Αφηρημένο

Ιστορικό

Η οδός Κέννεντυ δημιουργεί phosphocoline και φωσφοαιθανολαμίνης μέσω δύο υποκαταστημάτων της. Κινάσης χολίνης (ChoK) είναι το πρώτο ένζυμο του υποκαταστήματος Kennedy της σύνθεσης του φωσφοχολίνης, το κύριο συστατικό της μεμβράνης του πλάσματος. ChoK οικογένεια πρωτεϊνών αποτελείται από ChoKα και ChoKβ ισομορφές, την πρώτη με δύο διαφορετικές παραλλαγές ματίσματος. Πρόσφατα ChoKα έχει εμπλακεί στην διαδικασία της καρκινογένεσης, δεδομένου ότι υπερ-εκφράζεται σε μια ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων. Ωστόσο, υπάρχουν ενδείξεις για το ρόλο της ChoKβ στην καρκινογένεση έχει αναφερθεί.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Εδώ συγκρίνουμε το

in vitro

και

in vivo

ιδιότητες ChoKα1 και ChoKβ σε μεταβολισμό λιπιδίων, και τον πιθανό ρόλο τους στην καρκινογένεση. Τόσο ChoKα1 και ChoKβ έδειξε χολίνη και αιθανολαμίνη δραστηριότητες κινάσης όταν δοκιμάζεται σε κυτταρικά εκχυλίσματα, αν και με διαφορετική συγγένεια για υποστρώματα τους. Ωστόσο, συμπεριφέρονται διαφορετικά όταν υπερεκφράζεται σε ολόκληρα κύτταρα. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η ChoKβ εμφανίσει ένα ρόλο αιθανολαμίνη κινάσης, ChoKα1 παρουσιάσει ένα διπλό ρόλο κινάσης χολίνης /αιθανολαμίνη, γεγονός που υποδηλώνει τη συμμετοχή κάθε ισομορφής ChoK σε διακριτά βιοχημικά μονοπάτια κάτω από το

in vivo

συνθήκες. Επιπλέον, ενώ η υπερέκφραση του ChoKα1 είναι ογκογόνος όταν υπερεκφράζεται σε ΗΕΚ293Τ ή MDCK κύτταρα, ChoKβ υπερέκφραση δεν είναι επαρκής για να επάγει

in vitro

μετασχηματισμό κυττάρων ούτε

in vivo

ανάπτυξη του όγκου. Επιπλέον, μια σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση των επιπέδων ChoKα1 mRNA σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών μαστού και τον καρκίνο του πνεύμονα βρέθηκε, αλλά δεν παρατηρήθηκαν αλλαγές στα επίπεδα ChoKβ mRNA. Τέλος, MN58b, ένα περιγράφηκε προηγουμένως ισχυρός αναστολέας της ChoK με

in vivo

αντικαρκινική δράση, δείχνει περισσότερο από 20 φορές υψηλότερη απόδοση προς ChoKα1 από ChoKβ.

Συμπέρασμα /Σημασία

Αυτή η μελέτη αποτελεί την πρώτη απόδειξη της ξεχωριστή μεταβολικό ρόλο της ChoKα και ChoKβ ισομορφές, προτείνοντας διαφορετικούς φυσιολογικούς ρόλους και τις επιπτώσεις στην ανθρώπινη καρκινογένεση. Τα ευρήματα αυτά αποτελούν ένα βήμα προς τα εμπρός στο σχεδιασμό μιας αντικαρκινική στρατηγική που βασίζεται στην αναστολή ChoK

Παράθεση:. Gallego-Ortega D, Ramirez de Molina Α, Ράμος MA, Valdes-Mora F, Barderas MG, Sarmentero-Estrada J, et al. (2009) Διαφορικές ρόλος των Ανθρωπίνων κινάσης χολίνης α και β Ένζυμα στο μεταβολισμού των λιπιδίων: Επιπτώσεις στον Καρκίνο Έναρξη και θεραπεία. PLoS ONE 4 (11): e7819. doi: 10.1371 /journal.pone.0007819

Επιμέλεια: Suzannah Rutherford, Έρευνας Καρκίνου Fred Hutchinson Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 22 Ιούν, 2009? Δεκτές: 7, Οκτωβρίου του 2009? Δημοσιεύθηκε: 12 του Νοεμβρίου 2009

Copyright: © 2009 Gallego-Ortega et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο έχει υποστηριχθεί από επιχορηγήσεις σε JCL από Comunidad de Madrid (GR-SAL-0.821 έως 2004), Ministerio Επιστημών e Innovación (SAF2008-03750, RD06 /0020/0016), Fundación Mutua Madrileña, και με επιχορήγηση για ARM από την Fundación mutua Madrileña. DGO ήταν ένας συνάδελφος από την Comunidad de Madrid. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ανθρώπινο άλφα κινάσης χολίνης (ChoKα) και βήτα (ChoKβ) είναι μέλη της οικογένειας κινάσης χολίνης. Στα θηλαστικά αυτή η οικογένεια κωδικοποιείται από δύο διαφορετικά γονίδια,

CHKA

και

CHKB

, με αποτέλεσμα τρεις διαφορετικές πρωτεΐνες με μία κινάση χολίνης /αιθανολαμίνη (ChoK /EtnK) τομέας: ChoKα1 (NP_001268), ChoKα2 (NP_997634) και ChoKβ1 (NP_005189) [1]. ChoKα1 διαφέρει από ChoKα2 σε μόνο μια επιπλέον έκταση 18 αμινοξέα, ενώ ChoKβ διαφέρει από ChoKα1 και ChoKα2 σε περίπου 40%. Η παρουσία της περιοχής ChoK /EtnK προσδίδει την ικανότητα να καταλύουν την φωσφορυλίωση της χολίνης (Cho) προς φωσφοχολίνη (PCho) [1]. Αυτό αποτελεί το πρώτο βήμα στη βιοσύνθεση οδό φωσφατιδυλοχολίνη (PC) [2]. PC είναι η κύρια φωσφολιπίδιο σε ευκαρυωτικά μεμβράνες και διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην δομή της μεμβράνης και επίσης στη σηματοδότηση κυττάρου [2]. ChoK ένζυμα θα μπορούσαν να εμπλέκονται επίσης στη σύνθεση των φωσφατιδυλαιθανολαμίνη (ΡΕ), χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα αιθανολαμίνη να καταστήσει φωσφοαιθανολαμίνης (ΡΕΤΝ) [1], [3] – [5]

Προηγούμενες μελέτες προτείνουν ότι ChoK δρα ως. μία διμερής πρωτεΐνη [6], [7] και έχει προταθεί η αναλογία των διαφόρων ομο- ή ετερο-διμερές πληθυσμός να είναι ιστο-ειδική [8]. Επιπλέον, ο συνδυασμός μεταξύ κινάσης χολίνης ισομορφών οδηγεί σε ένα διαφορετικό επίπεδο δραστικότητας ChoK

in vitro

υπό ελεύθερα κυττάρων συνθήκες συστημάτων. Έτσι, το α /α ομοδιμερούς είναι η πιο δραστική μορφή κινάσης χολίνης, η β /β ομοδιμερείς ο λιγότερο ενεργό, και το α /β ετεροδιμερές έχει ένα ενδιάμεσο φαινότυπο [8].

Η ειδική φωσφολιπάση D με γνώμονα υδρόλυση του PC δημιουργεί χολίνη και μεταγωγής σήματος μεταβολίτες όπως ΡΑ (φωσφατιδικό οξύ), και τα παράγωγά του LPA (λυσοφωσφατιδικό οξύ) και DAG (διακυλογλυκερόλη), που είναι σημαντικές σε μιτογένεση και κυτταρικό μετασχηματισμό [9] – [11]. Η χολίνη παίρνει περαιτέρω μετατρέπεται από ChoK σε PCho, ένας σταθερός μεταβολίτης είναι σε θέση να επάγει μιτογένεση σε ινοβλάστες ποντικού [12]. Επιπλέον, αρκετά ογκογονίδια όπως

RAS

ή

RhoA

αύξηση δραστηριότητας ChoKα με αποτέλεσμα την υψηλότερη ενδοκυττάρια επίπεδα PCho [13] – [16]. φασματοσκοπία μαγνητικού συντονισμού (MRS) μελέτες έχουν αποκαλύψει ανώμαλη μεταβολισμό των φωσφολιπιδίων σε καρκινικά κύτταρα [17], [18]. Επιπλέον, τα υψηλά επίπεδα της PCho έχουν βρεθεί σε κύτταρα όγκου όπως επίσης και σε δείγματα όγκων των ασθενών με καρκίνο σε σύγκριση με τις κανονικές ομολόγους του μαστού, του προστάτη, του εγκεφάλου και του καρκίνου των ωοθηκών [19] – [25]. Η αύξηση των φωσφοαιθανολαμίνη έχει επίσης αναφερθεί σε μετασχηματισμένα κύτταρα ή δείγματα όγκων χρησιμοποιώντας MRS, αν και συμβάλλει σε πολύ μικρότερο βαθμό, σε σύγκριση με την αύξηση του PCho, με την κορυφή του φωσφομονοεστέρα [26].

Η επίπτωση της ChoKα στην ανάπτυξη των κυττάρων, πολλαπλασιασμό, έναρξη και την πρόοδο του καρκίνου είναι καλά τεκμηριωμένη. ChoKα υπερεκφράζεται σε μερικές από τις πιο κοινές μορφές καρκίνου, όπως του μαστού, του πνεύμονα, του παχέος εντέρου, του προστάτη [27] – [30] και της ουροδόχου κύστης (αδημοσίευτες παρατηρήσεις). Επιπλέον, έχει ογκογόνο δραστικότητα όταν υπερεκφράζεται σε ανθρώπινα κύτταρα [15]. Αυξημένα επίπεδα mRNA ChoKα έχουν πρόσφατα περιγραφεί ως ένα ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη σε ασθενείς μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [30]. Επίσης, ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκίνου του μαστού δείχνουν προς τα πάνω ρύθμιση του ChoKα αλλά όχι ChoKβ, σε σύγκριση με φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα μαστού [21]. Υπό αυτή την έννοια, έχει πρόσφατα αναφερθεί ότι στο μοντέλο ποντικού όγκου του προστάτη (TRAMP), χρησιμοποιώντας IHQ ανοσοανίχνευση ChoKβ, μια έκφραση χαμηλό επίπεδο ChoKβ βρέθηκε στα δείγματα όγκων συγκριτικά με τους ιστούς του άγριου τύπου [31].

Η επίπτωση των μελών της οικογένειας Rho ΟΤΡάσης έναρξη και πρόοδο του καρκίνου έχει περιγραφεί εκτενώς [32] – [35]. Αποδεικτικά στοιχεία που εμπλέκεται ChoK σε κακοήθη μετασχηματισμό μαζί με Ras και RhoA έχει παρασχεθεί [14], [15], [36]. Επιπλέον, η δραστηριότητα των ChoKα διαμορφώνεται με γνωστές τελεστές τόσο Ras και RhoA [15], [29].

Η φαρμακολογική αναστολή της ChoKα έχει προταθεί ως μια νέα αντικαρκινική στρατηγική [2]. Μια ισχυρή υποστήριξη σε αυτή τη στρατηγική βασίζεται στη χρήση του MN58b, καλώς χαρακτηρισμένης αναστολέα ChoKα, η οποία εμφανίζει μια ισχυρή αντιπολλαπλασιαστική επίδραση σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές σειρές in vitro, και μια ισχυρή μείωση της ανάπτυξης του όγκου σε γυμνά ξενομοσχεύματα ποντικούς [14], [37] – [40]

Έχουμε συγκρίναμε τις βιοχημικές και βιολογικές ιδιότητες των ChoKα και ChoKβ, και να αποδείξει ότι εκτός από την ομολογία τους, ο τελευταίος δεν είναι σε θέση να προκάλεσε μετασχηματισμό κυττάρων στον ΗΕΚ293Τ ή MDCK κύτταρα.. Επιπλέον, προτείνουμε διαφορική συμπεριφορά μεταξύ α και β ισομορφές στο μεταβολισμό φωσφολιπιδίων. Τέλος, οι αντί-όγκου ιδιοτήτων της MN58b μπορεί να αποδοθεί στην εξειδικευμένη αναστολή της ChoKα. Οι συνέπειες αυτών των ευρημάτων που συζητήθηκαν.

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός ενζυμικές ιδιότητες των ChoKα1 και ChoKβ ισομορφές

Η δραστηριότητα των δύο χολίνης ισομορφές κινάσης, ChoKα1 και ChoKβ, έχει περιγράφηκε προηγουμένως σε διαφορετικούς ιστούς θηλαστικού, ωστόσο κινάσης χολίνης τους ή /και κινάση αιθανολαμίνη δραστηριότητες δεν έχουν πλήρως χαρακτηριστεί [1], [4], [41] – [43]. Έτσι, η πρώτη μας πραγματοποίησε μια συγκριτική ανάλυση του

in vitro

δραστηριότητα κινάσης των δύο ισομορφές του ανθρώπινου ChoKα1 και ChoKβ, όσον αφορά την ικανότητά τους να φωσφορυλιώνει χολίνη και αιθανολαμίνη. κύτταρα ΗΕΚ293Τ επιμολύνθηκαν με κατάλληλους φορείς έκφρασης που μεταφέρουν τα ανθρώπινα CHKA ή CHKB γονίδια ή ένα άδειο φορέα, και δοκιμάστηκαν για δραστικότητα ChoK και EtnK. Τα επίπεδα έκφρασης επιτεύχθηκαν ελέγχθηκαν με Western Blot (Σχήμα 1α), και η σχετική ενζυμική δραστικότητα από τα εκχυλίσματα των κυττάρων εκτιμηθεί. Τόσο ChoKα1 και ChoKβ εμφανίζεται χολίνη και κινάσης αιθανολαμίνη δραστηριότητες υπό αυτές τις πειραματικές συνθήκες, αλλά ο ρυθμός της μετατροπής ήταν προφανώς διαφορετικές (Σχήμα 1β).

κύτταρα ΗΕΚ293Τ επιμολύνονται με ευκαρυωτικούς φορείς έκφρασης του ανθρώπινου γονιδίου ChoKα1 και ChoKβ1. pCDNA3b κενό φορέα χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. Α) Η υπερέκφραση του ChoKα1 και ChoKβ1 στα ΗΕΚ293Τ κύτταρα ανιχνεύεται με Western Blot. ανίχνευση GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος του επιπέδου έκφρασης. B, C) In vitro ChoK (Β) και EtnK (C) δραστικότητα της κινάσης χολίνης α1 και β1 ισομορφές σε εκχυλίσματα ελεύθερα κυττάρων του ΗΕΚ293Τ επιμολυσμένων κυττάρων. Ποσοστό μετατροπής

14C-χολίνη ή

14C-αιθανολαμίνη με την φωσφορυλιωμένη προϊόν εκπροσωπείται. Το πείραμα διεξήχθη εις διπλούν δείγματα, επαναλαμβάνεται 4 φορές, και οι μέσες τιμές ± SEM από όλα τα πειράματα εκτιμηθεί.

Η

Αναλύουμε περαιτέρω ChoK και EtnK κινητικές δραστηριότητες για ChoKα1 και ChoKβ ισομορφές χρησιμοποιώντας τα ανασυνδυασμένα ένζυμα. ΫΗ5α

Escherichia coli

μετασχηματίστηκαν με το γονίδιο που κωδικοποιεί για την ανθρώπινη ChoKα1 ή ChoKβ και μια ενζυματική

in vitro

δοκιμασία είτε ChoK ή δραστηριότητες EtnK εκτελούνται. Michaelis σταθερές (Km) για κάθε ισομορφή για τα διάφορα υποστρώματα ελήφθησαν (Πίνακας 1). ChoKβ έδειξε Km για χολίνης 2,8 φορές υψηλότερη από ChoKα1. Αντίθετα, η Km του ChoKβ για αιθανολαμίνης ήταν χαμηλότερη από ChoKα1. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι σε συστήματα άνευ κυττάρων χολίνη είναι ένα καλύτερο υπόστρωμα για ChoKα1 (2,85 φορές) από ChoKβ, ενώ η αιθανολαμίνη είναι ένα καλύτερο υπόστρωμα για ChoKβ (5,83 φορές) από ChoKα1.

Η

ChoK ισομορφές είναι διαφορικά ρυθμίζονται από Ras και Rho ΘΤΡάσες

από Ras και RhoA GTPases είναι ανάντη ρυθμιστές της ChoKα1 [15], [28], μερικές από τις πιο μελετήθηκαν πρωτεΐνες της μικρής οικογένειας ΘΤΡάση συμπεριλαμβανομένης H-Ras, και η Rho -Οικογένεια μέλη RhoA και Cdc42 ελέγχθηκαν ως πιθανοί ανάντη διαμορφωτών της ChoKβ. Για το σκοπό αυτό, ένα

προσδιορισμού δραστικότητας in vitro

ChoK και EtnK διεξήχθη σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ που μορφομετατρέπονται με τα συστατικά ενεργά μεταλλάγματα της κάθε ΟΤΡάσης (Σχ. 2α) και είτε ChoKα1 και ChoKβ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, καμία από τις GTPases δοκιμάστηκαν ήταν σε θέση να αυξήσουν σημαντικά χολίνη ή αιθανολαμίνη κινάσης δραστικότητα του ChoKβ. Αντίθετα, υπό παρόμοιες συνθήκες, Ras και RhoA ήταν σε θέση να προκαλέσει μια στατιστικά σημαντική αλλαγή στην ενεργοποίηση και των δύο δραστηριοτήτων ChoK και EtnK του ChoKα1 (Εικ. 2b και 2c).

κινάσης χολίνης ισομορφές εκφράστηκαν μόνες ή σε συνδυασμό με τις υποδεικνυόμενες Ras και Rho ΟΤΡάσες και το

in vitro

ChoK δραστικότητα προσδιορίστηκε. Α) Ανάλυση της έκτοπης έκφρασης με Western Blot σε ΗΕΚ293Τ επιμολυσμένα κυτταρικά εκχυλίσματα του ChoKα1 (52 kDa), ChoKβ1 (45 kDa), RhoA-QL (22 kDa), Cdc42-QL (25 kDa) και Η-RASV12 (23 kDa) . Αδειάστε φορείς αυτοί χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι για τα ενδογενή επίπεδα και GAPDH ως έλεγχος φόρτωσης. Β) και Γ)

In vitro

δραστικότητα κινάσης χολίνης του ChoKα1 ή ChoKβ1 παρουσία ενισχυμένη έκφραση συστατική ενεργές μορφές RhoA, Cdc42 ή Η-Ras. Δ) και ε)

In vitro

δραστικότητα κινάσης αιθανολαμίνης ChoKα ή ChoKβ παρουσία κάθε υποδεικνύεται συστατική δραστική μορφή του ΟΤΡάσης. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως πλάσια επαγωγή μετατροπή στο αντίστοιχο φωσφορυλιωμένη μεταβολίτη προσδιορίζονται ως σύνολο cpm /μg ολικού κυτταρικού εκχυλίσματος, και ομαλοποιήθηκε ως προς τον κενό φορέα επιμολυσμένα κύτταρα ως έλεγχος. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν τις μέσες τιμές ± SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα, κάθε ένα εκτελείται με διπλά δείγματα. Η στατιστική σημαντικότητα (p ≤ 0,05) σημειώνεται με αστερίσκο σε σύγκριση με την δραστηριότητα που επιτυγχάνεται όταν ChoKα1 ή ChoKβ1, ανάλογα με την περίπτωση, τα επιμολυσμένα μόνο. ​​

Η

Διαφορικές ρόλο μεταξύ ChoK ισομορφών στο μετασχηματισμό των κυττάρων και ογκογένεση

Η επίπτωση της ChoKα1 στο μετασχηματισμό των κυττάρων και την ανθρώπινη καρκινογένεση έχει μελετηθεί εκτενώς και έχει δειχθεί ότι εμφανίζουν ογκογόνο δραστηριότητα [15], [36]. Λόγω της εκτεταμένης ομολογίας του, ερευνήσαμε αν ChoKβ θα μπορούσε να επάγει κυτταρικό μετασχηματισμό όταν υπερεκφράζεται σε μη ογκογόνα κύτταρα. Πρώτον, η ικανότητα του ChoKβ-επιμολυσμένων κυττάρων για την προώθηση αγκύρωσης ανεξάρτητη ανάπτυξη των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την ΗΕΚ293Τ κυτταρική γραμμή. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, ChoKα1 προκάλεσε μια σημαντική αύξηση του αριθμού των μαλακών αποικιών άγαρ [15]. Αντίθετα, υπό παρόμοιες συνθήκες, ChoKβ υπερέκφραση δεν είχε σημαντική επίδραση στον αριθμό ούτε το μέγεθος των αποικιών, σε σύγκριση με εκείνα που δημιουργούνται από τον έλεγχο, με κενό φορέα επιμολυσμένα κύτταρα ΗΕΚ293Τ (Εικ. 3). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα άλλο μη-ογκογονική κυτταρική σειρά από ένα διαφορετικό είδος, όπως MDCK, αποκτώντας παρόμοια αποτελέσματα παρά το χαμηλότερο επίπεδο υπερέκφρασης των δύο ChoK ισομορφές σε σύγκριση με τα κύτταρα ΗΕΚ293Τ. Η διαφορική επίπεδο έκφρασης που λαμβάνεται οφειλόταν στην μάλλον διαφορετική αποτελεσματικότητα στην επιμόλυνση για κάθε κυτταρικές σειρές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Α) και Β)

In vitro

ChoK δραστικότητα του ελεύθερου κυττάρων εκχυλίσματα από τα επιμολυσμένα κύτταρα κατά τη στιγμή της επιμετάλλωσης, προσδιορίζεται ως η μετατροπή του

14C-επισημασμένου χολίνης προς PCho. C) Οι φωτογραφίες ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος του δοκιμασία μαλακού άγαρ. Ένα σύνολο 10

5 κύτταρα τοποθετήθηκαν ανά 60 mm δίσκο, και ο αριθμός των αποικιών προσδιορίζεται ποσοτικά μετά από 5-8 εβδομάδες επώασης. Δ) και ε) του υπολογιστή που βασίζεται αυτόματη ποσοτικοποίηση του αριθμού των αποικιών, οι μέσες τιμές ± SEM αντιπροσωπεύεται. Η δοκιμασία διεξήχθη 3 ανεξάρτητες φορές με δείγματα εις τριπλούν απόκτηση παρόμοια αποτελέσματα. Η στατιστική σημαντικότητα (p ≤ 0,05) σημειώνεται με αστερίσκο.

Η

Η ικανότητα της ChoKβ να επάγει την ανάπτυξη του όγκου ερευνήθηκε επίσης. Τόσο ChoKα1- και ChoKβ επιμολυσμένα ΗΕΚ293Τ ή MDCK κύτταρα εμβολιάστηκαν υποδορίως σε αθυμικά ποντίκια. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4, η υπερέκφραση του ChoKα1 ήταν αρκετή για να επάγει την ανάπτυξη του όγκου σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς στα δύο κυτταρικά συστήματα που αναλύθηκαν. Σε αντίθεση, τα κύτταρα που υπερεκφράζουν ChoKβ δεν ήταν σε θέση να επάγει την ανάπτυξη του όγκου κάτω από παρόμοιες συνθήκες. Όπως αναφέρεται ανωτέρω, σύγκριση των ρυθμών ανάπτυξης του όγκου μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών σχετίζεται με την ποικίλη αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης, πολύ υψηλότερο σε ΗΕΚ293Τ (aproxm. 80-90%) από ό, τι MDCK (aproxm. 15-20%). Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με αυτά που λαμβάνονται στα μαλακά-άγαρ πειράματα, και έντονα υποδεικνύουν ότι η υπερέκφραση του ChoKβ δεν είναι επαρκής για να επάγει την ανάπτυξη του όγκου κάτω από συνθήκες όπου ChoKα1 κάνει.

ξενομοσχεύματα συστάθηκε με s.c. ένεση των επιμολυσμένων ΗΕΚ293Τ ή MDCK κυττάρων σε αθυμικούς ηυ /ηυ γυμνούς ποντικούς. Α) και Β) Ανάλυση Western Blot του έκτοπη έκφραση της χολίνης ισομορφών κινάσης σε επιμολυσμένα ΗΕΚ293Τ ή MDCK κύτταρα, αντίστοιχα, πριν από τον ενοφθαλμισμό των ποντικών. Γ) και Δ) Ανάλυση της δραστικότητας κινάσης χολίνης σε ChoKα1 ή β1 επιμολυσμένα ΗΕΚ293Τ ή MDCK κύτταρα εκχυλίσματα ελεύθερα πριν τον ενοφθαλμισμό των ποντικών. Ε) και στ) Όγκος των όγκων που δημιουργούνται με υποδόρια ένεση 10

6 επιμολυσμένων κυττάρων. Όγκων όγκος υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο:

Όγκος = [D * d

2] /2

, όπου D και d είναι μεγάλες και μικρές διάμετροι του όγκου, αντίστοιχα. Τα δεδομένα από ΗΕΚ293Τ παριστάνουν τις μέσες τιμές ± SEM από δύο ανεξάρτητα πειράματα (n

1 = 12? N

2 = 16), το πείραμα MDCK αντιστοιχεί σε ένα ισοδύναμο πείραμα με n = 12.

Η

ChoKβ ισομορφή παρουσιάζει προνομιακή δραστηριότητα EtnK

in vivo

η

επόμενο διερευνηθεί αν υπήρχε κάποια διαφορά στην ενζυματική δραστηριότητα των δύο ChoK ισομορφών κάτω από το

in vivo

προϋποθέσεις ότι θα μπορούσε να εξηγήσει απόκλιση βιολογική δράση τους. Έτσι, η δραστηριότητα του ChoKα1 και ChoKβ ως ChoK ή /και EtnK σε ένα σύστημα ολικού κυττάρου ελέγχθηκε. Η ενδοκυτταρική λιπίδια της ανθρώπινης ΗΕΚ293Τ που υπερεκφράζουν ChoKα1, ChoKβ ή επιμολυσμένα με ένα άδειο φορέα, εκχυλίζονται μια αναλύθηκαν. Τόσο, το αδιάλυτο κλάσμα λιπιδίου περιέχει τις υδρόφοβες λιπίδια και συνολική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος φόρτωσης απόκτηση παρόμοια αποτελέσματα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, τα ενδοκυτταρικά επίπεδα φωσφοαιθανολαμίνη αυξήθηκαν σε παρόμοιο βαθμό σε ChoKα1- ή ChoKβ-επιμολυσμένα κύτταρα. Ωστόσο, τα ενδοκυτταρικά επίπεδα φωσφοχολίνη του ChoKβ επιμολυσμένα κύτταρα δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από εκείνη των κυττάρων ελέγχου, ενώ ChoKα1-επιμολυσμένα κύτταρα έδειξαν αυξημένη ενδοκυτταρική επίπεδα PCho (Σχήμα 5Β). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας επιθηλιακά κύτταρα διαφόρων προελεύσεων: ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα μαστού κύτταρα SK-BR-3 (Εικόνα 5C, D.) Ή το ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) κυτταρική γραμμή Η1299 (Σχ 5Ε, F.). Επιπλέον, σε όλες τις κυτταρικές σειρές που αναλύθηκαν, η έκφραση της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε επίσης με ανάλυση Western Blot (Σχ. 5g).

ΗΕΚ293Τ, SK-BR-3 ή Η1299 κύτταρα επιμολύνθηκαν με φορείς ευκαρυωτικής έκφρασης της ανθρώπινης ChoKα1 και ChoKβ1 γονίδιο ή pCDNA3b κενό φορέα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Α), γ) και ε) δραστηριότητα Ενδοκυτταρική EtnK χολίνης α1 β1 κινάσης και ισομορφές σε ακέραια κύτταρα σε ΗΕΚ293Τ, Η1299 και τα κύτταρα SK-BR-3, αντίστοιχα. Β), δ) και στ) δραστηριότητα Ενδοκυτταρική ChoK του ChoKα και ChoKβ ισομορφών σε ακέραια κύτταρα σε ΗΕΚ293Τ, Η1299 και τα κύτταρα SK-BR-3, αντίστοιχα. Η ποσότητα του

14C-PCho και

14C-ΡΕΤΝ εκχυλίστηκαν και ποσοτικοποιείται όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν δείγματα, επαναλαμβάνεται 3 φορές, και οι μέσες τιμές ± SEM από όλα τα πειράματα εκτιμηθεί. Η στατιστική σημαντικότητα (p ≤ 0,05) σημειώνεται με αστερίσκο. Ένα τυπικό πείραμα τα αποτελέσματα ραδιοσήμανσης σε περίπου 70% της ένωσης ενσωμάτωση ραδιενεργού εντός των κυττάρων. G) Αντιπρόσωπος Western Blot της έκτοπης ChoKα1 ή έκφραση ChoKβ1 σε κάθε κυτταρική σειρά. Αρχικές τιμές επιλεγεί ως 1-φορές στα γραφήματα για κάθε κυτταρική σειρά αντιπροσωπεύει: κύτταρα ΗΕΚ293Τ (PCho: 1153 cpm? ΡΕΤΝ: 1231 cpm)? κύτταρα Η1299 (PCho: 22821 CPM? PETN: 13.339 cpm)., και SK-Br-3 κύτταρα (PCho: 18.620 cpm, PETN: 3151 cpm)

Η

Έτσι, η διαφορά ενζυματική δραστηριότητα του ChoKα1 και ChoKβ βρέθηκαν σε ΗΕΚ293Τ δεν είναι κυτταρική σειρά ειδικών. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ChoKα1 αλλά δεν ChoKβ, είναι σε θέση να επάγει αυξημένα ενδοκυτταρικά επίπεδα PCho υπό

in vivo

συνθήκες. Ωστόσο, υπό τις ίδιες συνθήκες και τα δύο ένζυμα είναι σε θέση να παράγουν phophorylethanolamine. Έτσι, ακόμα κι αν ChoKβ εμφανίζει δραστηριότητα τόσο ChoK και EtnK κάτω από το

in vitro

συνθήκες, δείχνει προνομιακή EtnK δραστηριότητα

in vivo

.

Αυξημένα επίπεδα ChoKα mRNA, αλλά δεν ChoKβ στον όγκο που προέρχονται από κυτταρικές σειρές

για να διερευνήσει περαιτέρω την καταλληλότητα του κάθε ισοενζύμου ChoK στην ογκογένεση, προσδιορίσαμε τα επίπεδα τόσο του mRNA ChoKα και ChoKβ σε μια ομάδα ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών που προέρχονται από ποσοτική τεχνολογία PCR . Ένα πάνελ των κυτταρικών γραμμών καρκίνου του μαστού και του πνεύμονα σε σύγκριση με την πρωτογενή, γηρασμένα, μη καρκινική κυτταρική σειρά HMEC (ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα μαστού) ή τα αθανατοποιημένα, μη-ογκογόνο κύτταρα ΜΟΡ10Α ως των κυττάρων του μαστού έλεγχος γραμμές, και πρωτογενή κύτταρα Βρογχικό Επιθηλιακά ( BEC) ως έλεγχος του πνεύμονα κυτταρική γραμμή. Όλα καρκινικών κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν υπερεκφράζουν σημαντικά ChoKα mRNA σε σύγκριση με τις κανονικές κυτταρικές γραμμές, ενώ Δεν βρέθηκαν αλλαγές για τα επίπεδα ChoKβ mRNA (Εικ. 6). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ChoKβ δεν ρυθμίζεται αυξητικά ειδικά σε κύτταρα του μαστού ή του καρκίνου του πνεύμονα, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα υψηλά επίπεδα του ChoKβ δεν απαιτούνται για την προώθηση του καρκίνου.

Q-PCR διεξήχθη για να προσδιοριστεί το επίπεδο της έκφρασης του mRNA σε μη-ογκογόνο μαστικού κυτταρικές γραμμές (HMEC, ΜΟΡ10Α), κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού (MDA-ΜΒ435, ΜϋΑ-ΜΒ468, T47D, MCF7), μη-ογκογόνο πνευμονικά κύτταρα (BEC) και καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές (H510, Η82). Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν με το ενδογενές 18S ριβοσωματικού RNA. Για τη σύγκριση μεταξύ των καρκινικών και μη καρκινικών κυτταρικών σειρών, η 2

-ΔΔCt μέθοδος εφαρμόστηκε και συνδεθείτε

10 RQ εκπροσωπείται. Σημειώστε ότι τα δεδομένα που αναφέρονται στα ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα μαστού επίπεδα (HMEC) mRNA σε κυτταρικές σειρές του μαστού και μη σημαντική διαφορά στο επίπεδο τόσο της ChoK ισομορφές mRNA βρέθηκε με την κανονική ΜΟΡ10Α κυτταρική γραμμή. Η αναφορά για τον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων ήταν τα πρωτογενή κύτταρα Βρογχικό Επιθηλιακά (BEC).

Η

MN58b είναι ένας ειδικός αναστολέας του ChoKα ισομορφής

Η επίπτωση της ChoKα στην ανθρώπινη καρκινογένεση έχει χρησιμοποιηθεί για ο σχεδιασμός των ειδικών αναστολέων αυτού του ενζύμου ως νέου αντικαρκινικό στρατηγική [2], [14], [37]. MN58b είναι η κορυφαία ένωση για να υποστηρίξει αυτή τη νέα στρατηγική, δεδομένου ότι έχει αποδειχθεί μια ισχυρή αντικαρκινική δραστηριότητα κάτω από το

in vivo

συνθήκες σε σχέση με τα μοντέλα ανθρώπινου παχέος εντέρου, του πνεύμονα, του μαστού και της ουροδόχου κύστης όγκων [15], [37].

Η πρωτογενής δομή του ChoKβ θηλαστικών εμφανίζει μια συνολική 60% ομολογία με εκείνη του ChoKα1 [1]. Ο υψηλότερος βαθμός ομολογίας βρίσκεται εντός του πεδίου κινάσης χολίνης /αιθανολαμίνης. Αυτή η ομολογία θα μπορούσε να καταστήσει επιρρεπή σε παρόμοια αναστολή τόσο για ChoKα1 και ChoKβ με τους ίδιους αναστολείς. Έτσι, ερευνήσαμε την ιδιαιτερότητα του MN58b έναντι αυτών των δύο ChoK ισοενζύμων προκειμένου να εξακριβωθεί εάν αντικαρκινική δράση του σχετίζεται ειδικά με την αναστολή της άλφα ισομορφή, ότι είναι η μία εμπλέκεται σε εξέλιξη του όγκου, ή το φάρμακο επηρεάζει ομοίως και τα δύο ισόμορφα. Χρησιμοποιώντας τις ανθρώπινες ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες ChoKα1 και ChoKβ, πραγματοποιήσαμε μια

in vitro

ChoK δοκιμασία αναστολής δραστηριότητας με αυξανόμενες συγκεντρώσεις MN58b, τον καθορισμό της IC

50 για κάθε ένζυμο. Όπως ήταν αναμενόμενο, παρά την υψηλή ομοιότητα εμφανίζεται μεταξύ ισομορφών ChoK, MN58b έδειξε μια πολύ υψηλότερη ειδικότητα έναντι ChoKα1 (IC

50 = 5 μΜ) από ό, τι κατά ChoKβ (IC

50 = 107,5 μΜ). Έτσι, MN58b είναι 21,5 φορές πιο ισχυρό από ChoKα1 από ChoKβ ισομορφή.

Συζήτηση

Η οικογένεια του ανθρώπινου κινασών χολίνης /αιθανολαμίνης περιλαμβάνει δύο γονίδια,

CHKA

και

CHKB

που κωδικοποίηση για τρία ένζυμα, ChoKα1 (52 kDa), ChoKα2 (50 kDa) και ChoKβ1 (45 kDa). ChoKα1 και ChoKα2 είναι σχεδόν ταυτόσημα, εκτός από ένα τέντωμα των 18 επιπλέον αμινοξέα σε ChoKα1, όπως προκύπτουν από διαφορικό μάτισμα από το ίδιο γονίδιο,

CHKA

. Ενώ η επίπτωση της ChoKα1 στη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης και του καρκίνου έχει εκτεταμένα καταδειχθεί [13], [15], [27], [28], [37], [38], [44], τα προκαταρκτικά στοιχεία δείχνουν ότι ChoKβ δεν μπορεί να συμμετέχει στην καρκινογένεση, δεδομένου ότι δεν υπερεκφράζεται στον καρκίνο του μαστού κυτταρικές γραμμές [21], ούτε στο μοντέλο καρκίνου του προστάτη TRAMP ποντικών [31].

Μια ξεχωριστή οικογένεια ανθρώπινο γονίδιο έχει περιγραφεί ότι κωδικοποιεί για την δραστικότητα EtnK [45], υποδηλώνοντας ότι EtnK1 είναι το κύριο ένζυμο που εμπλέκεται στην ομοιόσταση ΡΕ. Ο τομέας ChoK /EtnK εκχωρεί σε ChoKα και ChoKβ την ικανότητα να λειτουργεί τόσο ως δραστηριότητα ChoK και EtnK υπό συνθήκες ελεύθερου κυττάρων [1], [3] – [5], αλλά εξακολουθεί να είναι άγνωστο αν αυτές οι προηγουμένως χαρακτηριζόμενη ένζυμα έδειξαν καμία εκλεκτικότητα σε κάθε κλάδο της οδού Kennedy στο

de novo

σύνθεση του PC ή PE. Έχει περιγραφεί πρόσφατα την διαφορετική ειδικότητα προς Cho και ETN των δύο ισομορφών του Cho /EtnK του

Tripanosoma brucei

. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η

Tb

Cho /Etn1 εμφανίζει μόνο EtnK δραστηριότητα,

Tb

δραστηριότητες Cho /Etn2 εμφανίζει τόσο ChoK και EtnK

in vitro

[46]. Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με αυτά που περιγράφονται για EtnK1 ποντικού που είναι ETN συγκεκριμένες και EtnK2 που εμφανίζει μια διπλή λειτουργία ChoK /EtnK [45], [47]. Από την άλλη πλευρά, ενώ ποντικού Pcyt1α και Pcyt1β εμπλέκονται στη βιοσύνθεση PC, Pcyt2 εστιάζεται σε ΡΕ μόνο [48].

Ωστόσο, δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητή η οποία ChoK ισομορφή, εάν υπάρχουν, συμβάλλει

in vivo

σε κάθε οδό να διατηρηθεί η κανονική ομοιόσταση των δύο PC και ΡΕ σε βιολογικές μεμβράνες. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ επιβεβαιώνουν ότι αμφότερα τα ένζυμα έχουν την ικανότητα να φωσφορυλιώνουν χολίνη και αιθανολαμίνη υπό συνθήκες άνευ κυττάρων, είτε ως ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες που παράγονται σε

E. coli

, ή σε κυτταρικά εκχυλίσματα από κύτταρα θηλαστικών. Ωστόσο, βρήκαμε ότι υπό συνθήκες πλήρους κυττάρου ChoKα1 έχει την ικανότητα να λειτουργεί τόσο ως ChoK και EtnK, αλλά ChoKβ επηρεάζει μόνο την παραγωγή PETN. Τα ευρήματα των διαφορετικών ρόλων για α και β ισομορφές είναι σύμφωνα με τις πληροφορίες από το πρόσφατα δημιουργηθέν Knock Out (KO) ποντίκια για ChoKα και ChoKβ γονίδια [49], [50]. Έτσι, ChoKβ ΚΟ ποντίκια (

RMD

ποντίκια) είναι βιώσιμο, αλλά να αναπτύξει μια κεφαλοουραία μυϊκή δυστροφία, ενώ τα φυσιολογικά επίπεδα λιπιδίων PC που βρέθηκαν στους περισσότερους ιστούς που αναλύθηκαν εκτός hindlimb σκελετικούς μύες [49]. Ως εκ τούτου, ChoKα είναι επαρκής για να διατηρήσει τα κανονικά επίπεδα PC σε περισσότερους ιστούς. Αντιθέτως, η έλλειψη ChoKα οδηγεί σε εμβρυϊκή θνησιμότητα, και ChoKα

+/- ετεροζυγωτικά ποντίκια εμφανίζουν μια συσσώρευση Cho και μείωση της PCho στο ήπαρ και τους όρχεις, γεγονός που υποδηλώνει ότι δεν υπάρχει αποζημίωση ChoKβ για βιοσύνθεση PC

in vivo

. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν διαφορετικούς ρόλους

in vivo

τόσο για ChoKα και ισομορφές ChoKβ. Επιπλέον, τα εξασθενημένα επίπεδα ΡΕ βρέθηκαν σε ChoKα

+/- ετεροζυγωτικά ποντίκια υποδεικνύουν την εμπλοκή ChoKα όχι μόνο στη βιοσύνθεση του PC, αλλά και στην οδό ΡΕ. Αυτό συνάδει επίσης με το γεγονός ότι στα ποντίκια ChoKβ ΚΟ, τα επίπεδα ΡΕ δεν επηρεάζονται, υποδεικνύοντας ότι ομοιόσταση PE διατηρείται πλήρως με τις πρωτεΐνες EtnK1 και ChoKα ανέπαφη.

Η ομάδα της Ishidate παρείχε πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με το

in vitro

δραστικότητα ChoK από διάφορους ιστούς ποντικού, και έχουν ως αίτημα ότι η πιο δραστική μορφή για τη δράση της κινάσης χολίνης είναι το ομοδιμερές α /α που ακολουθείται από ετεροδιμερή α /β, που είναι η β /β ομοδιμερείς το λιγότερο δραστικό μορφή [8]. Οι

in vivo

αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ είναι εν μέρει σύμφωνη με αυτή την υπόθεση. Η

in vivo

δραστηριότητα ChoKβ επικεντρώνεται στη βιοσύνθεση PE και εμφανίζει υψηλότερη Km για τη χολίνη από ChoKα, αυτό θα μπορούσε να είναι ο λόγος β /β διμερή παρουσιάζουν χαμηλή δραστηριότητα ChoK. Όταν ChoKβ υπερεκφράστηκε παρατηρήσαμε μια αύξηση στα ενδοκυτταρικά επίπεδα του ΡΕΤΝ αλλά όχι του PCho. Ωστόσο, δεν βρέθηκαν διαφορές μεταξύ των δύο ισομορφών για την παραγωγή ΡΕΤΝ, αφού και οι δύο εμφανίζουν παρόμοια δραστηριότητα EtnK.

PCho έχει προταθεί για την προώθηση μιτογένεση σε κύτταρα θηλαστικών [12]. Σε συμφωνία με αυτό, μαγνητικές τεχνικές φασματοσκοπία αποκάλυψαν υψηλότερα επίπεδα phosphomonoesthers στην ογκική δείγματα σε σύγκριση με τους αντίστοιχους φυσιολογικούς [19] – [24]. Επιπλέον, η υπερέκφραση του ChoKα1 είναι ογκογόνου [15], και ενισχυμένη δραστηριότητα ChoKα είναι ένα συχνό χαρακτηριστικό σε νεοπλασματικά δείγματα σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς [27], [28]. Στο σύνολό τους όλα αυτά τα αποτελέσματα έντονα υποδεικνύουν ότι η δραστηριότητα ChoKα1 και τα επίπεδα PCho έχουν μια ισχυρή επίπτωση στον καρκίνο. Επιπλέον, η υπερέκφραση του ChoKα1 ως αποτέλεσμα μια αύξηση στη δραστηριότητα EtnK και τα επίπεδα ΡΕΤΝ. Ωστόσο, η τελευταία αυτή επίδραση από μόνη της δεν είναι επαρκής για να προκαλέσει τον μετασχηματισμό των κυττάρων, δεδομένου ότι η υπερέκφραση του ChoKβ δεν διεγείρει αυξημένη σχηματισμό αποικίας σε μαλακό άγαρ ή την ανάπτυξη του όγκου σε γυμνά ποντίκια. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με την υπόθεση ότι είναι η παραγωγή PCho τι συνδέεται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μετασχηματισμό που διαμεσολαβείται από ChoK, και ότι η παραγωγή του ΡΕΤΝ μπορεί να μην είναι επαρκείς ή συναφείς σε αυτή τη διαδικασία.

Η ανωτέρω τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι δύο ισομορφές ChoK διερευνήθηκε, πέρα ​​από την ομοιότητά τους σε πρωτογενείς αλληλουχίες τους, εμπλέκονται σε διαφορετικές μεταβολικές οδούς. Έτσι, ενώ ChoKα1 προσκρούει σε δύο σύνθεσης PC και PE, ChoKβ επηρεάζει μόνο την σύνθεση PE. Επιπλέον, η ικανότητα μετασχηματισμού φαίνεται να είναι αποκλειστική στο ισομορφή ChoKα. Ωστόσο, δεδομένου ότι στο ανθρώπινο ΗΕΚ293Τ, Sk-Br-3 και κυτταρικές σειρές Η1299, ChoKα1 υπερέκφραση παράγει αυξημένα επίπεδα τόσο PCho και ΡΕΤΝ, ενώ παρόμοιες ChoKβ υπερέκφραση αποτελέσματα μόνο σε υψηλότερα επίπεδα ΡΕΤΝ, αλλά φυσιολογικά επίπεδα της PCho, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε έξω από το ενδεχόμενο ότι ο μετασχηματισμός των κυττάρων απαιτεί τόσο δραστηριότητες ChoK και EtnK.

Σύμφωνα με την ιδέα που συνδέει ογκογόνο δραστηριότητα με τη λειτουργία του ChoKα, αλλά όχι ChoKβ, η αντιπολλαπλασιαστική και κατά του όγκου δραστικότητα του MN58b συνδέθηκε μόνο με την δραστηριότητα της ChoKα. Επιπλέον, όπως έχει ήδη αναφερθεί, η

in vivo

θεραπεία με MN58b καταλήγει σε μία συγκεκριμένη μείωση των επιπέδων PCho στους όγκους, αλλά χωρίς σημαντική επίδραση στα επίπεδα του ΡΕΤΝ [51]. Προηγούμενα αποτελέσματα από την ομάδα μας έχουν δείξει ότι MN58b αναστέλλει επίσης χολίνη μεταφορών [38]. Ωστόσο η επίδραση αυτή έχει μια μικρή επιρροή στην αντιπολλαπλασιαστική και αντικαρκινική δραστικότητα του φαρμάκου από το HC-3, ένα πολύ πιο ισχυρός αναστολέας των μεταφορέων χολίνης, είναι πολύ λιγότερο ισχυρός ως ανασταλτικός παράγοντας από MN58b [2]. Επιπλέον, MN58b έχει μια διαφορετική επίδραση επί είτε φυσιολογικά ή καρκινικά κύτταρα, μια ισχυρή επίδειξη ενός διαφορικού δραστηριότητα οφείλεται στην αναστολή ChoK [38] – [40]. Τα αποτελέσματα αυτά συνάδουν επίσης με την παρατήρηση ότι ChoKα αλλά δεν ChoKβ είναι μεταγενέστερος στόχος των ογκογόνων μορίων όπως Ras και RhoA. Έτσι, ενώ Ras ενεργοποιεί ChoKα μέσω Ral-GDS και PI3K [29], και RhoA ενεργοποιεί ChoKα μέσω ROCK [15], κανένα από αυτά τα ογκογόνο GTPases επηρεάζουν δραστηριότητα ChoKβ κάτω από παρόμοιες συνθήκες. Και πάλι, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι παρόλο που και οι δύο ένζυμα ChoK είναι σε θέση να φωσφορυλιώνει τόσο χολίνη και αιθανολαμίνη υπό ελεύθερα κυττάρων συνθήκες συστήματα, εμφανίζουν διαφορετικές συγγένειες για αυτά τα υποστρώματα, και σε συνθήκες δοκιμασίες ολικού κυττάρου ρυθμίζονται από διακριτά ρυθμιστικά μονοπάτια.

Τέλος, η συμμετοχή των ChoKβ στον καρκίνο του μαστού και του πνεύμονα έχει μελετηθεί, ChoKα και β mRNA επίπεδα προσδιορίστηκαν από την Q-PCR. Όλα προέρχονται από όγκους κυτταρικών σειρών αναλύθηκαν σημαντικά υπερεκφράζουν ChoKα mRNA, ενώ Δεν βρέθηκαν αλλαγές στην έκφραση του ChoKβ. Παρόμοια αποτελέσματα έχουν αναφερθεί πρόσφατα, χρησιμοποιώντας ημι-ποσοτική PCR σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού [21].