Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο καρκίνος εξαπλωθεί σε άλλα όργανα είναι η κύρια αιτία θανάτου των ογκολογικών ασθενών. Η μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων από πρωτογενή όγκο είναι το κρίσιμο βήμα στη σύνθετη διαδικασία της μετάστασης, ως εκ τούτου εμποδίζοντας τη διαδικασία αυτή είναι σήμερα η κύρια στρατηγική θεραπείας. αναστολείς Μετάσταση προέρχονται από φυσικά προϊόντα, όπως, migrastatin, είναι πολύ ελπιδοφόρα αντικαρκινικούς παράγοντες. Έτσι, ο σκοπός της μελέτης μας ήταν να διερευνηθεί η επίδραση της έξι migrastatin αναλόγων (MGSTA-1 έως 6) για τη μετανάστευση και την εισβολή του σκύλου μαστικού αδενοκαρκινώματος κυτταρικές σειρές που απομονώθηκαν από πρωτογενείς όγκους και μεταστάσεις τους στους πνεύμονες. Canine όγκων του μαστού αποτελούν ένα πολύτιμο εργαλείο για τη μελέτη των πολλαπλών πτυχή του ανθρώπινου καρκίνου

Αποτελέσματα

Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι δύο από τους έξι πλήρως συνθετικών αναλόγων της migrastatin:. MGSTA-5 και MGSTA-6 ισχυρά αναστολείς του σκύλου μαστικών καρκινικών κυττάρων μετανάστευση και εισβολή. Αυτά τα δεδομένα ελήφθησαν με τη χρήση της πληγής δοκιμή επούλωσης, όπως επίσης και προσδιορισμούς μετανάστευσης και της εισβολής trans-καλά. Επιπλέον, η θεραπεία των καρκινικών κυττάρων με την πιο αποτελεσματική ένωση (MGSTA-6) διαταραχθεί πρόσδεση μεταξύ νηματοειδείς F-ακτίνη και fascin1. Οι αναλύσεις ομοεστιακό μικροσκόπιο αποκάλυψαν ότι η θεραπεία με MGSTA-6 αύξησε την παρουσία του αδέσμευτου fascin1 και μειωμένη συν-εντοπισμό των F-ακτίνης και fascin1 σε κυνικός καρκινικά κύτταρα. Το πιο πιθανό, νημάτια ακτίνης δεν ήταν εγκάρσια συνδεδεμένο με fascin1 και δεν δημιουργούν την τυπική αρχιτεκτονική filopodial νηματίων ακτίνης σε απόκριση προς τη δραστηριότητα της MGSTA-6. Έτσι, η χορήγηση του MGSTA-6 αποτελέσματα σε μειωμένο σχηματισμό προεξοχών filopodia και ίνες στρες σε κυνικός μαστικά καρκινικά κύτταρα, προκαλώντας την αναστολή της μετανάστευσης καρκίνου και εισβολή.

Συμπέρασμα

Δύο συνθετικά ανάλογα migrastatin (MGSTA -5 και MGSTA-6) έχουν αποδειχθεί ότι είναι πολλά υποσχόμενες ενώσεις για την αναστολή της μετάστασης του καρκίνου. Μπορούν να έχουν ευεργετικά θεραπευτικά αποτελέσματα στη θεραπεία του καρκίνου σε σκύλους, ιδιαίτερα σε συνδυασμό με άλλα αντικαρκινικά φάρμακα. Ωστόσο, περαιτέρω

στο

vivo είναι

μελέτες που απαιτούνται για την επαλήθευση αυτής της υπόθεσης

Παράθεση:. Majchrzak K, Lo Re D, Gajewska Μ, Bulkowska M, Homa Α, Παβλόφσκι Κ, et al. (2013) Migrastatin Ανάλογα Αναστολής σκύλου καρκίνο του μαστικού μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή. PLoS ONE 8 (10): e76789. doi: 10.1371 /journal.pone.0076789

Επιμέλεια: Waldemar Debinski, Πανεπιστημίου Wake Forest, Ιατρική Σχολή, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 22, 2013? Αποδεκτές: 4 του Σεπτέμβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 8 Οκτωβρίου 2013

Copyright: © 2013 Majchrzak et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τον αριθμό επιχορήγηση Ν N308 574.940 από το Υπουργείο Επιστημών και Τριτοβάθμιας Εκπαίδευσης της Πολωνίας και Επιστημών Ίδρυμα της Ιρλανδίας (αριθμός επιχορήγηση 07 /IN.1 /B966). Η έρευνα που οδηγεί σε αυτά τα αποτελέσματα έχει λάβει χρηματοδότηση από το Πρόγραμμα Άνθρωποι (Δράσεις Marie Curie) του έβδομου προγράμματος-πλαισίου της Ευρωπαϊκής Ένωσης (FP7 /2007-2013) στο πλαίσιο ΡΕΑ αριθμό συμφωνίας επιχορήγησης PIEF-GA-2011 με 299.042. Το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από CM1106 COST Action. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η μετάσταση είναι η αιτία των περισσότερων θανάτων από καρκίνο [1,2]. Αν και είναι ερευνηθεί εκτενώς, εξακολουθεί να παραμένει ένα από τα πιο ανεξιχνίαστες πτυχές της νόσου. Κακή αποτελέσματα τρέχουσες θεραπείες, ιδίως κακή πρόγνωση για τους ασθενείς σε προχωρημένα στάδια των συμπαγών όγκων λόγω μετάστασης ενθαρρύνει ερευνητές σε όλο τον κόσμο για να βρει νέα φάρμακα που θα μπορούσαν να αναστείλουν μεταστατικό καταρράκτη. Μια πολλά υποσχόμενη παράγοντας είναι το φυσικό migrastatin προϊόν: ένα νέο αντι-μεταστατική ένωση της μικροβιακής προέλευσης. Είναι ένα φυσικό προϊόν μακρολακτόνη αρχικά απομονώθηκε από

Streptomyces

sp. MK929-43F1 από Imoto et al. το 2000 [3-5] και αργότερα από

Streptomyces platensis από

Licari et al. το 2002 [6] ως αναστολέας της μετανάστευσης των κυττάρων του όγκου. Λίγα χρόνια αργότερα, η πρώτη συνολική χημική σύνθεση των migrastatin αναφέρθηκε [7,8]. Από τότε, έχουν αρκετές πιο αποτελεσματική ανάλογα migrastatin έχουν συντεθεί και περιγραφεί ως ελπιδοφόρα αντι-μεταστατική φάρμακα [8-13]. Υπήρξαν προσπάθειες για να δημιουργήσει περαιτέρω ανάλογα για μελέτες δομής-δραστικότητας [14-17]. Σημαντικά, απλούστερη ανάλογα migrastatin, όπως μακρολίδης MGSTA-8 (Σχήμα 1), έχουν δείξει δραστηριότητα ~ 1000 φορές περισσότερο δραστική από μόνη της migrastatin σε προσδιορισμούς μετανάστευσης κυττάρων όγκου

in vitro

[9]. Περικομμένο ανάλογα όπως MGSTA-4 και το macroketone MGSTA-5 και MGSTA-8 αναστέλλουν τη μετάσταση των εξαιρετικά μεταστατικών καρκινικών κυττάρων σε μοντέλα ποντικών [10,12]. Ωστόσο, η αναστολή του κυτταρικού μεταναστευτική ικανότητα εξαρτάται σημαντικά από τη δομή των ενώσεων και μερικά μη κυκλικό ανάλογά του επιδεικνύουν δραστηριότητα [11,14,15].

Η

Ο μοριακός μηχανισμός με τον οποίο migrastatin επηρεάζει τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολής δεν έχει πλήρως ανακαλυφθεί, αν και έχει προταθεί για να κατευθύνουν fascin1, η πρωτεΐνη ακτίνη ομαδοποίηση [18]. Migrastatin μπορεί να δεσμεύονται σε μία από τις θέσεις πρόσδεσης ακτίνης πρόληψη ακτίνη σταυροσύνδεση των ινών και τον σχηματισμό filopodia [18]. Υπερέκφραση του

fascin1

στα καρκινικά κύτταρα έχει προηγουμένως συνδεθεί με κλινικά επιθετικό χαρακτήρα του όγκου, η κακή πρόγνωση και μείωση του χρόνου επιβίωσης ελεύθερης νόσου [18-20].

προηγούμενες μελέτες μας έχουν δείξει πάνω ρύθμιση του

fascin

σε ιδιαίτερα επεμβατική κυνικός μαστικού καρκινικές κυτταρικές γραμμές [21]. Έτσι, τα χρησιμοποιούσαν ως μοντέλο για την έρευνα φαρμάκων fascin-στόχευσης, όπως migrastatin. Ως εκ τούτου, εξετάσαμε ένα ρόλο έξι διαφόρων αναλόγων του migrastatin MGSTA-1 έως 6, συμπεριλαμβανομένου του macroketone Danishefsky (MGSTA-5) και μακρολακτόνη (MGSTA-4), σε κυνικός μαστικού εισβολή των καρκινικών κυττάρων, η μετανάστευση και αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού.

Οι σκύλου όγκων του μαστού είναι ελκυστικό και χρήσιμο μοντέλο για τη μελέτη του ανθρώπινου καρκίνου του μαστού, επειδή συλλάβει την ουσία των ανθρώπινων καρκίνων του μαστού, σε αντίθεση με τα περισσότερα γενετικά τροποποιημένα ή μοντέλα ξενομοσχεύματος τρωκτικών. Πρώτον, τα σκυλιά μοιράζονται το ίδιο περιβάλλον ως άνθρωποι, έτσι εκτίθενται σε πολλές από τις ίδιες καρκινογόνες ουσίες. Δεύτερον, οι όγκοι σε σκύλους φυσικά και αυθόρμητα και έχουν πανομοιότυπο πορεία με εκείνη στον άνθρωπο. Πολυάριθμες κλινικές ομοιότητες αποδειχθεί μέχρι σήμερα, σχετικά με την ορμονική αιτιολογία των όγκων, ηλικία έναρξης, παράγοντες κινδύνου (π.χ. παχυσαρκία), κλινική έκβαση, παράγοντες πρόγνωση (π.χ. το μέγεθος του όγκου, των λεμφαδένων διεισδυτικότητα και κλινικό στάδιο) (για ανασκόπηση βλέπε: [ ,,,0],22-24]?). Επιπλέον, πολλές ισχυρές και σημαντικές ομοιότητες σε μοριακό επίπεδο έχουν δειχθεί στο γονιδίωμά ολόκληρη συγκριτικές μελέτες. Για παράδειγμα, μονοπάτια που σχετίζονται με την προώθηση του πολλαπλασιασμού ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε δύο είδη, και εκείνων που συνδέονται με την ανάπτυξη των κυττάρων, προσκόλληση μήτρας κυττάρου και κυτταρική επικοινωνία, οι κάτω-ρυθμίζονται [23]. Επιπλέον, η υπερέκφραση των υποδοχέων των στεροειδών, δείκτες πολλαπλασιασμού, επιδερμικό παράγοντα ανάπτυξης, γονιδιακές μεταλλάξεις ρ53 καταστολέα, μεταλλοπρωτεϊνάσες και κυκλοοξυγενάσες, βρέθηκε και στα δύο είδη, καθώς και φανταστικές ομολογία στις μεταβολές του καρκίνου που σχετίζονται με οδούς όπως η φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση ( ΡΙ3Κ) /μονοπατιού ΑΚΤ, KRAS, φωσφατάση και tensin ομόλογο (ΡΤΕΝ), Wnt-β-κατενίνης, και η ενεργοποιημένη από μιτογόνο πρωτεΐνη κινάση (ΜΑΡΚ) καταρράκτη [23,25]. Ως εκ τούτου, ο κυνικός μαστικό μοντέλο όγκου αποτελεί ένα πολύτιμο εργαλείο για Translational Medicine ιδιαίτερα για την αξιολόγηση και την ανάπτυξη νέων διαγνωστικών και προγνωστικών εφαρμογές, καθώς και θεραπευτικές στρατηγικές που θα ωφελήσει και τις δύο σκυλιά και οι ασθενείς ανθρώπινο καρκίνο [22-26].

Μέθοδοι

κυτταρική καλλιέργεια

Οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη αυτή έχει περιγραφεί στο παρελθόν δημοσίευσε την έρευνά μας [21,27]. Δύο κυτταρικές γραμμές αδενοκαρκινώματος απομονώθηκαν από τις σκύλου όγκων μαστού (CMT-W1 και CMT-W2) και δύο κυτταρικές σειρές απομονώθηκαν από μεταστάσεις πνεύμονα τους (ΟΜΤ-W1M και CMT-W2M). Οι κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 που περιέχει 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (FBS), 50 U /ml πενικιλλίνη, 50 μg /ml στρεπτομυκίνη και 2,5 μg /ml αμφοτερικίνη Β (αντιδραστήρια ελήφθησαν από την Sigma Aldrich Chemical Co., USA). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε φιάλες καλλιέργειας ιστού (Nunc ™, Denmark) σε μια ατμόσφαιρα 5% CO2 και 95% υγροποιημένο αέρα σε 37 ° C, και συνήθως υποκαλλιεργήθηκαν κάθε δεύτερη μέρα.

Migrastatin αναλόγων

Οι δομές δοκιμαστεί ανάλογα migrastatin (MGSTA-1 έως 6) παρουσιάζονται στο Σχήμα 1.

Σύνθεση των αναλόγων της migrastatin

Η ένωση MGSTA-4 και MGSTA-5 συντέθηκαν από 9 , όπως αναφέρεται στη βιβλιογραφία [9], ενώ οι ενώσεις MGSTA-1 προς 3 και MGSTA-6 παρασκευάστηκαν από 9 [9], όπως απεικονίζεται στο σχήμα 2. Έτσι εστεροποίηση 9 με 5-εξενοϊκό οξύ υπό συνθήκες Mitsunobu που ακολουθείται από μετάθεσης κλεισίματος δακτυλίου (RCM) έδωσε 10 και επακόλουθη απομάκρυνση της ομάδας TBS έδωσε MGSTA-1. Κατεργασία του 9 με τετραβρωμιούχο άνθρακα παρουσία του πολυμερούς που υποστηρίζονται τριφαινυλφωσφίνη σε διχλωρομεθάνιο έδωσε την αλλυλική βρωμίδιο 11 [9]. Μετέπειτα αντίδραση του β-κετοσουλφόνης 12 με την παρουσία DBU ακολουθούμενη από αναγωγική απομάκρυνση της ομάδας σουλφόνης έδωσε 13. κλεισίματος δακτυλίου μετάθεσης και την απομάκρυνση της ομάδας TBS έδωσε MGSTA-2. Η θειολακτόνη παρασκευάσθηκε από 14, η οποία ήταν κατ ‘αρχάς μετατρέπεται στο θειο οξύ 15 χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Lawesson [28]. Σχηματισμός του θειολακτίνης υπό Mitsunobu συνθήκες, RCM και απομάκρυνση TBS έδωσε MGSTA-3. Το TBS προστατευμένο macroketone 16 παρασκευάστηκε από 9 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9]. Ο σχηματισμός του TMS ενολαιθέρος επιτεύχθηκε σε ένα τοποεκλεκτικό τρόπο και επακόλουθη οξείδωση με Pd (OAc)

2 έδωσε το α, β-ακόρεστου macroketone 17. Τέλος, η απομάκρυνση της προστατευτικής ομάδας TBS έδωσε ακόρεστο macroketone MGSTA-6.

Αντιδραστήρια και συνθήκες: (α) 5-εξενοϊκό οξύ, Ph

3P, DIAD, PhCH

3, rt, 3Η, 69%? (Β) Grubbs 2

ου, PhCH

3, παλινδρόμηση, 25 λεπτά, 68%? (Γ) HF. Py, THF, θδ, 18 ώρες, 61%? (Δ) CBr

4, Ph

3P συνδεδεμένη με πολυμερές, CH

2Cl

2, rt, 50 λεπτά? (Ε) 12, ΟΒϋ, PhCH

3 στη συνέχεια 11, rt, 1,5 ώρες? (Στ) Na /Hg, MeOH, θδ, 3 ώρες, 51% σε τρία βήματα? (Ζ) Grubbs 2

ου, PhCH

3, παλινδρόμηση, 15 λεπτά, 99%? (H) HF. Py, THF, rt, 38Η, 84%? (I) αντιδραστήριο Lawesson, CH

2Cl

2, MW, 100 ° C, 10 λεπτά? (Ι) 9, Ph

3P, DIAD, PhCH

3, rt, 15 ώρες, 42%? (Ια) Grubbs 2

ου, PhCH

3, παλινδρόμηση, 15 λεπτά, 88%? (Ιβ) HF. Py, THF, θδ, 18 ώρες, 85%? (M) TMSCl, LHMDS, THF, 0 ° C, 2 ώρες? (Ιδ) Pd (OAc)

2, CH

3CN, rt, 3Η, 64% σε δύο στάδια? (O) HF. Py, THF, RT, 18 ώρες, 90%.

Η

δοκιμασία Κυτταρική βιωσιμότητα (ΜΤΤ-ανάλυση)

Η βιωσιμότητα των κυττάρων (μεταβολική δραστηριότητα των βιώσιμων κυττάρων) προσδιορίστηκε ποσοτικά με δοκιμασία ΜΤΤ. Τα κύτταρα σπάρθηκαν επί πλάκας 96-φρεατίων (Nunc Inc., Denmark) σε συγκέντρωση 1 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο. Όταν τα κύτταρα έφθασαν 60-70% συρροή, το μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο που περιείχε 10% FBS και έξι διάφορα migrastatin ανάλογα (MGSTA-1 έως 6) στις συγκεντρώσεις του: 1, 10 ή 100 μΜ. Οι καλλιέργειες επωάστηκαν για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με 0,5 mg ml τετραζολίου ΜΤΤ /άλατος αραιωμένο σε άνευ ερυθρού φαινόλης RPMI 1640 (Sigma Aldrich) για 4 ώρες στους 37 ° C. Για να ολοκληρωθεί η διαλυτοποίηση των κρυστάλλων φορμαζάνης, 100 μΐ DMSO (διμεθυλοσουλφοξείδιο, Sigma Aldrich) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση της απορρόφησης φωτομετρική στα 570 nm σε έναν αναγνώστη πολλαπλών φρεατίων πλάκα (άπειρη 200 PRO Tecan ™, TECAN, Ελβετία). Όλα τα δείγματα εξετάστηκαν εις τριπλούν, το κάθε πείραμα διεξήχθη τρεις φορές (η = 9).

Κυτταρική καλλιέργεια επί μεμβράνης ανασυσταθέν υπόγειο (Matrigel)

Τα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με θρυψίνη και επαναιωρήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας. Κάθε φρεάτιο των πλακών καλλιέργειας 8-θαλάμου Lab-Tek (Nunc Inc., USA) επικαλύφθηκε με 25 μΙ αυξητικού παράγοντα μειωμένη Matrigel (BD Biosciences) και τα πλακίδια αφέθηκαν να στερεοποιηθούν για 30 λεπτά. στους 37 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια επιστρώθηκαν σε συγκέντρωση 10

4 κύτταρα /mL σε migrastatin αναλογικό μέσο που περιέχει ή μέσο με την προσθήκη DMSO (όχημα φαρμάκου). Η ανάπτυξη των κυττάρων σε Matrigel παρατηρήθηκε καθημερινά κάτω από μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (IX 70 της Olympus Optical Co., Γερμανία). Το πείραμα διεξήχθη τρεις φορές (n = 3).

In vitro

πληγών δοκιμασία επούλωσης (ξύσιμο δοκιμή)

Ο προσδιορισμός μηδέν διεξήχθη για να αξιολογηθεί η επίδραση της migrastatin αναλόγων για κυνικός μαστικού κινητικότητα καρκινικών κυττάρων. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε υψηλή πυκνότητα στα 600 mm τρυβλία πιάτα (Corning-Costar, Cambridge, USA). Μετά από 24 ώρες, το μέσο απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με μέσο που περιείχε 10% FBS και ένα από τα έξι migrastatin αναλόγων (MGSTA-1 έως 6) ή DMSO (έλεγχος). Η μονοστοιβάδα τραυματίστηκε με το ξύσιμο της επιφάνειας: ως ομοιόμορφα και ίσια όσο το δυνατόν με ένα ρύγχος πιπέτας (1000 μl) τουλάχιστον τρεις φορές. Οι εικόνες των κυττάρων που εισβάλλουν στην γρατσουνιά συλλήφθηκαν σε δεικνυόμενα χρονικά σημεία (0, 4, 6, 8 και 24 ώρες) χρησιμοποιώντας μικροσκοπία αντίθεσης φάσης (IX 70 της Olympus Optical Co., Γερμανία). Οι εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας αναλυτή εικόνας με τη βοήθεια υπολογιστή (Ανάλυση εικόνας της Olympus μικροσκοπικών εικόνων ™, έκδοση λογισμικού 4.0 για Windows, USA). Ο ρυθμός μετανάστευσης εκφράστηκε ως ποσοστό του κλεισίματος μηδέν και υπολογίστηκε ως ακολούθως:% του κλεισίματος μηδέν = ab /a, όπου (α) είναι μία απόσταση μεταξύ των άκρων της πληγής, και (β) είναι η απόσταση η οποία παρέμεινε ελεύθερο κυττάρων κατά τη μετανάστευση των κυττάρων για να κλείσει το τραύμα [29].

Οι τιμές παρουσιάζονται ως μέσοι όροι από τρία ανεξάρτητα πεδία πληγή από τρία ανεξάρτητα πειράματα (n = 9).

δοκιμασία μετανάστευσης Trans-καλά

δοκιμασία μετανάστευσης Boyden κυττάρων θάλαμο πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του BD Falcon ™ FluoroBlock ™ 24-πολλαπλών Τοποθετήστε πλάκες (8 micron μέγεθος πόρων) (BD Biosciences, USA). Πρώτον, τα κύτταρα (1 × 10

5) ανεστάλησαν σε FBS μέσο ελεύθερο και προστίθενται στα κορυφαία επιμελητήρια ένα ένθετο πλάκες (500 μλ). Στη συνέχεια, 750 μΙ χημειοελκτικό (10% FBS) προστέθηκε στους θαλάμους βασική. Migrastatin ανάλογα (MGSTA-5 ή MGSTA-6 στα 100 μΜ) ή DMSO (ως μάρτυρας) προστέθηκαν στο μέσο σε δύο θαλάμους. Για μελέτες δοσοεξαρτώμενη MGSTA-6 χρησιμοποιήθηκε στο εύρος συγκέντρωσης από 0,1 έως 100 μΜ. δοκιμασίες Μετανάστευση διεξήχθησαν για 18-20 ώρες σε πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας. Στη συνέχεια, το μέσο απομακρύνθηκε προσεκτικά από το κορυφαίο θάλαμο και το σύστημα ένθεμα μεταφέρθηκε σε ένα δεύτερο πλακίδιο των 24 φρεάτων που περιέχουν 500 μΙ 2.5 μg /ml Calcein ΑΜ σε Hanks ‘ισόρροπο διάλυμα άλατος (HBSS). Οι πλάκες επωάστηκαν για μία ώρα σε πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας. Στη συνέχεια, ο φθορισμός του μετανάστευσαν κυττάρων μετρήθηκε σε μήκος κύματος διέγερσης 485 nm και μήκος κύματος εκπομπής 530 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη φθορισμού πλακός με δυνατότητες πυθμένα ανάγνωση άπειρη 200 PRO Tecan ™ (TECAN, Ελβετία). Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν και κάθε πείραμα διεξήχθη τρεις φορές (η = 9). Για κάθε πείραμα χρησιμοποιήθηκαν δύο αρνητικοί έλεγχοι: (1) κύτταρα που αναπτύσσονται όπως δόθηκε παραπάνω, χωρίς την προσθήκη χημειοελκτικό στο μέσο, ​​και (2) μέσο προστίθεται όπως περιγράφεται χωρίς κύτταρα. Για να προσδιοριστεί ο φθορισμός των κυττάρων που μετανάστευσαν μέσω της μεμβράνης, οι πλάκες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus ΒΧ60, μεγέθυνση x4).

Trans-φρεατίων δοκιμασία εισβολής

Η δοκιμασία κύτταρο εισβολή διεξήχθη χρησιμοποιώντας το BD BIOCOAT ™ 24-πολλαπλών εισβολή Σύστημα προ-επικαλυμμένα με BD Matrigel ™ Matrix (BD Biosciences, USA). Οι ένθετες πλάκες είχαν κατ ‘αρχάς παρασκευάζεται με επανυδάτωση της στιβάδας μήτρας BD Matrigel ™ με θερμό PBS για δύο ώρες στους 37 ° C. Το διάλυμα επανυδάτωσης στη συνέχεια προσεκτικά απομακρύνθηκε και 500 μΙ κυτταρικού εναιωρήματος προστέθηκαν στην κορυφαία θαλάμους (2,5 × 10

5 κυττάρων). εναιώρημα κυττάρων παρασκευάστηκε με θρυψίνη μονοστιβάδες κυττάρων (80% συρροή) και επαναιώρηση των κυττάρων σε μέσο ελεύθερο FBS. Στη συνέχεια, 750 μΙ χημειοελκτικό (10% FBS) προστέθηκε στους θαλάμους βασική. Για το πείραμα, MGSTA-6 ή DMSO (ως μάρτυρας) προστέθηκαν στο μέσο σε δύο θαλάμους. πλάκες δοκιμασίας εισβολή επωάστηκαν για 22-24 ώρες σε κανονικές συνθήκες καλλιέργειας. Στη συνέχεια, το μέσο απομακρύνθηκε προσεκτικά από το κορυφαίο θάλαμο και ένθετο σύστημα χρωματίστηκε με Calcein ΑΜ σε HBSS με τον ίδιο τρόπο όπως περιγράφεται στο δοκιμασία μετανάστευσης. Στη συνέχεια, ο φθορισμός του εισέβαλαν κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη φθορισμού πλάκας άπειρη 200 PRO Tecan ™ (Ext.485 nm /Ems. 530 nm) (TECAN, Ελβετία). Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν, το κάθε πείραμα διεξήχθη τρεις φορές (η = 9). Για κάθε πείραμα ο αρνητικός μάρτυρας αποτελούσε μέσο όπου δεν προστέθηκε χημειοελκτικό. Για να προσδιοριστεί ο φθορισμός των κυττάρων που εισέβαλαν μέσα από τη μεμβράνη επικαλυμμένη με Matrigel οι πλάκες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus ΒΧ60, μεγέθυνση x4).

συνεστιακή μικροσκοπία

Ο κυνικός μαστικά καρκινικά κύτταρα ήσαν αναπτύχθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας Lab-Tek επικαλυμμένα με Matrigel επί 24 ώρες σε μέσο που περιέχει migrastatin (MGSTA-6 σε συγκέντρωση 100 μΜ). Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε θερμό PBS και σταθεροποιήθηκαν με 3,7% παραφορμαλδεΰδη για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Στη συνέχεια, τα κύτταρα κατέστησαν διαπερατά με 0,5% Triton Χ-100 αραιωμένο σε PBS (10 λεπτά σε RT), πλύθηκαν σε PBS τρεις φορές και επωάστηκαν με αντι-φωσφο-FSCN1 αντίσωμα πρωτογενούς κουνελιού (-SeΓ39) σε αραίωση 1: 100 σε PBS ( BIOSs, USA). Μετά από ολονύκτια επώαση με πρωτογενή αντισώματα στους 4 ° C τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές σε PBS και επωάστηκαν με δευτερεύον Alexa Fluor αντισώματα αντι-κουνελιού κατσίκας 568 αραιωμένο 1: 500 σε PBS (Santa Cruz Biotechnology Inc., USA) και συν-χρώση για το F β-ακτίνης με FITC-X φαλλοϊδίνη αραιωμένο 1: 100 σε PBS (Invitrogen, USA) για μια ώρα στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου. Οι καλυπτρίδες στη συνέχεια τοποθετείται σε πλάκες μικροσκοπίου χρησιμοποιώντας μέσο στερέωσης SlowFade®Gold (Life Technologies, Invitrogen). Τα κύτταρα οπτικοποιήθηκαν με τη χρήση του συνεστιακού μικροσκοπίου σάρωσης λέιζερ σύστημα FV-500 (Olympus Optical Co, Αμβούργο, Γερμανία). Ο συνδυασμός της διέγερσης /εκπομπής ήταν: Αργό 488 nm laser με 505-525 φίλτρο nm για FITC και HeNe 543 nm laser με φίλτρο 610 nm για Alexa Fluor χρώση 568. Οι εικόνες συλλέχθηκαν ξεχωριστά για κάθε κανάλι φθορισμού. Τα κύτταρα εξετάστηκαν με τη χρήση του προγράμματος Fluoview (Olympus Optical Co, Γερμανία). Για την ποσοτικοποίηση των συνεστιακή αποτελέσματα, έχουμε αναλύσει την ένταση του κόκκινου φθορισμού που σχετίζονται με fascin1 έκφρασης και χρωματομετρική ένταση των κηλίδων που δείχνουν συν-εντοπισμό των fascin1 και F-ακτίνης σε εικόνες συγχώνευση, με τη χρήση αναλυτή εικόνας με τη βοήθεια υπολογιστή (Ανάλυση εικόνας της Olympus μικροσκοπικών εικόνων ™ , έκδοση λογισμικού 5.0 για windows, USA). Πέντε έως δέκα εικόνες σε κάθε διαφάνεια αναλύθηκαν. Η ένταση του χρώματος κηλίδα αντιγόνου εκφράζονται ως μέση τιμή pixel ολοκληρωμένη οπτική πυκνότητα (IOD).

Η στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση GraphPad Prism έκδοση 5.00 του λογισμικού (GraphPad Software, USA). Η μονόδρομη ANOVA και Tukey HSD (Ειλικρινά σημαντική διαφορά)-hoc μετά τη δοκιμή, τη δοκιμή του Dunnett και

t-test

εφαρμόστηκαν καθώς και ανάλυση παλινδρόμησης. Η τιμή p & lt? 0.05 θεωρήθηκε ως σημαντική λαμβάνοντας υπόψη ότι η τιμή p & lt? 0.01 και & lt? 0.001 ως ιδιαίτερα σημαντική. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι +/- S.D. εκτός κι αν ειπωθεί αλλιώς. Η

in vitro

επούλωσης πληγών δοκιμασία αναλύθηκε χρησιμοποιώντας αμφίδρομη ΑΝΟνΑ RM και Bonferroni post-hoc τεστ.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Η επίδραση της έξι αναλόγων migrastatin επί καρκινικών κυττάρων βιωσιμότητας

Πρώτον, ερευνήσαμε αν τα εξεταζόμενα ανάλογα migrastatin επηρεαστεί η βιωσιμότητα των κυττάρων. Τέσσερις από αυτές τις χημικές ενώσεις (MGSTA-1, MGSTA-3, MGSTA-5, και MGSTA-6) δεν άλλαξε την βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων σκύλου σε οποιαδήποτε χρησιμοποιείται συγκέντρωση (Σχήμα S1). Ωστόσο, η βιωσιμότητα των κυττάρων CMT-W1 και CMT-W2 μειώθηκε σημαντικά (κατά περίπου 29% και 32%, αντίστοιχα) μετά την αγωγή με MGSTA-4 σε συγκέντρωση 100 μΜ (ρ & lt? 0,01) (Σχήμα S1A, B ). Η βιωσιμότητα των κυττάρων CMT-W1 επίσης μειώθηκε μετά από επώαση με MGSTA-2 κατά περίπου 26% (Σχήμα S1A). Η μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων μετά την αγωγή με 100 μΜ MGSTA-4 και MGSTA-2 θα μπορούσε να συσχετιστεί με την κυτταροτοξικότητα τους, ως εκ τούτου, στα ακόλουθα πειράματα, αυτές οι ενώσεις χρησιμοποιήθηκαν σε συγκέντρωση 10 μΜ για να εξασφαλιστεί ότι η παρατηρούμενη επίδραση του αυτές οι ενώσεις για τη μετανάστευση και εισβολή δεν προκύπτουν από την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων ή επαγωγή κυτταρικού θανάτου.

Αντίθετα, μπορούμε επίσης να παρατηρηθεί, ότι οι χαμηλότερες συγκεντρώσεις άλλων αναλόγων του migrastatin προκάλεσε ελαφρά αύξηση της βιωσιμότητας των κυττάρων του καρκίνου (π.χ. MGSTA -5 ή MGSTA-6 στην κυτταρική σειρά CMT-W1? κυτταρικές σειρές CMT-W2M) (Σχήμα S1) MGSTA-1, MGSTA-2 στην κυτταρική σειρά CMT-W2 και MGSTA-3 στο CMT-W1M και. Έτσι, για να αποφευχθεί πιθανή την προώθηση της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων με κατεργασία ενώσεων, σε ακόλουθα πειράματα χρησιμοποιήσαμε την υψηλότερη δυνατή συγκέντρωση (100 μΜ) που δεν επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων (ούτε μείωση ούτε αύξηση της βιωσιμότητας του). Επιπλέον, προηγούμενες μελέτες που διεξάγονται για τα ανθρώπινα Α549 πνεύμονα κυτταρική σειρά καρκίνου έδειξαν ότι χαμηλότερες συγκεντρώσεις migrastatin αναλόγων (ME – migrastatin πυρήνας αιθέρας) δεν επηρέασε τη μετανάστευση των κυττάρων [13]. Επιπλέον, μια μελέτη από Shen και συν-εργαζομένων [11], στην οποία εξετάστηκαν δεκαοκτώ διαφορετικές ημι-συνθετικά παραγόμενο migrastatin ομοειδείς ουσίες, αποκάλυψε ότι μόνο δύο ενώσεις εμφάνισαν αναστολή της μετανάστευσης κυττάρων IC

50 τιμές κάτω από 100 μΜ στην επούλωση των πληγών δοκιμασία .

Αναστολή της κυνικός μαστικών μετανάστευση καρκινικών κυττάρων με ανάλογα της migrastatin αξιολογήθηκαν από τραύμα δοκιμασία επούλωσης

in vitro

Η

το τραύμα δοκιμασία επούλωσης διεξήχθη με σκοπό να χαρακτηρίσει την επίδραση της ανάλογα migrastatin για τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων σκύλου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3 δύο από έξι εξεταζόμενες ενώσεις (MGSTA-5 και MGSTA-6) που προκαλείται ισχυρή ανασταλτική επίδραση επί της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων στο CMT-W1, CMT-W1M και κυτταρικές σειρές CMT-W2. Επιπλέον, επίσης MGSTA-2 ήταν αρκετά αποτελεσματική στην κυτταρική σειρά CMT-W2 στα χρονικά σημεία 4, 6 και 8 ώρες μετά το ξύσιμο. Ενώ σε κύτταρα συνθήκη ελέγχου κλειστό 39,2 ± 6,8%, 57 ± 7,5% και 84 ± 9,4% του τραύματος (μετά από 4, 6 και 8 ώρες, αντιστοίχως), αφού τα κύτταρα MGSTA-2 χορήγησης να κλείνει μόνο 19.9 ± 2.1%, 29.6 ± 9,9% και 38,9 ± 8,8% του τραύματος, αντίστοιχα. Ωστόσο, μετά από 24 ώρες το τραύμα ήταν εντελώς κλειστή όπως στην κατάσταση ελέγχου (Σχήμα 3Β). Η μετανάστευση των κυττάρων δεν επηρεάστηκε από καμία από τις εξετάστηκαν migrastatin ανάλογα στον CMT-W2M κυτταρική σειρά (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Ποσοτικοποίηση της μετανάστευσης των CMT-W1 (Α), CMT-W2 (Β) CMT- οι W1M (C) κυτταρικές σειρές παρουσιάζονται ως ποσοστά του κλεισίματος μηδέν και υπολογίστηκαν ως εξής:% του κλεισίματος μηδέν = ab /a, όπου (α) είναι μία απόσταση μεταξύ των άκρων της πληγής, και (β) είναι η απόσταση η οποία παρέμεινε ελεύθερο κυττάρων κατά τη διάρκεια της μετανάστευσης των κυττάρων για να κλείσετε το μηδέν. Φωτογραφίες των κυττάρων εισβάλλουν στην γρατσουνιά λήφθηκαν στο σημείο εκκίνησης και μετά από 4, 6, 8, και 24 ώρες χρησιμοποιώντας μικροσκοπία αντίθεσης φάσης (IX 70 της Olympus Optical Co., Γερμανία). Χορήγηση MGSTA-5 και MGSTA-6 (100 μΜ) μειώθηκε κύτταρα κινητικότητα σε CMT-W1, CMT-W2 και κυτταρικές σειρές CMT-W1M. Η θεραπεία MGSTA-2 μειώθηκαν τα κύτταρα κινητικότητα μόνο στην κυτταρική σειρά CMT-W2. Άλλα ανάλογα migrastatin δεν επηρεάζουν την ικανότητά μετανάστευση των εξεταζόμενων κυτταρικών σειρών. (Δ) Εκπρόσωπος εικόνες του κλεισίματος μηδέν σε συνθήκες ελέγχου και μετά από MGSTA-5 και MGSTA-6 θεραπεία (100 μΜ) σε 8

ου ώρες μετά το ξύσιμο στο CMT-W1, CMT-W2 και κυτταρικές σειρές CMT-W1M? εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας φακό με 4x μεγέθυνση και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας αναλυτή εικόνας με τη βοήθεια υπολογιστή (Ανάλυση εικόνας της Olympus μικροσκοπικών εικόνων ™, έκδοση λογισμικού 5.0 για Windows, USA). Το πείραμα διεξήχθη τρεις φορές. Αμφίδρομη ANOVA και Bonferroni post-hoc δοκιμές εφαρμόστηκαν. p & lt? 0.05 χαρακτηρίστηκε ως * και η P & lt? 0.001 χαρακτηρίστηκε ως ***.

Η

Η MGSTA-5 δόθηκε σε συγκέντρωση 100 μΜ ανέστειλε τη μετανάστευση των CMT-W1, CMT-W1M και των κυττάρων CMT-W2 για την αντιμετώπιση της πληγής μηδέν. Τα κύτταρα ΟΜΤ-W1 επεξεργάστηκε με MGSTA-5 κλείνει μόνο 29 ± 6,5% και 56 ± 5,2% του τραύματος (μετά από 6 και 8 ώρες, αντιστοίχως), ενώ σε συνθήκες ελέγχου, το 50 ± 7,2% και 78 ± 7,8% της πληγή κλείστηκε 6 και 8 ώρες μετά το ξύσιμο, αντίστοιχα (Σχήμα 3Α). Παρομοίως, κύτταρα ΟΜΤ-W2 επωάζονται με MGSTA-5 (100 μΜ) κλείνει μόνο το 30 ± 3,8% και 43 ± 3% της πληγής 6 και 8 ώρες μετά το ξύσιμο (αντίστοιχα), ενώ σε συνθήκες ελέγχου έκλεισαν 57 ± 7,5% και 84 ± 9,4% της πληγής εκείνη τη στιγμή (6 και 8 ώρες, αντιστοίχως) (Σχήμα 3Β). Παρομοίως, επίσης κύτταρα ΟΜΤ-W1M επωάζονται με την ένωση αυτή κλειστά 21 ± 7,7% και 30 ± 7,4% της πληγής 6 και 8 ώρες μετά το ξύσιμο, αντίστοιχα, ενώ τα κύτταρα ελέγχου κλειστού 59 ± 6,3% και 80 ± 8,7% του τραύματος στο τα ίδια χρονικά σημεία (Σχήμα 3C). Επιπλέον, οι κυτταρικές γραμμές CMT-W2 και CMT-W1M επεξεργάστηκε με MGSTA-5 δεν κλείσει το τραύμα, ακόμη και μετά από 24 ώρες από ξύσιμο (74 ± 7,3% και 52 ± 7,8% κλείσιμο, αντίστοιχα). Σε συνθήκες ελέγχου, το τραύμα ήταν εντελώς κλειστό (Σχήμα 3Β, C).

Ο MGSTA-6 επίσης αποδειχθεί ότι είναι ένας πολύ αποτελεσματικός αναστολέας της μετανάστευσης. Η κυτταρική σειρά CMT-W1 αντιμετωπίζονται με αυτόν τον παράγοντα κλείσει μόνο το 25 ± 5,1% και 37 ± 2,8% του τραύματος 6 και 8 ώρες μετά το ξύσιμο (Σχήμα 3C). Θεραπεία των κυττάρων CMT-W2 με MGSTA-6 μείωσε επίσης την ικανότητά της μετανάστευσής τους. Ήταν πολύ σημαντική 8 και 24 ώρες μετά το ξύσιμο. Σε συνθήκες ελέγχου, η πληγή ήταν σχεδόν εντελώς κλειστό εκείνη την εποχή (86-100%), ενώ κύτταρα κατεργασμένα με MGSTA-6 κλείνει μόνο 52 ± 8,1% και 78 ± 5,2% του τραύματος, αντίστοιχα (Σχήμα 3Β). Η MGSTA-6 προκάλεσε μια παρόμοια επίδραση στην κυτταρική σειρά CMT-W1M, η οποία εκδηλώνεται με σχεδόν πλήρη μπλοκ της μετανάστευσης (9 ± 6,8% και 21 ± 3,7% του τραύματος κλείσιμο 6 και 8 ώρες μετά το ξύσιμο, αντίστοιχα). Μετά από 24 ώρες μόνο το 41 ± 4,2% του τραύματος έκλεισε (Σχήμα 3C).

Danishefsky και τους συναδέλφους που λαμβάνονται παρόμοια αποτελέσματα [13]. Οι συντάκτες ερεύνησαν αντι-μεταστατικές ιδιότητες των migrastatin πυρήνα αιθέρα (ΜΕ) και καρβοξυμεθυλο- migrastatin αιθέρα (CME). Και οι δύο ενώσεις δίδονται σε συγκέντρωση 100 μΜ σχεδόν μπλοκαριστεί εντελώς μετανάστευση του καρκινώματος πνεύμονα ανθρώπινου μη-μικρού κυττάρου 12 ώρες μετά το μηδέν. Οι συγγραφείς με βάση δοκιμασία επούλωσης πληγών καθόρισε το ήμισυ της μέγιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης μετανάστευσης (IC

50 τιμή), η οποία ήταν χαμηλότερη από ό, τι λαμβάνεται με την έρευνα μας με τη χρήση δοκιμασία μετανάστευσης trans-φρεατίων (συζήτηση κατωτέρω). Η πιο αποτελεσματική αναστολή της μετανάστευσης σε τρεις κυνικός καρκινικές κυτταρικές σειρές, αξιολογήθηκε με προσδιορισμό επούλωσης πληγών επιτεύχθηκε με MGSTA-5 και MGSTA-6 σε συγκέντρωση 100 μΜ, και αυτά τα δύο χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω χαρακτηρισμό. Αν και η MGSTA-2 ανέστειλε την ικανότητα μετανάστευση κυττάρων CMT-W2 ήταν αναποτελεσματική σε άλλες κυτταρικές σειρές. Με τη σειρά του, ο MGSTA-4 ( «μακρολακτόνη ‘Danishefsky) σε υψηλή συγκέντρωση 100 μΜ αναστέλλει σημαντικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό των δύο κυτταρικών σειρών (CMT-W1 και CMT-W2) (Σχήμα S1A, Β), αλλά σε χαμηλότερη συγκέντρωση (10 μΜ ) δεν είχε καμία επίδραση στην κυτταρική μετανάστευση (Σχήμα 3). Αυτές οι διαφορές μπορεί να οφείλονται σε διαφορετικά χαρακτηριστικά του σκύλου κυτταρικών σειρών.

Αναστολή της μετανάστευσης και της εισβολής του σκύλου μαστικών καρκινικών κυττάρων από δύο πιο αποτελεσματικών αναλόγων του migrastatin (MGSTA-5 και MGSTA-6) αξιολογήθηκε με θαλάμους Boyden δοκιμασία

Για να επιβεβαιώσετε αντι-μεταστατική δράση των δύο ενώσεων που ήταν το πιο αποτελεσματικό στην επούλωση των πληγών δοκιμασία, πραγματοποιήσαμε τις δοκιμασίες μετανάστευσης και εισβολής σε θαλάμους Boyden.

μετανάστευση των κυττάρων του καρκίνου μειώθηκε σημαντικά μετά επώαση 24 ώρες με 100 μΜ των κυτταρικών σειρών CMT-W1M MGSTA-5 και MGSTA-6 στο CMT-W1 και. Η ένταση του φθορισμού που σχετίζονται με τις μεταναστεύουν κύτταρα σε συνθήκες ελέγχου ήταν 10,3 ± 2,5, και 19,7 ± 3,1 σε CMT-W1 και κυτταρική γραμμή CMT-W1M, αντίστοιχα, ενώ, η θεραπεία με macroketone MGSTA-5 μείωσε τις σχετικές μονάδες φθορισμού (RFU) για να 5.6 ± 1.2 και 14.2 ± 2,1 σε CMT-W1 και κυτταρική γραμμή CMT-W1M, αντίστοιχα (Σχήμα 3Α). Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα ελήφθη σε κύτταρα που υπέστησαν κατεργασία με MGSTA-6. RFU μειώθηκε σε 4,2 ± 1,2 και 3,8 ± 1 σε CMT-W1 και κυτταρική γραμμή CMT-W1M, αντιστοίχως (Σχήμα 4Α). Η μετανάστευση των κυττάρων CMT-W2 ήταν σχεδόν πλήρως αναστάλθηκε από τις ενώσεις αυτές. Ωστόσο, καμία επίδραση σχετικά με τη μετανάστευση των κυττάρων CMT-W2M σημειώθηκε, αν και μια μικρή μείωση παρατηρήθηκε (Εικόνα 4Α).

(Α) Ποσοτικοποίηση της μετανάστευσης εξετάζονται κυτταρικές σειρές (CMT-W1, CMT-W1M , CMT-W2, CMT-W2M) παρουσιάζεται ως Σχετική φθορίζοντα Μονάδες (RFU) λαμβάνονται χρησιμοποιώντας αναγνώστη φθορισμού πλάκας Άπειρο 200 PRO Tecan ™ (Ex. 485, Εμ. 530). Η θεραπεία των καρκινικών κυττάρων με MGSTA-5 και MGSTA-6 επί 20 ώρες σε συγκέντρωση 100 μΜ μείωσε την μετανάστευση διαμέσου της μεμβράνης του CMT-W1, και τα κύτταρα ΟΜΤ-W1M και σχεδόν καταργηθεί τελείως μετανάστευση των κυττάρων CMT-W2. Στη γραμμή κυττάρων CMT-W2M αυτές οι ενώσεις ήταν αναποτελεσματικές. Το πείραμα διεξήχθη τρεις φορές. Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση Prism έκδοση 5.00 του λογισμικού (GraphPad Software, USA). Η μονόδρομη ANOVA που ακολουθήθηκε από Tukey HSD δοκιμή post-hoc και μη ζευγαρωμένο t-test εφαρμόστηκαν. p & lt? 0.05 χαρακτηρίστηκε ως *, p & lt? 0.001 χαρακτηρίστηκε ως ***. (Β) Μικρογραφίες των μετανάστευσαν CMT-W1, CMT-W1M και CMT-W2 κύτταρα που λαμβάνονται με την Olympus μικροσκόπιο ΒΧ60 σε x4 μεγέθυνση.

Η

Ο προσδιορισμός των καρκινικών κυττάρων εισβολή έγινε μόνο με την πιο ισχυρή αναλογική του migrastatin (MGSTA-6). Η ικανότητα εισβολής του CMT-W1, CMT-W1M και CMT-W2 κυνικός καρκινικές κυτταρικές σειρές ήταν σημαντικά μειωμένη από την παρούσα ένωση που χορηγείται σε συγκέντρωση 100 μΜ για 24 ώρες. Η ένταση του φθορισμού που σχετίζονται με τις εισέβαλαν CMT-W1, CMT-W1M και CMT-W2 κυττάρων σε συνθήκες ελέγχου ήταν 11 ± 1.7, 9.7 ± 0.6, 11.4 ± και 1.5, αντίστοιχα (Σχήμα 5Α). Χορήγηση MGSTA-6 μείωσε το διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων. Η ένταση φθορισμού που σχετίζονται με τις εισέβαλαν CMT-W1, CMT-W1M και CMT-W2 κυττάρων ήταν 6.7 ± 0.6, 6.6 ± 0.6, 7.3 ± 0.7, αντίστοιχα (p & lt? 0.005). Η εισβολή της CMT-W2M κυττάρων δεν επηρεάστηκε από MGSTA-6. Η μικροσκοπική ανάλυση διεξάγεται με τη χρήση μικροσκοπίου φθορισμού επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα που ελήφθησαν (Σχήματα 4Β και 5Β).

(Α) Ποσοτικοποίηση της εισβολής των εξεταζόμενων κυτταρικές σειρές (CMT-W1, CMT-W1M, CMT-W2, CMT-W2M ) παρουσιάζεται ως σχετικές μονάδες φθορίζοντα (RFU) λαμβάνεται με τη χρήση αναγνώστη πλάκας φθορισμού Άπειρο 200 PRO Tecan ™ (Ex. 485, Em.530). Η θεραπεία των καρκινικών κυττάρων με MGSTA-6 επί 24 ώρες σε συγκέντρωση 100 μΜ μείωσε την διεισδυτικότητα διαμέσου της μεμβράνης προ-επικαλύπτονται με Matrigel ™ μήτρας, του CMT-W1M, CMT-W2, κύτταρα ΟΜΤ-W1M. Στη γραμμή κυττάρων CMT-W2M MGSTA-6 ήταν αναποτελεσματική. Το πείραμα διεξήχθη τρεις φορές. Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση Prism έκδοση 5.00 του λογισμικού (GraphPad Software, USA).