολάβηση απελευθέρωση ασβεστίου από το ενδοπλασματικό δίκτυο, ή με αλληλεπίδραση με ενδοκυτταρικά στόχους της, όπως HDAC και TNF υποδοχέα που σχετίζονται παράγοντας 2 (TRAF2) [20]. Το πιο σημαντικό, S1P ανύψωση έχει ενοχοποιηθεί ως παράγοντας κινδύνου για LC σε μία επιδημιολογική μελέτη [21]

(Α), Σχηματική αναπαράσταση του μεταβολισμού S1P και λειτουργία, SGPP, S1P φωσφατάση.? ΔρΗΚ, σφιγγοσίνης κινάσης? SGPL, S1P λυάση? μπιζέλι, φωσφοαιθανολαμίνη. (Β), ανάλυση κηλίδας Western των Spns2-EGFP έκφραση που ανιχνεύεται από ένα αντι-ΟΡΡ αντίσωμα. β-ακτίνης (ακτίνη) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Α549 κύτταρα επιμολυσμένα με Spns2-EGFP και κυτταρολύματα συλλέχθηκαν 48 ώρες αργότερα. Το μοριακό βάρος του Spns2-GFP είναι περίπου 84 kD (58 + 26? Βέλος). (C), η έκφραση Spns2 αυξημένη εξωκυττάρια επίπεδο του S1P, σφιγγοσίνης (Sph) και διϋδροσφιγγοζίνη (dhSph). Τα κύτταρα αλλάχθηκαν σε μέσο με απολιπιδωμένο FBS 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Ένα άλλο 24 ώρες αργότερα, τα μέσα συλλέχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν, και το υπερκείμενο αναλύθηκε με lipidomics. (D), ώρα, μεσολάβηση εικόνες Spns2 θετικών κυττάρων. Α549 κύτταρα επιμολυσμένα με Spns2-EGFP όπως στο Α 12-16 ώρες αργότερα, τα κύτταρα τοποθετούνται σε ένα περιβαλλοντικό θάλαμο που διατηρεί 37 ° C και 5% CO χρόνο εικόνες μεσολάβηση λαμβάνονται σε χρονικά σημεία που υποδεικνύονται

2 και. μπαρ κλίμακα είναι 10 μm. (Ε), Ομοεστιακή εικόνες σάρωσης με λέιζερ των κυττάρων ανοσο-χρώση με ενεργό (διασπάται) κασπάσης 3 (Casp3). Α549 κύτταρα παροδικά διαμολυσμένα, σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με αντίσωμα έναντι διασπασμένης Casp3. μπαρ κλίμακα είναι 20 μm.

Η

S1P παράγεται ενδοκυτταρικά από SphKs και κυτταρικό επίπεδο διατηρείται από ένα τελειοποιηθεί ισορροπίας μεταξύ παραγωγής, μετατροπής, την υποβάθμιση και την εξαγωγή (Εικ. 1Α). S1P εξάγεται από τα κύτταρα με πρωτεΐνες μεταφορείς (Εικ. 1Α). Αρκετές σύνδεσης ΑΤΡ κασέτας μέλη της οικογένειας (ABC), όπως ABCA1, ABCC1, και ABCG1 έχουν προταθεί για τη μεταφορά S1P βασίζεται στις παρατηρήσεις ότι knockdown τους ή φαρμακολογική αναστολή απελευθέρωσης μείωση S1P [22], [23], [24], [ ,,,0],25], [26]. Ωστόσο, αυτή η αντίληψη παραμένει αμφιλεγόμενη, δεδομένου ότι S1P εξαγωγής δεν μεταβάλλεται όταν αυτές οι πρωτεΐνες εξωγενώς εκφράζονται σε κύτταρα ή νοκ άουτ σε ποντίκια [18], [27], [28]. Πρόσφατα, γεροντοκόρη ομόλογο 2 (Spns2), ένα μέλος της μεγάλης διευκόλυνσης υπερ της μη-εξαρτώμενες από ATP μεταφορείς, έχει αποδειχθεί ότι S1P τόσο

in vitro

και

in vivo

[27 μεταφέρει ], [29], [30], [31], [32], [33], [34]. Ακόμη πιο ενδιαφέρον, αν και μειωμένη στο πλάσμα, τα επίπεδα S1P αυξήθηκαν σε ορισμένους ιστούς συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα σε ποντίκια με έλλειψη Spns2 [33], η οποία είναι συνεπής με μια προηγούμενη αναφορά που δείχνει ότι Spns2 εκφράζεται πιο άφθονα στο ανθρώπινο πνεύμονα [18].

Αυτά τα προηγούμενα ευρήματα μας ώθησε να υποθέσει ότι Spns2 εμπλέκεται στην ανάπτυξη LC. Έχουμε εκτελέσει κέρδος-of-λειτουργίας και πειράματα απώλειας λειτουργίας στα κύτταρα NSCLC. Έχουμε επίσης εντοπιστεί επίπεδο έκφρασης Spns2 σε δείγματα ασθενών LC.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

Τα αντισώματα έναντι φωσφο-GSK-3β (Ser 9), GSK-3β, φωσφο-Stat3, Stat3, διασπασμένη κασπάση 3, και Survivin ήταν από τη Cell Signaling Technologies (Danvers, ΜΑ). Αντισώματα έναντι του ΟΕΕ και β-ακτίνη ήταν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Το αντίσωμα έναντι LC3B ήταν από Abcam (Cambridge, ΜΑ). Το αντίσωμα έναντι SphK2 ήταν από Exalpha Biologicals (Dublin, ΟΗ). Η φθορίζουσα επισήμανση των αναστολέων κασπασών (FLICA) Κιτ ήταν από Immunochemical Technologies (Bloomington, ΜΝ). ΔρΗΚ αναστολέα Ski-1 ήταν από Biovision (Milpitas, CA). Η λεκάνη αναστολέας κασπάσης Ζ-VAD ήταν από την Promega (Madison, WI). Ο αναστολέας ΡΙ3Κ LY294002 ήταν από την Cayman (Αηη Arbor, ΜΙ). Και ο αναστολέας Jak JAKI ήταν από την Millipore (Billerica, ΜΑ). Ανθρώπινα LC πραγματικό χρόνο συστοιχίες PCR ήταν από ΟηΟεηε (Rockville, MD).

Μέθοδοι

πλασμίδιο κλωνοποίησης.

Ανθρώπινο SPNS2 ενισχύθηκε με PCR από ένα BAC χρησιμοποιώντας τους εκκινητές hSpns2forward: AAG CTT ΑΤΟ TGC CTG GAA TGC GCC ΤΕΕ, και hSPns2reverse: GGT ACC AA GAC ΤΤΤ CAC AGA TGC GGG CGG? και υποκλωνίστηκε μέσα σε φορέα pGEM Teasy (Promega, Madison, WI). Το θραύσμα υπέστη πέψη χρησιμοποιώντας τα ένζυμα Hindlll και ΚρηΙ και κλωνοποιήθηκε μέσα σε φορέα pEGFP-N1 (Clontech, Mountain View, CA), με αποτέλεσμα τη pSPNS2-EGFP κατασκεύασμα. Για ΗΑ ετικέτα Spns2, εκκινητές που περιέχουν την ετικέτα ΗΑ σχεδιάστηκαν. Το PCR προϊόν κλωνοποιήθηκε σε pcDNA3.1 (Ζωή Tech., Carlsbad, CA, USA) παρόμοια με pSPNS2-EGFP.

Κυτταρική καλλιέργεια και θεραπεία.

Το ανθρώπινο NSCLC κυτταρικές γραμμές Α549 και Η1299 (ATCC, Manassas, VA) ήταν πλούσια δώρα από τον Dr. Zhonglin Hao, Κέντρο Καρκίνου, Γεωργία Regents του Πανεπιστημίου. Τα πρωτογενή ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα βραχιονίου (HBEpC) ήταν από την ATCC (Manassas, VA). Κύτταρα Α549 και κύτταρα Η1299 διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (Cellgro, Herndon, VA, USA) που περιείχε 10% FBS (Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Austin, ΤΧ), και Pen /Strep (Life Tech.). HBEpC διατηρήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Επιμόλυνση του Spns2 siRNAs έγινε είτε με Lipofectamine 2000 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Life Tech.) Ή με ηλεκτροδιάτρηση χρησιμοποιώντας ένα Nucleofactor (Lonza, Allendale, NJ).

χρόνο ζωντανό κύτταρο απεικόνισης μεσολάβηση, ανοσοκυτταροχημεία, και συνεστιακό λέιζερ μικροσκοπία.

απεικόνιση ζωντανών κυττάρων πραγματοποιήθηκε μετά τις προηγούμενες δημοσιευμένες διαδικασίες [35], [36], [37], [38]. Εν συντομία, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με Spns2-GFP. Δεκαέξι ώρες αργότερα, η καλλιέργεια τέθηκε σε μια ζωντανή θάλαμο απεικόνισης κυττάρων και αντίθεσης φάσης μικρογραφίες λαμβάνονται κάθε 30-60 λεπτά με μια Nikon Eclipse TE300 (Nikon Instruments, Inc., Melville, Νέα Υόρκη, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής. Για ανοσοκυτταροχημεία και ομοεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ, το στερεωμένα κύτταρα ανοσοχρώστηκαν με αντισώματα που απαριθμούνται και οι εικόνες που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας ένα Zeiss LSM 510 μικροσκόπιο σάρωσης ομοεστιακό λέιζερ εξοπλισμένο με δύο φωτονίων λέιζερ αργού στα 488 nm (Cy2), 543 nm (Cy3), και 633 nm (Cy5, Alexa Fluor 647), αντίστοιχα . LSM 510 Meta 3.2 λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για την απόκτηση της εικόνας. Adobe Photoshop CS4 χρησιμοποιήθηκε για μείωση υποβάθρου και επεξεργασία. Εικόνες που λαμβάνονται με δευτερεύον αντίσωμα μόνο χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι που αντιπροσωπεύει την ένταση φόντου σε ένα συγκεκριμένο κανάλι λέιζερ. αντιγόνου-ειδικές ανοσοχρώση ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση των κυττάρων που παρουσίασε σήματα διπλός ή περισσότερο πάνω από φθορισμό υποβάθρου.

εκχύλιση RNA, RT-PCR, και qPCR.

RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen). Πρώτα κλώνος cDNA που παράγεται από το κιτ σύνθεσης cDNA iScript (BioRad, Hercules, CA, USA). Real time qPCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας SYBR πράσινο /Rox qPCR κύριου μείγματος σε ένα PTC-200 Gradient Cycler εξοπλισμένο με ένα συνεχές ανιχνευτή φθορισμού χρωμο 4 (BioRad). Οι εκκινητές για qPCR ήταν: το ανθρώπινο hSpns2 προς τα εμπρός: ΤΤΑ CTG GCT CCA GCG TGA, hSpns2 αντίστροφη: TGA TCA TGC CCA GGA CAG? hPOLR2A προς τα εμπρός: GGGTGGCATCAAATACCCAGA? hPOLR2A αντίστροφη: AGACAC AGCGCAAAACTTTCA? hSphK1 προς τα εμπρός: GGC TGC TGT CAC CCA TGA Α, hSphK1reverse: TCA CTC TCT ΑΓΓ TCC ACA TCA G? hSphK2 προς τα εμπρός: AGC ΟΤΟ GTA GCC ACT TCA G, hSphK2 αντίστροφη: GAG CAG TGT ACC GAT GCC Α? hSGPP1 προς τα εμπρός: ATC ATC ATC GGG CTT CAT ΤΤΑ GC, hSGPP1reverse: ΟΤΟ CTC CAG GTG TCA AGA GT? hSGPP2 προς τα εμπρός, TCA Γ CG CAC TCC TCA TCG Τ, hSGPP2 αντίστροφη: CCG GGT ΤΟΟ GCT GTA GTA ATC? hSGPL1 προς τα εμπρός: ΚΔ AGC ACA GAC CTT CTG ATG Τ, hSGPL1 αντίστροφη: ACT CCA TGC ΑΑΤ TAG CTG CCA? hABCA1 προς τα εμπρός: ΤΤΑ AAC GCC CTC ACC ΑΑΑ GAC, hABCA1reverse: ΑΑΑ AGC ΚΕΔ CAT ACC ΤΑΑ ACT? hABCC1 προς τα εμπρός: ΤΤΑ CTC ΑΤΤ CAG CTC GTC TTG TC, hABCC1reverse: CAG GGA ΤΤΑ GGG TCG TGG AT? hABCG1 προς τα εμπρός: ACT GCA GCA TCG TGT ACT GGA, hABCG1reverse: CGT CTC GTC GAT GTC ACA GTG? hABCG2 προς τα εμπρός: TGA GCC TAC AAC ΤΟΟ CTT AGA, hABCG2 αντίστροφη:. CCC TGC ΤΤΑ GAC ATC CTT TTC AG

δοκιμασίες

Η βιωσιμότητα των κυττάρων και τον κυτταρικό θάνατο

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού και απόπτωσης πραγματοποιήθηκαν με Α549. και Η1299 κύτταρα επιμολυσμένα με hSPNS2-ΕΟΡΡ ή ΗΑ-Spns2 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [39], [40], [41]. Ο αριθμός των ζωντανών κυττάρων μετρήθηκε με έναν αναγνώστη μικροπλάκας χρησιμοποιώντας την κυτταρική Μετρώντας Kit-8 (CCK8) (Dojindo Molecular Technologies, Inc, η οποία βασίζεται στην δραστικότητα αφυδρογονάσης σε βιώσιμα κύτταρα). Εν συντομία, το διάλυμα CCK8 προστέθηκε στο κατεργασμένο κύτταρο καλλιέργειας, επωάστηκαν για 2-4 ώρες, και η απορρόφηση τους σε μήκος κύματος 450 nm διαβάζεται από έναν αναγνώστη μικροπλάκας. Η απορρόφηση στα 450 nm συσχετίστηκε με το ζωντανό αριθμό κυττάρων που υπάρχουν στο φρεάτιο. Η δοκιμασία FLICA διεξήχθη με Spns2-EGFP κύτταρα Α549 πλασμίδιο-μορφομετατρέπονται χρησιμοποιώντας αναστολέα σουλφοροδαμίνης-επισημασμένο φθορομεθυλ κετόνη πεπτίδιο (κόκκινο) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με τα πλασμίδια Spns2-EGFP, το αντιδραστήριο FLICA προστέθηκε στο μέσο και τα κύτταρα επωάζονται για 1 ώρα στους 37 ° C υπό 5% CO

2. Τα κύτταρα πλύθηκαν μια φορά με διάλυμα έκπλυσης και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με 4%

σ

-formaldehyde σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό για περαιτέρω ανάλυση με μικροσκοπία.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.

Spns2 -ΟΡΡ επιμολυσμένα κύτταρα Α549 συλλέχθηκαν, στερεωμένο με 4% παραφορμαλδεΰδη, και ανοσο-επισημασμένο με Caspase 3 αντίσωμα που ακολουθείται από Alexa Fluor 555 δευτερογενές αντίσωμα. Τα επισημασμένα κύτταρα αναλύθηκαν με FACSCalibur Becton Dickinson 4-χρώμα αναλυτές εξοπλισμένο με 4 λέιζερ (BD Biosciences, San Jose, CA).

δοκιμασίες κυτταρικής μετανάστευσης.

μετανάστευση των κυττάρων μετρήθηκε με τραύμα δοκιμασίες επούλωσης όπως προγενέστερα είχαν δημοσιευθεί [42]. Εν συντομία, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με Spns2 siRNAs ή ομελέτα ελέγχου από λιποφεκταμίνης 2000. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 72 ώρες χρόνος στον οποίο είχαν γίνει συρροή. Ένα κενό των περίπου 400 μm δημιουργήθηκε από ένα ρύγχος πιπέτας. Το πλάτος του διακένου μετρήθηκε σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Για τη θεραπεία Ski-Ι, 10 μΜ Ski-Ι συμπληρώθηκε 24 ώρες μετά siRNA επιμόλυνση. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί άλλες 48 ώρες και στη συνέχεια προσδιορισμός που εκτελείται.

μέτρηση σφιγγολιπίδιο και S1 Ρ.

Κύτταρα μετεμβολιασμένα με Spns2 ή Spns2 siRNA αναπτύχθηκαν για 48 ώρες και στη συνέχεια συλλέχθηκαν και τα δύο κυτταρικών σφαιριδίων και των μέσων ενημέρωσης . Τα κυτταρικά ιζήματα πλύθηκαν τρεις φορές με ψυχρό PBS. Τα μέσα καλλιέργειας φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά στους 4 ° C για να απομακρυνθεί επιπλέοντα κύτταρα και τα κυτταρικά υπολείμματα. επίπεδα S1P στα κύτταρα και μέσα καλλιέργειας μετρήθηκαν στο Lipidomics Πυρήνα του Ιατρικού Πανεπιστημίου της Νότιας Καρολίνας (υπό την επίβλεψη του Δρ Jacek Bielawski) σύμφωνα με τα δημοσιευμένα πρωτόκολλα για ένα τριπλό φασματόμετρο μάζας ThermoFisher TSQ Quantum, που λειτουργούν σε ένα έλεγχος πολλαπλής αντίδρασης (MRM) σήμα θετικού ιοντισμού, χρησιμοποιώντας τροποποιημένη εκδοχή [43]. Εν συντομία, κυτταρικά ιζήματα ή μέσων που αντιστοιχεί σε περίπου 2-3 ​​× 10

6 κύτταρα, εμπλουτισμένα με τα εσωτερικά πρότυπα (ISS: C

17 βάσεων D-ερυθρο-σφιγγοσίνης (17CSph), C

17 σφιγγοσίνης -1-φωσφορικού (17CSph-1P), Ν-παλμιτοϋλ-D-ερυθρο-C

13 σφιγγοσίνη (13C16-Cer) και δεκαεπτανοϋλίου-D-ερυθρο-σφιγγοσίνης (C17-Cer)), και εκχυλίζεται με οξικό αιθυλεστέρα /ισο-προπανόλη /ύδωρ (ν 60/30/10 ν /) σύστημα διαλύτη. Μετά την εξάτμιση και την ανασύσταση σε 100 μλ δείγματα μεθανόλης ενέθηκαν στην ΗΡ1100 /σύστημα TSQ Quantum LC /MS και κλίση εκλούεται από τη BDS Hypersil C8, 150 χ 3,2 mm, που 3 μm στήλη μεγέθους σωματιδίων, με 1,0 mM μυρμηκικό μεθανολικό αμμώνιο /2 mM υδατικού μυρμηκικού αμμωνίου σύστημα κινητής φάσης. Οι κορυφές που αντιστοιχούν στους αναλύτες στόχου και εσωτερικά πρότυπα συλλέχθηκαν και επεξεργασία χρησιμοποιώντας το λογισμικό σύστημα Xcalibur. Ποσοτική ανάλυση βασίστηκε στις καμπύλες βαθμονόμησης που παράγονται από καρφώσει μια τεχνητή μήτρα με τις γνωστές ποσότητες των συνθετικών προτύπων αναλύτη στόχο και ένα ίσο ποσό των εσωτερικών προτύπων (ISS). Ο αναλύτης στόχος /IS αναλογίες κορυφής περιοχές παρίστανται γραφικώς έναντι συγκέντρωσης αναλύτη. Ο αναλύτης στόχος /IS αναλογίες περιοχής κορυφής από τα δείγματα παρομοίως κανονικοποιήθηκαν προς τις αντίστοιχες ISS τους και σε σύγκριση με τις καμπύλες βαθμονόμησης, χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο γραμμικής παλινδρόμησης. Άλλες σφιγγολιπίδια, όπως κεραμίδια και σφιγγοσίνη, προσδιορίστηκαν επίσης.

Στατιστικά.

Μέσα και οι τυπικές αποκλίσεις υπολογίστηκαν από το Microsoft Excel. Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας ένας τρόπος ANOVA και τεστ Tukey post hoc ή ANOVA επαναλαμβανόμενης μέτρησης με GraphPad Prism. P & lt? 0,05 θεωρείται σημαντική κύτταρα

Αποτελέσματα

έκφραση έκτοπη Spns2 προκαλεί κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα NSCLC

Για να μελετήσουμε τη λειτουργία Spns2 σε LC, χρησιμοποιήσαμε NSCLC.. Επιχειρήσαμε να δημιουργήσει πρώτα ένα σταθερό εκφράζει Α549 κυτταρική γραμμή Spns2-EGFP, αλλά καμία τέτοια γραμμή ελήφθη (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι, επικεντρωθήκαμε σε παροδική έκφραση της Spns2. ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας αντι-ΟΡΡ αντίσωμα έδειξε ότι Spns2 εκφράστηκε ως πρωτεΐνη σύντηξης ~84 kD (58 kD + 26 kD? βέλος, Σχήμα 1Β.). Για να εξασφαλιστεί ότι η έκτοπη εκφράζεται Spns2 ήταν λειτουργική, μετρήσαμε εάν μεταφέρονται S1P. δεδομένα Lipidomics έδειξαν ότι το επίπεδο S1P στο μέσο καλλιέργειας αυξήθηκε κατά 5,6 ± 0,55 φορές (Σχ. 1 C), σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [29], [31], [32], [33], [34] και επιβεβαιώνει ότι η επιμολυσμένα Spns2 ήταν πλήρως λειτουργικό. Είναι ενδιαφέρον, εξωκυτταρικά επίπεδα του σφιγγοσίνης (Sph) και διϋδροσφιγγοζίνη (dhsph) επίσης αυξήθηκε κατά 1,5 και 2,8 φορές, αντίστοιχα (Εικ. 1 C), πράγμα που σημαίνει ότι θα μπορούσε να Spns2 μεταφέρουν αυτά τα δύο σφιγγολιπίδια, καθώς και. Διαφορετικά είδη κηραμιδίου δοκιμάστηκαν, αλλά κανένας δεν εμφάνισε μια σημαντική διαφορά σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικ. S1 Α).

Στη συνέχεια ερευνήσαμε τις κυτταρικές λειτουργίες των Spns2 σε κύτταρα Α549. απεικόνιση ζωντανών κυττάρων έδειξε ότι τα κύτταρα Spns2 πέρασε από δραματικές μορφολογικές αλλαγές και αποσπάστηκαν από τα τρυβλία κυτταρικής καλλιέργειας (βέλη στο Σχ. 1D), γεγονός που υποδηλώνει αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Έτσι ανοσο-επισημασμένου των κυττάρων με ένα αντίσωμα ανίχνευσης ενεργοποιημένη (διασπάται) κασπάσης 3 (Casp3) (Σχ. 1Ε). Διπλή τυφλή ποσοτική ανάλυση δείχνει ότι το 34,2 ± 9% των θετικών κυττάρων Spns2 ήταν Casp3 θετικά (σχ. 1 Ε και 2Α). Αυτή η επαγωγή Casp3 επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κηλίδος Western και κυτταρομετρίας ροής? και μπλοκάρεται από ένα τηγάνι αναστολέα της κασπάσης Z-VAD (Εικ. 2Β, S1B και S1c). Επαγωγή Casp3 επανελήφθη με έκφραση του ΗΑ-Spns2 οποίο έχει μικρότερη ετικέτα (δεν απεικονίζεται). Σύμφωνα με Casp 3 ενεργοποίηση, το γονίδιο anti-Survivin απόπτωση ήταν σημαντικά μειωμένη (Εικ. 2Β) [36], [44]. Επαγωγής απόπτωσης παράγοντα (ΟΕΕ) και διασπάται LC3B μετρήθηκαν επίσης, αλλά καμία αυξήθηκαν κατά έκφραση Spns2 (Εικ. 2Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι Spns2 δεν επάγει κασπάσης-ανεξάρτητη απόπτωση ή αυτοφαγία.

(Α), Ποσοτικοποίηση του Casp3 θετικών κυττάρων φαίνεται στο D. οχήματος (pEGFP) επιμολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος (Con). Ν & gt? 100 κύτταρα μετρήθηκαν από τρία ξεχωριστά πειράματα. (Β), στύπωμα Western αναλύσεις για δείκτες κυτταρικού θανάτου. Α549 κύτταρα παροδικά διαμολυσμένα όπως στο κυτταρολύματα Α συλλέχθηκαν και στυπώθηκαν με τα αντισώματα υποδεικνύονται. Όχημα (pEGFP) επιμολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως ένας αρνητικός έλεγχος και ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (C), Εκπρόσωπος εικόνες της FLICA χρώση των Spns2 θετικών κυττάρων. Ζωντανά κύτταρα Α549 επωάστηκαν με FLICA για 1 ώρα 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και μικρογραφική εικόνες που λαμβάνονται. μπαρ κλίμακα είναι 10 μm. (D), Ποσοτικοποίηση των FLICA θετικών κυττάρων φαίνεται στο C. Ν & gt? 100 κύτταρα από τρία ξεχωριστά πειράματα μετρήθηκαν διπλά τυφλά. (Ε), η έκφραση Spns2 μειωμένος αριθμού βιώσιμων κυττάρων σε κύτταρα Α549. Κύτταρα διαμολύνθηκαν όπως στο Α 48 ώρες αργότερα, ο σχετικός αριθμός ζωντανών κυττάρων μετρήθηκε με ένα κιτ CCK-8 χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας. Ν = 4. (F), Spns2 έκφραση του μειωμένου αριθμού κυττάρων σε Η1299 κύτταρα. Ζήστε τον αριθμό των κυττάρων Η1299 μετρήθηκαν όπως στο Ι Ν = 4. Στο Β, Ε, Η, Θ, Ι, μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SD, *, p & lt? 0,05, **, p & lt? 0,01

Η

για να επικυρώσετε περαιτέρω ότι Spns2 επαγόμενη απόπτωση, πραγματοποιήσαμε FLICA (φθορισμού επισημασμένο αναστολέας του τηγανιού κασπάσες) δοκιμασίες σε ζωντανά κύτταρα. Το Σχήμα 2C δείχνει τυπικές μικρογραφική εικόνες της δοκιμασίας. Διπλή τυφλή ποσοτικοποίησης έδειξε ότι το 70 ± 15,9% του Spns2 θετικών κυττάρων ήταν θετικά FLICA (Εικ. 2D).

Ένα τελικό αποτέλεσμα του κυτταρικού θανάτου είναι η μείωση της συνολικής αριθμού βιώσιμων κυττάρων. καταμέτρηση Προτάσεις κύτταρο χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών (CCK-8) έδειξε ότι η έκφραση Spns2 είχε ως αποτέλεσμα μείωση 59 ± 1.2% των βιώσιμων κυττάρων Α549 σε 48 ώρες (Σχ. 2Ε). Αυτά τα αποτελέσματα αναπαράχθηκαν σε μία άλλη κυτταρική σειρά NSCLC Η1299 (Σχ. 2F).

Στο σύνολό τους, τα ανωτέρω δεδομένα αποδεικνύουν ότι η έκτοπη έκφραση Spns2 επάγει κασπάσης-εξαρτώμενη απόπτωση σε κύτταρα NSCLC.

έκφραση Spns2 ρυθμίζει το μεταβολισμό S1P

Σας έδειξε ότι η έκφραση Spns2 μεταφέρονται S1P έξω από τα κύτταρα (Εικ. 1Γ). Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κυτταρικά επίπεδα του S1P, σφιγγοσίνης, και διάφορα είδη κεραμίδιο δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά με έκφραση Spns2, εκτός dhSph και μακράς αλύσου κεραμίδιο C20:1were αυξήθηκε κατά περίπου 2,0, και 1,4 φορές, αντίστοιχα (Σχ. 3Α και δεν παρουσιάζονται).

(Α), η έκφραση Spns2 δεν μετέβαλε το ενδοκυτταρικό επίπεδο της S1P. Α549 κύτταρα αλλάχθηκαν σε μέσο με απολιπιδωμένο FBS 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Ένα άλλο 24 ώρες αργότερα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν και τα επίπεδα των λιπιδίων αναλύθηκε με lipidomics. (Β), η έκφραση Spns2 οδήγησε σε οξεία αύξηση του SphK1 σε κύτταρα Α549. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν, mRNA συλλέγονται, και σε πραγματικό χρόνο qRT-PCR εκτελείται για να μετρήσει SphK1. (C), η έκφραση Spns2 οδήγησε σε οξεία αύξηση του SphK2. Α549 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο Β, εκτός του ότι qRT-PCR εκτελείται για να μετρήσει SphK2. (D), η έκφραση Spns2 οδήγησε σε μείωση του SGPP1 σε κύτταρα Α549. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο Β, εκτός του ότι qRT-PCR εκτελείται για να μετρήσει SGPP1. (Ε), η έκφραση Spns2 μειωμένη υποδοχείς S1P. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο Β, εκτός του ότι qRT-PCR εκτελείται για να μετρήσει S1P1, S1P2, S1P3 και. Ν = 3. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SD. *, P & lt? 0,05, **, p & lt? 0,01. Τα δεδομένα κανονικοποιούνται σε GAPDH.

Η

Για να οριοθετηθούν υποκείμενο μεταβολικό μηχανισμό του, αναλύσαμε τα βασικά ένζυμα στο σφιγγολιπίδιο μεταβολισμού από ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qPCR). Τόσο SphK1 και SphK2 mRNA ήταν σημαντικά αυξημένα εντός 24 ωρών από Spns2 επιμόλυνση, και επανήλθε σε φυσιολογικά επίπεδα κατά 48 ώρες (Σχ. 3Β και 3C). Αύξηση της έκφρασης SphK2 επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κηλίδος western, εκτός από το ότι το επίπεδο της πρωτεΐνης του παρέμεινε σε σχετικά υψηλό επίπεδο, ακόμη και στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση Spns2 (Εικ. S1D). Αυτό είναι λογικό δεδομένου ότι οι πρωτεΐνες συνήθως να διαρκέσει περισσότερο χρόνο για να υποβαθμίσει από mRNA. S1P φωσφατάση 1 (SGPP1), το ένζυμο που αποφωσφορυλιώνει S1P, μειώθηκε δραματικά στο 8,5% του επιπέδου ελέγχου μέσα σε 24 ώρες, και παρέμεινε σε χαμηλά επίπεδα μέχρι 48 ώρες μετά την επιμόλυνση (Εικ. 3D και S1E). SGPP2 και S1P λυάση 1 (SGPL1) δεν επηρεάστηκαν σημαντικά από την έκφραση Spns2 (Σχ. S1E-S1F). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα κύτταρα μεταβάλλουν τα επίπεδα έκφρασης των πολλαπλών ένζυμα κλειδιά για να αντισταθμίσει S1P εξαγωγή διαμεσολαβείται από την έκφραση Spns2, συμπεριλαμβανομένης της αναβάθμισης της γενιάς (αύξηση SphKs) καθώς επίσης και διακοπή μετατροπή (μείωση SGPP1).

έκφραση Spns2 οδηγεί σε μείωση των υποδοχέων S1P και πολλαπλές οδούς προ-επιβίωσης

Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, S1P είναι γενικά ένας παράγοντας προ-επιβίωσης. Για να κατανοήσουμε γιατί η απόπτωση που επάγεται όταν το εξωκυτταρικό S1P αυξήθηκε μετά Spns2 επιμόλυνση, ανιχνεύσαμε τα επίπεδα των υποδοχέων S1P και διαπιστώθηκε ότι τα επίπεδα του mRNA των υποδοχέων S1P1, S1P2, και S1P3 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω μετά την έκφραση Spns2 (Σχ. 3Ε ).

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω αυτή την παρατήρηση, προσδιορίσαμε το κύτταρο μονοπάτια προς τα κάτω από αυτούς τους υποδοχείς S1P σηματοδότησης. Spns2 έκφραση οδήγησε σε δραστικές μειώσεις της φωσφο-GSK-3β (pGSK-3β, σερίνη 9) και στις δύο Α549 και κύτταρα Η1299 (Σχ. 4Α και 4Β). Για την επικύρωση αυτής της παρατήρησης, προσδιορίσαμε ανάντη ενεργοποιητή GSK-3β του Akt [35], [45]. Τα Σχήματα 4Α και 4Β έδειξαν ότι τα επίπεδα pAkt μειώθηκαν κατά έκφραση Spns2, υποδεικνύοντας ότι Spns2 βλάπτει την ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι. Jak /Stat3 μονοπάτι, ένα άλλο σηματοδοτικό μονοπάτι προς τα κάτω των υποδοχέων S1P, παίζει κρίσιμο ρόλο στην κυτταρική επιβίωση, τη μετανάστευση και ανοσολογική απόκριση [46], [47]. Έχουμε καθορίζεται εάν Spns2 επηρεάζει αυτή την οδό μετρώντας τη δραστηριότητα Stat3. Οι αναλύσεις στυπώματος Western έδειξε ότι οι φωσφο-Stat3 επίπεδα (pStat3) έχουν μειωθεί σε μεγάλο βαθμό με έκφραση Spns2 σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 4Α και 4Β). Casp3 ενεργοποιήθηκε με Spns2 σε Η1299 κύτταρα τα οποία είναι συνεπής με τα δεδομένα που ελήφθησαν από Α549 κύτταρα (Σχ. 4Β). Στη συνέχεια, ανοσο-επισημασμένο Spns2-EGFP επιμολυσμένα κύτταρα με αντισώματα έναντι pGSK-3β και pStat3 και διαπίστωσε ότι τα σήματα φθορισμού τους μειώθηκαν σημαντικά σε όλα τα κύτταρα με τον ίδιο καλλιέργεια, είτε Spns2 θετική ή όχι, σε σύγκριση με τον έλεγχο της GFP επιμολυσμένα κύτταρα ( Con) (Σχ. 4C και 4D). Αυτό είναι πιθανό να οφείλεται στην εξωκυτταρική συσσώρευση σφιγγολιπιδίων, όπως Sph. Πιο ενδιαφέρον, το σήμα φθορισμού για pGSK-3β μειώθηκε περαιτέρω σε κύτταρα Spns2-GFP από μη επιμολυσμένα κύτταρα (βέλη στο Σχ. 4C). Τα στοιχεία αυτά επιβεβαιώνουν ότι αυτά τα μονοπάτια προ-επιβίωσης σε κίνδυνο όταν Spns2 ήταν εκτοπικά εκφράζεται.

(Α), κηλίδα Western αναλύσεις σε δείγματα Α549 κυττάρων. Α549 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά και λύματα συλλέγονται 24 και 48 ώρες αργότερα και γίνεται αποτύπωμα με τα αντισώματα υποδεικνύονται. pGSK, φωσφο-GSK-3β? tGSK, συνολικής GSK-3β? pAkt, φωσφο-Akt? pStat3, φωσφο-Stat3? tStat3, συνολικής Stat3? Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β), κηλίδα Western αναλύσεις σε δείγματα κυττάρων Η1299. κύτταρα Η1299 επιμολύνθηκαν παροδικά όπως αναφέρθηκε νωρίτερα. Κυτταρολύματα συλλέχθηκαν 48 ώρες αργότερα και γίνεται αποτύπωμα με τα αντισώματα υποδεικνύονται. (C), Ομοεστιακή λέιζερ εικόνες σάρωσης των κυττάρων χρωματίστηκαν για pGSK-3β. Α549 κύτταρα επιμολυσμένα με Spns2-GFP και καλυπτρίδες συλλέχθηκαν μετά από 48 ώρες. (D), Ομοεστιακή εικόνες σάρωσης με λέιζερ των κυττάρων Α549 χρωματίστηκαν για pStat3. Τα κύτταρα παρασκευάστηκαν όπως στο C.

Η

Spns2 knockdown αυξήσεις ενδοκυτταρικού επίπεδο S1P

Τα ανωτέρω δεδομένα αποδεικνύουν ότι Spns2 ρυθμίζει το μεταβολισμό S1P και έκτοπη έκφραση της οδηγεί σε απόπτωση σε κύτταρα NSCLC. Για την περαιτέρω τεμαχίσει ρόλο Spns2 σε LC, έχουμε γκρέμισε Spns2 από siRNA. Εικόνες 5Α και 5Β δείχνουν ότι siRNA Spns2i-Α σημαντικά μειωμένο επίπεδο Spns2 mRNA κατά περισσότερο από 80%. Έτσι χρησιμοποιήσαμε Spns2i-Α σε περαιτέρω μελέτες μας. Κωδικοποιημένα RNA (SCR) και Spns2i-C (εφεξής ΕΣΠ), η οποία δεν καταστέλλει την έκφραση Spns2, χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες.

(Α), (Β), Χαρακτηρισμός Spns2 siRNAs. 20 ηΜ siRNA Spns2 Α, Β, και Γ επιμολύνθηκαν ξεχωριστά σε κύτταρα Α549. 48 ώρες αργότερα το ολικό RNA συλλέχθηκαν και RT-PCR (Α) και qRT-PCR (Β) εκτελούνται για να μετρηθεί Spns2. Κωδικοποιημένα RNA (SCR) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. (C), Spns2 νοκ ντάουν από Spns2i-ένα σημαντικά αυξημένο επίπεδο ενδοκυτταρική S1P. Α549 κύτταρα μορφομετατράπηκαν με Spns2 siRNA όπως στο Α, 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση, μέσα κυτταρικής καλλιέργειας αλλάχθηκαν σε μέσα με απολιπιδωμένο FBS. Ένα άλλο 24 ώρες αργότερα, σφαιρίδια κυττάρου συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με S1 Ρ lipidomics. Ν = 3. (D), Spns2 knockdown μεταβάλλει τα επίπεδα SGPP1, SGPP2, και SGPL1. Α549 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο Α, εκτός qRT-PCR διεξήχθη για να μετρηθεί SGPP1, SGPP2, και SGPL1. Ν = 4. δεδομένων qPCR ήταν κανονικοποιούνται σε GAPDH.

Η

Για να χαρακτηρίζουν το αποτέλεσμα του Spns2 νοκ ντάουν για σφιγγολιπίδιο μεταβολισμό στα κύτταρα NSCLC, προσδιορίσαμε τα επίπεδα των σφιγγολιπιδίων και των σχετικών ενζύμων τους. δεδομένα Lipidomics δείχνει ότι Spns2 νοκ ντάουν από Spns2i-Α αύξησε σημαντικά το ενδοκυτταρικό επίπεδο S1P, ενώ μειωμένο επίπεδο Sph, σε κύτταρα Α549 σε σύγκριση με SCR και SPC (Εικ. 5C και S2A). Τα επίπεδα των διαφορετικών ειδών κεραμιδιού δεν μεταβλήθηκαν με Spns2 knockdown (Εικ. S2B). Αυτό είναι σύμφωνο με μια προηγούμενη αναφορά ότι η ανεπάρκεια S1P σε ποντικούς οδηγεί σε αυξημένο επίπεδο S1P στον πνεύμονα [33]. Προκειμένου να αναλυθεί ο μηχανισμός της αυξημένη κυτταρική S1P, μετρήσαμε τα επίπεδα κύρια ένζυμα στο μεταβολισμό S1P. Σχήμα 5D δείχνει ότι τα επίπεδα των πολλαπλών ενζύμων μεταβλήθηκαν μετά Spns2 νοκ ντάουν από Spns2i-Α: SGPP1 αυξήθηκε σημαντικά κατά 8 φορές? SGPP2 μειώθηκε κατά -50%? και SGPL1 μειώθηκε κατά περισσότερο από 80%. Αύξηση SGPP1 θα επιταχύνει τη μετατροπή S1 Ρ για τη μείωση κυτταρικό επίπεδο S1P, η οποία θα αντισταθμίζεται από μείωση της SGPP2 και την αύξηση της SGPL1. Ωστόσο, SGPL1 ήταν πολύ μεγαλύτερη αφθονία εκφράζεται από SGPP1 σε κύτταρα Α549 (22 φορές υψηλότερη) (Σχ. 5D). Αυτό εξηγεί γιατί S1P αυξήθηκε μετά Spns2 νοκ ντάουν. Άλλα ένζυμα, όπως SphKs, δεν επηρεάστηκαν σημαντικά από Spns2 νοκ ντάουν (Εικ. S2C και S2D).

Spns2 νοκ ντάουν ενισχύει το ρόλο των κυττάρων NSCLC μετανάστευσης

Λειτουργικά, εξετάσαμε πρώτα Spns2 νοκ ντάουν για κυτταρική επιβίωση /πολλαπλασιασμός αφού έκφραση έκτοπη Spns2 επαγόμενη απόπτωση. Ζωντανά δοκιμασίες μέτρησης κυττάρων βρήκαν ότι Spns2 knockdown με Spns2i-Α δεν είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική αύξηση του αριθμού των βιώσιμων κυττάρων σε είτε Α549 ή κύτταρα Η1299 (δεν φαίνεται), υποδεικνύοντας ότι Spns2 κάτω ρύθμιση δεν επηρεάζει την επιβίωση των κυττάρων ή τον πολλαπλασιασμό σε NSCLC κύτταρα.

στη συνέχεια εξέτασαν το ρόλο των Spns2 νοκ ντάουν για τη μετανάστευση των κυττάρων από το ενδοκυτταρικό S1P είναι απαραίτητη για τη μετανάστευση των κυττάρων των πνευμόνων και την κινητικότητα [48]. Επούλωση δοκιμασίες μηδέν επούλωση διεξήχθησαν με τα δύο Α549 κύτταρα και κύτταρα Η1299. Τετρακόσια μm κενά δημιουργήθηκαν σε συρρέουσες καλλιέργειες και μικρογραφική εικόνων που λαμβάνονται σε 8 και 24 ώρες μετά το ξύσιμο. Το Σχήμα 6Α δείχνει χαρακτηριστικές εικόνες της δοκιμασίας σε κύτταρα Α549. Διπλό τυφλωθεί ποσοτικές αναλύσεις έδειξαν ότι τα κύτταρα Α549 ελέγχου (SCR) μετανάστευσε σε ταχύτητα 8,0 ± 1,5 μm /h και 5.4 ± 0.8 μm /h για την περίοδο από 8 και 24 ωρών, αντίστοιχα (κύτταρα SPC έχουν παρόμοια αποτελέσματα) (Σχ. 6Β). Ωστόσο, τα κύτταρα knockdown Spns2 μετανάστευσαν σε ταχύτητα 14,9 ± 3,1 μm /h και 10,0 ± 0,3 μm /h στην ίδια χρονική περίοδο, που αντιπροσωπεύει μια διπλάσια αύξηση 1,86 και 1,85, αντίστοιχα (Εικ. 6Β). Αυτή η παρατήρηση επαναλήφθηκε σε Η1299 κύτταρα (Σχ. 6C).