Αφηρημένο

Αυτή η μελέτη είχε ως στόχο να διερευνήσει τη δράση κατά των όγκων του RY10-4, ένα μικρό μοριακού που σχεδιάστηκε και συντέθηκε με βάση τη δομή του protoapigenone. Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η διαλογή RY10-4 κατείχε αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα έναντι κυττάρων ανθρώπινου ηπατοκυτταρικού καρκινώματος HepG2. Ωστόσο, το πλήρες φάσμα των RY10-4 αντικαρκινικές επιδράσεις σε όγκους του ήπατος και των υποκείμενων μηχανισμών που δεν έχουν εντοπιστεί. Εδώ, χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής, και ανάλυση στυπώματος Western, έχουμε αποδείξει ότι RY10-4 μπορεί να επάγει αναστολή του κυτταρικού κύκλου, η ενδοκυτταρική αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) παραγωγή και απόπτωση σε κύτταρα HepG2. Στο μοντέλο όγκου ξενομοσχεύματος κυττάρων HepG2, RY10-4 ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των όγκων και απόπτωση που επάγεται σε κύτταρα όγκου, με μικρή παρενέργειες. Επιπλέον, RY10-4 προκάλεσε την καταστολή της ενεργοποίησης STAT3, η οποία μπορεί να εμπλέκεται η επαγωγή απόπτωσης. Επιπλέον, RY10-4 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των Hep3B και τα κύτταρα ανθρώπινου καρκινώματος ηπατοκυτταρικού ΗυΗ- 7 σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι RY10-4 έχει μεγάλες δυνατότητες για την ανάπτυξη ως χημειοθεραπευτικό παράγοντα για καρκίνο του ήπατος

Παράθεση:. Zhang Χ, Wang Υ, Han S, Xiang Η Peng Υ, Wu Y, et al. (2016) RY10-4 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό του ανθρώπινου ηπατοκυτταρικού Καρκίνου HepG2 κύτταρα από επαγωγή της απόπτωσης

In Vitro

και

In Vivo

. PLoS ONE 11 (3): e0151679. doi: 10.1371 /journal.pone.0151679

Συντάκτης: William B. Coleman, του Πανεπιστημίου της Βόρειας Καρολίνας Σχολή Ιατρικής, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 20, Οκτώβρη 2015? Δεκτές: 2, Μάρτη του 2016? Δημοσιεύθηκε: 14 Μαρτίου 2016

Copyright: © 2016 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 31270390, για να YYW) και το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Hubei (Νο 2015CFC852, να XZ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Σύμφωνα με την τελευταία παγκόσμια στατιστική του καρκίνου, ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα είναι η τρίτη κατά σειρά αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται με όλο τον κόσμο [1]. Ως μία από τις σημαντικότερες μεθόδους θεραπείας του καρκίνου, η χημειοθεραπεία έχει αποτελεσματικότητα στην παράταση και τη βελτίωση της ποιότητας ζωής των ασθενών [2]. Έρευνα των μικρών μοριακών ενώσεων με δραστικότητα κατά του όγκου έχει σημαντικά οφέλη για την ανάπτυξη νέων παραγόντων χημειοθεραπείας. Μερικές μικρές μοριακές ενώσεις, όπως επιλεκτική θανάτωση καρκινικών κυττάρων piperlongumine [3] και obtusaquinone [4], στόχευσης και, θα μπορούσε να είναι πολλά υποσχόμενη θεραπευτικούς του καρκίνου παράγοντες.

Χρησιμοποιώντας φυσικά προϊόντα όπως ο μόλυβδος ένωση είναι ένα χρήσιμο και εφικτό μέθοδος ανάπτυξη φαρμάκων. Με βάση την δομή ενός φυσικού προϊόντος protoapigenone, RY10-4 σχεδιάστηκε και συντέθηκε με Yuan

κ.ά.

. στο εργαστήριο μας, και έδειξε ισχυρή αντι-νεοπλασματικές ενεργότητες έναντι πολλαπλών καρκινικών κυτταρικών σειρών του ανθρώπου [5]. χημική δομή της ήταν κοντά στο protoapigenone, ενώ η δραστηριότητα κατά του όγκου της ήταν βελτιώθηκε και οι παρενέργειες μειώθηκαν. Οι μηχανισμοί που μεσολαβούν την δραστικότητα κατά του όγκου των RY10-4 περιλαμβάνονται επαγωγή της αυτοφαγία ή απόπτωση σε κυτταρικές γραμμές ανθρώπινου μαστού ή καρκίνου του πνεύμονα, αντίστοιχα [6,7]. Σε προηγούμενη μελέτη διαλογής, RY10-4 επέδειξε αξιοσημείωτη αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα επί HepG2 ανθρώπινου ηπατοκυτταρικού καρκινικά κύτταρα

in vitro

, και ανέστειλε την ανάπτυξη του ηπατοκυτταρικού ποντίκι Η22 όγκου

in vivo

[5] . Ωστόσο, απαιτείται περαιτέρω έρευνα για να κατανοήσουμε πλήρως τις επιδράσεις κατά του όγκου των RY10-4 σε καρκίνο του ήπατος και δυναμικό τρόπο δράσης. Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι RY10-4induces απόπτωση σε HepG2 καρκίνο του ήπατος κύτταρα τόσο

in vitro

και

in vivo

, και ως εκ τούτου έχει την ικανότητα να καταστέλλουν τους όγκους στο ήπαρ.

Υλικά και μέθοδοι

Regents και αντισώματα

RY10-4 (& gt? 95%) παρασκευάστηκε προηγουμένως στο εργαστήριο μας όπως περιγράφεται από Yuan et al. [5]. Σουλφοροδαμίνης Β (SRB) αγοράστηκε από την J & amp? Κ Scientific (Πεκίνο, Κίνα). Διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και Ν-ακετυλοκυστεϊνη (NAC) αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). Hoechst 33342, ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ), αντιδραστική κιτ δοκιμασίας είδη οξυγόνου (DCFH-DA), RIPA ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, BCA κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης, και BeyoECL συν χημειοφωταύγειας κιτ ελήφθησαν από Beyotime Inc. (Σαγκάη, Κίνα). κιτ ανίχνευσης απόπτωσης V-FITC /PI αννεξίνη αγοράστηκε από keygen Biotech (Nanjing, Κίνα). Ειδικά αντισώματα έναντι Bcl-2, Βαχ, ρ53, κυκλίνη Ε, CDK2, που διασπάται caspase3, ακτίνη, STAT3, ρ-STAT3, ρ21, GAPDH και τα αντίστοιχα δευτερογενή αντισώματα ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ, USA).

γραμμή κυττάρων και κυτταρική καλλιέργεια

ανθρώπινου ηπατοκυτταρικού κυτταρικές σειρές καρκίνου ΗυΗ- 7 HepG2, Hep3B και αγοράστηκαν από την Κίνα Center for Type Culture Collection, CCTCC). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ, Hyclone) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) ορό εμβρύου μόσχου (FBS, Hyclone) και διάλυμα αντιβιοτικού (100 μg /ml στρεπτομυκίνη και 100 IU /ml πενικιλίνη), σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στους 37 ° C.

δοκιμασία SRB

Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία SRB όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6]. Εν συντομία, τα κύτταρα HepG2 σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 96 φρεατίων (5000 κύτταρα ανά φρεάτιο), και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με μία σειρά συγκεντρώσεων RY10-4. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 10% τριχλωροοξικό οξύ επί 1 ώρα στους 4 ° C, και πλύθηκαν με 1% οξικό οξύ. Τα σταθεροποιημένα κύτταρα βάφτηκαν με 0,4% SRB επί 15 λεπτά, πλένονται τέσσερις φορές και αφέθηκε να ξηρανθεί σε θερμοκρασία δωματίου. Η δεσμευμένη χρωστική διαλυτοποιήθηκε με διάλυμα Tris-Base, και η απορρόφηση στα 540 nm καταγράφηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών (BioTek Instruments, Inc. USA). Για να διερευνηθεί ο ρόλος των ROS σε RY10-4-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο, τα κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με τον καθαριστή ROS NAC (5 mM) για 2 ώρες που ακολουθείται από την κατεργασία με RY10-4 και την κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε.

κλωνογόνος

δοκιμασία

HepG2 κύτταρα στην εκθετική φάση ανάπτυξης σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (1000 κύτταρα ανά φρεάτιο), και αφέθηκαν να προσκολληθούν. Μετά τη θεραπεία με αύξοντα συγκεντρώσεις RY10-4 για 24 ώρες, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο χωρίς φάρμακα μέχρι ορατές αποικίες. Οι αποικίες των κυττάρων στη συνέχεια μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με διάλυμα 0,5% χρώσης crystal violet.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, η κατανομή φάση του περιεχομένου DNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ΡΙ χρώση. Μετά τη θεραπεία με 0, 0,9, 1,8, και 2.7μM του RY10-4 για 24 ώρες, τα κύτταρα HepG2 συλλέχθηκαν και μονιμοποιήθηκαν με 70% αιθανόλη όλη τη νύκτα στους -20 ° C. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν και χρωματίστηκαν με διάλυμα χρώσης ΡΙ (50 μg /ml ΡΙ και 10 μg /ml RNase) για 30 λεπτά στο σκοτάδι. Η κατανομή κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας το λογισμικό ΟβΙΙ Quest-(Becton Dickinson, USA).

Μέτρηση του ενδοκυτταρικού

παραγωγή ROS

DCFH-DA χρησιμοποιήθηκε ως φθορίζοντα ανιχνευτή για τη μέτρηση της ενδοκυτταρικής παραγωγή ROS με κυτταρομετρία ροής. Εν συντομία, κύτταρα HepG2 σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων. Μετά προσκόλληση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις RY10-4. Στη συνέχεια, το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν με 10 μΜ DCFH-DA για 20 λεπτά στο σκοτάδι. Τα βαμμένα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (Becton Dickinson, USA). Σε μερικά πειράματα, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με την καθαριστή NAC ROS.

Η απόπτωση

ανίχνευση

κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις RY10-4 και αναλύθηκαν για απόπτωση χρησιμοποιώντας είτε Hoechst 33342 χρώσης ή Αννεξίνη V-FITC /PI. Εν συντομία, μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Hoechst 33342 για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, μετά πλύθηκαν και παρατηρήθηκαν κάτω από ένα φθορίζον ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Nikon Eclipse, Ιαπωνία). Εναλλακτικά, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με κιτ ανίχνευσης Annexin V-FITC /ΡΙ απόπτωσης σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή? τα αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν με cytomety ροής (Becton Dickinson, USA).

κηλίδος

δοκιμασία

έκφραση Western πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με στύπωση Western. Εν συντομία, οι συνολικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν με RIPA ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 1% φαινυλομεθανοσουλφονυλοφθορίδιο (PMSF) και 1% κοκτέιλ. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF (Bio-Rad). Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε από 5% άπαχο γάλα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και επωάζεται με ένα ειδικό πρωτογενές αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Η μεμβράνη στη συνέχεια πλύθηκε και επωάστηκε με ένα αντίστοιχο δευτερεύον αντίσωμα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Το συγκεκριμένο σύμπλεγμα πρωτεΐνης-αντισώματος οπτικοποιήθηκε με ECL συν χημειοφωταύγειας κιτ.

Γυμνό μοντέλο ποντικού ξενομοσχεύματος

Όλα τα πειράματα σε ζώα έχουν εγκριθεί από το Θεσμικό Ζώων Επιτροπή Ηθικής της Huazhong Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας, η Κίνα . Όλα τα πειραματόζωα υποβλήθηκαν σε θεραπεία σε συμμόρφωση με τις κατευθυντήριες γραμμές που προτείνει Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήσης, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. Τεσσάρων έως πέντε εβδομάδων BALB /c γυμνά ποντίκια (Νο 4304701485) αγοράστηκαν από Χουνάν SJA Εργαστήριο Ζώων & ΣΙΑ ΕΠΕ (Χουνάν, Κίνα). Οι ποντικοί στεγάστηκαν κάτω από ειδικές συνθήκες ελεύθερες παθογόνων με ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή τρωκτικών και νερό στους 20-22 ° C με κύκλο φωτός-σκότους 12 ωρών, και εγκλιματίστηκαν για μία εβδομάδα πριν από το πείραμα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα HepG2 (2 × 10

6) ενέθηκαν υποδορίως σε κάθε ποντικό. Όταν οι όγκοι των εγκατεστημένων όγκων έφθασε 100-200 mm

3, οι ποντικοί τυχαιοποιήθηκαν στις ακόλουθες ομάδες: αλατούχο ελέγχου, RY10-4 χαμηλής δόσης (5 mg /kg) έλαβαν ομάδα και RY10-4 υψηλή δόση (50 mg /kg) ομάδα αγωγής. Το σωματικό βάρος και ο όγκος του όγκου των ζώων που μετρήθηκαν μία φορά την εβδομάδα. Τα ποντίκια παρατηρήθηκαν καθημερινά για εξέλκωση, κοιλιακή διόγκωση, απίσχνανση και /ή άλλα συμπτώματα δυσφορίας. Όταν ένας ποντικός υπέβαλε την ανωτέρω σύμπτωμα (ες) και πιστευόταν ότι το ποντίκι δεν θα επιβιώσουν, θα θυσιάστηκε και ο χρόνος θανάτου καταγράφηκε. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε με τον τύπο: V =

ab

2/2 (

μια

,

β

είναι το μήκος του όγκου και το πλάτος, αντίστοιχα). Ο όγκος σχετική όγκου (RTV) = V

T /V

0, όπου V

0 είναι ο όγκος του όγκου μετρήθηκε κατά το χρόνο της πρώτης χορήγησης του φαρμάκου και V

t αντιπροσωπεύει κάθε μέτρηση του όγκου μετά η θεραπεία. Στο πειραματικό τελικό σημείο, όλοι οι ποντικοί θυσιάστηκαν με αυχενική εξάρθρωση υπό αναισθησία με αιθέρα.

Ιστοπαθολογία και ανάλυση ανοσοϊστοχημείας

Ένα μέρος του δείγματος του ιστού του όγκου μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη. Τομές ιστού (4 mm) παρασκευάστηκαν και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη /ηωσίνη (Η &? Ε) σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο. Το άλλο μέρος του δείγματος καταψύχεται στους -80 ° C, στη συνέχεια καταψύχθηκε διατομής σε 4 έως 10 μm πάχους τομές. Οι τομές αποκλείσθηκαν με 5% BSA και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά την πλύση, οι τομές επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με HRP, ακολουθούμενη από την εφαρμογή ενός κιτ ανάπτυξης χρώματος DAB (Beyotime Inc., Κίνα). Οι εικόνες που έχουν καταγραφεί κάτω από ένα μικροσκόπιο (Nikon, Ιαπωνία).

Η στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± Τ.Α. από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση μονόδρομης ANOVA με posttest Dunnett.

P

τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το

t

test του Student (άλφα επίπεδο: 0.05, δύο-tailed). Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων θεωρήθηκαν σημαντικές σε

P

τιμές λιγότερο από 0.05.

Αποτελέσματα

Τα αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις των RY10-4 στα κύτταρα HepG2

Όταν τα αποτελέσματα της ανάλυσης SRB είναι γραμμικές σε ένα εύρος του αριθμού των κυττάρων, η δοκιμασία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό του φαρμάκου που προκαλείται κυτταροτοξικότητα [8]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, RY10-4 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HepG2 σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο. Η μισή μέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση (

50 IC) αξία των RY10-4 στα κύτταρα HepG2 ήταν 1,88 μΜ. Επιπλέον, η κλωνογονική δοκιμασία έδειξε ότι η θεραπεία RY10-4 μειώθηκε σημαντικά τους αριθμούς αποικιών των κυττάρων HepG2 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Ο σχηματισμός αποικίας των κυττάρων HepG2 ήταν σχεδόν καταργήθηκε πλήρως από RY10-4 σε συγκέντρωση 3,6 μΜ (Σχήμα 1Β).

(Α) κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις (0.312, 0.625, 1.25, 2.5, 5, και 10 μΜ) του RY10-4? λόγος αναστολής της ανάπτυξης των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία SRB, και το IC

50 τιμή ήταν 1,88 μΜ. (Β) κύτταρα HepG2 σπάρθηκαν σε πολύ χαμηλή πυκνότητα, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με RY10-4 για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο χωρίς φάρμακα για να σχηματίσουν αποικίες. Ο λόγος σχηματισμού αποικίας (% του ελέγχου) υπολογίστηκε.

Η

προκαλείται από RY10-4 διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα HepG2

Η κατανομή του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων HepG2 μετά τη θεραπεία RY10-4 ήταν αξιολογήθηκε με ανάλυση του περιεχομένου του DNA χρησιμοποιώντας χρώση ΡΙ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α και 2Β, RY10-4 σε συγκεντρώσεις 0.9, 1.8, και 2.7 μΜ προκάλεσε μια σημαντική αύξηση στο ποσοστό των κυττάρων στη φάση S. Επίσης, 2.7 μΜ RY10-4 προκάλεσε μια αξιοσημείωτη αύξηση στην φάση G2 /M (

P

= 0.0127). Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι η έκφραση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τον κύκλο των κυττάρων κυκλίνη Ε και CDK2 σε κύτταρα HepG2 μειώθηκε κατόπιν θεραπείας RY10-4 (Σχήμα 2C).

(Α) Κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 0.9, 1.8 , και 2.7μM RY10-4 για 24 ώρες, και το περιεχόμενο DNA αναλύθηκε χρησιμοποιώντας χρώση με ιωδιούχο προπίδιο και κυτομετρία ροής. (Β) κατανομές κυτταρικού κύκλου, που παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. (C) μετά την επεξεργασία με RY10-4, η έκφραση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τον κύκλο των κυττάρων κυκλίνη Ε και CDK2 αναλύθηκε με κηλίδα Western.

Η

επάγεται RY10-4 παραγωγή ενδοκυτταρικής ROS στα κύτταρα HepG2

Η ενδοκυτταρική παραγωγή ROS ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας οξείδωση ευαίσθητο φθορίζοντα ανιχνευτή DCFH-DA. Όπως φαίνεται στο σχήμα 3Α, μετά από θεραπεία με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις RY10-4, η ενδοκυτταρική παραγωγή ROS αυξήθηκε δραματικά στα κύτταρα HepG2. Εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο παρατηρήθηκε, και προ-θεραπεία με NAC (5 mM) για 2 ώρες σχεδόν αντιστραφεί πλήρως το RY10-4 επαγόμενη παραγωγή ROS στα κύτταρα HepG2 (σχήμα 3Β). Σταθερά, προ-αγωγή με NAC εμπόδισε επίσης την μείωση κυτταρικής βιωσιμότητας που επάγεται από RY10-4 (Σχήμα 3C).

(Α) κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις RY10-4, και η παραγωγή ενδοκυτταρικών ROS ήταν ανιχνεύθηκαν όπως περιγράφεται στις μεθόδους. (Β) Τα ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS (% του ελέγχου), παρουσιάζονται ως μέση ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. (Γ) Κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με RY10-4 απουσία ή παρουσία της NAC προεπεξεργασίας? η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία SRB.

Η

RY10-4 επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα HepG2

Η χρώση φθορισμού των πυρήνων και χρώση /ΡΙ Annexin V-FITC έγιναν για την ανίχνευση της απόπτωσης σε κύτταρα HepG2. Σχήμα 4Α απέδειξαν ότι μετά παρατηρήθηκαν θεραπεία με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις RY10-4, συμπυκνωμένους πυρήνες και αποπτωτικά σώματα σε κύτταρα HepG2 με χρώση με Hoechst 33342. Annexin V-FITC χρώση /ΡΙ έδειξε επίσης ότι RY10-4 επαγόμενη απόπτωση σε μία εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση τρόπο (Σχήμα 4Β). Συγκρίνοντας με την ομάδα ελέγχου, το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά σε RY10-4 αγωγή ομάδες (σχήμα 4Γ). Επιπλέον, η απόπτωση που σχετίζονται με πρωτεΐνες ρ53, Bcl-2, Βαχ, και διασπάται κασπάσης-3 αναλύθηκαν με κηλίδα Western. Όπως φαίνεται στο Σχ 4D, η έκφραση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 μειώθηκαν μετά την θεραπεία με RY10-4, ενώ η έκφραση του p53, Bax και διασπασμένη κασπάση 3 αυξήθηκαν σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι RY10-4 μπορεί να επάγει απόπτωση σε κύτταρα HepG2.

(Α) κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις RY10-4 για 24 ώρες, και χρωματίστηκαν οι πυρήνες από την Hoechst 33342. Βέλη δείχνουν συνοπτικές και αποσπασματικές πυρήνες. (Β) Η κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας για την ανίχνευση απόπτωσης σε κύτταρα HepG2 χρησιμοποιώντας χρώση /ΡΙ αννεξίνης V. Εκπρόσωπος κυτταρομετρίας ροής προφίλ φαίνονται. (Γ) Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων, παρουσιάζονται ως μέση ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. (D) Η έκφραση πρωτεϊνών απόπτωσης που σχετίζονται αναλύθηκε με στύπωμα Western σε κύτταρα HepG2 άνευ αγωγής ή υπέστησαν αγωγή με RY10-4.

Δραστηριότητα

Αντι-όγκου RY10-4 σε HepG2 κυττάρων ξενομοσχεύματος μοντέλο

Η αντικαρκινική επίδραση του RY10-4

in vivo

αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Όλοι οι ποντικοί επιβίωσαν καθ ‘όλη την περίοδο του πειράματος, και θυσιάστηκαν υπό αναισθησία με αιθέρα σε πειραματικό τελικό σημείο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, η θεραπεία με RY10-4 οδήγησε σε αξιοσημείωτη αναστολή της ανάπτυξης του HepG2 κυτταρικούς όγκους ξενομοσχεύματος σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου έλαβαν αλατούχο διάλυμα. Στο τέλος του πειράματος, ο όγκος του όγκου ήταν 1,326 ± 407 mm

3, 530 ± 201 mm

3 και 411 ± 108 mm

3 στην ομάδα ελέγχου, χαμηλής δόσης ομάδα RY10-4 θεραπείας και ομάδα θεραπείας RY10-4 υψηλής δόσης, αντίστοιχα. Ο μέσος όγκος του όγκου στην ομάδα ελέγχου έφθασαν σχεδόν επτά φορές του αρχικού όγκου, ενώ οι όγκοι στις ομάδες θεραπείας αυξήθηκαν μόνο περίπου δύο φορές, σε σύγκριση με τον αρχικό όγκο (Σχήμα 5Β). Αναλύσαμε επίσης την έκφραση της απόπτωσης που συνδέονται με τις πρωτεΐνες Bcl-2 και Bax σε δείγματα ιστού του όγκου από κάθε ομάδα με ανοσοϊστοχημεία και στύπωμα Western. Όπως φαίνεται στο Σχ 5C και 5D, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η έκφραση του αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 μειώθηκαν, ενώ η προ-αποπτωτική πρωτεΐνη Bax αυξήθηκε τόσο σε χαμηλές και υψηλές δόσεις RY10-4. Η χρώση έδειξε επίσης μεγάλες περιοχές του θανάτου καρκινικών κυττάρων στις ομάδες θεραπείας (Σχήμα 5Ε). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι RY10-4 θα μπορούσε να προκαλέσει ηπατοκυτταρικό απόπτωση καρκινικών

in vivo

. Το βάρος του σώματος σε κάθε ομάδα δεν άλλαξε σημαντικά κατά τη διάρκεια του πειράματος (Σχήμα 5F), και θεραπεία RY10-4 δεν επηρέασε αίμα βιοχημικούς δείκτες του όγκου-γυμνούς ποντικούς που φέρουν (S1 πίνακας), υποδηλώνοντας ότι RY10-4 έχει πιθανώς λίγο πλευρά επιδράσεις

in vivo

.

(Α) Αντιπροσωπευτική όγκους ξενομοσχεύματος ελήφθη από ποντικούς ελέγχου και ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με RY10-4. (Β) Ο σχετικός όγκος του όγκου (RTV) υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο στις Μεθόδους. (Γ και Δ) Έκφραση του Bcl-2 και Bax στον ιστό του όγκου αναλύθηκε με χρώση ανοσοφθορισμού και στύπωμα Western. χρώση (Ε) HE εκτελέστηκε για παθολογική εξέταση του ιστού του όγκου σε διαφορετικές ομάδες. (F) Οι μέσες σωματικά βάρη των ποντικών σε κάθε ομάδα εκτιμήθηκαν.

Η

Οι μοριακοί μηχανισμοί επαγωγής απόπτωσης από RY10-4 σε κύτταρα HepG2

Από STAT3 ρυθμίζει την έκφραση διαφόρων την ανάπτυξη του όγκου που σχετίζονται με ογκογόνο γονιδίων και παίζει ένα ρόλο κλειδί στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [9], ερευνήσαμε αν RY10-4 μπορεί να ρυθμίσει συστατική ενεργοποίηση STAT3 σε κύτταρα HepG2. Όπως φαίνεται στο Σχ 6Α, RY10-4 ανέστειλε συστατική φωσφορυλίωση του STAT3 (τυροσίνη 705) σε κύτταρα HepG2. RY10-4 επάνω ρυθμισμένη η έκφραση του ρ21, η οποία μπορεί να εμπλέκεται RY10-4 επαγόμενη διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Επιπλέον, η IL-6 (10 ng /ml) αντιστρέφεται RY10-4 προκαλούμενη αδρανοποίηση STAT3, ακολουθούμενη από την αύξηση της έκφρασης κυκλίνης Ε σε RY10-4 επεξεργασμένα HepG2 κύτταρα (Σχ 6Β). Επιπλέον, η προ-θεραπεία με NAC παρεμπόδισε STAT3 κατάργηση και αύξηση ρ53 που προκλήθηκε από RY10-4 σε κύτταρα HepG2 (σχήμα 6C).

(Α) κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις RY10-4, και η έκφραση ρ-STAT3 και ρ21 αναλύθηκε με στύπωμα Western. (Β) κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με RY10-4 με ή χωρίς IL-6 διέγερση? έκφραση του ρ-STAT3 και κυκλίνη Ε αναλύθηκε με στύπωμα Western. (Γ) Κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με RY10-4 απουσία ή παρουσία του NAC προεπεξεργασίας. Η έκφραση του ρ-STAT3 και ρ53 αναλύθηκε με κηλίδα Western.

Η

Τα αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα της RY10-4 σε άλλες κυτταρικές σειρές ηπατοκυτταρικού καρκινώματος

Για να παρατηρήσουμε την αντι-πολλαπλασιαστική επιδράσεις των RY10-4 έναντι άλλων ανθρώπινων κυτταρικών σειρών καρκίνου του ήπατος, επιλέγουμε κυτταρικές γραμμές καρκινώματος Hep3B και ΗυΗ- 7 ηπατοκυτταρική. Όπως φαίνεται στο Σχ 7Α, RY10-4 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των Hep3B και τα κύτταρα ΗυΗ- 7 σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο, και τα κύτταρα Hep3B ήταν πιο ευαίσθητα. Στη συνέχεια, ανιχνεύσαμε τις εκφράσεις των πρωτεϊνών απόπτωσης που σχετίζονται με RY10-4-επεξεργασμένα κύτταρα Hep3B. Όπως φαίνεται στο Σχ 7Β, μετά τη θεραπεία με RY10-4, την έκφραση των ρ53 και Bax αυξήθηκε, ενώ η έκφραση του Bcl-2 μειώνεται.

κύτταρα (Α) ή Hep3B ΗυΗ- 7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με συγκεντρώσεις σειρά του RY10-4, και λόγος αναστολής της ανάπτυξης των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία SRB. κύτταρα (Β) Hep3B υπέστησαν αγωγή με RY10-4, και οι εκφράσεις της απόπτωσης που συνδέονται με τις πρωτεΐνες ρ53, Bcl-2 και Bax αναλύθηκαν με κηλίδα Western.

Η

Συζήτηση

Η φυσικό protoapigenone προϊόν και διάφορα από τα παράγωγά του έχουν δείξει ισχυρά αποτελέσματα κατά του όγκου έναντι ορισμένων ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών [10,11]. Protoapigenone θα μπορούσε να θεωρηθεί ως μια χρήσιμη ένωση μολύβδου για να ανακαλύψουν νέους παράγοντες χημειοθεραπείας. Στο εργαστήριο μας, RY10-4 σχεδιάστηκε και συντέθηκε όπως ένα ανάλογο protoapigenone, ως μια προσπάθεια να αναπτυχθεί μια νέα ένωση κατά του όγκου. Σύμφωνα με ορισμένες προηγουμένως έρευνες και εκθέσεις [12,13], RY10-4 είχε ισχυρές δραστηριότητες κατά του όγκου εναντίον ανθρώπινου κύτταρα καρκίνου του μαστού. Σε μια άλλη έκθεση, RY10-4 θα μπορούσε να προκαλέσει αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα MCF-7, ενώ protoapigenone δεν θα μπορούσε [6]. Επιπλέον, Xue

et al

. ανέφεραν ότι RY10-4 προκαλεί απόπτωση και αναστέλλει την εισβολή σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα Α549 με αναστολή STAT3 σηματοδότηση [7]. Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι RY10-4 έχει μεγάλες δυνατότητες ως νέου παράγοντα κατά του όγκου.

Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε την αντικαρκινική δραστικότητα του RY10-4 σε καρκίνο του ήπατος. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι RY10-4 αποτελεσματικά ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό του καρκίνου του ήπατος HepG2 κύτταρα

in vitro

με την IC

50 τιμή του 1,88 μΜ. Επιπλέον, η κλωνογονική δοκιμασία διεξήχθη για να καθοριστούν οι μακροπρόθεσμες επιπτώσεις των RY10-4 επί κυττάρων HepG2. Η κλωνογονική δοκιμασία συσχετίζεται καλά με την δοκιμασία της ογκογονικότητας

in vivo

, και έχει αποδειχθεί προγνωστική αξία σε δοκιμή χημειοευαισθησία των αντικαρκινικών παραγόντων [14]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αναστολή της ικανότητας κλωνισμού σε RY10-4 επεξεργασμένα HepG2 κύτταρα (Σχήμα 1Β), προτείνοντας ότι RY10-4 έχει μια θεραπευτική δυναμικό κατά του ηπατοκυτταρικού καρκίνου.

Διέγερση διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης είναι τα βασικά μηχανισμοί δράσης πολλών αντικαρκινικών παραγόντων. Έχει αναφερθεί ότι η protoapigenone και τα ανάλογά της καθώς και RY10-4 θα μπορούσε να προκαλέσει διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης, σε ορισμένες ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές [13,15-17]. Εδώ, αναλύσαμε τη διανομή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης των κυττάρων HepG2 μετά από επεξεργασία με RY10-4. Βρήκαμε ότι RY10-4 θα μπορούσε να προκαλέσει διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε S και G2 /M φάσεις, που θα μπορούσε να αποδοθεί στην προς τα κάτω ρύθμιση των πρωτεϊνών συνδέονται με τον κύκλο των κυττάρων κυκλίνη Ε και CDK2 (Σχήμα 2). Επιπλέον, η Hoechst 33342 χρώσης και κηλίδωση /ΡΙ αννεξίνης V-FITC έδειξε ότι RY10-4 επάγεται επίσης εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση απόπτωση σε κύτταρα HepG2 (σχήμα 3). P53 είναι ένα από τα πιο σημαντικά καταστολείς όγκων και στόχευση πρωτεϊνών της οικογένειας ρ53 μπορεί να αποδειχθεί θεραπευτικώς χρήσιμα [18,19]. P53 μπορεί να διεγερθεί από υποξία, καρκινογόνες ουσίες, το οξειδωτικό στρες και άλλων στρεσογόνων παραγόντων, προκαλώντας διακοπή του κυτταρικού κύκλου ή απόπτωση

μέσω

αρκετές οδούς [20]. Οικογένειας Bcl-2 πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένης της προ- και αντι-αποπτωτικών ρυθμιστικές αρχές, διαδραματίζουν επίσης σημαντικό ρόλο στην επαγωγή της απόπτωσης και την επιβίωση των κυττάρων [21,22]. Επιπλέον, οι οικογένεια κασπάσης πρωτεΐνες όπως κασπάση-3 είναι εκτελεστές της απόπτωσης και την ενεργοποίηση των κασπασών θα ξεκινήσει απόπτωση [23]. Μετά τη θεραπεία με RY10-4, την έκφραση του p53, Bax και διασπασμένη κασπάση 3 αυξήθηκε, ενώ η έκφραση του Bcl-2 μειώθηκαν σε κύτταρα HepG2 (σχήμα 3D). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η επαγωγή της απόπτωσης μπορεί να είναι ο υποκείμενος μηχανισμός της δραστικότητας κατά του όγκου για RY10-4 έναντι ανθρώπινου ηπατοκυτταρικού καρκινικά κύτταρα HepG2.

Αδιάσειστα τεκμήρια υποδεικνύουν ότι ROS εμπλέκονται σε μια ποικιλία κυτταρικών προγραμμάτων και παίζει ένα βασικό ρόλο στην ανθρώπινη φυσιολογικές και παθολογικές διεργασίες [24]. Τα καρκινικά κύτταρα συνήθως εμφανίζουν υψηλότερα βασικά επίπεδα των ROS, που έχει διαφορετική οξειδοαναγωγική κατάσταση σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα, και τα υψηλά επίπεδα ROS μπορεί συχνά να προκαλέσει βλάβη των κυττάρων [25,26]. Ως εκ τούτου, την επαγωγή της παραγωγής ROS στα καρκινικά κύτταρα μπορεί να έχει θετικό θεραπευτικό αντίκτυπο. Ενώσεις όπως piperlongumine, obtusaquinone και psoralidin επάγουν ROS παραγωγή αναστέλλοντας έτσι πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων [3,4,27]. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι RY10-4 προκαλούμενη παραγωγή ενδοκυτταρικού ROS, η οποία θα μπορούσε να αναστραφεί δια προκατεργασίας με NAC σε κύτταρα HepG2. Επίσης RY10-4 επαγόμενη κυτταρικός θάνατος αποτράπηκε μερικώς από προθεραπεία NAC (Σχήμα 4). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η παραγωγή ROS μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην προκαλούμενη από RY10-4 HepG2 κυτταρικό θάνατο. Η σχέση μεταξύ RY10-4 απόπτωση και η παραγωγή ROS θα διερευνηθεί περαιτέρω σε μια μελέτη παρακολούθησης. Πολυάριθμες ενδείξεις υποδεικνύουν ότι STAT3 διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη και πρόοδο πολλών ανθρώπινων όγκων, και η καταστολή της ενεργοποίησης STAT3 οδηγεί σε αναστολή της ανάπτυξης και την απόπτωση σε κυτταρικές γραμμές όγκου, καθώς και μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού [9,28]. Στη μελέτη μας, βρήκαμε ότι RY10-4 καταστέλλεται η ενεργοποίηση STAT3 στα κύτταρα HepG2, και το αποτέλεσμα ήταν εξαρτάται από την παραγωγή ROS (Σχήμα 6). Στο σύνολό τους, εξαρτώνται από ROS αδρανοποίηση της STAT3 μπορεί να είναι το μοριακό μηχανισμό της RY10-4 για τη δράση του όγκου αντι-ήπατος.

Σε γενικές γραμμές, μόνο κλινικές δοκιμές μπορεί τελικά να καθορίσει αν ένα νέο μέσο είναι αποτελεσματικό για τη θεραπεία του καρκίνου σε ασθενείς. Ωστόσο, υπάρχουν πολλά ηθικά, ιατρικές και οικονομικές τους περιορισμούς και τους περιορισμούς για κλινικές δοκιμές, ως εκ τούτου, μια βολική πειραματικό σύστημα έχει μεγάλη σημασία για τη διαλογή αντικαρκινικού φαρμάκου [29]. Το γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντίκια χρησιμοποιείται συνήθως για να αξιολογηθεί η βιολογική δραστικότητα των αντικαρκινικών παραγόντων

in vivo

[30,31]. Ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα μπορούν να αναπτυχθούν ως ξενομοσχεύματα σε ένα ποντίκι με ανοσοανεπάρκεια. Σε κάποιο βαθμό, αυτό το μοντέλο είναι χρήσιμο να προβλεφθεί η κλινική ανταπόκριση στη θεραπεία με το φάρμακο. Εδώ, ιδρύσαμε το μοντέλο των κυττάρων ξενομοσχεύματος HepG2 να αξιολογήσει την αντικαρκινική δράση της RY10-4. Βρήκαμε ότι RY10-4 απόπτωση που επάγεται επί του όγκου και σημαντικά ανέστειλε την ανάπτυξη του

in vivo

(Σχήμα 5). Επιπλέον, RY10-4 έχει πιθανότατα μόνο μικρές παρενέργειες

in vivo

, καθώς δεν επηρέασε σωματικό βάρος των ζώων και το αίμα βιοχημικών δεικτών.

Εν κατακλείδι, αυτό το χαρτί αποδεικνύει ότι RY10-4 μπορεί εντυπωσιακά αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων κυττάρων ηπατοκυτταρικού καρκίνου HepG2 τόσο

in vitro

και

in vivo

. Η επαγωγή της απόπτωσης μπορεί να είναι ο υποκείμενος μηχανισμός για τη δραστικότητα κατά του όγκου της. RY10-4 κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου ήπατος

in vivo

χωρίς σημαντική αιματολογική τοξικότητα, ηπατοτοξικότητα ή νεφροτοξικότητα. Επιπλέον, RY10-4 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των Hep3B και τα κύτταρα ανθρώπινου καρκινώματος ηπατοκυτταρικού ΗυΗ- 7 σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι RY10-4 έχει μεγάλες δυνατότητες ως νέο χημειοθεραπευτικό παράγοντα για καρκίνο του ήπατος.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1. Αιματολογικές και βιοχημικές προφίλ για το γυμνούς ποντικούς μετά τη θεραπεία με RY10-4 για 4 εβδομάδες (μέση ± SD, η = 8)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0151679.s001

(DOCX)