Αφηρημένο

CK2 πρωτεΐνης κινάσης είναι συχνά up-ρυθμίζονται σε ανθρώπινους καρκίνους, αν και ο μηχανισμός της ενεργοποίησης CK2 στον καρκίνο του παραμένει άγνωστη. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε το ρόλο του γονιδίου της CK2α ιντρόνια (

CSNK2A1P

, μια υποτιθέμενη CK2α ψευδογονίδιο) στην παθογένεση ανθρώπινων καρκίνων. Βρήκαμε στοιχεία ενίσχυσης και υπερ-έκφραση του

CSNK2A1P

γονιδίου σε μη μικρό κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα και τη λευχαιμία και το 25% των ιστών καρκίνου του πνεύμονα που μελετήθηκαν. Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA συσχετίζονται με τους αριθμούς αντίγραφο του

CSNK2A1P

γονίδιο. Εντοπίσαμε επίσης μία νέα πολυμορφική παραλλαγή (398T /C, I133T) του

CSNK2A1P

γονίδιο και έδειξε ότι το αλληλόμορφο 398T επιλεκτικά ενισχύεται πάνω από το αλληλόμορφο 398C σε 101 μη-μικροκυτταρικό δείγματα ιστού καρκίνου του πνεύμονα σε σύγκριση με εκείνα σε 48 φυσιολογικούς μάρτυρες (

σ

= 0.013 & lt? 0,05). Δείχνουμε για την έκφραση της πρωτεΐνης CSNK2A1P πρώτη φορά σε επιμολυσμένα ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά 293Τ και ποντίκι εμβρυϊκών ινοβλαστών κυτταρικές γραμμές ΝΙΗ-3Τ3. Και τα δύο αλληλόμορφα μετασχηματισμού σε αυτές τις κυτταρικές σειρές, και το αλληλόμορφο 398T φαίνεται να είναι πιο μετασχηματισμού από το αλληλόμορφο 398C. Επιπλέον, το αλληλόμορφο 398T υποβαθμίζει καταστολέα πρωτεΐνης PML όγκου πιο αποτελεσματικά από ό, τι το αλληλόμορφο 398C και δείχνει μία σχετικά ισχυρότερη δέσμευση με PML. Νοκ ντάουν του

CSNK2A1P

γονιδιακής έκφρασης με συγκεκριμένες siRNA αύξησε το επίπεδο της πρωτεΐνης PML σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Αναφέρουμε, για πρώτη φορά, ότι ο

CSNK2A1P

γονίδιο είναι ένα λειτουργικό πρωτο-ογκογονίδιο σε ανθρώπινους καρκίνους και λειτουργική πολυμορφισμός του φαίνεται να υποβαθμίσει PML διαφορικά σε καρκινικά κύτταρα. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με σημαντικό ρόλο για το αλληλόμορφο 398T του

CSNK2A1P

στην ευαισθησία του ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα

Παράθεση:. Hung MS, Lin YC, ο Μάο JH, Kim IJ, Xu Z, Yang CT, et al. (2010) Λειτουργική Πολυμορφισμός του CK2α εσώνια γονιδίων παίζει Ογκογόνες ρόλοι στον καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 5 (7): e11418. doi: 10.1371 /journal.pone.0011418

Επιμέλεια: Chun-Ming Wong, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 17 Δεκ 2009? Αποδεκτές: 5 Ιούνη του 2010? Δημοσιεύθηκε: 2, Ιουλίου, 2010

Copyright: © 2010 Hung et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (093708-01A3) και του Larry Hall και Zygielbaum Memorial Trust, και το Καζάν, McClain, Edises, Abrams, Fernandez, Λυών και Farrise Ιδρύματος. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Μερικά από τα σωματικά γεγονότα που εμπλέκονται στον καρκίνο του πνεύμονα έχουν χαρακτηριστεί καλά, αλλά μερικά από αυτά παραμένουν άγνωστα [2], [3]. CK2 πρωτεΐνης κινάσης (παλαιότερα γνωστό ως κινάση καζεΐνης II) είναι μια πρωτεϊνική κινάση σερίνης /θρεονίνης η οποία φωσφορυλιώνει περισσότερες από 300 πρωτεΐνες [4]. Είναι αποδομεί πρωτεΐνες καταστολής όγκου όπως PML [5] και προωθεί τη δραστικότητα και τη σταθερότητα των ογκογόνων πρωτεϊνών όπως ΑΚΤ [6]. Για παράδειγμα, CK2 προωθεί PML αποδόμησης και δραστικότητα κινάσης CK2 συσχετίζεται αντίστροφα με τα επίπεδα πρωτεΐνης PML σε ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα [5]. Πρόσφατα, η επιβίωση πολλαπλά κύτταρο μυελώματος δείχθηκε να επικαλεστεί την υψηλή δραστικότητα της πρωτεΐνης κινάσης CK2 [7]. CK2 επηρεάζει επίσης αρκετές κυτταρικές σηματοδότησης οδούς, συμπεριλαμβανομένων των ΡΙ3Κ, NFkB και Wnt οδούς [8].

Το επίπεδο έκφρασης CK2α ρυθμίζεται στενά σε φυσιολογικά κύτταρα [9], και αυξημένο επίπεδο CK2α και δραστηριότητα ήταν σταθερά παρατηρηθεί σε μια ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων [10]. Για παράδειγμα, η υψηλού επιπέδου ή /και πυρηνική εντόπιση του CK2α είναι ένας δείκτης της κακής πρόγνωσης για ασθενείς με οξεία μυελοειδή λευχαιμία, καρκίνο του προστάτη, και καρκίνο πλακωδών κυττάρων του πνεύμονα [10]. CK2α είναι η καταλυτική υπομονάδα της πρωτεϊνικής κινάσης CK2 και CK2α έχει αναφερθεί να κωδικοποιηθεί από το

CSNK2A1

γονίδιο στο χρωμόσωμα 20p13 [11]. Η

CSNK2A1

γονίδιο μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα ογκογονίδιο και απορυθμισμένη έκφραση του μπορεί να προκαλέσει μαστικών όγκων και λεμφωμάτων σε διαγονιδιακά ποντίκια [12], [13]. Αν και η δράση του

CSNK2A1

γονίδιο έχει δειχθεί ότι είναι αυξημένα σε ανθρώπινους καρκίνους, κανένα στερεό γενετική ή επιγενετική στοιχεία είναι διαθέσιμα στοιχεία σχετικά με την αιτία της υψηλής δραστικότητας του CK2α σε καρκινικά κύτταρα [10]. Το γονίδιο ιντρόνια CK2α (επίσης γνωστή ως CK2α «ψευδογονίδιο»),

CSNK2A1P

, βρίσκεται στο χρωμόσωμα 11p15.3 και η αλληλουχία του είναι άκρως ομόλογη (99% ταυτότητα) προς το

CSNK2A1

cDNA αλληλουχία [14]. Αν και η

CSNK2A1P

γονίδιο φέρεται να εκφράζεται σε ένα μεγακαρυοκυτικών κυτταρική γραμμή [15], ο ρόλος του στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων παραμένει άγνωστη. Συνεπώς ερευνήσαμε την ενίσχυση και την έκφραση του

CSNK2A1P

γονίδιο στον καρκίνο του πνεύμονα και κυτταρικές γραμμές λευχαιμίας και τους ιστούς του καρκίνου του πνεύμονα.

Αποτελέσματα

Υπερ-έκφραση και ενίσχυση του

CSNK2A1P

γονιδίου στα καρκινικά κύτταρα και τους ιστούς του καρκίνου του πνεύμονα

Είμαστε επικεντρώθηκε η

CSNK2A1P

γονίδιο γιατί αρχικά διαπίστωσαν ότι ελάχιστα εκφράζεται σε φυσιολογικά κύτταρα, αλλά εκφράζεται κυρίως σε διάφορες τύποι ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών και ιστών όγκου, συμπεριλαμβανομένης της λευχαιμίας κυττάρου Τ κυτταρική σειρά ανθρώπινου Jurkat, η οποία είναι γνωστή για την υψηλή δραστικότητα CK2 της. Με ημι-ποσοτική RT-PCR, δείξαμε ότι η

CSNK2A1P

γονίδιο είναι επίσης υπερ-εκφράζεται σε τρεις γραμμές NSCLC: Η1299, H322, και Α549, αλλά ελάχιστα που εκφράζεται σε φυσιολογικά κύτταρα και δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα H1650 και Η460 (Εικ. 1Α). Επιπλέον,

CSNK2A1P

mRNA υπερεκφράστηκε σε καρκινικό ιστό πνεύμονα από επτά από τα δείγματα 29 (~ 25%) των όγκων σε σύγκριση με τα συμφωνημένα ιστούς ελέγχου (Εικ. 1Β). Επιπλέον, η ανάλυση FISH στις ίδιες γραμμές ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων υπό την προϋπόθεση προκύπτει από το πολλαπλασιασμό του

CSNK2A1P

γονίδιο βρίσκεται στο χρωμόσωμα 11p15.3 (Σχ. 1D). Για παράδειγμα, τέσσερα αντίγραφα του

CSNK2A1P

γονίδιο βρέθηκαν στην Τ κυτταρική λευχαιμία κυτταρική σειρά ανθρώπινου Jurkat, και τρία αντίγραφα στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα Η1299, Α549, και H322. Αντίθετα, τα φυσιολογικά λεμφοκύτταρα και κυτταρική γραμμή Η460 είχε διπλοειδή αντίγραφα του

CSNK2A1P

γονίδιο (Εικ. 1 C και D). Σημαντικά, τα επίπεδα έκφρασης του mRNA συσχετίζεται με αριθμούς αντιγράφων του

CSNK2A1P

γονίδιο σε αυτούς ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών (η = 8? Γ του Pearson = 0,9346?

σ

= 0,0007). (Εικόνα 1 Ε ). Πραγματοποιήσαμε περαιτέρω ημι-ποσοτική RT-PCR για να αξιολογηθεί η έκφραση του mRNA της

CSNK2A1

γονίδιο με ειδικούς εκκινητές. Υπερέκφραση του

CSNK2A1

γονίδιο παρατηρήθηκε επίσης σε πάνω από καρκινικές κυτταρικές σειρές (Σχ. 1 F), γεγονός που υποδηλώνει ότι εκτός από την

CSNK2A1

γονίδιο, το

CSNK2A1P

γονίδιο επίσης παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεση του καρκίνου του πνεύμονα. Ευθυγράμμιση των εκκινητών που χρησιμοποιούνται για την ημι-ποσοτική RT-PCR από το

CSNK2A1

και

γονίδια CSNK2A1P

παρουσιάστηκαν στο συμπληρωματικών στοιχείων (Εικ. S1).

(Α) Ημι-ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιώντας CSNK2A1P-ειδικούς εκκινητές δείχνει το επίπεδο έκφρασης CSNK2A1P mRNA είναι συνεπής με τους αριθμούς αντίγραφο ανιχνεύθηκε με FISH (3 για Η1299, 4 για Jurkat, 3 για H322 και Α549, 2 για WI-38 και CCL-211 ). (Β) Ημι-ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιώντας CSNK2A1P-ειδικούς εκκινητές δείχνει το mRNA CSNK2A1P υπερεκφράζεται σε επτά (ασθενής 1 έως 7) από όγκους 29 (~ 25%) των πνευμόνων σε σύγκριση με συμφωνημένα φυσιολογικό γειτονικό ιστό. Ο ασθενής 8 έως 14 παριστάνει δείγματα χωρίς υπερεκφράζεται mRNA CSNK2A1P. Άλλες 14 δείγματα με παρόμοια αποτελέσματα δεν φαίνονται. (Γ) Η

CSNK2A1P

γονίδιο ενισχύεται στο κύτταρο Τ κυτταρική γραμμή λευχαιμίας ανθρωπίνων Jurkat, και σε καρκινικές κυτταρικές σειρές πνεύμονα Η1299, Α549, και H322. (Δ) Εκπρόσωπος εικόνες των αποτελεσμάτων της μελέτης FISH σε μεταφάσεις φυσιολογικών λεμφοκυττάρων, κυτταρικές σειρές Α549 Jurkat, H322 και. Η

CSNK2A1P

γονιδίου σημάνθηκε με Cy3 (με κόκκινο χρώμα). Χρωμόσωμα 11 ανιχνευτής εκατοστό σημάνθηκε με FITC (με πράσινο χρώμα). (Ε) Συσχέτιση του αριθμού αντιγράφων και της έκφρασης του mRNA της

CSNK2A1P

γονίδιο υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας Pearson συσχέτιση. (F) Ημι-ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιώντας CSNK2A1-ειδικούς εκκινητές δείχνει το επίπεδο έκφρασης CSNK2A1 mRNA σε φυσιολογικά και καρκινικές κυτταρικές σειρές που αναφέρονται ανωτέρω. Όλα τα ημι-ποσοτική πειράματα RT-PCR επαναλήφθηκαν τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

αλληλόμορφο-ειδική ενίσχυση του

CSNK2A1P

γονιδίων στον καρκίνο του πνεύμονα

Για να προσδιορίσετε αν υπάρχουν μεταλλάξεις του

CSNK2A1P

σε ανθρώπινους καρκίνους του πνεύμονα, που αποκωδικοποίησε το ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης του

CSNK2A1P

γονίδιο. Αν και δεν βρούμε μεταλλάξεις, ανακαλύψαμε ένα νέο πολυμορφισμό εντός του πεδίου κινάσης (398T /C, η οποία οδηγεί στο αμινοξύ I133T αλλαγή, Σχ. 2Α) σε 18 κυτταρικές γραμμές καρκίνου (Πίνακας 1) και 101 δείγματα καρκινικού ιστού πρωτογενούς πνεύμονα (Πίνακας 2). Η ειδική αλλαγή αμινοξέων προβλέπεται να επηρεάσει τη λειτουργία της πρωτεΐνης όταν το δυσανεξία από ανεκτική μέθοδο ταξινόμησης (SIFT) χρησιμοποιείται [16]. Είναι ενδιαφέρον, αυτό πολυμορφισμός φάνηκε να είναι ομοιόμορφα κατανεμημένοι στο φυσιολογικό ιστό, αλλά σε όγκους, ήταν σημαντικά πιο συχνή στο αλληλόμορφο 398T (Σχήμα 2C.) (Chi-square test, p & lt? 0,05). Περαιτέρω, από τα 56 ετερόζυγων καρκινικούς ιστούς των πνευμόνων που εξετάστηκαν σε σχέση με αυτό το πολυμορφισμό (Εικ. 2D), 20 (35,7%) δείγματα έδειξαν ενίσχυση σε αυτή την περιοχή, και σε 18 (90%) αυτών των 20 δειγμάτων, το αλληλόμορφο 398T ήταν επιλεκτικά ενισχύεται (Σχ. 2Ε). Αυτή η επιλεκτική ενίσχυση δείχνει ότι το αλληλόμορφο 398T μπορεί να παρέχει ένα πλεονέκτημα της ανάπτυξης πάνω από το αλληλόμορφο 398C. Για την περαιτέρω επικύρωση των αποτελεσμάτων από της αλληλουχίας του DNA, ερευνήσαμε το αλληλόμορφο-ειδική ενίσχυση του αλληλόμορφου 398T του

CSNK2A1P

(που κωδικοποιεί την παραλλαγή Ile133) σε ανθρώπινους όγκους χρησιμοποιώντας μια ποσοτική πολυμορφισμού ενός νουκλεοτιδίου ανάλυση (SNP), δηλαδή, TaqMan με βάση δοκιμασία αλληλομόρφων των διακρίσεων. Τα δεδομένα διάκριση αλληλόμορφων είναι συνεπής με τα δεδομένα αλληλουχίας (Σχ. 2Β). Από τα δείγματα όγκου 101 πνεύμονα πληκτρολογήσει, 56 ήταν ετερόζυγα σε σχέση με τον πολυμορφισμό 398C → Τ, και αναλύσαμε αυτά τα 56 δείγματα για αλληλόμορφο-ειδική ενίσχυση της 398C → Τ πολυμορφισμού

CSNK2A1P

με ανάλυση TaqMan (Σχ . 2Β). Είκοσι δείγματα έδειξαν αλληλική ανισορροπία μεταξύ των δύο αλληλόμορφα, 2 δείγματα εμφάνισαν αύξηση του αλληλόμορφου 398C (που κωδικοποιεί Thr133) και 18 δείγματα έδειξαν αύξηση του αλληλόμορφου 398T (που κωδικοποιεί Ile133). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν στατιστικώς σημαντική αλληλόμορφο-ειδική ενίσχυση του αλληλόμορφου 398T (

P

& lt? 0,05, δοκιμή Chi-Square), παρέχοντας πρόσθετη μαρτυρία για το ρόλο αυτού του αλληλόμορφου στον ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα. Αυτά τα αποτελέσματα μας ώθησε να μελετήσουμε πιο βαθιά μέσα στο ρόλο της παραλλαγής

CSNK2A1P

μορφές στην ανάπτυξη των όγκων.

(Α) αλληλόμορφο-ειδική ενίσχυση του αλληλόμορφου 398T (ΤΤΤ /C ή TT /C) βρίσκεται σε κάποια μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του δείγματα ιστών του πνεύμονα. Η T πάνω από το βέλος (νουκλεοτίδιο 398T, I133,) στα δεξιά είναι η ένδειξη του γονιδίου άγριου τύπου. (Β) Ενίσχυση της

CSNK2A1P

αλληλόμορφα σε όγκους του πνεύμονα είχε επικυρωθεί από ειδική ανάλυση ποσοτικών αλληλόμορφο μόνο πολυμορφισμός (SNP). Η αναλογία μεταξύ των 398T και 398C αλληλόμορφα σε ετερόζυγη όγκων του πνεύμονα προσδιορίστηκε με ανάλυση TaqMan χρησιμοποιώντας αλληλίου-ειδικούς ανιχνευτές και εκφράζεται ως διαφορές στα επίπεδα CT (κύκλοι) με θετικά ή αρνητικά τιμές ΔCt υποδεικνύοντας ενίσχυση του 398T ή 398C αλληλόμορφο, αντίστοιχα. 56 δείγματα δακτυλογραφημένες, 2 έδειξαν ενίσχυση του 398C αλληλόμορφο μεγαλύτερη από 0,6 CTs (δείγματα T3-4) και 18 παρουσίασαν ενίσχυση του αλληλόμορφου 398T (δείγματα T5-23). Τριάντα-έξι δείγματα δεν έδειξε καμία ενίσχυση (εκπρόσωπος T1-2). Κανονική δείγματα μάρτυρες δεν έδειξαν ενίσχυση (Ν1-3). Οι κανονικοποιημένες μέσα και οι τυπικές αποκλίσεις από τρία ανεξάρτητα πειράματα που δείχνονται. (C, D και Ε) αλληλόμορφων-ειδική ενίσχυση του αλληλόμορφου 398T αυξάνει σημαντικά σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του δείγματα ιστών του πνεύμονα. Κανονικό: ενήλικο άνθρωπο κανονική γονιδιωματική DNA. Όγκων: NO-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα καρκινικούς ιστούς. * Υποδηλώνει p & lt?. 0.05 (Chi-square test)

Η

Η

Διαφορικές μετατροπή δραστηριότητας των δύο

CSNK2A1P

αλληλόμορφα

Για να ελέγξετε το λειτουργική σημασία του πολυμορφισμού 398T → C στο

CSNK2A1P

γονίδιο, που κλωνοποίησαν το

CSNK2A1

και

CSNK2A1P

γονιδίων σε pcDNA 3.1 /myc-His φορέα και πραγματοποιείται μια σειρά δοκιμασιών κυτταρικής ανάπτυξης χρησιμοποιώντας κύτταρα ΝΙΗ3Τ3. Στη μελέτη αυτή, αυτοί οι φορείς επιμολύνθηκαν παροδικά σε κύτταρα 293Τ και ΝΙΗ3Τ3 και ανάλυση Western χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει την πρωτεΐνη έκφραση και των δύο αλληλόμορφων του

CSNK2A1P

γονίδιο (Εικ. 3Α). Τα αποτελέσματα δείχνουν, για πρώτη φορά, ότι η έκφραση του

CSNK2A1P

μπορούν να παράγουν τις πρωτεΐνες του.

(Α) Το

CSNK2A1

και

CSNK2A1P

γονίδια διαμολύνθηκαν παροδικά σε κύτταρα 293Τ και ΝΙΗ3Τ3 χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 Αντιδραστήριο σύμφωνα με το πρωτόκολλο κατασκευαστή. 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συγκομιδή και το συνολικό κυτταρικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν. Η ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιωθεί η έκφραση της πρωτεΐνης στα δύο αλληλόμορφα του

CSNK2A1P

γονίδιο. αντίσωμα αντι-tag Myc χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των πρωτεϊνών σύντηξης ετικέτα CSNK2A1P-Myc. δοκιμασία σχηματισμού (Β) αποικίας. Η επιμόλυνση του

CSNK2A1P

γονιδίου σε ΝΙΗ3Τ3 κύτταρα έχει ως αποτέλεσμα ενισχυμένη αγκύρωση εξαρτώμενη αύξηση, σε σύγκριση με τον κενό φορέα ελέγχου. Οι αριθμοί αποικιών του ΝΙΗ3Τ3-CSNK2A1 και κύτταρα ΝΙΗ3Τ3-CSNK2A1P είναι δραματικά υψηλότερα από εκείνα των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3-EV. (Γ) δοκιμασία μαλακού άγαρ. Σταθερή διαμόλυνση

CSNK2A1P

γονιδίων σε ΝΙΗ3Τ3 κύτταρα έχει ως αποτέλεσμα ενισχυμένη αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη. Τόσο οι ΝΙΗ3Τ3-CSNK2A1 και ΝΙΗ3Τ3-CSNK2A1P κύτταρα παρήγαγαν σημαντικά περισσότερες αποικίες από τα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3-EV έκανε (* ρ & lt? 0,05, t-test). Από τα δύο αλληλόμορφα του

CSNK2A1P

γονιδίου, το αλληλόμορφο 398T σχηματίζεται περισσότερο αποικίες από ότι το αλληλόμορφο 398C (** ρ & lt? 0,05, t-test). Σχετική σχηματισμό αποικίας σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές εκφράζεται ως ποσοστό κανονικοποιημένη για να αδειάσει-διάνυσμα-επιμολυσμένα ομάδα ελέγχου και παρουσιάζεται ως bar ± τυπική απόκλιση σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. (D) Δοκιμασία κινάσης της εκφρασμένης CSNK2A1 και πρωτεΐνες CSNK2A1P σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3. Οι εκφραζόμενες πρωτεΐνες ανοσο-καταβυθίστηκαν με δοκιμασία αντισώματος ετικέτα και κινάση Anti-Μγο διεξήχθη. Τόσο η ΝΙΗ3Τ3-CSNK2A1 και κύτταρα ΝΙΗ3Τ3-CSNK2A1P είχαν σημαντικά υψηλότερα δραστηριότητες κινάσης από τα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3-EV έκανε (* ρ & lt? 0,05, t-test). Από τα δύο αλληλόμορφα του

CSNK2A1P

γονίδιο, τα κύτταρα αλληλόμορφο 398T είχαν σημαντικά υψηλότερη ενεργότητα της κινάσης από το αλληλόμορφο 398C έκανε (** ρ & lt? 0,05, t-test). Σχετική δραστικότητα κινάσης εκφράζεται ως εκατοστιαία αναλογία ομαλοποιημένη προς κενός-διάνυσμα-επιμολυσμένα ομάδα ελέγχου και παρουσιάζεται ως bar ± τυπική απόκλιση σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. EV: κενό φορέα. Κβ: CSNK2A1. 398C: CSNK2A1P (I133) 398T: CSNK2A1P (I133T)

Η

Στην δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, επιμόλυνση του

CSNK2A1P

γονίδια σε ΝΙΗ3Τ3 (ΝΙΗ3Τ3-CSNK2A1P) κυττάρων οδηγεί σε αυξημένη αγκύρωση. εξαρτώμενης ανάπτυξης, σε σύγκριση με τον κενό φορέα ελέγχου (ΝΙΗ3Τ3-EV). Επιπλέον, δημιουργούνται κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 με CSNK2A1 (ΝΙΗ3Τ3-CSNK2A1) ως θετικός έλεγχος. Οι αριθμοί αποικιών του ΝΙΗ3Τ3-CSNK2A1 και κύτταρα ΝΙΗ3Τ3-CSNK2A1P ήταν δραματικά υψηλότερα από αυτά των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3-EV (Σχ. 3Β). Η επιμόλυνση του

CSNK2A1P

γονιδίου σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 είχε επίσης ως αποτέλεσμα ενισχυμένη αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη. Όταν συγκρίθηκαν μαλακό άγαρ αποτελέσματα του προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας, βρήκαμε ότι σταθερή επιμόλυνση του

CSNK2A1P

γονιδίων σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 οδήγησε σε ενισχυμένη αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη (Σχήμα 3C). Τόσο η ΝΙΗ3Τ3-CSNK2A1 και τα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3-CSNK2A1P παράγονται περισσότερες αποικίες από τα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3-EV έκανε. Σε σύγκριση με τα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3-EV, ΝΙΗ3Τ3-CSNK2A1 και κύτταρα ΝΙΗ3Τ3-CSNK2A1P παράγονται αποικίες που ήταν ως επί το πλείστον μεγαλύτερο και είχε εξαπλωθεί-out σχήματα. Όταν τα δύο αλληλόμορφα του

CSNK2A1P

γονίδια συγκρίθηκαν, βρήκαμε ότι το αλληλόμορφο 398T σχηματίζεται περισσότερο αποικίες από το αλληλόμορφο 398C έκανε. Μια δοκιμασία κινάσης των εκφρασμένων πρωτεϊνών διεξήχθη επίσης (Σχήμα 3D). Το γονίδιο 398T προϊόν έχει υψηλότερη δραστικότητα κινάσης από το προϊόν του γονιδίου 398C κάνει. Τα αποτελέσματα από την δοκιμασία κινάσης είναι συνεπείς με το σχηματισμό αποικιών και μαλακό δεδομένων άγαρ.

Λειτουργική πολυμορφισμό των

CSNK2A1P

γονίδια σχετικά με την υποβάθμιση της PML ογκοκατασταλτικών πρωτεϊνών

Για να προσδιορισμό του δυναμικού μηχανισμός με τον οποίο το αλληλόμορφο 398T κατά προτίμηση ενισχύεται σε δείγματα καρκίνου του πνεύμονα, μελετήσαμε τα αποτελέσματα των δύο αλληλόμορφα του

CSNK2A1P

γονίδιο στο ογκοκατασταλτικό PML πρωτεΐνης. Η

CSNK2A1P

γονίδια διαμολύνθηκαν σταθερά σε κυτταρικές σειρές ΝΙΗ3Τ3 και NSCLC H1650. ανάλυση κηλίδας Western έδειξε ένα μειωμένο επίπεδο πρωτεΐνης PML στα κύτταρα επιμολυσμένα με το

CSNK2A1P

γονίδια. Το αλληλόμορφο CSNK2A1P 398T, παρόμοια με αγρίου τύπου CSNK2A1, μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης PML περισσότερο από το αλληλόμορφο 398C έκανε (Σχ. 4Α). Δεύτερον, προσδιορίσαμε αν η ημιζωή του PML ρυθμίζεται διαφορετικά από τις δύο αλληλόμορφα. Αυτές οι δύο κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν με το

CSNK2A1P

γονίδιο υποβλήθηκαν σε αγωγή με κυκλοεξιμίδιο για 0, 2, και 6 ώρες, και εξετάστηκαν οι ενδογενείς PML επίπεδα πρωτεΐνης. Το αλληλόμορφο 398T μείωσε το χρόνο ημιζωής του PML αποτελεσματικότερα από το αλληλόμορφο 398C έκανε (Σχ. 4Β). Τρίτον, χρησιμοποιήσαμε συνανοσοκαθίζηση να δείξει την άμεση και κατά προτίμηση σύνδεση μεταξύ της πρωτεΐνης και 398T πρωτεΐνη PML (Εικ. 4C).

(Α) Η πρωτεΐνη PML μειώνεται σε σταθερές κυτταρικές σειρές ΝΙΗ3Τ3 και H1650 που επιμολύνθηκαν από το

CSNK2A1

και

CSNK2A1P

γονίδια. Η ενδογενής πρωτεΐνη CSNK2A1 και υπερεκφράζεται πρωτεΐνες CSNK2A1 και CSNK2A1P είχαν επίσης δείξει. (Β) Υποβάθμιση της πρωτεΐνης PML είναι πιο εμφανή σε ΝΙΗ3Τ3 σταθερές κυτταρικές σειρές επιμολύνονται με CSNK2A1 και CSNK2A1P (I133). Hr: ώρες μετά τη θεραπεία κυκλοεξιμίδιο. (Γ) Κύτταρα 293Τ συν-επιμολύνθηκαν με PML-V5 και Myc-tagged CSNK2A1 ή CSNK2A1P κατασκευάσματα. CSNK2A1 και CSNK2A1P (I133) δείχνουν ισχυρότερη δέσμευση στην πρωτεΐνη PML σε αμοιβαία προσδιορισμούς ανοσοκαθίζησης. EV: κενό φορέα. Κβ: CSNK2A1. 398T: CSNK2A1P (I133) 398C: CSNK2A1P (I133T). (Δ) Η έκφραση του

CSNK2A1P

γονίδιο μειώνεται στην καρκινική κυτταρική σειρά Η1299 πνεύμονα μετά από επιμόλυνση με το

CSNK2A1P

γονίδιο συγκεκριμένες siRNA. Δεν παρατηρήθηκε μείωση στην έκφραση του

CSNK2A1

και

CSNK2B

σημειώθηκαν γονίδια. (Ε) Οι CK2α επίπεδο πρωτεΐνης μειώνεται και η PML αυξάνεται το επίπεδο της πρωτεΐνης στην κυτταρική σειρά καρκίνου του πνεύμονα Η1299 μετά από επιμόλυνση με το

CSNK2A1P

γονίδιο συγκεκριμένες siRNA. Ν: αρνητικού ελέγχου siRNA. CSNK2A1P:

CSNK2A1P

siRNA. Οι πυκνότητες μπάντα κανονικοποιούνται με την αρνητική ομάδα επιμολυσμένα siRNA χρησιμοποιώντας ακτίνη ως εσωτερικός έλεγχος. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

Για να αντιμετωπιστεί περαιτέρω το ερώτημα εάν το mRNA CSNK2A1P είναι πλήρως μεταφρασμένο και υποβαθμίζει PML σε καρκινικά κύτταρα, εμείς γκρέμισε το

CSNK2A1P

γονιδίων σε Η1299 πνεύμονα καρκινικές κυτταρικές σειρές με siRNA ειδικά για το

CSNK2A1P

γονίδιο. Επιλέξαμε το κυτταρική σειρά καρκίνου του πνεύμονα Η1299 επειδή η μελέτη μας (Σχήμα 1Α και C) έδειξε ότι το

CSNK2A1P

γονίδιο ενισχύεται και υπερεκφράζεται σε αυτή την κυτταρική σειρά. Η

CSNK2A1P

συγκεκριμένο γονίδιο siRNA προκάλεσε μείωση μεγαλύτερη από 70% στην έκφραση του

CSNK2A1P

γονίδιο και καμία μείωση στην έκφραση του

CSNK2A1

και

CSNK2B

γονίδια (Εικ. 4D). Σύμφωνα με μειωμένη έκφραση του

CSNK2A1P

γονίδιο, η συνολική πρωτεΐνη CK2α μειώθηκε και η πρωτεΐνη PML αυξημένη στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με

CSNK2A1P

siRNAs σύγκριση με τους αρνητικούς μάρτυρες siRNA επιμολυσμένα (Εικ. 4Ε) .

Συζήτηση

σε αυτή τη μελέτη, έχουμε δώσει, στη γνώση μας, το πρώτο στοιχείο που να αποδεικνύει ότι η

CSNK2A1P

γονίδιο είναι ένα λειτουργικό πρωτο-ογκογονιδίου σε ανθρώπινους καρκίνους . Για να υποστηρίξει την υπόθεσή μας ότι

CSNK2A1P

γονίδιο είναι ένα λειτουργικό πρωτο-ογκογονιδίου, παρά μια «ψευδογονίδιο», έχουμε κάνει εκτενή DNA, mRNA, πρωτεΐνης και ανάλυση siRNA. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης παρέχουν την πρώτη απόδειξη ότι το επίπεδο έκφρασης του mRNA συσχετίζεται με τον αριθμό αντιγράφου του

CSNK2A1P

γονίδιο σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές γραμμές του ανθρώπου. Επιπλέον, siRNA γκρεμίζω του

CSNK2A1P

γονίδιο μειώθηκε το συνολικό επίπεδο της πρωτεΐνης CK2α στα καρκινικά κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι η

CSNK2A1P

γονίδιο είναι πλήρως μεταφρασμένο στα καρκινικά κύτταρα. Έτσι, η ενίσχυση του

CSNK2A1P

γονίδιο μπορεί να παίζει ένα ογκογόνο ρόλο σε αυτές τις ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Με βάση τα αποτελέσματά μας, προτείνουμε δύο λειτουργικά γονίδια μπορεί να υπάρχουν στην ανθρώπινη οικογένεια CK2α,

CSNK2A1

, το οποίο τοποθετεί στο χρωμόσωμα 20p13, και

CSNK2A1P

, το οποίο τοποθετεί στο χρωμόσωμα 11p15.3.

Βρήκαμε επίσης μία νέα πολυμορφισμό εντός του πεδίου κινάσης (398T /C, η οποία οδηγεί στο αμινοξύ I133T αλλαγή, Σχήμα 2α) σε 101 πρωτογενείς όγκους. Αυτός ο πολυμορφισμός φαίνεται να είναι κατανεμημένες ομοιόμορφα σε φυσιολογικό ιστό, αλλά σε όγκους, είναι σημαντικά πιο συχνή στην αλληλόμορφο 398T (Πίνακας 2, Σχήμα 2). Το αλληλόμορφο 398T ήταν επιλεκτικά ενισχύθηκε σε δεκαοκτώ από τα 101 ιστούς καρκίνου του πνεύμονα, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να παρέχει ένα πλεονέκτημα της ανάπτυξης πάνω από το αλληλόμορφο 398C. Η ενίσχυση αλληλόμορφο 398C βρέθηκε μόνο σε δύο από τις 101 ιστών καρκίνου του πνεύμονα, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να είναι ένα τυχαίο γεγονός. Αυτά τα ενδιαφέροντα αποτελέσματα γενετικών μας ώθησε να μελετήσουμε πιο βαθιά μέσα στο ρόλο της παραλλαγής

CSNK2A1P

μορφές στην ανάπτυξη των όγκων. Κάτι τέτοιο απέδωσε δύο σημαντικές διαπιστώσεις, πρώτον, ότι το αλληλόμορφο 398T είναι πιο μετασχηματισμού από το αλληλόμορφο 398C, και, δεύτερον, ότι το αλληλόμορφο 398T υποβαθμίζει πρωτεΐνη PML ογκοκατασταλτικό πιο αποτελεσματικά από ό, τι το αλληλόμορφο 398C. Για παράδειγμα, το αλληλόμορφο 398T έδειξε σημαντικά υψηλότερη δραστικότητα μετασχηματισμού τόσο σχηματισμό αποικίας και προσδιορισμούς μαλακού άγαρ από το αλληλόμορφο 398C (Σχ. 3Β και C). Τα δεδομένα της δοκιμασίας κινάσης έδειξε ότι το γονίδιο 398T προϊόν έχει υψηλότερη δραστικότητα κινάσης από το γονίδιο 398C προϊόν (Σχ. 3D), γεγονός που υποδηλώνει ότι το αλληλόμορφο 398T είναι περισσότερο μετατροπή αλληλόμορφο από το αλληλόμορφο 398C. Επιπλέον, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν επίσης ότι η ικανότητα μετασχηματισμού του αλληλομόρφου 398T του

CSNK2A1P

ψευδογονιδίου είναι παρόμοια με εκείνη του κανονικού

CSNK2A1

γονιδιακού προϊόντος, έτσι ώστε η πιο ενεργό αλληλόμορφο του ψευδογονιδίου εμφανίζεται να έχει δραστικότητα συγκρίσιμη με την τακτική

CSNK2A1

γονίδιο. Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχει γενετική ή επιγενετική στοιχεία για την ενεργοποίηση του γονιδίου CSNK2A1 στον καρκίνο του ανθρώπου. Έτσι, η μελέτη μας παρέχει την πρώτη απόδειξη ότι το

CSNK2A1P

398T αλληλόμορφο, το οποίο είναι παρόμοιο με το

CSNK2A1

γονίδιο, ενισχύεται σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του πνεύμονα.

Το γονίδιο PML αρχικά εντοπίσθηκε στο σημείο διακοπής του t (15? 17) μετατόπιση σε οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία [17] και αποδείχθηκε ότι είναι ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο [18]. Απώλεια της PML έχει συσχετιστεί με φτωχή κλινική έκβαση σε ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα, υποστηρίζοντας καταστολέας όγκου λειτουργία του [5], [19]. PML προωθεί την αποφωσφορυλίωση των pRb και ρυθμίζει κυτταρική μοίρα στον αναπτυσσόμενο νεοφλοιού [20]. CK2 ρυθμίζει διαμεσολαβείται από ουβικουϊτίνη αποικοδόμηση της PML σε ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικών σειρών [5], [21]. Αυτό μπορεί να είναι ένα από τα πιθανούς μηχανισμούς με τους οποίους το αλληλόμορφο 398T κατά προτίμηση ενισχύεται σε δείγματα καρκίνου του πνεύμονα. Αυτό γενετικός πολυμορφισμός είναι πιθανώς ένας χρήσιμος δείκτης για την ανίχνευση της ενίσχυσης του γονιδίου ιντρόνια CK2, επειδή μο- νοαλληλική ενίσχυση πιστεύεται ότι είναι υπεύθυνη για την ενίσχυση του γονιδίου στον καρκίνο [22]. Αυτή η ενίσχυση συγκεκριμένων αλληλόμορφων συνεπάγεται επίσης ότι τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να εθιστεί στην ογκογόνο CK2α [23]. Με λίγα λόγια, η ενίσχυση του αλληλόμορφου 398T του

CSNK2A1P

γονίδιο μπορεί να συμβάλλουν, τουλάχιστον εν μέρει, στην παθογένεση του καρκίνου του πνεύμονα.

Το

CSNK2A1P

γονίδιο είναι μια επεξεργασία ψευδογονίδιο βρίσκεται στο χρωμόσωμα 11p15.3 και υποτίθεται ότι σχηματίζονται από ρετροενδομετάθεση, και χαρακτηρίζεται από την απουσία ιντρονίων, η παρουσία του πλευρικού κατευθύνει επαναλήψεις, και η ουρά 3 ‘πολυαδενυλίωσης [15]. Ωστόσο, έχει ένα ισχυρό υποκινητή ανοδικά από το κωδικόνιο έναρξης (14, 15). Η έκφραση του

CSNK2A1P

γονίδιο είναι δυνητικά πιο σφιχτά ρυθμιζόμενη από το

CSNK2A1

είναι. Για παράδειγμα, η περιοχή προαγωγού του

CSNK2A1P

γονίδιο περιέχει δύο κουτιά ΤΑΤΑ και ένα κουτί CAAT, ενώ η ανοδική αλληλουχία του

CSNK2A1

παρουσιάζει χαρακτηριστικά housekeeping γονίδιο, π.χ., υψηλή περιεκτικότητα σε GC, η παρουσία αρκετών κουτιών GC και η έλλειψη ΤΑΤΑ κουτί (14, 15). Επιπλέον, αρκετές θέσεις παράγοντας δέσμευσης σημαντική μεταγραφή (π.χ., CEBP-, GATA-, και θέσεις SMAD δέσμευσης) έχουν προβλεφθεί εντός της περιοχής 5 ‘(1 Kb) από το

CSNK2A1P

ξεκινώντας κωδικόνιο, υποδηλώνοντας ότι η

CSNK2A1P

γονίδιο μπορεί ενδεχομένως να προκληθεί ή να κατασταλεί από αρκετές πλοίαρχο ρυθμιστές των αναπτυξιακών μονοπατιών. Η ενίσχυση του

CSNK2A1P

γονίδιο θα μπορούσε να οδηγήσει στην υπερέκφραση της CSNK2A1P πρωτεΐνης στα καρκινικά κύτταρα. Μπορεί επίσης να είναι πιθανό ότι η

CSNK2A1

γονιδίου είναι κάπως έμμεσα ρυθμίζεται από την έκφραση του

CSNK2A1P

γονίδιο. Οι μελλοντικές μελέτες για να αποκαλύψει τον μηχανισμό μέσω του οποίου ρυθμίζονται η

CSNK2A1P

και το

CSNK2A1

γονίδια. Μέχρι τώρα, έχουν περίπου 10.000 επεξεργασία ψευδογονίδια [24] έχουν χαρακτηρισθεί στο ανθρώπινο γονιδίωμα, και μερικά από αυτά τα γονίδια έχουν αναφερθεί ότι εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα. Για παράδειγμα, η ογκογόνος

CRIPTO3

ψευδογονιδίου εκφράζεται σε καρκίνους του παχέος εντέρου, του μαστού και του πνεύμονα [25], το ανθρώπινο ομόλογο του γονιδίου ιού δαμαλίτιδας κλώνου Η1 φωσφατάση 5 (

HVH-5 ​​

) ψευδογονίδιο είναι που εκφράζεται σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού [26], και το

rac1

ψευδογονιδίου εκφράζεται σε όγκους του εγκεφάλου [27]. Σε συνδυασμό με τα αποτελέσματά μας, αυτό υποδηλώνει μια πιθανή ογκογόνο ρόλο των υποτιθεμένων ψευδογονιδίων σε ορισμένες ανθρώπινους καρκίνους.

Αυτή η μελέτη είχε κάποιους περιορισμούς. Έχουμε αποδείξει την συσχέτιση μεταξύ

CSNK2A1P

γονιδίων και τη σταθερότητα της πρωτεΐνης PML μόνο σε δύο πνεύμονα καρκινικές κυτταρικές σειρές in vitro. Τα δείγματα από μόνο 101 ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα αναλύθηκαν, 56 από τα οποία ήταν ετερόζυγα όσον αφορά αυτό τον πολυμορφισμό και θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την ανάλυση. Σε μελλοντικές μελέτες, θα είναι σημαντικό να συμπεριληφθούν πρόσθετες καρκινικές κυτταρικές σειρές και περισσότερους ιστούς του καρκίνου.

Τα αποτελέσματά μας παρέχουν γενετική αποδείξεις για ενεργοποίηση του γονιδίου CK2α ιντρόνια στον καρκίνο του ανθρώπου. Αν και CK2 στο παρελθόν ήταν γνωστό ότι είναι ένας βασικός παράγοντας για τον καρκίνο, ο μηχανισμός ενεργοποίησης στον καρκίνο δεν ήταν γνωστό [10], [28]. Λόγω αυτής της έλλειψης γνώσεων σχετικά με το μηχανισμό ενεργοποίησης CK2 και συστατική δράση του, CK2 έχει ως επί το πλείστον παραμεληθεί ως βασικό στόχο για φάρμακα κατά του καρκίνου. Δεδομένου ότι σημαντική πρόοδος έχει σημειωθεί όσον αφορά τις διαρθρωτικές βάσεις της αναστολής CK2, είναι πλέον δυνατόν να αναπτυχθούν ισχυροί και εκλεκτικοί κύτταρο-διαπερατό αναστολείς CK2 [29], [30]. Η κατανόηση της διαφοράς στις αλληλουχίες των

CSNK2A1P

πολυμορφισμοί του γονιδίου μπορεί να μας επιτρέψει να σχεδιάσουμε συγκεκριμένες διαγνωστικές εξετάσεις για τον καρκίνο του ανθρώπου. Σημαντικά, τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν την ιδέα ότι πρωτεϊνική κινάση CK2α αποτελεί μια ελκυστική στόχος για θεραπευτικές του καρκίνου όπως αναστολείς μικρού μορίου [10], [31].

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρικές σειρές

Το ανθρώπινο καρκίνο (Jakurt, Η1299, Α549, Α427, Η441, H1703, H322, H460, HCT116, H1975, H322, H358, H838, H28, H2052, HeLa και H1650) και φυσιολογικό πνεύμονα (WI-38 και CCL-211 κυτταρικές γραμμές) λήφθηκαν από την American Type Culture Collections (Manassas, VA). H290 και κυτταρικές σειρές MS-1 ελήφθησαν από ΝΙΗ (Frederick, MD). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλήρες μέσο ανάπτυξης (μέσο Eagle τροποποιημένο για HeLa, Α549 και CCL-211? Ελάχιστο Απαραίτητο Μέσο του Eagle για WI-38? Μέσου Roswell Park Memorial Institute για Η1299, Α549, Α427, Η441, H1703, H322, Η460, HCT116, H1975, H322, H358, H838, H28, H2052 και H1650) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 10 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 10 μg /ml στρεπτομυκίνη σε 37 ° C και 5% CO2.

δείγματα ιστού

Φρέσκα καρκινικών ιστών και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών ελήφθησαν από ασθενείς με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSLC), οι οποίοι υποβάλλονταν σε χειρουργική εκτομή του πρωτογενούς όγκου. Η μελέτη εγκρίθηκε από το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, στο Σαν Φρανσίσκο, θεσμική αναθεώρηση της επιτροπής (CHR # H8714-11647-14). Έχουμε λάβει γραπτή πληροφορημένες συγκαταθέσεις από όλους τους συμμετέχοντες στη μελέτη μας. δείγματα ιστού διατηρήθηκαν στους -180 ° C καταψύκτες υγρό άζωτο πριν από τη χρήση και την τελική παθολογοανατομική διάγνωση επιβεβαιώθηκε από έναν παθολόγο στο Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια στο Σαν Φρανσίσκο (UCSF), Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής. Φυσιολογικό ενήλικα γενωμικού μορφή DNA περιφερικού αίματος αγοράστηκε από BioChain (Hayward, CA).

φθορισμού-in situ υβριδισμού

Ο φθορισμός-in situ υβριδισμού (FISH) καθετήρας για CSNK2A1P (RP11-567I13 , χρωμόσωμα 11p15.3) αγοράστηκε από Bacpac Πόρων (Oakland, CA). Το κεντρομερίδιο χρωμοσώματος 11 σημάνθηκε με Vysis CEP 11 ανιχνευτή SpectrumGreen ™ (Abbott Molecular, Abbott Park, IL). Μεταφάσης διαφάνειες παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας πρότυπα πρωτόκολλα της εγκατάστασης UCSF Molecular Pathology Core. Όλες οι υβριδοποιήσεις έγιναν από την εγκατάσταση UCSF Μοριακής Παθολογίας Core. Ο ανιχνευτής CSNK2A1P BAC σημάνθηκε με Cy3 κόκκινο με μετάφραση αποκοπής. μείγμα Probe παρασκευάστηκε σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο

DNA και αλληλούχιση του cDNA ανάλυση

γονιδιακό DNA ή ολικό RNA απομονώθηκε από κυτταρικές γραμμές και δείγματα ιστών χρησιμοποιώντας το DNeasy Blood & amp.? Kit ιστών ή ο RNeasy Mini Kit (Qiagen Valencia, CA), αντίστοιχα. Το γονίδιο CSNK2A1P ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας ειδικά για το γονίδιο εκκινητές της. Οι εμπρόσθιοι και αντίστροφοι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για PCR και αλληλούχιση ήταν: 5′-AGAAAATTGCTCCCCACTCC-3 ‘και 5′-GTGCTGCCAGAGAATGA CAA-3’, αντίστοιχα. Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν με πηκτή χρησιμοποιώντας το κιτ QIAquick Gel Extraction (Qiagen Valencia, CA) και στη συνέχεια αλληλουχήθηκαν σε MCLab (South San Francisco, CA).

ημι-ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ (RT-PCR ) ανάλυση

Ολικό RNA από κυτταρικές σειρές και ιστούς απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ εκχύλισης, και το DNA αποβλήθηκε με επί στήλης θεραπεία με DNase (κιτ RNeasy Mini? Qiagen, Valencia, CA, USA). Ημιποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση SuperScript One-βήμα RT-PCR με κιτ Platinum Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. One-βήμα RT-PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ζεύγη CSNK2A1P-ειδικούς εκκινητές (Forward: 5′-AGAAAATTGCTCC CCACTCC-3 ‘και αντίστροφη: 5′-GTGCTGCCAGAGA ATGACAA-3′), CSNK2A1-ειδικούς εκκινητές (Forward: 5’-TGGGGACAGAAGATTTATATGA -3 ‘και αντίστροφη: 5′-CTGAAGAAATCCCTGACA TCAT-3′) και CSNK2B-ειδικούς εκκινητές (Forward: 5’-CAGGTCCCTCACTACCGACA -3 ‘και αντίστροφη: 5′-CAGCTGGTAGGCCATCGGAT-3’). Τα προϊόντα PCR επαληθεύεται με άμεση αλληλούχιση του DNA. Αφυδρογονάση 3-phosphatedehydrogenase (GAPDH) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.