Αφηρημένο

σουλφατίδιο είναι μια γλυκοσφυγγολιπίδιο γνωστό ότι αλληλεπιδρούν με διάφορες πρωτεΐνες εξωκυττάριας μήτρας, όπως tenascin- C, η οποία υπερεκφράζεται σε πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου ότι του παχέος εντέρου. Λόγω της περιορισμένης επιτυχίας της χημειοθεραπείας στον καρκίνο παχέος εντέρου και υψηλή τοξικότητα του δοξορουβικίνη (ϋΟΧ), ελήφθη προσέγγιση ενθυλάκωσης σουλφατίδιο που περιέχει λιπόσωμα (SCL) για να ξεπεραστούν αυτά τα εμπόδια. Αυτή η μελέτη αξιολόγησε την κυτταροτοξικότητα in vitro, βιοκατανομή, η θεραπευτική αποτελεσματικότητα και συστηματική τοξικότητα in vivo του σουλφατιδίου που περιέχει λιποσωμιακή δοξορουβικίνη (SCL-ϋΟΧ) χρησιμοποιώντας ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα του κόλου ΗΤ-29 ξενομοσχεύματος ως πειραματικό μοντέλο. In vitro, SCL-ϋΟΧ δείχθηκε να παραδοθεί στους πυρήνες και εμφανίζεται παρατεταμένη συγκράτηση σε σχέση με την ελεύθερη ϋΟΧ. Η χρήση αυτού του συστήματος απελευθέρωσης nanodrug να παραδώσει DOX για θεραπεία των ποντικών που φέρουν όγκο παρήγαγε μια πολύ βελτιωμένη θεραπευτική αποτελεσματικότητα από την άποψη της καταστολής ανάπτυξης όγκου και παρατεταμένη επιβίωση σε αντίθεση με το ελεύθερο φάρμακο. Επιπλέον, η αγωγή των ποντικών που φέρουν όγκο με SCL-DOX οδήγησε σε χαμηλότερη απορρόφηση ϋΟΧ στα κύρια σημεία της τοξικότητας του ελευθέρου φαρμάκου, δηλαδή την καρδιά και το δέρμα, καθώς και μειωμένη μυελοκαταστολή και μειωμένη καρδιοτοξικότητα. Τέτοια συστήματα παράδοσης nanodrug φυσικών λιπιδίων καθοδηγείται μπορεί να αντιπροσωπεύει μια νέα στρατηγική για την ανάπτυξη αποτελεσματικών αντικαρκινικών χημειοθεραπευτικών στόχο την μικροπεριβάλλον του όγκου τόσο για πρωτοπαθή όγκο και μικρομεταστάσεων

Παράθεση:. Lin J, Yu Υ, Shigdar S, Fang DZ , Du JR, Wei MQ, et al. (2012) Ενισχυμένη αντικαρκινική αποτελεσματικότητα και μειωμένη συστημική τοξικότητα των σουλφατίδιο Περιέχουν Nanoliposomal δοξορουβικίνη σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 7 (11): e49277. doi: 10.1371 /journal.pone.0049277

Επιμέλεια: Maurilio Sampaolesi, Stem Cell Research Institute, το Βέλγιο

Ελήφθη: 22 Ιουλ 2012? Αποδεκτές: 8 του Οκτώβρη 2012? Δημοσιεύθηκε: 7 του Νοέμβρη 2012

Copyright: © 2012 Lin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Υγείας και του Συμβουλίου Ιατρικής Έρευνας (# 479505)? Αυστραλία-Ινδίας Στρατηγικό Ταμείο Έρευνας, (ST01-0013). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι η τρίτη πιο κοινή αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο [1], [2], με έως και 25% των ασθενών που προσέρχονται με μεταστατική νόσο. Παρά τη χειρουργική επέμβαση και τη χημειοθεραπεία, πολλοί από αυτούς τους ασθενείς τελικά υποκύπτουν σε μεταστατικές ασθένειες. Επικουρική θεραπείες, συμπεριλαμβανομένων της ακτινοθεραπείας και της χημειοθεραπείας, είναι σχεδιασμένα να στοχεύουν υπολειμματικά καρκινικά κύτταρα. Σε III ασθενείς με καρκίνο παχέος εντέρου σταδίου, η χημειοθεραπεία παραμένει η κύρια στρατηγική θεραπείας [3]. Ωστόσο, η επιτυχία αυτών των θεραπειών είναι περιορισμένη από την εμφάνιση της θεραπείας ανθεκτικών καρκινικών κυττάρων, καθώς και περιοριστικές της δόσης τοξικότητες [4]. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών, νανοκλίμακα θεραπευτικά συστήματα έχουν αναδειχθεί ως νέες θεραπευτικές μεθόδους για την καταπολέμηση του καρκίνου [4]. Τα σκευάσματα νανοσωματιδίων της παραδοσιακής ελεύθερης αντικαρκινικών φαρμάκων μπορεί να έχουν βελτιωμένες φαρμακοκινητικές και προφίλ βιοκατανομή, ενισχυμένη αντικαρκινική αποτελεσματικότητα, καθώς επίσης και μειωμένη τοξικότητα στους υγιείς ιστούς.

Λιποσωμικά φάρμακα ήταν το πρώτο εγκεκριμένο και ευρέως χρησιμοποιούμενο, όπως νανοϊατρικής για τη θεραπεία της καρκίνους [5], [6]. Τα λιποσώματα είναι μικροσκοπικά κυστίδια φωσφολιπιδίου με μια δομή διπλής στοιβάδας της μεμβράνης. Προκλινικές και κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι τα φαρμακοκινητικά προφίλ, όπως επίσης και οι ιδιαιτερότητες στόχευσης, λιποσωμάτων μπορεί να ελεγχθεί και να τροποποιηθεί για να μειώσει τις παρενέργειες των ενθυλακωμένων φαρμάκων και να ενισχύσει την αποτελεσματικότητά τους [7], [8], [9].

Έχουμε αναπτύξει πρόσφατα ένα σύστημα φορέα νέα λιποσωμικού που αποτελείται από δύο λιπίδια που βρέθηκαν σε ανθρώπους, σουλφατίδιο και 1,2-dioleoyl-

sn

-γλυκερο-3-φωσφοαιθανολαμίνη (DOPE) [12 ], [13]. Κάτω από φυσιολογικό ρΗ, DOPE προσδίδει σταθερότητα στο σουλφατίδιο που περιέχουν λιποσώματα (SCL) μέσω ανασταλτικές επιδράσεις της στην σύντηξη λιποσωμάτων, όπως την ενσωμάτωση του σουλφατιδίου σε DOPE κυστίδια ενισχύει σημαντικά την σταθερότητα των λιποσωμάτων που σχηματίζονται, ακόμη και με την παρουσία του πλάσματος, προφανώς λόγω η ενυδάτωση του αρνητικά φορτισμένου θειικού head-ομάδα του γλυκοσφιγγολιπίδιο [10]. Έχουμε επίσης καταδείξει ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ σουλφατίδιο και τενασκίνης μεσολαβεί στην πρόσδεση του SCL στην ECM και ενδοκυτταρική πρόσληψη των λιποσωμάτων με κύτταρα όγκου τουλάχιστον in vitro [10], [11].

Η στοχευμένη χορήγηση του αντικαρκινικούς παράγοντες στο μικροπεριβάλλον του όγκου είναι μια πολλά υποσχόμενη λεωφόρος για τη θεραπεία του μεταστατικού καρκίνου του παχέος εντέρου. Τενασκίνης C, ένα μεγάλο εξωκυτταρικό γλυκοπρωτεΐνη hexabracchion μήτρα, εκφράζεται έντονα στο μικροπεριβάλλον των περισσοτέρων στερεών όγκων, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων του παχέος εντέρου, αλλά είναι απούσα ή σε μεγάλο βαθμό μειωμένη στις περισσότερες ιστούς ενηλίκων [14]. σουλφατίδιο που περιέχουν μας σύστημα φορέα λιποσωμικό αντιπροσωπεύει έτσι μια νέα κατηγορία φυσικού συστήματος ενδοκυτταρικής χορήγησης λιπίδια καθοδηγείται στοχεύουν το μικροπεριβάλλον του όγκου. Στην διερεύνηση ενός τέτοιου νέα κατεύθυνση για την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών αντικαρκινικών χημειοθεραπευτικών, είναι σημαντικό να κατανοήσουμε τη συμπεριφορά in vivo του nanocarrier, καθώς η μοναδική κατανομή διέπεται από τις ιδιότητες του nanocarrier μπορεί να αλλάξει την θεραπευτική αποτελεσματικότητα, καθώς μεταβάλλουν την τοξικότητα προφίλ του έγκλειστου φαρμάκου. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιούμε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού ορθοκολικού αδενοκαρκινώματος ανθρώπου (ΗΤ-29) το οποίο είναι γνωστό ότι εκφράζουν τενασκίνη-C [15], [16] και ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο φάρμακο χημειοθεραπείας, δοξορουβικίνη (ϋΟΧ), ως μοντέλο ωφέλιμο φορτίο να μελετήσει την βιοκατανομή, αντικαρκινική αποτελεσματικότητα και την τοξικότητα του συστήματος λιποσωματικό φορέα σουλφατιδικά περιέχουν.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Η επιτροπή Πανεπιστήμιο Deakin καλή μεταχείριση των ζώων έχει εγκριθεί όλα τα ζωικά πρωτόκολλα που χρησιμοποιούνται σε αυτή την έρευνα.

Cell Culture

Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά ορθοκολικού αδενοκαρκινώματος ΗΤ-29 αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). McCoy 5Α (τροποποιημένο) μέσο αγοράστηκε από την Invitrogen ™ (Αυστραλία). Ο εμβρυϊκός βόειος ορός (FBS) αγοράστηκε από την Hyclone (Καναδάς). Η θρυψίνη αγοράστηκε από την Invitrogen ™ (Αυστραλία). φιάλες καλλιέργειας ιστών αγοράσθηκαν από BD Falcon ™ (Αυστραλία). Γυάλινα πιάτα κάτω αγοράστηκαν από MatTek Corporation (Ashalnd, ΜΑ, ΗΠΑ). ΗΤ-29 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, πενικιλλίνη (50 U /mL), και στρεπτομυκίνη (50 μg /mL) σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2 και 95% αέρα στους 37 ° C.

Παρασκευή SCL-DOX

τα λιποσώματα παρασκευάστηκαν σύμφωνα με μια προηγουμένως δημοσιευμένη μέθοδο με ορισμένες τροποποιήσεις [10]. Εν συντομία, DOPE μονοελασματικά κυστίδια που περιέχει 30% (μοριακή αναλογία) σουλφατίδιο παρασκευάστηκαν με μια μέθοδο ενυδάτωσης που ακολουθείται από εξώθηση πολυανθρακικής μεμβράνης. DOPE (13,35 mM) και το σουλφατίδιο (6 mM, Avanti Polar Lipids, Inc.) διαλύθηκαν σε ένα μίγμα χλωροφορμίου και μεθανόλης (2:01, ν /ν), και το μείγμα λιπιδίων, που αποτελείται από ϋΟΡΕ /σουλφατίδιο (3: 7, mol /mol), μεταφέρθηκε σε γυάλινους σωλήνες. Τα δείγματα στη συνέχεια μειώνεται σε ένα ελάχιστο όγκο υπό ρεύμα αζώτου και αποθηκεύθηκε υπό κενό για 24 ώρες στους 4 ° C για να εξατμισθεί πλήρως το οργανικό διαλύτη. Οι λεπτές μεμβράνες λιπιδίων ενυδατώθηκαν με την προσθήκη 1 mL 250 mM θειικού αμμωνίου (ρΗ 8,5). Τα δείγματα στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε ένα λουτρό πάγου-ύδατος και υφίσταται κατεργασία με υπερήχους κάτω από άζωτο για 2.5 λεπτά με πλάτος 50% με τη χρήση υπερήχων (Sonics Όργανα (Malvern, Ηνωμένο Βασίλειο). Η DOX φορτώνονται σε SCL ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας ανιχνευτή φθορισμού σε Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (HPLC).

Ο χρωματογραφικός όργανα χρησιμοποιήθηκε βασίζεται σε μια προηγουμένως δημοσιευμένη μέθοδο με ορισμένες τροποποιήσεις [18], [19]. Εν συντομία, το σύστημα HPLC (Milford, ΜΑ, USA) που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη αποτελείται από μια ηλεκτρονική μονάδα e2695 Διαχωρισμός Waters και ένα Waters 2475 Ανιχνευτής φθορισμού πολυ λ. Τα μήκη κύματος διέγερσης και εκπομπής ρυθμίστηκαν σε 470 nm και 585 nm, αντίστοιχα. Χρωματογραφικός διαχωρισμός διεξήχθη χρησιμοποιώντας στήλη Nova-Pak® C18 (3,9 χ 150 mm i.d., 4 μm, Waters, USA) με μία στήλη C18 προστατευτικό Nova-Pak® (3.9 × 20 mm i.d., 4 μm, Waters, USA). Ένα μίγμα από μεθανόλη και 10 mM φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (ρΗ = 3.0) χρησιμοποιήθηκε ως κινητή φάση. Ο ρυθμός ροής που χρησιμοποιείται στη δοκιμασία ήταν 1 mL /min και η στήλη διατηρήθηκε στους 40 ± 5 ° C καθ ‘όλη τη χρωματογραφική διαδικασία.

Ανάλυση κυτταροτοξικότητας

Η επίδραση της ελεύθερης ϋΟΧ ή SCL-ϋΟΧ σε ΗΤ-29 κυτταροτοξικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την δοκιμασία πολλαπλασιασμού ΜΤΤ κυττάρων [20], [21]. ΗΤ-29 κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 2 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο σε τρυβλίο 96 φρεατίων σε 100 μΐ μέσου McCoy 5Α που περιέχει 10% FBS. Ελεύθερο διάλυμα DOX και SCL-ϋΟΧ προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο 24 ώρες μετά την επίστρωση (τελική συγκέντρωση 0-100 μg /mL). Μετά από 48 ώρες επώασης στους 37 ° C, 5% CO

2, η απορρόφηση μετρήθηκε σε μήκος κύματος 570 nm χρησιμοποιώντας ένα Plate Reader VICTOR TM X5 Multilabel HTS (PerkinElmer Life and Analytical Sciences). Η κυτταροτοξικότητα εκφράζεται ως ποσοστό των κυττάρων ελέγχου. Η συγκέντρωση αναστολής 50% (IC

50), που ορίζεται ως η δόση των παραγόντων που αναστέλλει το 50% της κυτταρικής ανάπτυξης, η παρεμβολή από τις καμπύλες ανάπτυξης χρησιμοποιώντας SPSS 13.0 [18], [19]. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

Ομοεστιακή Μικροσκοπίας Ανάλυση για Κυτταρική πρόσληψη και κατακράτηση του SCL-DOX

κύτταρα ΗΤ-29 (1 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε 35 mm από γυαλί πιάτα πυθμένα και επωάζονται στους 37 ° C σε 5% CO

2 για 24 ώρες. Το μέσο στη συνέχεια αντικαταστάθηκε με μέσο πλήρους καλλιέργειας που περιέχει 2 μg /mL ελεύθερη ϋΟΧ ή SCL-DOX. Εικοσιτέσσερις ώρες αργότερα, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και απεικονίζεται για κυψελοειδή μελέτες πρόσληψης. Για συγκρατήσεις μελέτες, τα κύτταρα πρώτα εκτέθηκαν σε 2 μg /mL ελεύθερη ϋΟΧ ή SCL-ϋΟΧ σε πλήρη μέσο κυτταρικής καλλιέργειας για 24 ώρες και στη συνέχεια πλύθηκε δύο φορές με PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με μέσο φρέσκο ​​κυτταρική καλλιέργεια και σειριακά απεικονίζεται στην 1 ώρα, 2 ώρες, 4 ώρες, και 24 ώρες χρησιμοποιώντας ένα Fluoview FV10i λέιζερ φθορισμός συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης (Olympus, Japan).

Ανάλυση των φαρμακοκινητικών ιδιοτήτων in vivo

Αρσενικοί αρουραίοι Sprague-Dawley (SD) αρουραίοι (200 έως 250 g) στεγάστηκαν σε ένα ελεγχόμενης θερμοκρασίας δωματίου (25 ± 1 ° C) με ένα κύκλο φωτός-σκότους 12-h. Οι αρουραίοι τρέφονται

κατά βούληση

με μια τυπική δίαιτα, αλλά ήταν νηστικοί όλη την νύχτα πριν από την ελεύθερη ϋΟΧ ή χορήγηση SCL-DOX. Όλες οι διαδικασίες που αφορούν τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Μέριμνας Ζώων του Πανεπιστημίου Deakin.

Για να διερευνηθεί η φαρμακοκινητική (PK) ιδιότητες του SCL-DOX in vivo, υγιείς αρουραίους SD υπέστησαν ενδοφλέβια έγχυση με δωρεάν ϋΟΧ ή SCL-DOX μέσω η ουρά φλέβα με μία μόνο δόση των 5 mg DOX /kg. Το αίμα συλλέγεται σειριακά από το ίδιο ζώο σε σωλήνες με ηπαρίνη από την ουρά στα 2 λεπτά, 0,5 ώρα, 2 ώρες, 6 ώρες, 24 ώρες και 48 ώρες. Μετά τη συλλογή, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στις 3000 χ

g

στους 4 ° C για 10 λεπτά για να διαχωριστεί το πλάσμα. Για τον προσδιορισμό των επιπέδων στο πλάσμα DOX, 495 μΐ μεθανόλης και 405 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών προστέθηκαν στη συνέχεια 100 μL του πλάσματος, στροβιλίστηκε για 1 λεπτό, και φυγοκεντρείται στα 21.000 χ

g

για 10 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε έναν άλλο σωλήνα που ακολουθείται από την προσθήκη 2 μΙ υπερχλωρικού οξέος (35%, ν /ν). Τα δείγματα στροβιλίστηκαν για 1 λεπτό, και φυγοκεντρείται στα 21.000 χ

g

για 10 λεπτά στους 4 ° C, που ακολουθείται από την μέτρηση της συγκέντρωσης DOX χρησιμοποιώντας HPLC.

Tumor Εμφύτευση, Θεραπεία και Αξιολόγησης

ξενομοσχεύματος όγκοι εγκατεστημένοι σε 6 εβδομάδων θηλυκά BALB /c-Foxn1

nu ποντίκια που είχαν αγοραστεί από το Κέντρο ζώων Πόρων (Περθ, Αυστραλία). Όλα τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της Επιτροπής θεσμικών Μέριμνας Ζώων του Πανεπιστημίου Deakin. Τα ποντίκια διατηρήθηκαν κάτω από συνθήκες ελεύθερες παθογόνων σε TECNIPLAST Sealsafe ™ Ξεχωριστά κλωβοί (Buguggiate, Ιταλία) σε (25 ± 1 ° C) και ένα /σκότους 12-h φως 12 ωρών. Ταΐστηκαν

ad libitum

με μια τυπική δίαιτα.

ΗΤ-29 κύτταρα χρησιμοποιούνται για όγκους ξενομοσχεύματος παρασκευάστηκαν με τρυψινοποίηση. Τα κύτταρα πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε μια συγκέντρωση 3 χ 10

7 κύτταρα /mL σε PBS, το οποίο στη συνέχεια εμβολιάσθηκαν υποδορίως (s. C.) Στο δεξί πλευρό των ποντικών. Το μέγεθος του όγκου αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ψηφιακό παχύμετρο κάθε δεύτερη μέρα μετά την εμφύτευση και κατά προσέγγιση το φορτίο του όγκου (mm

3) υπολογίστηκε ως μήκος Χ πλάτος

2/2 (

V

=

LW

2/2), όπου το μήκος και το πλάτος είναι η μεγαλύτερη και τη μικρότερη άξονα σε χιλιοστά [22].

Για τη μελέτη της πρόσληψης του όγκου, τα ποντίκια με όγκους των -150 mm

3 ήταν κατεργάζεται με ελεύθερη ϋΟΧ ή SCL-DOX (5 mg /kg ϋΟΧ ή ισοδύναμο) μέσω ένεσης στην ουραία φλέβα. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την ένεση, τα ποντίκια θυσιάστηκαν με ένεση Lethabarb R (100 mg /kg) και οι όγκοι υπέστησαν επεξεργασία όπως περιγράφεται προηγουμένως [23], [24]. συγκέντρωση ϋΟΧ σε ιστό προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας HPLC.

Για θεραπευτική πειράματα, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή όταν οι όγκοι ξενομοσχεύματος έφθασαν 35 mm

3. Οι ποντικοί έλαβαν ένεση φυσιολογικού ορού, δωρεάν DOX (5 mg /kg), SCL-DOX (5 mg /kg σε ϋΟΧ) ή κενό SCL μέσω της φλέβας της ουράς δύο φορές την εβδομάδα για 3 εβδομάδες. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε με μέτρηση διάμετροι των όγκων κάθε δεύτερη ημέρα με ένα παχύμετρο και ζωικά βάρη παρακολουθήθηκαν ταυτόχρονα. Το τελικό σημείο της μελέτης ορίστηκε ως το φορτίο όγκου φθάνοντας 1.700 χιλιοστά

3.

Ανάλυση συστημική τοξικότητα

Για την αξιολόγηση της γενικής τοξικότητας των ελεύθερων DOX και SCL-DOX, το αίμα συλλέχθηκε όταν θυσιάστηκαν τα ποντίκια για θεραπευτική πειράματα. κύτταρα αίματος και τροπονίνη αναλύθηκαν από ένα κτηνιατρικό εργαστήριο παθολογίας (Gribbles Κτηνιατρικής Παθολογίας, Clayton, Βικτώρια, Αυστραλία). επιχρίσματα αίματος ελήφθησαν για κάθε ζώο για να ληφθεί μία σχετική αριθμός λευκών προσαρμοσμένη από τη μέθοδο που Fonio για μέτρηση των αιμοπεταλίων [25], [26], με μικρές τροποποιήσεις. Τα πλακίδια χρωματίστηκαν με Giesma και μια περιοχή της κηλίδας αίματος επελέγη όπου τα ερυθρά κύτταρα εφάπτονται το ένα το άλλο, αλλά δεν συμπίπτουν, με διαδοχικά πεδία επελέγη για τη διάθεση προκατάληψη. Ο συνολικός αριθμός των λευκών κυττάρων ανά 1.500 ερυθρά κύτταρα μετρήθηκαν (η = 3 για κάθε διαφάνεια) και συγκρίθηκαν για κάθε ομάδα.

Είναι

Δεδομένα

Ανάλυση

Όλα τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσο και το τυπικό σφάλμα (μέση τιμή ± SE). Οι φαρμακοκινητικές παράμετροι υπολογίστηκαν από τις μέσες συγκεντρώσεις πλάσματος χρησιμοποιώντας την DAS λογισμικό φαρμακοκινητικές λογισμικού 2.0 (Mathematical Φαρμακολογία Επαγγελματικής Επιτροπής της Κίνας, Σαγκάη, Κίνα). Οι διαφορές στις μέσες τιμές μεταξύ των διαφορετικών ομάδων προσδιορίστηκαν με μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA) χρησιμοποιώντας SPSS 13.0 πρόγραμμα. Σημασία θεωρήθηκε σε τιμές

σ

,

P

,

P

& lt?. 0.001 σε σύγκριση με κενό SCL

Η

Στη συνέχεια, σε σύγκριση με τα ποσοστά επιβίωσης των ποντικών που φέρουν όγκο μετά από τις τέσσερις διαφορετικές θεραπευτικές αγωγές. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, μέσοι χρόνοι επιβίωσης για τις τέσσερις διαφορετικές ομάδες ήταν 26 ημέρες (αλατούχο διάλυμα), 33 ημέρες (ελεύθερη ϋΟΧ), 36 ημέρες (SCL-DOX) και 32 ημέρες (κενό SCL), αντίστοιχα. Έτσι, η θεραπεία SCL-DOX αυξημένο μέσο χρόνο ζωής κατά 38,5% σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου φυσιολογικού ορού, κατά 12,5% σε σύγκριση με το τυφλό SCL ομίλου και κατά 9,1% σε σύγκριση με την ομάδα ελεύθερης ϋΟΧ. Αυτά τα πειράματα έδειξαν ότι η χορήγηση του SCL-DOX σε 6 δόσεις σε χρονικό διάστημα τριών εβδομάδων, όχι μόνο έδωσε την καλύτερη αναστολή της ανάπτυξης του όγκου, αλλά επίσης βελτίωσε την επιβίωση των ζώων που φέρουν ξενομοσχεύματα.

Η καμπύλη επιβίωσης Kaplan-Meier δείχνει βελτίωση της διάρκειας ζωής των ποντικών που φέρουν ξενομόσχευμα έλαβαν θεραπεία με SCL-DOX (n = 9~10 ανά ομάδα). Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 3 και θυσιάστηκαν καθ ‘όλη τη διάρκεια της μελέτης κατά τη συμπλήρωση καταληκτικό σημείο της μελέτης μας.

Η

Μειωμένη συστημική τοξικότητα του SCL-DOX

DOX που προκαλείται από μυοκαρδιοπάθεια είναι μια από τα βασικά περιοριστικές της δόσης τοξικότητες του φαρμάκου [27]. Καρδιακή τροπονίνη Τ-απελευθερώνεται από ϋΟΧ-κατεστραμμένα μυοκύτταρα [28], επομένως, μέτρηση των επιπέδων αυτής της πρωτεΐνης ορού παρέχει μία ευαίσθητη εκτίμηση της πρόωρης καρδιοτοξικότητα της DOX. Η μέθοδος που χρησιμοποιείται στην παρούσα μελέτη έχει αποκοπής κατωφλίου των & lt? 0,01 μg /L για το φυσιολογικά άτομα [29]. Όπως φαίνεται στον Πίνακα-3, η ελεύθερη DOX θεραπεία είχε ως αποτέλεσμα μια 75-φορές υψηλότερο επίπεδο τροπονίνης στον ορό σε σύγκριση με τους μάρτυρες, επιβεβαιώνοντας τη γνωστή καρδιοτοξικότητα του ελεύθερου φαρμάκου. Ωστόσο, καμία αύξηση της τροπονίνης στον ορό παρατηρήθηκε για την ομάδα θεραπείας SCL-DOX, το οποίο παρέμεινε κάτω από τα επίπεδα αποκοπής, όπως και με τις ομάδες ελέγχου, υποδεικνύοντας ότι η θεραπεία ποντικιών που φέρουν ξενομοσχεύματα με 6 δόσεις SCL-DOX για την περίοδο από 4 εβδομάδες είχε ελάχιστη καρδιοτοξικότητα. Να διερευνήσει κατά πόσον ενθυλάκωση της DOX σε SCL είχε καμία επίδραση στη σοβαρότητα της καταστολής του μυελού των οστών (μυελοκαταστολή), η πιο συχνή ανεπιθύμητη ενέργεια της DOX χημειοθεραπεία [27], μελετήσαμε τις αλλαγές στο περιφερικό λευκών αιμοσφαιρίων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6, δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά στο συνολικό αριθμό των λευκών αιμοσφαιρίων μεταξύ του αλατούχου αγωγή ή SCL-ϋΟΧ-αγωγή ομάδες. Επιπλέον, σε σύγκριση με τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με ελεύθερη DOX, που έλαβαν αγωγή με SCL-DOX είχε 2.0-πλάσια και 3,3-πλάσια υψηλότερη αρίθμηση για τα λεμφοκύτταρα και τα μονοκύτταρα, αντίστοιχα. Έτσι, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι SCL-DOX έχει ελάχιστη καρδιοτοξικότητα και σημαντικά μειωμένη μυελοκαταστολή.

ΗΤ-29 ποντικούς που φέρουν ξενομοσχεύματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 3. Το αίμα συλλέχθηκε αμέσως μετά οι ποντικοί θανατώθηκαν μετά την επίτευξη του τελικό σημείο. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι μέσα ± S.E. (N = 3~5). *,

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με το φυσιολογικό ορό? ***

P

& lt? 0.001 σε σύγκριση με το φυσιολογικό ορό? #,

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με ελεύθερη DOX? ##,

P

& lt?. 0.01 σε σύγκριση με την ελεύθερη DOX

Η

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη είναι η πρώτη που αξιολογεί την κατανομή των ιστών, in vivo αντικαρκινική δραστηριότητα και το προφίλ τοξικότητας του SCL-DOX σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού ορθοκολικού αδενοκαρκινώματος του ανθρώπου. Έχουμε δείξει πολλά σημαντικά σημεία: (α) SCL-ϋΟΧ εύκολα παραλαμβάνεται από καρκινικά κύτταρα κόλου και εμφανίζεται παρατεταμένη κατακράτηση? (Β) ενθυλάκωση του DOX σε SCL οδήγησε σε μειωμένη κατανομή του φαρμάκου προς τις κύριες θέσεις της οξείας και χρόνιας τοξικότητας της ελεύθερης ϋΟΧ, δηλαδή την καρδιά και το δέρμα, καθώς και αξιοσημείωτα μείωσε καρδιοτοξικότητα και μυελοκαταστολή? (Γ) το σουλφατίδιο που περιέχει λιποσωματικό φάρμακο εμφανίζεται μια αυξημένη θεραπευτική αποτελεσματικότητα σε ένα μοντέλο ποντικού ορθοκολικού αδενοκαρκινώματος ανθρώπινης.

Η ενδοκυτταρική πρόσληψη του SCL σε κύτταρα γλοιώματος δείχθηκε να είναι ένα αποτέλεσμα της ενδοκυτταρικής πρόσληψης των λιποσωμάτων σε προηγούμενες εργάζονται [11]. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε επιβεβαιώσει την ενδοκυτταρική πρόσληψη του SCL-ϋΟΧ από ανθρώπινα κύτταρα αδενοκαρκινώματος του παχέος, ΗΤ-29, με τη χρήση ομοεστιακού μικροσκοπίου. Είναι σημαντικό ότι, αποδείξαμε ότι το ενθυλακωμένο φάρμακο χημειοθεραπείας παραδόθηκε ενδοκυτταρικά στο σημείο δράσης, των πυρήνων, των κυττάρων ΗΤ-29 (Σχήματα 1 και 2). Επιπλέον, το χορηγούμενο φάρμακο λιποσωμική κατακρατήθηκε από τα κύτταρα του όγκου, ακόμη και 24 ώρες μετά το πλύσιμο. in vitro μελέτη κυτταροτοξικότητας μας συγκρίναμε την βιωσιμότητα του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα επεξεργασμένα με SCL-DOX και ελεύθερη ϋΟΧ χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ και έδειξε ότι και οι δύο μορφές έχουν εμφανή κυτταροτοξικότητα. Είναι ενδιαφέρον ότι η SCL-DOX έχει ένα IC

50 59% υψηλότερη από εκείνη της ελεύθερης ϋΟΧ (Πίνακας 1). Αυτό είναι σύμφωνο με τις παρατηρήσεις από τους άλλους ότι το IC

50 της ελεύθερης και λιποσωμικής φάρμακο, όταν δοκιμάστηκε in vitro, ποικίλλει ανάλογα με τα κυτταρικές γραμμές που χρησιμοποιούνται και τη φύση των λιποσωμάτων. Για παράδειγμα, Wang et al. βρέθηκαν στην κυτταρική σειρά καρκίνου προστάτη αρουραίου MLLB2, το IC

50 του λιποσωμικού σκευάσματος ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι ελεύθερη ϋΟΧ [30]. Σε μια μελέτη του ανθεκτικού MCF-7 κύτταρα /ADR, η λιποσωμική DOX έδειξε μια 30 φορές χαμηλότερη IC

50 σε σύγκριση με την ελεύθερη ϋΟΧ [31]. Ωστόσο, σε άλλες μελέτες ελεύθερη ϋΟΧ φαίνεται να έχουν υψηλότερες ενδοκυτταρική πρόσληψη και εμφανίζει υψηλότερη κυτταροτοξικότητα από εκείνη του λιποσωματικού DOX. Για παράδειγμα, στο κυτταρικής σειράς ηπατοκυτταρικού καρκινώματος, HepG2, δωρεάν DOX έχει υποδειχθεί να έχουν υψηλότερη κυτταροτοξικότητα σε σύγκριση με εκείνη του DOX φορτωμένων stealth λιποσώματα [24]. Επιπλέον, πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) επικαλυμμένο-λιποσωμική DOX έχει αποδειχθεί ότι έχουν λιγότερη τοξικότητα από την ελεύθερη ϋΟΧ στην κυτταρική σειρά γλοιώματος, U-87 κύτταρα [10]. Είναι σημαντικό να εκτιμηθεί ότι οι in vivo φαρμακοκινητική είναι πολύ διαφορετικές μεταξύ λιποσωμική DOX και ελεύθερη DOX. Ο χρόνος ημίσειας ζωής των λιποσωμικών DOX μπορεί να είναι αρκετές ημέρες, ενώ ελεύθερης ϋΟΧ μπορούν να εξαλειφθούν σε λίγα λεπτά in vivo [32], [33], [34]. Σε πιάτα κυτταρικής καλλιέργειας, τα κύτταρα εκτίθενται σε μια σταθερή συγκέντρωση του φαρμάκου σε όλη τη διάρκεια της ανάλυσης και συχνά καταλαμβάνουν ελεύθερη ϋΟΧ ταχύτερα από λιποσωμικό σκεύασμα [35]. Περαιτέρω, τα κύτταρα για δοκιμασίες ΜΤΤ είναι ως επί το πλείστον καλλιεργούνται σε μονοστοιβάδες, που έχουν μια χωρική οργάνωση δραστικά διαφορετικό από την in vivo 3-διαστάσεων ιστός αρχιτεκτονική [36]. Έτσι, η σύγκριση των IC

50 μεταξύ ενός ελεύθερου φαρμάκου και νανοσωματίδια σκεύασμα του φαρμάκου in vitro παρέχει μία μέτρηση της κυτταροτοξικότητας υπό σταθερή συγκέντρωση κατά τη διάρκεια μιας επιλεγείσας περιόδου δοκιμασίας, και ως εκ τούτου δεν μπορεί να είναι σε θέση να παρέχει μια αξιόπιστη πρόβλεψη της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας in vivo [37]. Στην παρούσα μελέτη, αν και το IC

50 του SCL-DOX ήταν υψηλότερη από εκείνη της ελεύθερης ϋΟΧ σε ΗΤ-29 κυττάρων in vitro, η σύνθεση SCL δείχθηκε να εμφανίζει μια πολύ βελτιωμένη όγκου ανασταλτική δράση έναντι της ελεύθερης ϋΟΧ σε ΗΤ -29 φέρουν όγκο γυμνοί ποντικοί (σχήματα 4 και 5).

γαστρεντερικών όγκων είναι γνωστό ότι είναι σχετικά ανθεκτική σε χημειοθεραπευτικά. Στο 80% των μη επεξεργασμένων όγκων του παχέος εντέρου, υπάρχει ένα ανυψωμένο επίπεδο του Ι (MDR Ι) γονίδιο πολυανθεκτικά [38]. Η σύγκριση των φαρμακοκινητικών ιδιοτήτων μεταξύ της ελεύθερης ϋΟΧ και SCL-DOX σε υγιείς αρουραίους SD εμφανίζεται η σημαντική μείωση του ρυθμού κάθαρσης του SCL-DOX σε σύγκριση με ελεύθερη DOX (

σ

& lt? 0,01).