Abstract

Στόχευση των ογκογόνων Kras στα παγκρεατικά νεστίνη εκφράζουν εμβρυϊκά προγονικά κύτταρα και στη συνέχεια στο διαμέρισμα ενήλικα acinar και νεστίνη κύτταρα που εκφράζουν είναι επαρκές για την ανάπτυξη του χαμηλού βαθμού παγκρεατικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας (PanIN) μεταξύ 2 και 4 μηνών. Τα ποντίκια πεθαίνουν περίπου 6 μηνών από άσχετες αιτίες, και ως εκ τούτου δεν είναι δυνατόν να εκτιμηθεί κατά πόσο οι βλάβες θα προχωρήσουν σε καρκίνωμα. Τώρα αναφέρουν ότι δύο σύντομα επεισόδια κερουλεΐνης που προκαλείται από την οξεία παγκρεατίτιδα σε 2 μηνών ποντίκια προκαλεί ταχεία εξέλιξη PanIN και πορογενές αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος (PDAC) ανάπτυξης κατά 4 μήνες της ηλικίας. Αυτά τα γεγονότα συμβαίνουν με παρόμοια συχνότητα όπως παρατηρείται σε ζώα όπου το ογκογονίδιο στοχεύεται κατά την εμβρυογένεση σε όλους τους τύπους παγκρεατικών κυττάρων. Έτσι, αυτά τα στοιχεία δείχνουν ότι ογκογόνο Kras με γνώμονα PanIN καταγωγής μη-πορογενές διαμέρισμα μπορεί γρήγορα να εξελιχθεί σε PDAC όταν υποβάλλεται σε μια σύντομη φλεγμονώδη προσβολή

Παράθεση:. Carrière C, Νέοι AL, Gunn JR, Longnecker DS , Korc Μ (2011) οξεία παγκρεατίτιδα Επιταχύνει την έναρξη και την εξέλιξη σε καρκίνο του παγκρέατος σε ποντίκια που εκφράζουν Ογκογόνες Kras στο κινητό Lineage νεστίνη. PLoS ONE 6 (11): e27725. doi: 10.1371 /journal.pone.0027725

Επιμέλεια: Wafik Σ El-Deiry, Penn State Hershey Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 Ιουνίου, 2011? Αποδεκτές: 23 Οκτ 2011? Δημοσιεύθηκε: 28, Νοεμ, 2011

Copyright: © 2011 Carrière et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από: το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου: CA-R37-075059 να Murray Korc και CA-127095 με την Catherine Carrière? Το Ίδρυμα Lustgarten για καρκίνο του παγκρέατος Έρευνα για την Catherine Carrière. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) αντιπροσωπεύει πάνω από το 95% του συνόλου των εξωκρινών παγκρεατικών κακοηθειών και είναι η τέταρτη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται θανάτου στις Ηνωμένες Πολιτείες, με μέση επιβίωση 6 μηνών [1]. Κατά τα τελευταία 30 χρόνια, τα ποσοστά επιβίωσης των ασθενών δεν έχουν βελτιωθεί αισθητά, και PDAC παραμένει δυσεπίλυτο στα τέλη της στάδια. Έτσι, υπάρχει επείγουσα ανάγκη να αναπτυχθούν νέες προσεγγίσεις για την έγκαιρη ανίχνευση των PDAC καθώς και νέες θεραπείες που στοχεύουν πρώτα στάδια του καρκίνου. μοντέλα ποντικών της PDAC που ανακεφαλαιώνουν καρκίνου στον άνθρωπο έχουν τη δυνατότητα να προωθήσει την κατανόηση μας για τα πρώτα γεγονότα στην ανάπτυξη του καρκίνου.

PDAC αναγνωρίζεται πλέον να προκύψουν κυρίως μέσω της εξέλιξης της παγκρεατικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας (PanIN), που κυμαίνονται από χαμηλές (PanIN-1Α, 1Β) σε υψηλής ποιότητες (PanIN-2, -3), PanIN-3 που αντιπροσωπεύει το καρκίνωμα

in situ

και την άμεση πρόδρομος του πόρου αδενοκαρκίνωμα [2]. Αυτή η ιστολογική εξέλιξη σχετίζεται με τη συσσώρευση των γενετικών ανωμαλιών εκ των οποίων μεταλλάξεις που οδηγούν σε συστατική ενεργοποίηση του KRAS είναι η πρώτη και πιο συχνή (95%) [3]. Οι πρώτες σχετικές μοντέλα ποντικών της PDAC παρήχθησαν με τη στόχευση υπό όρους μεταλλαγμένο

Kras

αλληλόμορφο (

Kras

G12D

) μέχρι τις αρχές του παγκρέατος προγόνους (χρησιμοποιώντας Pdx1 και Ptf1a υποκινητές) και στη συνέχεια σε όλα τα τύπους παγκρεατικών κυττάρων [4], [5]. Αυτά τα μοντέλα ανακεφαλαίωνε πιστά το πλήρες φάσμα των ανθρώπινων PanIN πρόοδο και την ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος, αποδεικνύοντας ότι η έκφραση ογκογόνων Kras είναι επαρκής για την έναρξη PDAC. Για να οριοθετηθούν τα κύτταρα προέλευσης των PDAC, πολλά μοντέλα στη συνέχεια αναπτύχθηκαν όπου μεταλλαγμένο KRAS ήταν στοχευμένες σε πιο περιορισμένη κυτταρικών πληθυσμών εμβρυϊκά ή ενήλικα. Χρησιμοποιήσαμε ένα πρόγραμμα οδήγησης νεστίνη Cre να στοχεύσετε Kras

G12D να acinar και νεστίνη-κύτταρα που εκφράζουν (νεστίνη Cre? LSL-Kras

G12D ή Ν /Κ ποντίκια) (Εικ. 1Α), ενώ άλλες απευθύνονται ογκογόνο Kras στην κυψελοειδή μόνο ή κυψελοειδή /centroacinar κυττάρων με διαφορετικές ελαστάση-Cre και οδηγούς mist1-Cre [6], [7], [8], [9]. Σε όλα αυτά τα μοντέλα, PDAC έναρξη και την εξέλιξη θα μπορούσε να παρατηρηθεί, καταδεικνύοντας ότι PDAC μπορεί να έχει μια μη-πορογενές προέλευσης σε ποντικούς. Παρά το γεγονός ότι μία πρόσφατη μελέτη προτείνει ότι PDAC μπορούσε να κινήσει στο διαμέρισμα ενδοκρινικό, έχει δειχθεί ότι ο υποκινητής που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη θα μπορούσε επίσης να στοχεύουν σε ένα μικρό κλάσμα κυψελοειδή κύτταρα [10], [11]. Σε όλα τα μοντέλα όπου ογκογόνο Kras ενεργοποιήθηκε κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης, χαμηλού βαθμού PanINs αναπτυχθεί, γενικά προχωρούν πάνω από 8-12 μήνες σε υψηλού βαθμού αλλοιώσεις και PDAC. Εμείς δεν ήταν σε θέση να παρατηρούν την εξέλιξη σε PDAC σε ποντίκια Ν /Κ, όπως συνήθως πεθαίνουν γύρω από την ηλικία των 6 μηνών από επιπλοκές στο κεντρικό νευρικό σύστημα.

(Α) Σχηματική της υπό όρους Kras

αλληλόμορφο G12D. Σε περίπτωση απουσίας της ρεκομπινάσης Cre, μόνο WT Kras εκφράζεται? μία φορά Cre εκφράζεται, η περιοχή στάση αποκόπτεται και Kras

G12D γίνεται εκφράζονται. (Β-Ε) Σε ποντίκια νεστίνη Cre /R26R, χρώση του LacZ παρατηρείται μόνο σε κυψελοειδή κύτταρα (Β), και είναι απούσα σε κύτταρα των πόρων (κεφαλές βελών) και νησίδες (Ι). (C) Επικάλυψη των LacZ ανοσοχρώση (Ε) με CK19 (D) δείχνει ότι πόρου κύτταρα δεν είναι στοχευμένες. (F) Pdx1-Cre οδηγεί στην έκφραση του Kras

G12D σε όλους τους τύπους παγκρεατικών κυττάρων, ενώ νεστίνη Cre οδηγεί την έκφραση του Kras

G12D μόνο στα κυψελοειδή κύτταρα. μπαρ κλίμακας: 20 μm

Η

Η ενεργοποίηση του Kras

G12D στον ενήλικο πάγκρεας οδήγησε σε μη πρόοδο σχηματισμό χαμηλού βαθμού βλάβη [7], [8], [12].. Ωστόσο, μετά την επαγωγή της χρόνιας παγκρεατίτιδας, αυτά τα ζώα ανέπτυξαν υψηλού βαθμού αλλοιώσεις και προχώρησε προς PDAC [7]. Αυτά τα δεδομένα είναι συνεπή με επιδημιολογικές μελέτες που δείχνουν ότι οι ασθενείς που πάσχουν από χρόνια παγκρεατίτιδα έχουν μια 16-πλάσια αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του παγκρέατος [13]. Ενώ σύντομα επεισόδια οξείας παγκρεατίτιδας (AP) να οδηγήσει σε ταχεία εξέλιξη PanIN και αυξημένη συχνότητα PDAC σε Pdx1-Cre? LSL-Kras

ποντίκια G12D [14], [15], [16], είναι άγνωστο αν θα οδηγήσει επίσης σε PDAC στη νεστίνη με γνώμονα μοντέλο ποντικού. Έχουμε τώρα δείξει ότι η Ν /Κ ποντίκια, όταν υποβάλλεται σε δύο επεισόδια κερουλεΐνης επαγόμενης AP, αναπτύσσουν ταχέως PanINs υψηλής ποιότητας που έχουν την ικανότητα να προχωρήσει σε PDAC. Αυτή η μελέτη επιβεβαιώνει ότι η οξεία παγκρεατική βλάβη έχει τη δυνατότητα να συμβάλει στην ανάπτυξη PDAC σε μοντέλα ποντικών Kras που βασίζονται και υποστηρίζουν την υπόθεση ότι μπορεί να προκύψουν PDAC στη νεστίνη κυττάρων γενεαλογία.

Αποτελέσματα

νεστίνη προγονικών κύτταρα δεν δημιουργούν κύτταρα των πόρων

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι τα εμβρυϊκά νεστίνη εκφράζουν παγκρέατος πρόγονοι να οδηγήσει σε κυψελοειδή κύτταρα και όχι σε ενδοκρινικές ή centroacinar κύτταρα, ενώ μια πιθανή συμβολή του πόρου κύτταρα δεν είχε αποκλειστεί πλήρως [ ,,,0],6]. Για την επίλυση αυτού του ζητήματος, πολλαπλά πειράματα γράμμωσης ανίχνευση έγιναν με αναπαραγωγή τη γραμμή ποντικού που εκφράζει το ανασυνδυάση Cre υπό τον έλεγχο των ρυθμιστικών στοιχείων νεστίνη [17] με τη γραμμή ποντικού ρεπόρτερ R26R. Αυτή η τελευταία γραμμή φέρει το γονίδιο β-γαλακτοσιδάσης (LacZ) υπό τον έλεγχο του υποκινητή πανταχού R26 και μεταγραφική περιοχή τερματισμού που περιβάλλεται από θέσεις ΙοχΡ (ΙοχΡ-Stop-ΙοχΡ ή LSL) [18]. Στα διπλά διαγονιδιακά ποντίκια, η έκφραση LacZ ενεργοποιείται μετά Cre μεσολάβηση ανασυνδυασμού σε εμβρυϊκά κύτταρα που εκφράζουν νεστίνη (παρόμοια προσέγγιση με αυτή που περιγράφεται για Kras στην Εικ. 1Α). Στη συνέχεια, με γενετική μετάδοση, όλα τα κύτταρα που προέρχονται από τα νεστίνη εκφράζουν πρόγονοι εκφράζουν LacZ. Τμήματα σε όλη την παγκρέατα ζώων νεστίνη Cre /R26R σε ηλικία 2 μηνών χρωματίστηκαν για δραστικότητα LacZ. Όπως παρατηρήθηκε προηγουμένως, το διαγονίδιο νεστίνη Cre αφέθηκε για στόχευση των ~ 70% των κυψελιδικών κυττάρων (Εικ. 1Β). χρώση LacZ παρατηρήθηκε μόνο σε δομές κυψελοειδή, ποτέ στο πόρου, ενδοκρινικές ή centroacinar κύτταρα (Σχ. 1Β) και συν-ανοσοφθορισμού με την κυτοκερατίνη δείκτη πόρου 19 (CK19) επιβεβαίωσε αυτή την παρατήρηση (Σχ. 1C-Ε). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι τα εμβρυϊκά παγκρεατικά πρόγονοι νεστίνη εκφράζουν δεν δίνουν αφορμή για πόρου κύτταρα (Σχ. 1 F). Η έκφραση του LacZ επίσης σπάνια παρατηρήθηκε σε παγκρεατικά τύπους μη παρεγχυματικού κυττάρου όπως τα ενδοθηλιακά και μεσεγχυματικά κύτταρα (δεν δείχνεται).

Η οξεία παγκρεατίτιδα επιταχύνει δραματικά πρόοδο της αλλοίωσης σε Ν /Κ παγκρέατα

Μεταξύ 2 6 μήνες, Ν /Κ ποντίκια ανέπτυξαν χαμηλό PanINs βαθμού σε περιορισμένο αριθμό (2-10 απομονωθεί βλάβες ή μικρών εστιών ανά τμήμα), καθώς και περιορισμένες περιοχές του acinar να πόρου μεταπλασία (ADM) (Σχ. 2Α-Β, G) παρόμοιο με αυτό που παρατηρείται σε Pdx1-Cre? LSL-Kras

G12D (Ρ /Κ) ποντίκια [4], [14]. Ενώ με το χρόνο Ρ /Κ ποντίκια μπορούν να αναπτύξουν PDAC αλλά σε πολύ χαμηλή συχνότητα, Ν /Κ μεταλλαγμένα ποντίκια επέζησαν σπάνια τελευταίους 6 μήνες, λόγω σοβαρών νευρολογικά προβλήματα, που μας εμποδίζει μετά από μια πιθανή εξέλιξη σε καρκίνο του παγκρέατος.

( Α-Ρ) Η Ανάκαμψη από AP στον άνθρωπο δεν οδηγεί αναγκαστικά σε μη αναστρέψιμη βλάβη και μπορεί να σχετίζεται με την αναγέννηση του παγκρέατος [28], όπως παρατηρείται στο ποντίκι. Κατά τη διάρκεια των 3 πρώτων ημερών μετά κερουλεΐνη θεραπεία, το πάγκρεας ποντικών αναπτύσσουν σωληνοειδείς δομές στη θέση του acini [23], και γενεαλογία εντοπισμό πειράματα χρησιμοποιώντας τον προαγωγό ελαστάσης δείχνουν ότι μέρος αυτών των σωληνοειδών δομών προέρχονται από κυψελοειδή κύτταρα που φαίνεται να αποδιαφοροποιούνται, πηγαίνοντας μέσα από ένα πόρο σαν μεταπλαστικού ενδιάμεση κατάσταση πριν από την είσοδο του πολλαπλασιασμού [23], [29]. Νέα κυψελοειδή κύτταρα προέρχονται τότε ουσιαστικά από προϋπάρχουσες κυψελοειδή κύτταρα [22], [23], [29] και πρέπει να υποβληθούν σε μια δευτερεύουσα πόρο για να κυψελιδικά μεταπλασία (DAM), ένα ουσιαστικό βήμα για την αναγέννηση του παγκρέατος [15]. Είναι ενδιαφέρον ότι, μετά από AP, κυψελοειδή κύτταρα που εκφράζουν ογκογόνο Kras πέθαναν ή υποβλήθηκαν ADM. Μεταξύ των δομών κυψελοειδή υποβάλλονται ADM, μερικοί φάνηκε να προκαλέσουν PanIN, τουλάχιστον κατά τη διάρκεια της σύντομης περιόδου κατά την οποία αναλύθηκαν οι ποντικοί [15]. αναγέννηση του παγκρέατος εμφανίστηκε επίσης να σταματήσει γεγονός που υποδηλώνει ότι Kras

G12D εκφράζουν κύτταρα που υποβλήθηκε η ADM δεν ήταν σε θέση να υποστεί την αντίστροφη διαδικασία DAM για να δημιουργήσει νέα κυψελοειδή κύτταρα [15]. Παρατηρήσαμε εκτεταμένη ADM /χαμηλού βαθμού σχηματισμό PanIN τόσο Ρ /Κ και Ν /Κ πάγκρεας στους 2-6 μήνες μετά AP υποστηρίζοντας και πάλι ότι μεγάλος αριθμός των παγκρεατικών κυττάρων ανταποκρίνονται σε ογκογονιδίου ενεργοποίηση. Ακόμα, μόνο λίγοι υψηλότερες βλάβες βαθμού μπορεί να ανιχνευθεί. Αυτό δείχνει ότι ενώ οι περισσότεροι κυψελοειδή κύτταρα ανταποκρίνονται σε κάποιο βαθμό σε ογκογόνους Kras παρακάτω κερουλεΐνης που προκαλείται AP μέσω της πραγματοποίησης της ADM, δεν είναι αρμόδια να προχωρήσει σε υψηλότερα βλάβες βαθμό και PDAC.

νεστίνη έκφραση ρυθμίζεται αυξητικά σε διάφορα μοντέλα της αναγέννησης παγκρέατος και νεστίνη έχει προταθεί ως μια παροδική δείκτης acinar αποδιαφοροποίηση [26], [29]. Είναι επίσης γνωστή ως ένας δείκτης βλαστικών κυττάρων κατά τη διάρκεια τόσο της εμβρυογένεσης και της ενήλικης ζωής σε διαφορετικά όργανα. Κάποιος θα μπορούσε τότε εικάζουν ότι παγκρεατικά κύτταρα ενηλίκων νεστίνη εκφράζουν βρίσκονται σε προγονικά κυψελιδικά γεγονός ενηλίκων και ότι η αναγέννηση του παγκρέατος μετά από AP συμβαίνει εν μέρει μέσω της επέκτασης αυτών των προγονικών κυττάρων. Ως τέτοια, ενήλικος νεστίνη κύτταρα που εκφράζουν θα μπορούσε δυνητικά να είναι πιο αρμόδια για την έναρξη και την πρόοδο του καρκίνου εξής AP-επαγόμενο πολλαπλασιασμό, όπως προτείνεται από την έκφραση νεστίνη σε όλες τις βλάβες βαθμό τόσο σε ανθρώπινο και σε ποντίκια. Περισσότερα πειράματα θα πρέπει να αξιολογήσει τις δυνατότητες αυτές.

Πρόσφατες εργασίες έδειξαν ότι η φλεγμονώδης μεσολαβητής Stat3 ενεργοποιείται σε όλα τα στάδια του καρκίνου του παγκρέατος από χαμηλού βαθμού PanIN να PDAC και είναι απαραίτητη για την εξέλιξη του καρκίνου [25], [ ,,,0],30]. AP προκαλεί παροδική ενεργοποίηση Stat3 στο φυσιολογικό πάγκρεας. Σε P /K ποντικούς, κερουλεΐνη επαγόμενη ΑΡ οδηγεί σε μια σημαντική ρύθμιση προς τα πάνω του φωσφο-Stat3 τόσο σε νεοπλασματικές αλλοιώσεις και την γύρω μικροπεριβάλλον στις 2-3 εβδομάδες μετά την επαγωγή του. Πράγματι, φωσφο-Stat3 φάνηκε να είναι άμεσα υπεύθυνοι για την επιτάχυνση της νεοπλασματικής εξέλιξη σε ποντίκια Ρ /Κ παρακάτω AP [16]. Στο μοντέλο μας δύο μήνες μετά την AP, φωσφο-Stat3 ήταν μόνο σπάνια ανιχνεύεται σε PanINs. Αντίθετα, αυτό εκφράστηκε κυρίως στις γύρω φλεγμονώδη κύτταρα, και ADM εστίες, καθώς και σε μικρές ομάδες των ιστολογικά φυσιολογικό κυψελοειδή κύτταρα. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι η ενεργοποίηση Stat3 θα μπορούσε να συμμετέχει σε διαδικασίες μεταπλασίας ως έναρξη βήματα σε νεοπλασματικό μετασχηματισμό. Το γεγονός ότι εκτεταμένες περιοχές της ADM εξακολουθούν να παρατηρούνται μετά από 2 μήνες υποδηλώνει επίσης ότι οι άλλες εκδηλώσεις που απαιτούνται για την ADM να προχωρήσουν σε PanIN. Αυξημένα επίπεδα του Kras

δραστηριότητα G12D θα μπορούσε να είναι ένα ουσιαστικό συστατικό για αυτή την εξέλιξη [31], [32].

Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι PDAC μεγαλώνει σιγά-σιγά κατά τη διάρκεια αρκετών δεκαετιών και μεταστάσεις μόνο σε «αργά» στάδια [ ,,,0],33], [34]. Αυτό υποδηλώνει ότι η έγκαιρη διάγνωση και η πρόληψη θα μπορούσε να είναι το πιο πολύτιμο προσεγγίσεις για να αντιμετωπίσει αυτό το εξαιρετικά θανατηφόρο καρκίνο. Καθορισμός των κυτταρικών τύπων στους οποίους ο καρκίνος μπορεί να ξεκινήσει, καθώς και την κατανόηση των μηχανισμών με τους οποίους η περιβαλλοντική τραυματισμοί μπορούν να επηρεάσουν την εξέλιξη του καρκίνου είναι τόσο απαραίτητες για αυτές τις προσεγγίσεις.

Υλικά και Μέθοδοι

Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από τη Φροντίδα και Χρήση Επιτροπής Θεσμικών ζώων στο Dartmouth College, αριθμό πρωτοκόλλου:. 9.7.07

ποντίκι γενιά αποικία

το LSL-Kras

G12D (01XJ6-Β6? 129 -Kras2

tm4Tyj) ποντίκια που παράγεται από DA Tuveson και Τ Jacks [35] και έλαβε από MMHCC, NCI. Τα ποντίκια νεστίνη Cre (B6.Cg-Tg (Nes-CRE) 1

KLN /J) που παράγεται από τον R. Klein [17] αγοράστηκαν από το εργαστήριο Jackson. Pdx1-Cre ποντικών ήταν ένα δώρο από τον G. Gu [35]. Όλα γονοτυπική έγιναν με PCR σύμφωνα με τους όρους των παρόχων. Δύο επεισόδια οξείας παγκρεατίτιδας που προκαλείται από μια σειρά επτά ωριαία ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις κερουλεΐνη διατυπώθηκε στις 2 διαδοχικές ημέρες, όπως περιγράφεται [14]. Κερουλεΐνη (Sigma, St. Louis ΜΟ) αραιώθηκε σε PBS και εγχύθηκε σε δόση 50 μg /kg σωματικού βάρους. Μια δεύτερη ομάδα της ένωσης μεταλλαγμένου και ελέγχου ζώα έλαβαν ενέσεις μόνο PBS. Όλα τα ζώα υποβλήθηκαν σε νηστεία για 12 ώρες πριν από το πείραμα.

Ιστολογία και ανοσοϊστοχημεία

Τα ποντίκια διαποτίστηκαν με PBS, στη συνέχεια 10% φορμαλίνη /ΡΒδ και ο παγκρέατα τεμαχίζεται. Για τη χρώση β-γαλακτοσιδάσης, οι ιστοί μεταφέρονται απευθείας μετά διαπότιση εντός 30% σακχαρόζη στους 4 ° C, και 24 ώρες αργότερα cryoembedded σε ένωση ΥΧΕ. Για ιστολογία και πιο ανοσοχρώση, πάγκρεας μονιμοποιήθηκαν διάρκεια της νύχτας και σε επεξεργασία για εμβάπτιση σε παραφίνη. Ρουτίνας αιματοξυλίνης και ηωσίνης (Η &? Ε) χρώση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση τυποποιημένων διαδικασιών. Για ανοσοκηλίδωση, τμήματα αποπαραφινοποιήθηκαν, ενυδατωμένο και αντιγόνα ανακτήθηκαν αν απαιτείται χρησιμοποιώντας ένα 2100-Retriever και αποκάλυψη διαλύματος αντιγόνου (Vector Laboratories). Για κυτοκερατίνη 19 (CK19) ανοσοχρώση, χρησιμοποιήθηκε πρωτεϊνάση Κ διαδικασία ανάκτησης αντιγόνου. διαδικασίες ανοσοχρώση ήταν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [5]. Τα αντισώματα και αραίωση που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: TromaIII (CK19 αντίσωμα που αναπτύχθηκε από Rolf Kemler και λαμβάνονται από Developmental Studies Hybridoma Bank, 1:10), αντι-β-γαλακτοσιδάσης (κουνέλι, Cappel, 1:200), αντι-Muc5a (Novocastra, 1:30 ), αντι-Κί67 (ποντίκι, Novocastra, 1:200), αντι-Hes1 (ένα δώρο από τον Dr. Τ Sudo, Toray Inc., Kamakura, Japan? 1:400), αντι-Cox2 και αντι-φωσφο-Stat3 (Tyr705) (αμφότερα Cell Signaling δύο παρα δέκα), αντι-Pdx1 (Upstate1:5000), αντι-αSMA (Abcam, 1:100), αντι-νεστίνη (Chemicon, AB5922 για ανθρώπινη, MAB353 για ποντίκι, 1:100) , και αντι-αμυλάση (Calbiochem, 1:500).

Εικόνες συνελήφθησαν με QImaging EXI Μπλε φωτογραφική μηχανή και αναλύονται με ImagePro Plus 7.0. Φθορισμού εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας τις ρυθμίσεις Black and White και τεχνητά χρωματισμένα για ανάλυση, εκτός από το Σχήμα 5, στην οποία ελήφθησαν φωτογραφίες χρησιμοποιώντας τις ρυθμίσεις χρώματος? H & amp? Ε και φωτογραφίες ανοσοχημεία συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας τις ρυθμίσεις χρώματος. Photoshop χρησιμοποιήθηκε για την επεξεργασία των εικόνων.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1. επεξεργασία

κερουλεΐνης οδηγεί σε οξεία παγκρεατίτιδα. Η &? Ε χρώση παγκρέατα χωρίς αγωγή (Α) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με κερουλεΐνη (Β, C). (Β) 48 ώρες μετά την αγωγή κερουλεΐνη (48 ώρες μετά C), το πάγκρεας εμφανίζει εκτεταμένη ADM, ατροφία εξωκρινείς και φλεγμονώδης διήθηση. (Γ) Σε μία εβδομάδα μετά C, το πάγκρεας έχει ανακτήσει την κανονική μορφολογία της, αλλά τα υψηλά επίπεδα του πολλαπλασιασμού εξακολουθεί να παρατηρείται, όπως φαίνεται από την έκφραση Ki67 (D)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0027725.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Μορφομετρική ανάλυση των ποντικών Ρ /Κ, 6 μήνες μετά κερουλεΐνης που προκαλείται από AP. Οι δραματικές αυξήσεις στον αριθμό των ζώων που εμφανίζουν εκτεταμένη ADM, υψηλού βαθμού αλλοιώσεις και περιοχές /microinvasion PDAC παρατηρήθηκε σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα ζώα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0027725.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

PanIN χαρακτηρισμό σε ποντίκια ΝΚ. χρώση (Α) Ki67 δείχνει μια σαφή αύξηση του πολλαπλασιασμού σε χαμηλού και υψηλού βαθμού αλλοιώσεις. Υψηλής ποιότητας PanINs εκφράζουν CK19 (Β), Muc5a (C). Τα εμβρυϊκά δείκτες προγόνους επανενεργοποιηθεί (D, E). μπλε χρώση τριχρωματική (F) του Masson δείχνει την παρουσία κολλαγόνου γύρω PanIN αλλοιώσεις. (G) Εκτεταμένες ADM παρατηρείται όπως φαίνεται από συνέκφραση CK19 (πράσινο, Η) και αμυλάση (κόκκινο, Ι) στα ίδια κύτταρα (λευκό βέλη). μπαρ κλίμακας: 20 μm

doi:. 10.1371 /journal.pone.0027725.s003

(ΔΕΘ)