Abstract

ΤΟΤΡ έχει εμπλακεί σε μια πληθώρα σημαντικών κυτταρικών διεργασιών που σχετίζονται με την κυτταρική ανάπτυξη, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, κακοήθη μετασχηματισμό και την αναστολή της απόπτωσης. Εκτός από αυτές τις ενδοκυτταρικές λειτουργίες, ΤΟΤΡ έχει εξωκυτταρικό λειτουργίες και παίζει σημαντικό ρόλο σε ανοσοκύτταρα. έκφραση TCTP είχε προηγουμένως δειχθεί ότι απορυθμισμένη στον καρκίνο του προστάτη, αλλά η λειτουργία του σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η έκφραση ΤΟΤΡ ρυθμίζεται από ανδρογόνα σε καρκινικά κύτταρα LNCaP του προστάτη

in vitro

καθώς και τα ανθρώπινα ξενομοσχεύματα καρκίνου του προστάτη

in vivo

. Knockdown του

ΤΟΤΡ

μειωμένο σχηματισμό αποικίας και αυξημένη απόπτωση σε κύτταρα LNCaP, εμπλέκοντας το ως σημαντικός παράγοντας για την ανάπτυξη καρκίνου του προστάτη κυττάρων. Παγκόσμια προφίλ γονιδιακής έκφρασης σε ΤΟΤΡ knockdown κυττάρων LNCaP έδειξε ότι αρκετά γονίδια ιντερφερόνης ρυθμίζεται ρυθμίζονται από ΤΟΤΡ, υποδηλώνοντας ότι μπορεί να έχει ένα ρόλο στη ρύθμιση της ανοσολογικής λειτουργίας σε καρκίνο του προστάτη. Επιπλέον, η ανασυνδυασμένη θεραπεία ΤΟΤΡ αυξημένο σχηματισμό αποικίας σε κύτταρα LNCaP υποδηλώνοντας ότι εκκρινόμενη ΤΟΤΡ μπορεί να λειτουργεί ως μία πολλαπλασιαστική παράγοντας στον καρκίνο του προστάτη. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ΤΟΤΡ μπορεί να έχει ένα ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη

Παράθεση:. Kaarbø Μ, Θύελλα ML, Qu S, Wæhre Η Risberg Β, Danielsen ΗΕ, et al. (2013) ΤΟΤΡ Είναι ένα ανδρογόνο-ρυθμιζόμενο γονίδιο ενέχεται στην εκδήλωση καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 8 (7): e69398. doi: 10.1371 /journal.pone.0069398

Συντάκτης: Μινγκ Tat Λινγκ, Queensland University of Technology, Αυστραλία

Ελήφθη: 2 Απριλίου 2013? Αποδεκτές: 10 Ιουν 2013? Δημοσιεύθηκε: 22 του Ιούλη του 2013

Copyright: © 2013 Kaarbø et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο έχει υποστηριχθεί από επιχορηγήσεις από το νορβηγικό Συμβούλιο Έρευνας (Grant # 193337 /V50, www.forskningsradet.no) και τη νορβηγική Αντικαρκινική Εταιρεία (Grant # 71395 – PR-2006 με 0335). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται μη δερματική κακοήθεια και η τρίτη κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με τους άνδρες στις δυτικές βιομηχανικές χώρες [1]. Η σημασία των ανδρογόνων για την ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη αποδείχθηκε νωρίς το 20

ου αιώνα. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα σημαντική έμφαση στην ανδρογόνων και τον υποδοχέα με τα οποία συνδέονται, ο υποδοχέας ανδρογόνου (AR) [2], και η θεραπεία ανδρογόνων έγινε η κύρια γραμμή της θεραπείας. Ακόμα κι αν AR και δράση των ανδρογόνων είναι κρίσιμης σημαντικές πτυχές στον καρκίνο του προστάτη, έχει καταστεί προφανές ότι και άλλα μονοπάτια σηματοδότησης, καθώς και μη-γονιδιωματική και γονιδιωματική μετατροπές, εμπλέκονται στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη (που επισκοπείται στο [3]) .

μεταφραστικά ελεγχόμενης πρωτεΐνης όγκων (TCTP) είναι ένα πολύπλευρο παράγοντας που είναι εξαιρετικά διατηρημένη σε έναν αριθμό ειδών. Αρχικά ανακαλύφθηκε σε μια κυτταρική γραμμή σαρκώματος ποντικού ως πρωτεΐνη ρυθμίζεται στο μεταφραστικό επίπεδο [4]. ΤΟΤΡ έκτοτε έχει εμπλακεί σε έναν αριθμό σημαντικών κυτταρικών διεργασιών, όπως της κυτταρικής ανάπτυξης, κακοήθη μετασχηματισμό και την αναστολή της απόπτωσης. ΤΟΤΡ δεν βρίσκεται αποκλειστικά σε καρκινικά κύτταρα, αλλά έχει μια ευρεία προφίλ έκφρασης που δεν περιορίζεται σε ένα συγκεκριμένο ιστό ή τύπο κυττάρου. Ωστόσο, η έκφραση ΤΟΤΡ είναι γενικά υψηλότερη σε όγκους σε σύγκριση με αντίστοιχο φυσιολογικό ιστό (που επισκοπείται στο [5]).

ΤΟΤΡ έχει αντι-αποπτωτική ρόλο σε έναν αριθμό κυτταρικών σειρών (που επισκοπείται στο [6]). ΤΟΤΡ ποντίκια knockout είναι εμβρυονικώς θανατηφόρα με μειωμένο αριθμό κυττάρων και υψηλότερη επίπτωση της απόπτωσης στα έμβρυα, τονίζοντας τη σημασία της στην πρώιμη ανάπτυξη [7], [8]. Επιπλέον, ΤΟΤΡ έχει αποδειχθεί ότι δεσμεύουν το ασβέστιο [9] – [12]? Αυτή η ιδιότητα μπορεί να συνδέεται με αντι-αποπτωτική δράση της ως η συγκέντρωση του ελεύθερου ενδοκυτταρικού ασβεστίου είναι γνωστό ότι αυξάνει κατά την διάρκεια της απόπτωσης, προκαλώντας μια αλληλουχία γεγονότων που οδηγούν σε κυτταρικό θάνατο [13]. ΤΟΤΡ έχει εμπλακεί σε μια ποικιλία των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης και δεσμεύει τουμπουλίνη, Plk-1, ρ53 και τον παράγοντα εναλλαγής νουκλεοτιδίου γουανίνης Rheb, μεταξύ άλλων [14]. Επιπλέον,

ΤΟΤΡ

mRNA είναι εξαιρετικά δομημένη και ενεργοποιεί PKR, μια κινάση πρωτεΐνης που εμπλέκεται στη φλεγμονώδη απόκριση [15]. Αν και αυτές οι μελέτες προσφέρουν πιθανές εξηγήσεις για τις πολλές ανεπιθύμητες από ΤΟΤΡ, οι ακριβείς μηχανισμοί με τους οποίους λειτουργεί ΤΟΤΡ απομένει να οριοθετηθεί.

ΤΟΤΡ είναι επίσης μια εκκρινόμενη πρωτεΐνη με εξωκυτταρικό λειτουργίες [16]. Η εκκρινόμενη μορφή της TCTP ταυτοποιήθηκε αρχικά από την ικανότητά της να προάγει την απελευθέρωση ισταμίνης από βασεόφιλα σε ένα υποσύνολο των αλλεργικών δοτών και έτσι ονομάζεται ισταμίνη παράγοντα απελευθέρωσης (HRF) [17]. Επιπλέον, ΤΟΤΡ διέγειρε τον πολλαπλασιασμό των Β-κυττάρων, που προκαλείται από την έκφραση της IL-1, IL-6, και η παραγωγή ανοσοσφαιρίνης συνεπής με ένα ρόλο σαν ανάπτυξης Β κυττάρου παράγοντα [16]. ΤΟΤΡ δεν περιέχει μια Ν-τερματική αλληλουχία σήματος τυπική για εκκρινόμενες πρωτεΐνες και εκκρίνεται μέσω ενός μη-κλασσικής οδού που περιλαμβάνει εξωσώματα [18]. Είναι ενδιαφέρον, nanovesicles εκκρίνεται από αποπτωτικά ενδοθηλιακά κύτταρα τα οποία δρουν σε έναν παρακρινή τρόπο περιέχουν ΤΟΤΡ, περαιτέρω παράταση της τροπικότητα της εξωκυττάριας δράσης της [19].

Πρόσφατες μελέτες έχουν προσδιορίσει έκφραση ΤΟΤΡ στον ανθρώπινο προστάτη. ΤΟΤΡ βρέθηκε να εκφράζεται σε προστατικό ιστούς από άνδρες που υποβάλλονται σε χειρουργικές adenomectomy για καλοήθη υπερπλασία του προστάτη (ΒΡΗ) και σε κυτταρικές σειρές που προέρχονται από φυσιολογικό προστάτη, όπως η κυτταρική γραμμή PWR-1E, και του καρκίνου του προστάτη [12]. έκφραση ΤΟΤΡ βρέθηκε επίσης να είναι υψηλότερη από ό, τι άλλες πρωτεΐνες δέσμευσης ασβεστίου (CBPs) στον ανθρώπινο προστάτη. Επιπλέον, ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις φυσιολογικό προστάτη έδειξε ότι ΤΟΤΡ εκφράστηκε κυρίως από τα εκκριτικά κύτταρα του αυλού και σε μικρότερο βαθμό από τα βασικά κύτταρα. ΤΟΤΡ ταυτοποιήθηκε επίσης σε προστατικό υγρά, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να έχει μία εξωκυτταρική ρόλο στον προστάτη [12]. Επιπλέον, ΤΟΤΡ μπορεί να επηρεάσει τον πολλαπλασιασμό και τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων του προστάτη [20]. LNCaP κύτταρα κατεργασμένα με siRNA που στοχεύει ΤΟΤΡ έδειξε ότι knockdown του ΤΟΤΡ αυξάνει την απόπτωση μέσω κασπάσης 3 και κασπάσης 8 και μειώνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα LNCaP [20]. Επιπλέον, τα αποτελέσματα από μία πρόσφατη μελέτη αναφέρει ότι η πρωτεΐνη θερμικού σοκ 27 (Hsp27) αλληλεπιδρά με TCTP σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη και την προστατεύει από την αποδόμηση [21]. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης ΤΟΤΡ συσχετίζεται με την εξέλιξη της νόσου, όπου ρυθμίζεται αυξητικά σε ανθεκτικούς ευνουχισμό καρκίνο του προστάτη (CRPC) [21]. Αυτές οι μελέτες εμπλέκουν ΤΟΤΡ στον καρκίνο του προστάτη? Ωστόσο, υπάρχουν περιορισμένες πληροφορίες σχετικά με τη ρύθμιση και τη λειτουργία του σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι ΤΟΤΡ ρυθμίζεται από ανδρογόνα, σημαντικοί παράγοντες επιβίωσης για τον καρκίνο του προστάτη κύτταρα καθώς και το φυσιολογικό προστάτη. Η έκτοπη έκφραση του ΤΟΤΡ και knockdown του, καθώς επίσης και πειράματα με ανασυνδυασμένη ΤΟΤΡ, δείχνουν ότι συμβάλλει στην ανάπτυξη των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό, εμπλέκοντας το ως σημαντικός παράγοντας στον καρκίνο του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την Περιφερειακή Επιτροπή Δεοντολογίας, REK Sør-Ost (S-07443a), και υλικό από εξακολουθούν να ζουν οι ασθενείς συμπεριλήφθηκε μετά από έγγραφη συγκατάθεσή τους. Η χρήση του υλικού από νεκρούς ασθενείς επιτράπηκε από την επιτροπή δεοντολογίας. πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από τις κατευθυντήριες γραμμές Πανεπιστήμιο Case Western Reserve IACUC. Όλα τα μέτρα που έχουν ληφθεί για την καλή διαβίωση των ζώων και να ελαχιστοποιηθούν υποφέρουν ήταν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές IACUC και έχουν περιγραφεί στο παρελθόν [22], [23].

Cell Culture

LNCaP κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS), 2 mM Ε-γλουταμίνη, 50 U /ml πενικιλίνη και 50 μg /ml στρεπτομυκίνη (Lonza). Το ανθρώπινο βρογχικά επιθηλιακά κυτταρική σειρά BEAS-2Β που μετασχηματίζεται με SV40 ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο από Sten Mollerup (Τμήμα Τοξικολογίας, Εθνικό Ινστιτούτο Επαγγελματικής Υγείας, Όσλο, Νορβηγία) [24]. κύτταρα BEAS-2Β διατηρήθηκαν σε LHC-9 μέσο συμπληρωμένο με 1,8 mg /ml βόεια λευκωματίνη ορού (BSA) σε πλάκες επικαλυμμένες με 0,01 mg /ml ινωδονεκτίνης και 0,03 mg /ml βόειο κολλαγόνο διαλύεται σε PBS.

Για δύο κυτταρικές σειρές το μέσο καλλιέργειας αλλάχθηκε κάθε δύο έως τρεις ημέρες, και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2, 95% επωαστή αέρα. Για πειράματα επαγωγή ανδρογόνου, τα κύτταρα LNCaP στερήθηκαν για 48 ώρες σε RPMI 1640 που περιείχε 2% ξυλάνθρακα αγωγή (CT) -FCS, που ακολουθείται από επιπλέον 24 ώρες σε RPMI 1640 που περιέχει 0.5% CT-FCS πριν από την κατεργασία με 10

– 8 Μ R1881 (συνθετικό ανδρογόνο). R1881 ελήφθη από την ΝΕΝ.

Ξενομοσχεύματος Πειράματα

Transplantation, την ανάπτυξη και συγκομιδή των όγκων από τα ποντίκια που φέρουν ξενομοσχεύματα CWR22 ήταν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22], [23]. CWR22 ξενομοσχεύματα αναπτύχθηκαν σε γυμνούς ποντικούς με την παρουσία ενός σφαιριδίου τεστοστερόνης παρατεταμένης απελευθέρωσης. Μετά την ανάπτυξη του όγκου, οι ποντικοί ευνουχισμένα, οι σβώλοι τεστοστερόνης απομακρύνθηκαν και τα υποχωρεί όγκοι συλλέχθηκαν σε 1, 2, ή 4 εβδομάδες μετά τον ευνουχισμό. Τα ζώα στεγάστηκαν και αντιμετωπίζονται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές IACUC.

Ποσοτική PCR (qPCR)

Μετά τη συγκομιδή, το συνολικό RNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Trizol® (Invitrogen) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. 1-5 μg RNA χρησιμοποιήθηκε για τη σύνθεση πρώτου κλώνου cDNA με το σύστημα SuperScript II (Invitrogen) και ολιγο-άΤ εκκινητές. qPCR αναλύσεις διεξήχθησαν επί του οργάνου LightCycler 480 (Roche) με το SYBR Green Ι κύριο μείγμα LightCycler 480 (Roche). Μία πρότυπη καμπύλη που κατασκευάζεται από διαδοχικές αραιώσεις του cDNA έγινε για να υπολογίσει τη σχετική ποσότητα του γονιδίου στόχου και αναφοράς για κάθε δείγμα. Αυτές οι τιμές στη συνέχεια κανονικοποιείται στη σχετική ποσότητα του γονιδίου αναφοράς. Αστάρια είναι διαθέσιμα κατόπιν αιτήματος. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας δύο-ουρά, σε συνδυασμό

t-

δοκιμασία του Student, με

P

& lt?. 0.05 να θεωρείται ως σημαντική

Πρωτεΐνη Εξόρυξη και Western αναλύσεις

ολόκληρου κυτταρικά εκχυλίσματα έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25], επιλύονται με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF (Bio-Rad). Η κηλιδωμένη μεμβράνη αποκλείστηκε σε 10% άπαχο ξηρό γάλα σε ρυθμισμένο με Tris φυσιολογικό ορό (TBS) που περιείχε 0,1% Tween (TBS-Tween) για 1 ώρα που ακολουθείται από επώαση με πρωτογενές αντίσωμα σε TBS-Tween που περιέχει 5% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) για 14-16 ώρες στους 4 ° C. Αντισώματα έναντι είτε ΤΟΤΡ (1:1000) [12], ή GAPDH (1:500) (Santa Cruz) χρησιμοποιήθηκαν. Ενισχυμένη αντιδραστήρια χημικής φωταύγειας κηλίδωση Western ανίχνευση (Amersham Biosciences) και το σύστημα ανάλυσης χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των επισημασμένων HRP πρωτεΐνες. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό, στυπώματα Western ψηφιοποιήθηκαν με μια μηχανή σαρωτή (Epson Perfection V700 Photo) και η οπτική πυκνότητα μετρήθηκε με το TL ImageQuant λογισμικού (Amersham Biosciences). Ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα ΤΟΤΡ ποντίκι ήταν μια γενναιόδωρη δωρεά από την ομάδα των del Vecchio [12]

παρεμβολή RNA

Συνθετικά siRNA που στοχεύει ΤΟΤΡ (αλληλουχία-στόχο 5′-AACCATCACCTGCAGGAAACA-3 ‘) λήφθηκε. από Dharmacon, ενώ siRNA για λουσιφεράση (αλληλουχία στόχος: 5’-AACTTACGCTGAGTACTTCGA-3 ‘) ήταν από την Qiagen. LNCaP κύτταρα σπάρθηκαν σε πλήρες μέσο 24 ώρες πριν την επιμόλυνση. Το μέσο αλλάχθηκε σε RPMI 1640 χωρίς FCS και αντιβιοτικά πριν την διαμόλυνση και τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 100 ηΜ siRNA ανά φρεάτιο χρησιμοποιώντας Oligofectamine (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού

LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA όπως περιγράφηκε παραπάνω και επιστρώθηκαν σε πλάκες 10 cm σε πυκνότητα-100.000 κύτταρα /φρεάτιο. Οι αποικίες αναπτύχθηκαν για τρεις εβδομάδες. LNCaP κύτταρα κατεργασμένα με ανασυνδυασμένη ΤΟΤΡ σπάρθηκαν σε πυκνότητα 2500 κυττάρων ανά φρεάτιο σε μια έξι-φρεατίων σε RPMI συμπληρωμένο με 10% FCS. Η ανασυνδυασμένη ΤΟΤΡ, GST, ή όχημα ελέγχου προστέθηκε κάθε δύο με τρεις ημέρες. σχηματισμός αποικιών εκτιμήθηκε μετά από δύο εβδομάδες ανάπτυξης. Τα κύτταρα στερεώθηκαν σε μεθανόλη στους -20 ° C για 30 λεπτά, χρωματίστηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες επί 20 λεπτά και στη συνέχεια πλύθηκε με νερό MQ. Η περιοχή που καλύπτεται από τις αποικίες προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας GeneTools λογισμικού από SynGene.

ΤΟΥΝΕΛ Δοκιμασία

LNCaP κύτταρα σπάρθηκαν σε καλυπτρίδες, πεινασμένο και επιμολυσμένα με siRNA όπως περιγράφεται παραπάνω. Για θαψιγαργίνη επαγωγή (TG), τα κύτταρα είτε σε επεξεργασία με όχημα ή 100 ηΜ TG για το τελευταίο 36 ώρες της περιόδου διαμόλυνση 72 ώρες. Για την ανίχνευση απόπτωσης, ένα TUNEL

In Situ

κιτ ανίχνευσης κυτταρικού θανάτου (Roche) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο φθορισμός ανιχνεύθηκε με τη χρήση ενός μικροσκοπίου απεικόνισης Axioplan2 (Zeiss) και φωτογραφίες τραβήχτηκαν με μια φωτογραφική μηχανή AxioCam HRc (Zeiss). Ο αριθμός των TUNEL θετικών κυττάρων εκφράστηκε ως ποσοστό του συνολικού αριθμού των κυττάρων.

Gene Expression Profiling

Το ολικό RNA από κύτταρα κατεργασμένα με siRNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο TRIzol® σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και αναλύθηκε στο νορβηγικό μικροσυστοιχιών Consortium (NMC), Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο του Όσλο, Όσλο, Νορβηγία. Το RNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Illumina® TotalPrep RNA Amplification (Illumina). 500 ng ολικού RNA χρησιμοποιήθηκε στην αντίδραση ενίσχυσης και την επισήμανση. Η ποιότητα του cRNA εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Bioanalyser. Βιοτίνη σημασμένο cRNA (1,5 μg) στη συνέχεια χρησιμοποιείται για να υβριδοποιηθεί σε Illumina Human-6 V3 Έκφραση beadchips χρησιμοποιώντας ολόκληρο το γονιδίωμα-Gene Expression δοκιμασία άμεση υβριδοποίηση από Illumina. Μετά τη σάρωση, τα αποτελέσματα εισήχθησαν στην Illumina BeadStudio, όπου η ποιότητα του κάθε πίνακα και σάρωση ελέγχθηκαν.

Δημιουργία και θεραπεία με ανασυνδυασμένη ΤΟΤΡ

Το ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF) του hTCTP κλωνοποιήθηκε σε pET-28a για την έκφραση της ανασυνδυασμένης ΤΟΤΡ. 0.1 mM IPTG χρησιμοποιήθηκε για επαγωγή της έκφρασης, και μετά τη συγκομιδή ο σβώλος επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό σύνδεσης (20 mM Ν &

2 ΡΟ

4, 500 mM NaCl, 20 mM ιμιδαζόλη, ρΗ 7,4). Αναστολείς πρωτεασών προστέθηκαν και το κυτταρικό εναιώρημα υποβλήθηκε σε υπερήχους στους 4 ° C. -Tagged His hTCTP καθαρίστηκε υπό φυσικές συνθήκες χρησιμοποιώντας μία στήλη HiTrap Chelating ™ HP (GE Healthcare) φορτώνεται με Ni

2 + -ιόντα σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το δείγμα ήταν στείρα διήθηση και αραιώθηκε με ρυθμιστικό σύνδεσης πριν από την εφαρμογή επί της στήλης. Η στήλη πλύθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης μέχρις ότου η απορρόφηση (280 nm) σταθεροποιημένα. Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες εκλούστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης (20 mM Ν &

2 ΡΟ

4, 500 mM NaCl, 500 mM ιμιδαζολ, ρΗ 7,4). Η διαδικασία καθαρισμού πραγματοποιήθηκε στους 4 ° C για την αποφυγή της υποβάθμισης της πρωτεΐνης. Το έκλουσμα υποβλήθηκε σε διαπίδυση έναντι PBS με χρήση Slide-Α-Lyzer® 10K κασέτες διαπίδυσης με μια cut-off τιμή 10 kDa. Για να ληφθεί ανασυνδυασμένη GST, ρΟΕΧ-4Τ αναπτύχθηκε σε κύτταρα BL21, που επάγεται με 0,1 mM IPTG και καθαρίστηκαν με επώαση με 50% πολτό Glutathione Sepharose 4Β. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν με PBS πριν από την έκλουση (50 mM Tris-HCl, 10 mM ανηγμένη γλουταθειόνη, ρΗ 8,0). Οι καθαρισμένες πρωτεΐνες τρέχουν παράλληλα Precision Plus Διπλή χρώμα Πρωτεΐνη Πρότυπο, προ-χρωματισμένους μάρτυρες πρωτεΐνη, Μεγάλο Εύρος (7-175 kDa) και Μη προετοιμασμένο πρωτεϊνικών δεικτών, Μεγάλο Εύρος (2-212 kDa) (Biorad) για να εκτιμηθεί η ποσότητα της πρωτεΐνης.

κύτταρα BEAS-2Β υποβλήθηκαν σε αγωγή με ανασυνδυασμένη ΤΟΤΡ /GST για μία ώρα πριν από τη συγκομιδή.

Ανοσοϊστοχημεία

μικροσυστοιχίες Tissue (TMA) παρασκευάστηκαν από ριζική προστατεκτομή δείγματα από ασθενείς που εκτελούνται την Νορβηγικά Ράδιο Νοσοκομείο μεταξύ του 1988 και του 1996 και ακολούθησε μετά την επέμβαση. Προστατικό ειδικό αντιγόνο (PSA) μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν πριν και μετά την επέμβαση και σε κάθε επακόλουθο κλινική εξέταση. περιόδους παρακολούθησης κυμαινόταν από 2 έως 176 μηνών (μέση, 73,3 μήνες). Οι ασθενείς θεωρήθηκαν ότι έχουν κλινικά εμφανή υποτροπή της νόσου εάν κάποιο από τα Ήσαν παρόντες: (

α

) απόδειξη της τοπικής υποτροπής (επιβεβαιώνεται από ιστολογικές βιοψίες ή υπερηχογράφημα) ή (

β

) αποδείξεις του μακρινές μεταστάσεις (που ανιχνεύεται από τους σκελετικούς σπινθηρογράφημα και /ή απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού). Εάν ένας ασθενής που έπασχε από υποτροπή είχαν μετεγχειρητική PSA του ορού & gt? 4 ng /ml πριν από την ημερομηνία είτε τοπική υποτροπή ή μετάσταση, η ημερομηνία της αυξημένης PSA ορίστηκε ως ημερομηνία υποτροπής. Η &? Ε-χρωματισμένες τομές έγιναν από κάθε επιλεγείσα πρωτογενή μπλοκ όγκου (μπλοκ δότη) του εγκλεισμένο σε παραφίνη υλικό να καθορίσουν αντιπροσωπευτικές περιοχές του όγκου. Με τη χρήση του μέσου συστοιχίας ιστού (Beecher Instruments), δύο κύλινδροι ιστού (0,6 mm σε διάμετρο) αποκόπηκαν από περιοχές του μπλοκ δότη. Λήφθηκαν επίσης δείγματα ελέγχου του μη καρκινικού ιστού από το μπλοκ παραφίνης. Το Gleason βαθμολογία που χρησιμοποιείται στην ανάλυση ήταν το υψηλότερο σκορ Gleason σε κάθε σειράς προστατεκτομή.

Η TMAs ήταν το πρώτο de-παραφινοποιήθηκαν από ξυλόλιο και σειριακές αιθανόλη αραιώσεις και πλένεται H

2O πριν από την απόσβεση της ενδογενούς υπεροξειδάσης σε 0,3% H

2O

2 H

2Ο για 30 λεπτά. Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη σε αυτόκαυστο στους 121 ° C για 20 λεπτά σε 0,01 Μ κιτρικού ρυθμιστικού διαλύματος (ρΗ 6.4). Η BioGenex υπερευαίσθητο Σύνδεσμος-Label κιτ ανίχνευσης IHC (BioGenex) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του αντιγόνου. Οι τομές εξισορροπηθεί σε TBS-Tween (0,05 Μ Tris, ρΗ 7.5, 0.3 Μ NaCl, 0,1% Tween 20) για 5 λεπτά πριν από την επώαση όλη τη νύκτα στους 4 ° C με μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-ανθρώπου ποντικού ΤΟΤΡ αραιωμένο σε TBS 1:100 -Tween με 1% BSA. Οι τομές στη συνέχεια πλένονται με TBS-Tween πριν από την επώαση με βιοτινυλιωμένα δευτερογενή αντι-imouse IgG (link) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά πλύση σε TBS-Tween, το δευτερεύον αντίσωμα επωάστηκε με το ένζυμο HRP στρεπταβιδίνη σημασμένη για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα πλακίδια στη συνέχεια πλύθηκαν σε TBS-Tween και χρωματίστηκαν με DAB για 5 λεπτά και οι αντιδράσεις διακόπηκαν σε H

2O. Αντίχρωση διεξήχθη με αιματοξυλίνη (ϋΑΚΟ) χρώση και τα πλακίδια τοποθετήθηκαν με ϋΑΚΟ Faramount υδατικό μέσο στερέωσης. Mouse μη άνοσο ορό εφαρμόστηκε ως αρνητικός έλεγχος. Κανονική τομές ιστών του προστάτη, χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι. Ένταση βαθμολογήθηκε χρησιμοποιώντας μια κλίμακα 0-3, που αντιστοιχεί σε απουσιάζει, αδύναμα, μέτρια και έντονη χρώση, αντίστοιχα. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας το

t-

δοκιμή ενός two-tailed, unpaired Student, με τα

P

& lt?. 0.05 να θεωρείται ως σημαντική

Στατιστικά στοιχεία

εκτός από τις αναλύσεις των μικροσυστοιχιών, οι στατιστικές διενεργήθηκαν χρησιμοποιώντας έλεγχος τ, όπου οι τιμές ρ & lt?.. 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές

η στατιστική ανάλυση των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης

η στατιστική ανάλυση διεξήχθη βασίζεται σε αξίες έκφραση περίληψη για κάθε ανιχνευτή και ομαλοποιήθηκαν με ποσοστημόριο ομαλοποίηση οποία έχει ως αποτέλεσμα τις μάρκες που έχουν ταυτόσημες κατανομή έντασης. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με λογισμικό v2.7 J-Express (https://www.molmine.com). Στατιστική Ανάλυση των μικροσυστοιχιών (SAM) και διαθέτουν την υποομάδα Επιλογής (FSS) χρησιμοποιήθηκαν για στατιστικές αναλύσεις.

Αποτελέσματα

Έκφραση ΤΟΤΡ προκαλείται από ανδρογόνα

Θα διερευνηθεί πρώτα το δυνατόν ρύθμιση της έκφρασης ΤΟΤΡ από ανδρογόνα στην ανδρογόνων ανταποκρίνεται κυτταρική γραμμή καρκίνου του προστάτη LNCaP σε ένα πείραμα χρονικής πορείας. Όπως φαίνεται στο

Σχήματα 1Α και 1Β

, υπήρχε ένα ανδρογόνο επαγόμενη αύξηση τόσο mRNA ΤΟΤΡ και τη συσσώρευση πρωτεϊνών πάροδο του χρόνου, η οποία έφθασε περίπου τέσσερις φορές υψηλότερα επίπεδα σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα σε 48 ώρες. Για να προσδιορίσετε αν η έκφραση ΤΟΤΡ ρυθμίζεται επίσης από τα ανδρογόνα

in vivo

, χρησιμοποιήσαμε την ανθρώπινη εξαρτώμενη από ανδρογόνο καρκίνο του προστάτη ξενομόσχευμα μοντέλο CWR22 που υποχωρεί αισθητά μετά τον ευνουχισμό [22], [23]. Ανάλυση Western της CWR22 όγκων που συλλέγονται από ποντικούς σε διάφορα χρονικά σημεία μετά τον ευνουχισμό έδειξαν ότι η έκφραση ΤΟΤΡ μειώθηκε σημαντικά σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο και ήταν σχεδόν χαθεί στις τέσσερις εβδομάδες (

Σχήμα 1C

). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκφραση ΤΟΤΡ ρυθμίζεται από ανδρογόνα σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη και τα δύο

in vitro

και

in vivo

.

A. LNCaP κύτταρα είτε αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με το συνθετικό ανδρογόνο R1881 (10

-8 Μ) για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Ολικό RNA απομονώθηκε και αναλύσεις qPCR διεξήχθησαν.

ΤΟΤΡ

έκφραση mRNA ομαλοποιήθηκε να

GAPDH

. Το γράφημα απεικονίζει ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν με γραμμές σφάλματος που υποδεικνύει ± SEM, τα επίπεδα έκφρασης είναι σε σχέση με κύτταρα που υπέστησαν αγωγή χωρίς ανδρογόνων (ρυθμιστεί στο 1). Το πείραμα επαναλήφθηκε περισσότερες από τρεις φορές Β Western αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε ολόκληρο κυτταρικά εκχυλίσματα κατασκευασμένο από κύτταρα επεξεργασμένα με την απουσία ή παρουσία R1881 (10

-8 Μ) για τα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Τα επίπεδα έκφρασης κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH. Οι τιμές που παρουσιάζονται είναι σχετικές με τα μη επεξεργασμένα δείγματα (ρυθμιστεί στο 1). Η γραφική παράσταση απεικονίζει δεδομένα από δύο πειράματα που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν με γραμμές σφάλματος απεικονίζουν ± SEM. Γ CWR22 ξενομοσχεύματα αναπτύχθηκαν σε γυμνούς ποντικούς και τα δείγματα όγκων συλλέχθηκαν είτε πριν (t = 0) ή 1, 2 και 4 εβδομάδες μετά τον ευνουχισμό. Σύνολο κυτταρικά εκχυλίσματα έγιναν και χρησιμοποιήθηκαν για αναλύσεις western blot. Το σχήμα δείχνει μία κηλίδα εκπρόσωπο για ΤΟΤΡ και GAPDH, με τις αντίστοιχες τιμές των ΤΟΤΡ (t = 0 σετ σε 1) κανονικοποιημένη προς GAPDH. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας δίπλευρη, paired t-test του Student σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα δείγματα, με την P & lt? 0,05 να θεωρείται ως σημαντική. Σημασία υποδεικνύεται με αστερίσκους? ένας αστερίσκος υποδηλώνει Ρ & lt? 0.05, δύο αστερίσκοι δηλώνουν Ρ & lt?. 0.01

Η

Νοκ ντάουν της ΤΟΤΡ Μειώσεις Colony Σχηματισμός LNCaP κύτταρα

ρύθμιση ανδρογόνων έκφρασης ΤΟΤΡ, όπως παρουσιάστηκε παραπάνω, πρότεινε ότι μπορεί να έχει ένα ρόλο στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Αυτό θα μπορούσε να είναι είτε μέσω της επαγωγής του πολλαπλασιασμού ή αναστολή της απόπτωσης, ή συνδυασμό και των δύο. Για να ερευνηθεί ο πιθανός ρόλος των ΤΟΤΡ στην κυτταρική ανάπτυξη, η έκφραση του αναστέλλεται σε κύτταρα LNCaP με σχηματισμό θεραπεία και αποικιών siRNA εκτιμήθηκε σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα ελέγχου siRNA. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, η έκφραση της πρωτεΐνης TCTP ήταν μειωμένη κατά 85% μετά από 72 ώρες από την επιμόλυνση με siRNA που στοχεύει ΤΟΤΡ. σχηματισμό αποικιών κυττάρων knockdown ΤΟΤΡ μειώθηκε κατά 50% σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήματα 2Β και 2C). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι ΤΟΤΡ μπορεί να έχει ένα ρόλο στον πολλαπλασιασμό των LNCaP κυττάρων και /ή της βιωσιμότητας.

A. siRNA μεσολαβεί νοκ ντάουν του

ΤΟΤΡ

στα κύτταρα LNCaP. LNCaP κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA (100 ναυτικών μιλίων) που στοχεύουν είτε

λουσιφεράση (Luc)

ή

ΤΟΤΡ

. Κατά τη ενδεικνυόμενα χρονικά σημεία τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πρωτεϊνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με ανάλυση Western. Αντιοροί εγείρονται έναντι ΤΟΤΡ και GAPDH χρησιμοποιήθηκαν διαδοχικά στην ίδια κηλίδα. κύτταρα Β LNCaP μορφομετατράπηκαν με 100 ηΜ siRNA που στοχεύει

Luc

ή

ΤΟΤΡ

, εμβολιάστηκαν σε πλάκες 10 cm και δοκιμάστηκαν για την ικανότητά σχηματισμό αποικιών με χρώση κρυσταλλικού ιώδους μετά από τρεις εβδομάδες ανάπτυξης. Αντιπροσωπευτικά εικόνες που παρουσιάζονται. C. Ποσοτικός προσδιορισμός σχηματισμού αποικίας των κυττάρων LNCaP μετά siRNA μεσολαβεί knockdown του ΤΟΤΡ. Η γραφική παράσταση παριστάνει δύο πειράματα εις τριπλούν. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας δίπλευρη, paired t-test του Student σε σύγκριση με Luc-siRNA επεξεργασμένα δείγματα, με *: Ρ & lt? 0,05 υποδεικνύοντας σημαντική διαφορά

Η

κάτω ρύθμιση των ΤΟΤΡ αυξάνει. η απόπτωση των LNCaP κύτταρα

TCTP είχε προηγουμένως αναφερθεί ότι αναστέλλει την απόπτωση σε έναν αριθμό κυτταρικών σειρών [20], [26] – [28]. Επιπλέον, μεσολάβηση RNAi knockdown του TCTP σε κύτταρα LNCaP ενεργοποιημένα κασπάσης 3 και κασπάση 8, ενδεικτική αυξημένη απόπτωση [20], [21]. έτσι Ερευνήσαμε τον πιθανό ρόλο του ΤΟΤΡ στην απόπτωση σε κύτταρα LNCaP. Προηγούμενη εργασία από το εργαστήριο μας απέδειξε ότι η θαψιγαργίνη (TG) προκαλεί σημαντική απόπτωση μετά από 36 ώρες θεραπείας σε κύτταρα LNCaP [25]. Μπορούμε έτσι καθοριστεί αν ΤΟΤΡ μπορούν να μεταβάλλουν TG-επαγόμενη απόπτωση. LNCaP κύτταρα διαμολύνθηκαν είτε με siRNA κατά ΤΟΤΡ ή ελέγχου (λουσιφεράση) siRNA, τότε αφεθεί χωρίς θεραπεία ή εκτεθεί σε TG, μετά την οποία η έκταση της απόπτωσης προσδιορίσθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία TUNEL. Όπως φαίνεται στα σχήματα 3Α και 3Β, με την απουσία της θεραπείας TG, υπήρχε μία περίπου τριπλάσια αύξηση στην απόπτωση σε κύτταρα knockdown TCTP σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Όπως ήταν αναμενόμενο, TG αυξήθηκε σημαντικά απόπτωση τόσο σε έλεγχο ή ΤΟΤΡ-siRNA επεξεργασμένα κύτταρα, ωστόσο, ήταν περίπου 2,5 φορές υψηλότερη κατά ΤΟΤΡ knockdown. Η knockdown του

ΤΟΤΡ

επαληθεύτηκε με qPCR για όλα τα πειράματα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι ΤΟΤΡ εμπλέκεται στη ρύθμιση της απόπτωσης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε καλυπτρίδες και επιμολύνθηκαν με siRNA έναντι

ΤΟΤΡ

ή

λουσιφεράσης (Luc)

για 72 ώρες. Απόπτωση προκλήθηκε με 100 ηΜ TG για 36 ώρες κατά τη διάρκεια της θεραπείας siRNA. Μετά την κατεργασία και καθήλωση, αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία TUNEL, πυρήνες κυττάρων χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ και τα κύτταρα έγιναν ορατά χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Axioplan απεικόνισης. Α Εκπρόσωπος εικόνες των κυττάρων LNCaP επιμολυσμένα είτε με

ΤΟΤΡ

– ή

Luc

-siRNA για 72 ώρες και αντιμετωπίζονται με DSMO ή TG για 36 ώρες κατά τη διάρκεια της επιμόλυνσης. TUNEL θετικά κύτταρα εμφανίζονται ως κόκκινες κηλίδες. Τα βέλη δείχνουν αποπτωτικά κύτταρα. B. Η ποσοτικοποίηση της απόπτωσης συχνότητα. Τα δεδομένα δείχνουν το ποσοστό των μη βιώσιμων κυττάρων μετά από θεραπεία 36 ώρες με TG σε κύτταρα επιμολυσμένα με

ΤΟΤΡ

ή

Luc siRNA

. Στήλες αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και ράβδοι αντιπροσωπεύουν ± SEM με *: Ρ & lt? 0,05 υποδεικνύοντας σημαντική διαφορά

Η

κάτω ρύθμιση των ΤΟΤΡ Αποτελέσματα σε Προς τα πάνω ρύθμιση του ανοσοποιητικού Response Genes σε LNCaP κύτταρα.

για να φωτιστούν οι οδοί ΤΟΤΡ μπορεί να επηρεάσει σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη, πραγματοποιήσαμε μια παγκόσμια γονιδιακής έκφρασης σε ΤΟΤΡ νοκ ντάουν κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα LNCaP έλεγχο. Σημαντική knockdown ΤΟΤΡ επιβεβαιώθηκε τόσο σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας δύο μεθόδους: Η στατιστική ανάλυση των μικροσυστοιχιών (SAM) και διαθέτουν την επιλογή υποομάδα (FSS) τα εργαλεία που εφαρμόζονται στην J-Express [29]. Από τις 15 πιο σημαντικά ρυθμισμένων γονιδίων καθορίζονται από κάθε ανάλυση, εννέα βρέθηκαν να είναι σημαντικές από τις δύο μεθόδους, όπως απεικονίζεται στο διάγραμμα Venn στην Εικόνα 4Α. Το Σχήμα 4Β δείχνει ανάντη ή προς τα κάτω ρύθμιση του μερικά από τα γονίδια, ενώ ένας κατάλογος πάνω από τα πιο σημαντικά ρυθμιζόμενα γονίδια στη συστοιχία, οντολογία τους, γνωστή λειτουργία και ορισμός απεικονίζονται στην Εικόνα 4C. Η πλειοψηφία των γονιδίων προβλέπεται να ρυθμίζεται σημαντικά από ΤΟΤΡ knockdown εμπλέκονται στην οδό σηματοδότησης ιντερφερόνης ή /και συνδέονται με το ανοσοποιητικό αποκρίσεις. Η έκφραση των έξι αυτών των γονιδίων (IFIT1, SLITRK3, IFI44L, IFIT3, OAS2 και ΜΧ1) επικυρώθηκε από qPCR (Σχήματα 5A-F). Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι ΤΟΤΡ ρυθμίζει ανοσοαποκρίσεις σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA έναντι

ΤΟΤΡ

ή

λουσιφεράσης

για 72 ώρες, RNA απομονώθηκε και χρησιμοποιήθηκε σε παγκόσμιο προφίλ γονιδιακής έκφρασης όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Α Venn διάγραμμα των γονιδίων που ρυθμίζονται από σημαντικά προφίλ γονιδιακής έκφρασης. Β Heatmap εκπροσώπηση των γονιδίων σε προηγούμενο ή προς τα κάτω-ρυθμίζονται σε απάντηση

ΤΟΤΡ

νοκ ντάουν. Κόκκινο και πράσινο αντιπροσωπεύουν πάνω και προς τα κάτω ρυθμισμένη γονίδια, αντίστοιχα. Γ Κατάλογος των δέκα πιο σημαντικά γονιδίων που ρυθμίζονται με αριθμούς την προσχώρησή τους, τον ορισμό και τη διαδικασία οντολογία για τα οποία έχουν εμπλακεί σε. Η πτυχή μεταβολή σε σχέση με τα κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία

λουσιφεράσης

siRNA υποδεικνύεται.

Α-F. qPCR χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η έκφραση των γονιδίων που προβλέπεται ότι να εκφράζονται διαφορικά σε κύτταρα μορφομετατραπέντα με Luc-siRNA έναντι ΤΟΤΡ-siRNA. Η έκφραση mRNA κανονικοποιήθηκε προς

GAPDH

και υπολογίστηκε σε σχέση με τα δείγματα Luc-siRNA (που προς 1). Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν. Όλες οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± SEM. Η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε με τη χρήση δίπλευρη, paired t-test του Student με *: Ρ & lt? 0.05 και **: Ρ & lt? 0,01 να θεωρείται σημαντική

Η

Η ανασυνδυασμένη ΤΟΤΡ Προκαλεί καρκίνο του προστάτη ΟβΙΙ Growth

Η εκκρινόμενη μορφή της TCTP έχει προηγουμένως δειχθεί ότι επάγει έκφραση αρκετών διαμεσολαβητών, να ξεκινήσει διακριτά γεγονότα σηματοδότησης και να οδηγήσει σε αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού των κυττάρων του ανοσοποιητικού [30] – [32]. Δεδομένου ΤΟΤΡ είναι παρούσα σε προστάτη υγρά [12], μπορεί να έχει μία εξωκυτταρική λειτουργία σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Για να αξιολογηθεί η δυνατότητα αυτή, κάναμε ανασυνδυασμένου ΤΟΤΡ (rTCTP) στο

Ε. coli

και προσδιορίζεται η βιολογική δραστικότητα του σε κύτταρα BEAS-2Β σε σχέση με ανασυνδυασμένο γλουταθειόνης S-τρανσφεράσης (rGST) ως ελέγχου [33]. κύτταρα BEAS-2Β υποβλήθηκαν σε αγωγή με rTCTP ή rGST σε μια τελική συγκέντρωση 1.0 μg /ml για 1 ώρα και

παραγωγή IL-8 mRNA

προσδιορίστηκε με qPCR.

IL-8 έκφραση

mRNA ήταν σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα που κατεργάζονται με rTCTP σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα με rGST (Σχήμα 6Α) δείχνει ότι η rTCTP είναι βιολογικά ενεργό. LNCaP κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1,0 μg /ml rTCTP ή rGST και μια δοκιμασία σχηματισμού αποικίας διεξήχθη. Μετά από δύο εβδομάδες σε καλλιέργεια με συνεχή έκθεση σε ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν για να απεικονίσει αποικίες. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 6Β και 6C, υπήρχαν σημαντικά υψηλότερο αριθμό αποικιών που σχηματίστηκαν από τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με rTCTP σύγκριση με rGST-επεξεργασμένα κύτταρα. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι rTCTP έχει μια επίδραση πολλαπλασιαστικής /pro-επιβίωση σε κύτταρα LNCaP και προτείνουν έναν ρόλο της εκκρινόμενης TCTP σε ανάπτυξη καρκίνου του προστάτη κυττάρου.

A. κύτταρα BEAS-2Β υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ανασυνδυασμένη ΤΟΤΡ ή GST (rTCTP και rGST) σε τελική συγκέντρωση 1.0 μg /ml, το ολικό RNA εκχυλίζεται, cDNA συντίθεται και qPCR διεξαχθεί. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς και οι τιμές που παρουσιάζονται είναι σε σχέση με GST (ρυθμιστεί στο 1). δοκιμασία σχηματισμού αποικίας Β σε κύτταρα LNCaP σε επεξεργασία με rTCTP ή rGST. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ή rTCTP rGST σε μια τελική συγκέντρωση 1.0 μg /ml για δύο εβδομάδες και οι αποικίες που σχηματίστηκαν έγιναν ορατές με 0,1% κρυσταλλικό ιώδες. Η περιοχή που καλύπτεται σε κάθε πλάκα από τις αποικίες μετρήθηκε και παριστάνεται ως ποσοστό της συνολικής περιοχής της πλάκας. Οι C. Δύο αντιπροσωπευτικές εικόνες. Το πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν τρεις φορές. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± SEM. Η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε με τη χρήση δίπλευρη, paired t-test του Student. Σημασία υποδεικνύεται από τον αστερίσκο, Ρ & lt?. 0.05

Η

Έκφραση ΤΟΤΡ υπερεκφράζεται στον καρκίνο του προστάτη σε σύγκριση με φυσιολογικά προστάτη

Από ΤΟΤΡ εκφράζεται στο φυσιολογικό προστάτη, καθώς επίσης και ρυθμίζεται από