Αφηρημένο

Ιστορικό

Achaete scute-σαν 2 (ASCL2), ένας παράγοντας μεταγραφής βασική έλικα-βρόχος-έλικα (bHLH), ελέγχει τη μοίρα του εντερικού βλαστικών κυττάρων. Ωστόσο, ο ρόλος του ASCL2 σε καρκίνο του παχέος εντέρου προγονικά κύτταρα παραμένει άγνωστος. Η κυτταρική σειρά ΗΤ-29 (47,5 έως 95% του CD133

+ πληθυσμού) και LS174T (0,45% του CD133

+ πληθυσμού) επιλέχθηκαν για τη λειτουργική αξιολόγηση των ASCL2 σε καρκίνο του παχέος εντέρου προγονικά κύτταρα μετά γονίδιο knockdown με παρεμβολή RNA .

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

η ανοσοϊστοχημεία έδειξε ότι ASCL2 ήταν σημαντικά αυξημένη σε παχέος αδενοκαρκινώματα. Προς τα κάτω ρύθμιση του ASCL2 χρησιμοποιώντας παρεμβολή RNA σε καλλιεργημένα κολονικού αδενοκαρκινώματος ΗΤ-29 και LS174T κύτταρα μειώνεται κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την ικανότητα σχηματισμού αποικιών, εισβολή και τη μετανάστευση in vitro, και είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση σύλληψη ξενομοσχευμάτων όγκου in vivo. Το επίπεδο της πρωτεΐνης ASCL2 στο CD133

+ ΗΤ-29 κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι στο CD133

– ΗΤ-29 κύτταρα. αποκλεισμός ASCL2 μέσω shRNA παρεμβολές σε ΗΤ-29 κύτταρα (κύτταρα ΗΤ-29 shRNA-ASCL2 /) κατέληξε σε 26,2% των κυττάρων χρώση CD133

+ σε σύγκριση με 54,7% στον έλεγχο shRNA-Ctr /ΗΤ-29 κύτταρα. Τα επίπεδα του «βλαστική ικανότητα» που συνδέονται γονίδια, όπως CD133, Sox2, Oct4, Lgr5, Bmi1, και C-myc, μειώθηκαν σημαντικά σε shRNA-ASCL2 /ΗΤ-29 και shRNA-ASCL2 /LS174T κύτταρα in vitro καθώς και σε η αντίστοιχη ξενομόσχευμα όγκου (CD133 δεν εκτελέσθηκε σε κύτταρα shRNA-ASCL2 /LS174T). Η shRNA-ASCL2 /ΗΤ-29 κύτταρα είχαν ανέστειλαν τις ικανότητες για να σχηματίσουν tumorspheres σύγκριση με τον έλεγχο. Τα microRNA (miRNAs) μικροσυστοιχίες, που προσδιορίζονται 26 επάνω ρυθμισμένη miRNAs και 58 ρυθμισμένα προς τα κάτω miRNAs σε κύτταρα ΗΤ-29 shRNA-ASCL2 /. επίπεδα έκφρασης ας-7b, miRNA-124, miRNA-125β, miRNA-17, miRNA-20α και miRNA-302b, που εμπλέκονται στη ρύθμιση της «βλαστική ικανότητα», ήταν ποσοτικά με qPCR, η οποία επιβεβαίωσε την ταυτότητά τους. Αποκατάσταση των miRNA-302b, μέσω μιμούνται τους, οδήγησε στην αποκατάσταση των χαρακτηριστικών shRNA-ASCL2 /HT-29 ‘βλαστική ικανότητα », συμπεριλαμβανομένων tumorsphere σχηματισμό και« βλαστική ικανότητα »τα αντίστοιχα επίπεδα των γονιδίων, και την ανάκτηση των κυτταρικών συμπεριφορές, συμπεριλαμβανομένης της ικανότητας σχηματισμού αποικιών , την εισβολή και τη μετανάστευση in vitro.

Συμπεράσματα /Σημασία

ASCL2 μπορεί να είναι ένας πιθανός στόχος για την αναστολή του καρκίνου του παχέος εντέρου προγονικών κυττάρων, και λειτουργεί μέσω ενός miR-302b που σχετίζονται με μηχανισμό.

Παράθεση: Zhu R, Γιανγκ Υ, Tian Υ, Bai J, Ζανγκ Χ, Λι Χ, et al. (2012) ASCL2 νοκ ντάουν αποτελέσματα στην αναστολή της ανάπτυξης του όγκου από miRNA-302b-Σχετικές Αναστολή του καρκίνου παχέος εντέρου προγονικών κυττάρων. PLoS ONE 7 (2): e32170. doi: 10.1371 /journal.pone.0032170

Επιμέλεια: Ilya Ulasov, University of Chicago, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19 του Οκτώβρη 2011? Αποδεκτές: 21 Ιανουαρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 23 Φεβρουαρίου 2012

Copyright: © 2012 Zhu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα κρατικών για τις Φυσικές Επιστήμες της Λαϊκής Δημοκρατίας της Κίνας 81000154 (σε ΥΥ) και το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών του έργου του CQ CSTC 2008BA5034 (σε RW). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο ορθοκολικός καρκίνος (CRC), η τρίτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως και η κύρια αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας στις αναπτυγμένες χώρες [1], αντιπροσωπεύει μια σημαντική θεραπευτική πρόκληση για τον καρκίνο. Πρόσφατα, ο καρκίνος των βλαστικών κυττάρων (CSC) υπόθεση έχει προταθεί για να εξηγήσει την λειτουργική ετερογένεια και καρκινογένεση του καρκίνου. Σύμφωνα με αυτό το μοντέλο, ένα υποπληθυσμό καρκινικών κυττάρων, τα οποία εμφανίζουν βλαστικά-όπως χαρακτηριστικά, τη διατήρηση του σχηματισμού όγκου, μετάσταση, και την αντίσταση στη θεραπεία [2] – [5]. Από την άποψη αυτή, ΚΕΠ θα αναμένεται να έχει ένα βλαστικό κύτταρο-φαινότυπο /προγονικά (γενικά αναφέρεται ως «βλαστική ικανότητα»). Επιπλέον, διάφορες μελέτες έχουν ερευνήσει τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες και τα προϊόντα τους που συμμετέχουν στη διατήρηση βλαστική ικανότητα και ογκογονικότητα του καρκίνου του παχέος εντέρου προγονικών κυττάρων [6] – [8]. Έτσι, είναι σημαντικό να προσδιοριστούν οι ρυθμιστικοί μηχανισμοί και μονοπάτια σηματοδότησης που εμπλέκονται σε καρκίνο του παχέος εντέρου προγονικά κύτταρα για την ανάπτυξη νέων αντιδραστηρίων για τη στόχευση του καρκίνου του παχέος εντέρου πυρίμαχο προγονικών κυττάρων του πληθυσμού [9].

Achaete scute-σαν 2 (ASCL2) , ένας μεταγραφικός παράγοντας βασικός έλικας-θηλιάς-έλικας (bHLH), είναι ένα προς τα κάτω στόχος του σηματοδότηση Wnt σε εντερικά βλαστικά κύτταρα. Η in situ υβριδοποίηση έδειξε έκφραση ASCL2 στη βάση των μικρών και μεγάλων εντερικών κρυπτών, αλλά η έλλειψη έκφρασης σε άλλους φυσιολογικούς ιστούς, εκτός από πλακούντα [10]. Τα συνδυασμένα αποτελέσματα από αυτά τα πειράματα gain- και απώλειας λειτουργίας συνεπάγεται ότι ASCL2 ελέγχει την τύχη των εντερικών βλαστοκυττάρων [11]. Διάφορες ομάδες έχουν αποδείξει ότι ASCL2 υπερεκφράζεται σε καρκίνο του παχέος εντέρου [10], [12], [13]. Επιπλέον, ASCL2 υπερ-έκφραση έχει τη δυνατότητα να μετατοπιστεί η ιεραρχία των βλαστικών και των προγονικών κυττάρων εντός ηπατικές μεταστάσεις με αποτέλεσμα αυτο-ανανέωσης και όχι διαφοροποίησης, οι οποίες ενδεχομένως επηρεάζουν την κλινική συμπεριφορά των όγκων αυτών [13]. Έτσι, ASCL2 μπορεί να είναι ένας ρυθμιστικός παράγοντας που ελέγχει την τύχη του καρκίνου του παχέος εντέρου προγονικών κυττάρων. Κατά την τελευταία δεκαετία, ένα αριθμός των αναπτυξιακών μονοπατιών που ρυθμίζουν ΚΕΠ έχουν αποκαλυφθεί [14] – [17]. Ωστόσο, ο ρόλος του ASCL2 σε καρκίνο του παχέος εντέρου προγονικά κύτταρα παραμένει άγνωστος.

Η κυτταρική σειρά ΗΤ-29 έχει ένα CD133

+ πληθυσμό 47,5 έως 95% στη βιβλιογραφία [18], [19] και απομονωμένος CD133

+ κύτταρα από την κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου ΗΤ-29 έδειξε υψηλότερη ογκογόνο δυναμικό από CD133

– κυττάρων στην δοκιμασία σχηματισμού όγκου in vivo [20]. Η πρωτεΐνη CD133 αναγνωρίστηκε αρχικά ως ένας δείκτης επιφάνειας για αιμοποιητικών αρχέγονων κυττάρων [21], αργότερα, χρησιμοποιήθηκε για να αναγνωρίσει καρκινικά βλαστικά κύτταρα σε πολλές συμπαγείς όγκους που προκύπτουν, για παράδειγμα, του μαστού [22], το πάγκρεας [23], το ήπαρ [ ,,,0],24] και του παχέος εντέρου [18], [19]. Το LS174T κυτταρική γραμμή έχει ένα CD133

+ πληθυσμό 0,45% στη βιβλιογραφία [20] και 0,1% στο πείραμα μας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι, ΗΤ-29 και LS174T κύτταρα επιλέχθηκαν για τη λειτουργική αξιολόγηση της ASCL2 στον καρκίνο του παχέος εντέρου προγονικών κυττάρων μετά από γονιδιακή νοκ ντάουν από την RNA παρεμβολής.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι ζωτικής σημασίας ως μετα-μεταγραφικό ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης και να συμμετέχουν σε διάφορες βιολογικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένης κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την απόπτωση [25]. miRNAs συμβάλλουν επίσης στη διατήρηση βλαστική ικανότητα των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων και την ανθρώπινη ΚΕΠ [26] – [28]. Διερεύνηση της λειτουργίας του ASCL2 για τον καρκίνο του παχέος εντέρου προγονικά κύτταρα και τα προφίλ έκφρασης των miRNAs είναι ζωτικής σημασίας για την κατανόηση των χαρακτηριστικών του καρκίνου του παχέος εντέρου προγονικών κυττάρων, η οποία θα ωφελήσει την ανάπτυξη νέων φαρμάκων ή νέων θεραπευτικών μεθόδων που στοχεύουν του παχέος εντέρου προγονικών κυττάρων. Επιπλέον, θα παρέχει νέες γνώσεις σχετικά με τις μεθόδους για την εξάλειψη του καρκίνου του παχέος εντέρου, λόγω της πιθανότητας ότι η εξάλειψη του καρκίνου του παχέος εντέρου προγονικών κυττάρων θα είναι ένα κρίσιμο βήμα για την επίτευξη μια θεραπεία για τον καρκίνο του παχέος εντέρου.

Στην έκθεση αυτή, δείχνουμε ο επιλεκτικός αποκλεισμός των ASCL2 σε ΗΤ-29 και LS174T κυττάρων θα μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη των κυττάρων, εισβολή και τη μετανάστευση in vitro, και να οδηγήσει σε διακοπή της ανάπτυξης in vivo, που είναι εν μέρει σχετίζεται με miRNA-302b συνδέονται με την αναστολή της «βλαστική ικανότητα» των προγονικών καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα με βάση τα πειράματα του shRNA-ASCL2 /ΗΤ-29 επιμολυσμένα με miRNA-302b μιμούνται. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ASCL2 θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός στόχος στον καρκίνο του παχέος εντέρου προγονικά κύτταρα για την ανάπτυξη νέων θεραπειών για την εκρίζωση των καρκίνων του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια

Ανθρώπινα κολονικού αδενοκαρκινώματος κυτταρικές γραμμές ΗΤ-29 και LS174T ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και διατηρήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α (Sigma, USA) που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS? HyClone, USA) στους 37 ° C και 5% CO

2, με το μέσο αλλάζεται κάθε δύο ημέρες. Τα κύτταρα περάστηκαν σε 80% συρροή και σπέρνεται σε 30% συρροή για τη συντήρηση των βέλτιστων συνθηκών πολλαπλασιαζόμενων.

RNA παρεμβολής

Η ακολουθία, CCGCGTGAAGCTGGTGAAC, με στόχο ASCL2 (shRNA-ASCL2 /EGFP) [11 ] σχηματίστηκε από δίκλωνο DNA που αποτελείται από 5′-CACCGCCGCGTGAAGCTGGTGAACTTCAAGACGGTTCACCAGCTTCACGCGGTTTTTTG-3 ‘, 5′-AGCTCAAAAAACCGCGTGAAGCTGGTGAACCGTCTTGAAGTTCACCAGCTTCACGCGGC-3’.

Α pGenesil-1,1 χρησιμοποιήθηκε χωρίς ένθετο για τον έλεγχο (shRNA-Ctr /EGFP). Τα ανοπτημένα δίδυμα ϋΝΑ κλωνοποιήθηκαν στο πλασμίδιο του pGenesil-1,1 πέψη με το ένζυμο περιορισμού Eco31I. ΗΤ-29 και LS174T κύτταρα επιμολύνθηκαν με shRNA-ASCL2 /EGFP ή φορέα shRNA-Ctr /EGFP, και στη συνέχεια επιλέγονται με 0.8 mg /G418 ml για κύτταρα ΗΤ-29 επιμολυσμένα και 0,4 mg /ml G418 για LS174T επιμολυσμένα κύτταρα, που αρχίζει 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Δύο εβδομάδες αργότερα, τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε 0.4 mg /ml G418 για ΗΤ-29 επιμολυσμένα κύτταρα και 0,2 mg /ml G418 για LS174T επιμολυσμένα κύτταρα μέχρι καθορίστηκαν τρεις ανεξάρτητους σταθεροί επιμολυσμένων κλώνων. Παρεμβολή RNA ήταν σταθερή καθ ‘όλη τη διάρκεια των πειραμάτων κάτω από την πίεση επιλογής του 0,4 mg /ml G418 για κύτταρα ΗΤ-29 επιμολυσμένα και 0,2 mg /ml G418 για LS174T επιμολυσμένα κύτταρα στο μέσο καλλιέργειας.

Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εξετάσθηκε κατά τις ημέρες 1, 2, 3 και 4. τα απομονωθέντα κύτταρα σπάρθηκαν σε 1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων (Corning, USA) σε τελικό όγκο 100 μl μέσου καλλιέργειας ανά φρεάτιο. Σε κάθε χρονικό σημείο, 5 mg /ml ΜΤΤ (Sigma, USA) προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας (20 μΐ /φρεάτιο) και επωάστηκαν για επιπλέον 4 ώρες στους 37 ° C σε 5% CO

2 ατμόσφαιρα για να επιτρέψει ΜΤΤ προς να μετατραπεί σε κρύσταλλοι φορμαζάνης. Μετά από αυτό, οι κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλύθηκαν με 150 μΙ DMSO (Sigma, USA) για 10 λεπτά. Η απορρόφηση μετρήθηκε σε μήκος κύματος 490 nm με έναν αναγνώστη μικροπλάκας (Thermo, USA). Ολες οι δοκιμασίες επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 1000 κυττάρων ανά πλάκα (35 mm, Corning, USA) και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C υπό 5 % CO

2. Το μέσο αλλάχθηκε κάθε 3-4 ημέρες. Τις ημέρες 20, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Giemsa και παρατηρήθηκε υπό ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο. Οι αριθμοί των αποικιών σε κάθε πλάκα μετρήθηκαν. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές και εκφράστηκε ως ο μέσος αριθμός των αποικιών ανά πλάκα.

Δοκιμασία in vitro εισβολή

Η in vitro ικανότητα εισβολής των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τους θαλάμους Transwell επικαλυμμένων με Matrigel (Corning, USA) δοκιμασίας. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 100 μΙ με πυκνότητα 1 × 10

6 κύτταρα /ml με 1% FBS στον άνω θάλαμο, και ο κατώτερος θάλαμος γέμισε με 600 μΐ μέσου καλλιέργειας με 20% FBS ως χημειοελκτικό. Transwells στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C υπό 5% CO

2 για 48 ώρες για να επιτραπεί στα κύτταρα να εισβάλουν. Στο τέλος της επώασης, τα κύτταρα επί της άνω πλευράς του Matrigel επικαλυμμένα φίλτρο απομακρύνθηκαν με σκούπισμα με ένα βαμβάκι. Τα κύτταρα που είχαν εισβάλει μέσα από την Matrigel επικαλυμμένα φίλτρο χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες διάλυμα. Τα επεμβατική κυττάρων που μετανάστευσαν μέσω της Matrigel επικαλυμμένα φίλτρο στην κατώτερη επιφάνεια μετρήθηκαν υπό ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο φωτός (Olympus, Japan), στα 200 χ μεγέθυνση. Κύτταρα σε πέντε τυχαιοποιημένες οπτικά πεδία στα 200 χ μετρήθηκαν και εκφράστηκαν ως ο μέσος αριθμός κυττάρων ανά οπτικό πεδίο. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές.

Μετανάστευση

ΗΤ-29, τα κύτταρα LS174T και μορφομετατροπείς τους, σε 90-100% συρροή σε πλάκες 6-φρεατίων, καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα σε μέσο άνευ ορού . Το μέσο αντικαταστάθηκε με PBS, και οι μονοστιβάδες τραυματίες μηχανικά χρησιμοποιώντας ένα αποστειρωμένο, μονής κόψης Razorblade. Μετά τον τραυματισμό, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν δύο φορές με αποστειρωμένο PBS και επωάστηκαν εντός μέσου McCoy 5Α που περιέχει 10% FBS για 48 ώρες στους 37 ° C, υπό 5% CO

2. Τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει από την τραυματίες άκρη μετρήθηκαν στα 200 × μεγέθυνση χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο φωτός (Olympus, Ιαπωνία). Κύτταρα σε 5 τυχαία πεδία του άποψη στα 200 × και εκφράζεται ως ο μέσος αριθμός κυττάρων ανά οπτικό πεδίο. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές.

Δοκιμασίες

Tumorsphere-σχηματισμός

Για tumorsphere σχηματισμός, μονοκύτταρους εναιωρήματα αιωρήθηκαν σε ένα Τροποποιημένο Μέσο /F12 Eagle του Dulbecco (DMEM /F12, Hyclone, USA) συμπληρωμένο με Β-27 (1 χ, Gibco), 20 ng /mL επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF, Peprotech, USA), και 20 ng /ml βασικό αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών (bFGF, Peprotech, USA), και στη συνέχεια επιστρώθηκαν σε 24- καλά εξαιρετικά χαμηλής πλάκες στερεώσεως (Corning, USA) σε συγκέντρωση 1000 κυττάρων ανά φρεάτιο. Οι πλάκες αναλύθηκαν 7-10 ημέρες αργότερα για tumorsphere σχηματισμό και ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Olympus) στους 100 × 400 × και μεγεθύνσεις. Για τις επόμενες ποσοτικοποίηση του αριθμού των κυττάρων ανά tumorsphere, tumorspheres συλλέχθηκαν με ένα um κόσκινο 40 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) και διαχωριστεί με 0,25% θρυψίνη /0,02% ΕϋΤΑ για να κάνει ένα αιώρημα μονών κυττάρων. Τα βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν στη συνέχεια χρησιμοποιώντας αποκλεισμό trypan blue.

In vivo ογκογονικότητα

Ο shRNA-Ctr /ΗΤ-29, shRNA-ASCL2 /ΗΤ-29, shRNA-Ctr /LS174T και shRNA -Ascl2 κύτταρα /LS174T επαναιωρήθηκαν σε 100 μΐ (1 χ 10

6 κύτταρα) του 0.9% φυσιολογικό ορό πριν από την ένεση. Έξι εβδομάδων BALB /c nude αρσενικά ποντίκια είχαν αγοραστεί από τη διευκόλυνση των Ζώων του Κέντρου Έρευνας της Τρίτης Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο και διατηρείται υπό κανονικές συνθήκες. Όλα τα πειράματα έγιναν με την έγκριση της Επιτροπής των ζώων Μελετών Δεοντολογίας της Τρίτης Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο (αριθμός άδειας: sw 20090713). Τα ποντίκια υποδορίως εμβολιάστηκαν με 1 × 10

6 απομονωμένα κύτταρα και στις δύο πλευρές (αριστερά με shRNA-ASCL2 /HT-29 ή κύτταρα /LS174T shRNA-ASCL2 και το δικαίωμα με shRNA-Ctr /HT-29 ή shRNA-Ctr /κυττάρων LS174T, αντίστοιχα). Τα μεγέθη του όγκου μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας καλίμπρες. Τα μεγέθη των όγκων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον τύπο: (μήκος Χ πλάτος

2) /2. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με αυχενική εξάρθρωση την ημέρα 20 μετά τον εμβολιασμό. Τα μοσχεύματα αφαιρέθηκαν, τεκμηριώθηκε φωτογραφικά και τα βάρη των όγκων μετρήθηκαν. Οι όγκοι χωρίστηκαν σε δύο ομάδες και είτε σταθερά με 10% ρυθμιστικό διάλυμα φορμόλης ή διατηρημένα σε -80 ° C.

Η κυτταρομετρία ροής διαλογή κυττάρων και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Για την απομόνωση του CD133

+ και CD133

– πληθυσμών εντός κυττάρων ΗΤ-29, μονοκύτταρους αιωρήματα επωάστηκαν με φυκοερυθρίνη (ΡΕ) αντι-ανθρώπινου CD133 αντίσωμα (κλώνος AC133? Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA) και FcR αντιδραστήριο αποκλεισμού ( Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA) σε διάλυμα χρώσης που περιέχει 0,5% BSA και 2 mM EDTA για 10 λεπτά στους 4 ° C. Που ταιριάζουν στον ισότυπο G1 ανοσοσφαιρίνης ποντικού (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA) χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. Τα κύτταρα αναλύθηκαν και ταξινομούνται με φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων διαλογέα (FACS) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Για το θετικό και αρνητικό πληθυσμού, η κορυφή 10,8% λαμπρά χρωματισμένα κύτταρα ή επιλέχθηκαν οι κάτω 7,6% αμυδρά χρωματισμένα κύτταρα, αντίστοιχα.

Ανοσοϊστοχημεία

Ανοσοϊστοχημικές μελέτες της ASCL2 διεξήχθησαν σε ανθρώπινο βλεννογόνο του παχέος εντέρου (n = 11), καρκίνωμα του κόλου (n = 11) και του όγκου ξενομοσχεύματα από γυμνά ποντίκια (η = 6), τα ανθρώπινα βλεννογόνο του παχέος εντέρου και του καρκίνου του ιστοί ήταν από τους ίδιους ασθενείς και όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση ενημερωμένη συγκατάθεση. Παραφίνη αφαιρέθηκε από σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη ιστό? δείγματα στη συνέχεια μπλοκαριστεί και επωάζονται με ειδικά αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Το αντίσωμα ανιχνεύτηκε με SP9002 Histostain ™ -PLUS Kits (Zymed Co., USA). Όλες οι τομές με αιματοξυλίνη. Πρωτογενής ASCL2 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (Πίνακας S1) χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:100. Όλα τα πειράματα έγιναν με την έγκριση της Επιτροπής Μελετών Δεοντολογίας της ΝΔ Νοσοκομείο, Τρίτη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο (αριθμός άδειας: sw 20090713).

ανοσοφθορισμού χρώση

HT-29 και LS174T κύτταρα, που καλλιεργούνται επί αποστειρωμένο καλυπτρίδες, βάφτηκαν με ASCL2 πρωτογενές αντίσωμα (Πίνακας S1), ακολουθούμενη από επώαση με αντι-ποντικού κατσίκας IgG-R (Santa Cruz Biotechnology, Inc., California USA), αντικηλίδωση με ϋΑΡΙ, και, τέλος, οπτικοποιούνται υπό μία σάρωση με λέιζερ ομοεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού (Carl Zeiss, Inc. Germany).

Real-time PCR ανάλυση

το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πρώτος κλώνος cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας primeScript ™ RT ένζυμο αναμειγνύεται Ι, ολίγο dT εκκινητές και τυχαία εξαμερή (Takara, Ιαπωνία). Για τον προσδιορισμό φορές αλλαγών σε κάθε γονίδιο, σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του πρώτου κλώνου cDNA, εμπρόσθιοι και αντίστροφοι εκκινητές, και ο SYBR πρόμιγμα Ex Taq ™ Πράσινη II (Takara, Ιαπωνία). Οι αλληλουχίες εκκινητών συνοψίζονται στον Πίνακα S2. Αντίδραση και σήμα ανίχνευσης μετρήθηκαν με το σύστημα PCR πραγματικού χρόνου (BioRad, USA). Τα επίπεδα έκφρασης υπολογίστηκαν ως η σχετική αναλογία έκφραση σε σύγκριση με β-ακτίνη. Οι σε πραγματικό χρόνο PCRs διεξήχθησαν εις τριπλούν ανεξάρτητα.

Western

δοκιμασία κηλίδος

κυτταρολύματα ή το ομογενοποιημένο ιστών από ξενομοσχεύματα όγκου διαλύθηκε σε ρυθμιστικό δείγματος SDS διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη μεμβράνη. Η β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Η μεμβράνη ανιχνεύθηκε με ειδικό πρωτογενές αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C (τα πρωτογενή αντισώματα συνοψίζονται στον Πίνακα S1), ακολουθούμενη από επώαση με συζευγμένο με HRP δευτερογενούς IgG (H + L) αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, Inc., California USA) . Οι κηλίδες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Immobilon ™ δυτική υπόστρωμα χημειοφωταύγειας HRP (Milipore, ΗΠΑ) και αναλύονται από το σύστημα ανάλυσης απεικόνισης γέλης (BioRad, USA).

miRNA ανάλυσης μικροσυστοιχιών και miRNAs ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR

η 6η γενιά της ανθρώπινης μικροσυστοιχίες miRNA (Exiqon, Δανία) χρησιμοποιήθηκε για να συγκριθούν τα προφίλ έκφρασης των miRNAs μεταξύ shRNA-Ctr /HT-29 και shRNA-ASCL2 /ΗΤ-29 κύτταρα. Η μικροσυστοιχία περιέχει περισσότερες από 1891 ανιχνευτές σύλληψης, που καλύπτει όλες τις miRNAs ανθρώπου, ποντικού και αρουραίου σχολιασμένο στην miRBase 16.0. Ολικό RNA εξήχθη από 1 × 10

7 σταθερά επιμολυσμένα shRNA-Ctr /ΗΤ-29 και shRNA-ASCL2 /ΗΤ-29 κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, USA). απομόνωση του RNA, τον ποιοτικό έλεγχο, τη σήμανση και υβριδοποίηση έγιναν στη Σαγκάη KANCHENG Biochip Εταιρείας σύμφωνα με τα πρωτόκολλα στο σύστημα μικροσυστοιχιών miRNA. Συστοιχίες σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες σαρωτή, και οι σαρωμένες εικόνες στη συνέχεια εισάγονται στην GenePix Pro 6.0 λογισμικό (Axon) για την ευθυγράμμιση του δικτύου και την εξόρυξη δεδομένων. Αναπαραχθεί miRNAs ήταν κατά μέσο όρο και miRNAs με εντάσεις & gt? 50 σε όλα τα δείγματα επιλέχθηκαν για τον υπολογισμό του παράγοντα κανονικοποίησης. Εκφράζεται δεδομένα ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το διάμεσο ομαλοποίηση. Μετά την κανονικοποίηση, διαφορικά εκφρασμένων miRNAs εντοπίστηκαν μέσω Fold Αλλαγή φιλτραρίσματος. Ιεραρχική ομαδοποίηση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού ΠΟΑ (v4.6, TIGR).

Για την επικύρωση miRNAs qPCR, οι αλληλουχίες εκκινητή για miRNAs συνοψίζονται στον Πίνακα S3. απομόνωση του RNA, τον ποιοτικό έλεγχο, cDNA συνθέσει και qPCR έγιναν στη Σαγκάη KANCHENG Biochip Εταιρείας σύμφωνα με τα πρωτόκολλα. Ένα t-test χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση διαφορικά εκφρασμένων miRNAs μεταξύ shRNA-Ctr /ΗΤ-29 και shRNA-ASCL2 /ΗΤ-29 συγκρίσεις.

Η επιμόλυνση των μιμείται miRNA ή αναστολείς miRNA σε shRNA-ASCL2 /ΗΤ-29 κύτταρα

shRNA-ASCL2 /ΗΤ-29 κύτταρα μορφομετατράπηκαν 24 ώρες μετά τη εμβολιάστηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων. Οι μιμείται miRNA (100 pmol) ή αναστολείς miRNA (200 pmol) (Guangzhou Ribobio Co., Ltd. Guangzhou, Λαϊκή Δημοκρατία της Κίνας) σε 250 μΙ, αντιβιοτικά άνευ μέσου χωρίς ορό αναμίχθηκαν με 5 μΐ του αντιδραστηρίου επιμόλυνσης Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) διαλύθηκαν σε 245 μΙ του ίδιου μέσου και αφέθηκε να παραμείνει σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά. Τα προκύπτοντα διαλύματα 500 μΙ διαμόλυνσης προστέθηκαν στη συνέχεια σε κάθε φρεάτιο που περιέχει 1.5 ml μέσου. Έξι ώρες αργότερα, το κάθε φρεάτιο αντικαταστάθηκε με 2 ml φρέσκου μέσου συμπληρωμένου με 10% FBS. Τα παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από επιπλέον 48 ώρες επώασης για περαιτέρω πειράματα, συμπεριλαμβανομένου του σχηματισμού tumorsphere, σε πραγματικό χρόνο PCR, ανάλυση στυπώματος western, δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, δοκιμασία εισβολή και την ανάλυση της μετανάστευσης. Η παροδική επιμολυσμένα shRNA-ASCL2 ΗΤ-29 κύτταρα /χρησιμοποιώντας miRNA μιμούνται αρνητικό μάρτυρα (100 pmol) ή miRNA αναστολείς αρνητικό μάρτυρα (200 pmol) χρησιμοποιήθηκαν ως ένας έλεγχος.

Στατιστική Ανάλυση

Για συνεχείς μεταβλητές, τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων εκτιμήθηκαν με t-test και επαναλαμβανόμενων μετρήσεων ανάλυση ΑΝΟνΑ Student. Όλες οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές στο επίπεδο ρ & lt? 0,05, πολύ σημαντική στο επίπεδο του ρ & lt? 0,01. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το SPSS 13.0 για το πακέτο λογισμικού Windows.

Αποτελέσματα

ASCL2 υπερεκφράζεται σε καρκίνο του παχέος εντέρου και κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου, και παρεμβολή ASCL2 σε ΗΤ-29 και LS174T κύτταρα αξιοσημείωτα μειωμένος έκφραση του

η ανοσοϊστοχημική χρώση χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί εάν πρωτεΐνη ASCL2 εκφράστηκε σε ανθρώπινο βλεννογόνο του παχέος εντέρου και του καρκίνου του παχέος εντέρου. Μια αύξηση στην έκφραση πρωτεΐνης ASCL2 στον πυρήνα του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων ανθρώπινης καρκίνων του παχέος εντέρου (Εικόνα 1Β) παρατηρήθηκε σε σύγκριση με την ειδική χρώση ASCL2 πρωτεΐνης στο πυρήνα των κυττάρων κρύπτης βάσης του φυσιολογικού βλεννογόνου του κόλου (Σχήμα 1Α). Τα κύτταρα με ASCL2 θετική χρώση στον πυρήνα διαχωρίστηκαν με αρνητική κυτταρική χρώση ακριβώς στην κανονική κρύπτη βάση (Σχήμα 1Α). Η χρώση ανοσοφθορισμού έδειξε ότι ASCL2 εκφράστηκε κυρίως στον πυρήνα των ΗΤ-29 κυττάρων και ασθενώς εκφράζεται στο κυτταρόπλασμα, ενώ, ASCL2 εκφράστηκε κυρίως στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων LS174T, και εκφράζεται ασθενώς στον πυρήνα. πρότυπο έκφρασης του ASCL2 σε ΗΤ-29 και LS174T κυττάρων ήταν ασύμφωνα, με την πλειονότητα των ΗΤ-29 και τα κύτταρα LS174T είναι σχετικά ασθενής για την έκφραση (Σχήμα 1 C). Η ανάλυση στυπώματος Western κατέδειξε ότι ASCL2 ήταν παρούσα και στις δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου ΗΤ-29 και τα κύτταρα LS174T (20 kDa και στα δύο), αλλά απουσιάζει από MHCC-97L, ενός καρκίνου του ήπατος κυτταρική γραμμή (Σχήμα 1 D).

έκφραση ASCL2 ειδικά εντοπισμένη στο πυρήνα του κρύπτη κυττάρων βάσης φυσιολογικού ανθρώπινου βλεννογόνου του κόλου (κεφαλή βέλους) (Α), Β καταδεικνύει ότι ASCL2 εκφράζεται ειδικά εις τον πυρήνα των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του κόλου (Αρχική μεγέθυνση του πινακίου κορυφής των Α και Β: χ 200? Πρωτότυπη μεγέθυνση της χαμηλής πάνελ Α και Β: χ 400). Η χρώση ανοσοφθορισμού δείχνει ASCL2 βρίσκεται κυρίως στον πυρήνα του ΗΤ-29 κυττάρων και το κυτταρόπλασμα των κυττάρων LS174T (C) (Αρχική μεγέθυνση: Χ 200). Η ανάλυση στυπώματος Western δείχνει ASCL2 είναι παρούσα σε ΗΤ-29 και τα κύτταρα LS174T, αλλά απουσιάζει στα κύτταρα MHCC-97L (D). ASCL2 παρεμβολή σε ΗΤ-29 και LS174T κύτταρα έχει ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση τόσο του mRNA ASCL2 αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR και η πρωτεΐνη επίπεδα αναλύθηκε με ανάλυση Western blot σε σχέση με τον έλεγχο (β-ακτίνη) (**: ρ & lt? 0,01) (Ε και F).

Η

Για να γκρεμίζω έκφραση ASCL2 σε ΗΤ-29 και LS174T κύτταρα, κύτταρα επιμολυσμένα με shRNA-ASCL2 /EGFP και shRNA-Ctr φορείς /EGFP, τέσσερις σταθερές-επιμολυσμένων κυτταρικών σειρών ( ιδρύθηκαν shRNA-ASCL2 /HT-29, shRNA-ASCL2 /LS174T, shRNA-Ctr /HT-29 και κύτταρα /LS174T shRNA-CTR). mRNA ASCL2 ποσοτικοποιούνται με πραγματικού χρόνου PCR μειώθηκε σε shRNA-ASCL2 /ΗΤ-29 και κύτταρα /LS174T shRNA-ASCL2 σύγκριση με τους ελέγχους τους (Σχήμα 1 Ε). Μια αντίστοιχη μείωση των ASCL2 πρωτεΐνη παρατηρήθηκε σε shRNA-ASCL2 /ΗΤ-29 και κύτταρα /LS174T shRNA-ASCL2 σύγκριση με τους ελέγχους τους (Σχήμα 1 F). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των shRNA-Ctr /ΗΤ-29 και μη επιμολυσμένα κύτταρα ΗΤ-29, και μεταξύ των shRNA-Ctr /LS174T και μη επιμολυσμένα κύτταρα LS174T, στις δύο mRNA ASCL2 και έκφραση πρωτεΐνης (Εικόνα 1 Ε και 1 F).

Η σιωπή του ASCL2 σε ΗΤ-29 και LS174T κύτταρα οδήγησε σε μεταβολές στην κυτταρική συμπεριφορές

δοκιμασία σχηματισμού αποικίας: shRNA-ASCL2 /ΗΤ-29 και shRNA-ASCL2 κύτταρα /LS174T αναπτύχθηκαν λιγότερες αποικίες μετά από 20 ημέρες σε σύγκριση με τους ελέγχους τους (ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 2Α). Δοκιμασία πολλαπλασιασμού: Οι ρυθμοί πολλαπλασιασμού των shRNA-ASCL2 /ΗΤ-29, shRNA-ASCL2 /LS174T και οι έλεγχοι τους εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας μια μέθοδο ΜΤΤ, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, από τις ημέρες 1 έως 4 μετά τη σπορά. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, υπήρχαν σημαντικές διαφορές στα ποσοστά ανάπτυξης μεταξύ shRNA ASCL2-/HT-29 και τα κύτταρα HT-29, καθώς και μεταξύ shRNA-ASCL2 /HT-29 και shRNA-Ctr /ΗΤ-29 κυττάρων στις ημέρες 3 και 4, επίσης μεταξύ shRNA-ASCL2 /LS174T και LS174T κύτταρα και μεταξύ shRNA-ASCL2 /LS174T και κυττάρων shRNA-Ctr /LS174T τις ημέρες 3 και 4 (ρ & lt? 0,05). Στην δοκιμασία εισβολή vitro: προσδιορισμοί εισβολή διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας επικαλυμμένα με Matrigel θαλάμους καλλιέργειας Transwell. Μετά από 48 ώρες επώασης, μετρήθηκαν οι αριθμοί της εισβολής κυττάρων. Με shRNA-ASCL2 /ΗΤ-29 κύτταρα, 7 ± 3 κυττάρων ανά πεδίο (κάτω από 200 × μεγέθυνσης χρησιμοποιώντας το ανεστραμμένο μικροσκόπιο) εισέβαλαν μέσω της μεμβράνης. Αυτός ο αριθμός ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη των μη επιμολυσμένα κύτταρα ΗΤ-29 (37 ± 5) ή shRNA-Ctr ΗΤ-29 κύτταρα /(31 ± 6), (ρ & lt? 0,01). Ομοίως, με shRNA-ASCL2 /κυττάρων LS174T, 84 ± 14 κύτταρα ανά πεδίο (κάτω από 200 × μεγέθυνσης χρησιμοποιώντας το ανεστραμμένο μικροσκόπιο) εισέβαλαν μέσω της μεμβράνης. Αυτός ο αριθμός ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη των μη επιμολυσμένα κύτταρα LS174T (292 ± 32) ή shRNA-Ctr /κύτταρα LS174T (296 ± 30) (ρ & lt? 0,01) (Σχήμα 2C). Μετανάστευση: Τέλος, 75 ± 10 shRNA-ASCL2 /ΗΤ-29 κυττάρων ανά πεδίο (κάτω από 200 × μεγέθυνση) κινήθηκε σε όλη την ξύνεται άκρη μετά από 48 ώρες. Αυτός ο αριθμός ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη των μη επιμολυσμένα κύτταρα ΗΤ-29 (185 ± 15) ή shRNA-Ctr /ΗΤ-29 κύτταρα (195 ± 25) (ρ & lt? 0,05). 82 ± 9 shRNA-ASCL2 /LS174T κυττάρων ανά πεδίο (κάτω από 200 χ μεγέθυνση) κινείται κατά μήκος του ξύνεται άκρη μετά από 48 ώρες. Αυτός ο αριθμός ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη των μη επιμολυσμένα κύτταρα LS174T (177 ± 21) ή κύτταρα /LS174T shRNA-Ctr (173 ± 25) (ρ & lt? 0,05). (Εικόνα 2D)

shRNA-ASCL2 /HT- 29 και shRNA-ASCL2 /κύτταρα LS174T έχουν λιγότερες αποικίες (*: p & lt? 0,05) (Α), τα χαμηλότερα ποσοστά ανάπτυξης (*: p & lt? 0,05) (Β), λιγότερο εισέβαλαν κυττάρων μέσω της Matrigel επικαλυμμένο με μεμβράνη (**: p & lt ? 0,01) (C) και λιγότερο τα κύτταρα μεταναστεύουν σε όλη την ξύνεται άκρη (*: ρ. & lt? 0,05) (Δ), σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου τους (Αρχική μεγέθυνση: × 200)

η

ASCL2 παρέμβαση οδήγησε σε in vivo την ανάπτυξη σύλληψη των όγκων

Για να συγκρίνετε τα ποσοστά αύξησης των shRNA-Ctr /HT-29 και shRNA-ASCL2 /ΗΤ-29 κύτταρα, shRNA-Ctr /LS174T και κύτταρα /LS174T shRNA-ASCL2, σε αθυμικά γυμνά ποντίκια, το shRNA-ASCL2 /ΗΤ-29 ή shRNA-ASCL2 /κύτταρα LS174T εγχύθηκαν σε αριστερό πλευρό ενώ κύτταρα /LS174T shRNA-Ctr /ΗΤ-29 ή shRNA-Ctr εγχύθηκαν στο δεξί πλευρό αντίστοιχα. Είκοσι ημέρες μετά τον εμβολιασμό με κάθε συνδεδεμένο κύτταρα (shRNA-ASCL2 /ΗΤ-29 και shRNA-Ctr /ΗΤ-29 κύτταρα στο Σχήμα 3Α, ή shRNA-ASCL2 /LS174T και κύτταρα /LS174T shRNA-Ctr (τα αποτελέσματα δεν φαίνονται)) σε κάθε ποντίκι, αντίστοιχα, όλα τα ποντίκια (12/12, αντίστοιχα) ανέπτυξαν όγκους. Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας καλίμπρες σε διάφορα χρονικά σημεία πριν από το θάνατο, ενώ τα βάρη προσδιορίσθηκαν μετά το θάνατο. Ο όγκος και η μάζα των /ΗΤ-29 ή shRNA-ASCL2 /LS174T όγκους shRNA-ASCL2 ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη των όγκων shRNA-Ctr /ΗΤ-29 ή shRNA-Ctr /LS174T (ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 3Β και 3C). Επιπλέον, η έκφραση ASCL2 στον ιστό του όγκου από shRNA-ASCL2 /ΗΤ-29 ή shRNA-ASCL2 κύτταρα /LS174T ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη των κυττάρων /ΗΤ-29 ή shRNA-Ctr /LS174T shRNA-Ctr, όπως προσδιορίζεται με πραγματικού χρόνου PCR και ανάλυση κηλίδος western (Σχήμα 3D και 3Ε). έκφραση ASCL2 σε ιστό όγκου από shRNA-ASCL2 /ΗΤ-29 ή κύτταρα /LS174T shRNA-ASCL2 ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη από κύτταρα /LS174T shRNA-Ctr /ΗΤ-29 ή shRNA-Ctr, όπως φαίνεται από την ανοσοϊστοχημική χρώση (Σχήμα 3F) .

Όλα τα ποντίκια (6/6, αντίστοιχα) να αναπτύξουν όγκους 20 ημέρες αργότερα μετά από 1 × 10

6 shRNA-Ctr /ΗΤ-29 κύτταρα (δεξιά πλευρά και χαρακτηρίζονται ως βέλος) και shRNA-ASCL2 /τα κύτταρα ΗΤ-29 (αριστερή πλευρά και επισημαίνονται ως αιχμή βέλους) που έχουν εμβολιαστεί σε γυμνά ποντίκια (Α), κύτταρα LS174T δεν απεικονίζεται. Ο όγκος του όγκου (Β) και μάζα βάρος (C) στην ομάδα του shRNA-ASCL2 /ΗΤ-29 και shRNA-ASCL2 κύτταρα /LS174T είναι σημαντικά χαμηλότερη από την ομάδα των shRNA-Ctr /ΗΤ-29 και shRNA-Ctr /LS174T κύτταρα (*: p & lt? 0,05). Το mRNA (D) και την πρωτεΐνη (Ε) επίπεδα ASCL2 στους ιστούς όγκων αναπτύσσουν από shRNA-ASCL2 /ΗΤ-29 και shRNA-ASCL2 /κύτταρα LS174T είναι χαμηλότερες από ό, τι στους ιστούς του όγκου που αναπτύχθηκε από shRNA-Ctr /ΗΤ-29 και shRNA-Ctr /κύτταρα LS174T (**: p & lt? 0,01). ASCL2 ανοσοχρώση στον πυρήνα των καρκινικών κυττάρων σε ξενομοσχεύματα όγκου από κύτταρα /LS174T shRNA-Ctr /ΗΤ-29 και shRNA-Ctr είναι ισχυρότερη από ό, τι στον πυρήνα των καρκινικών κυττάρων σε ξενομοσχεύματα όγκου από shRNA-ASCL2 /ΗΤ-29 και shRNA -Ascl2 /LS174T κύτταρα (F)

η

έκφραση ASCL2 στο CD133

+ και CD133

-. ΗΤ 29-κύτταρα

κυτταρομετρία ροής ανάλυση έδειξε CD133 εκφράστηκε στην 58,1% των κυττάρων ΗΤ-29, με 0,1% ΗΤ-29 κύτταρα ανιχνεύθηκαν στον αρνητικό έλεγχο. 98,6% των κυττάρων επιβεβαιώθηκαν να είναι CD133 θετικοί στην κορυφή 10,8% του CD133 θετικών κυττάρων ΗΤ-29 με postsorting επιλογή, 98,1% των κυττάρων επιβεβαιώθηκαν να είναι CD133 αρνητικός στο αμυδρά 7,6% των αρνητικών κυττάρων CD133 ΗΤ-29 (Σχήμα 4Α).

CD133 εκφράζεται σε 58,1% των κυττάρων ΗΤ-29. 98,6% των κυττάρων επιβεβαιώνεται για να είναι CD133 θετικά από μετα-διαλογής επιλογής στην κορυφή 10,8% του CD133

+ ΗΤ-29 κύτταρα, 98,1% των κυττάρων επιβεβαιώνεται για να είναι CD133 αρνητικά από μετα-διαλογής επιλογή στο αμυδρά 7.6 % του CD133

– ΗΤ-29 κύτταρα (Α). πρωτεϊνικό επίπεδο ASCL2 σχέση με το μάρτυρα (β-ακτίνη) σε CD133

+ ΗΤ-29 κύτταρα είναι σημαντικά υψηλότερη από ότι σε CD133

– ΗΤ-29 κύτταρα (*: ρ & lt? 0,05) (Β). Υπάρχει μια προφανής πυρηνική χρώση των ASCL2 στο CD133

+ ΗΤ-29 κύτταρα, αλλά ASCL2 είναι σχεδόν αρνητική CD133

– ΗΤ-29 κύτταρα (C) (Αρχική μεγέθυνση: × 200).

Ο CD133

+ και CD133

– ΗΤ-29 κύτταρα αναλύθηκαν για την έκφραση του ASCL2 χρησιμοποιώντας δοκιμασίες κηλίδος Western. Το επίπεδο της πρωτεΐνης ASCL2 σε σχέση με τον έλεγχο (β-ακτίνη) σε CD133

+ κύτταρα ΗΤ-29 ήταν σημαντικά υψηλότερο από εκείνο στο CD133

– ΗΤ-29 κύτταρα (ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 4Β). Το CD133

+ και CD133

– ΗΤ-29 κύτταρα ανοσοχρώση με το αντίσωμα αντι-ASCL2, επιδεικνύοντας ένα μοτίβο πυρηνική χρώση των ASCL2 σε CD133

+ κύτταρα ΗΤ-29 (το πάνω φύλλο του Σχήματος 4C), και μια αμελητέα χρώση για ASCL2 σε CD133

– ΗΤ-29 κύτταρα (το χαμηλό πλαίσιο του Σχήματος 4C)

το ποσοστό των CD133

+ κύτταρα ΗΤ-29 και «βλαστική ικανότητα« δείκτες ήταν αξιοσημείωτα. μειώνονται μετά ASCL2 νοκ ντάουν

η παρατήρηση ότι η έκφραση ASCL2 ήταν υψηλότερη στο CD133

+ ΗΤ-29 κύτταρα από ό, τι στο CD133

– ΗΤ-29 κύτταρα, οδήγησε στην υπόθεση ότι η πρωτεΐνη ASCL2 είναι σημαντική για την η έκφραση του CD133 σε CD133

+ βλαστικών /προγονικών κυττάρων ΗΤ-29.