Αφηρημένο

(RCC) είναι η πιο θανατηφόρος τύπος καρκίνου του ουροποιογεννητικού λόγω απόκρυφη του έναρξη και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία και ακτινοβολία. Πρόσφατα, συσσωρεύοντας στοιχεία αποδεικνύουν λεκέδες, οι αναστολείς της 3-υδροξυ-3-μεθυλ γλουταρυλ συνενζύμου Α (HMG-CoA), συνδέθηκαν με την μείωση του κινδύνου του καρκίνου. Στην παρούσα μελέτη, με στόχο να διερευνήσει τις πιθανές επιπτώσεις της σιμβαστατίνης σε κύτταρα RCC και των υποκείμενων μηχανισμών με τους οποίους η σιμβαστατίνη ασκείται ενέργειές της. Με τη βιωσιμότητα των κυττάρων, σχηματισμό αποικιών, και τη ροή δοκιμασίες κυτταρομετρίας απόπτωσης, βρήκαμε ότι σιμβαστατίνης ισχυρά κατέστειλαν την κυτταρική ανάπτυξη των Α498 και 786-Ο κύτταρα σε ένα χρόνο- και δοσο εξαρτώμενο τρόπο. Σταθερά, το μοντέλο ξενομοσχεύματος εκτελείται σε γυμνούς ποντικούς επέδειξαν μειωμένη ανάπτυξη του όγκου με τη σιμβαστατίνη. Επιπλέον, παρατηρήθηκαν επίσης οι ανασταλτικές επιδράσεις της σιμβαστατίνης για τη μετανάστευση και την εισβολή στο

vitro

. Μηχανικά, παρουσιάσαμε ότι η σιμβαστατίνη θα μπορούσε να καταστείλει τον πολλαπλασιασμό και την κινητικότητα των κυττάρων RCC μέσω αναστολής της φωσφορυλίωσης της ΑΚΤ, mTOR, και ERK σε ένα χρόνο- και δοσο εξαρτώμενο τρόπο. Περαιτέρω διερεύνηση του υποκείμενου μηχανισμού αποκάλυψε σιμβαστατίνη θα μπορούσε να ασκήσει τα αποτελέσματα κατά του όγκου με την καταστολή της IL-6 που προκαλείται φωσφορυλίωση της JAK2 και STAT3. Συμπερασματικά, αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η σιμβαστατίνη επαγόμενη απόπτωση και αντι-μετάσταση της δραστηριότητα στα κύτταρα RCC συνοδεύτηκαν από αναστολή της ΑΚΤ /mTOR, ERK, και JAK2 μονοπάτια /STAT3, που υπονοούν ότι η σιμβαστατίνη μπορεί να είναι ένας πιθανός θεραπευτικός παράγοντας για την θεραπεία των ασθενών RCC

Παράθεση:. Fang Ζ, Tang Υ, Fang J, Zhou Z, Xing Z, Guo Ζ, et al. (2013) σιμβαστατίνη Αναστέλλει Νεφρική Καρκίνος ανάπτυξη των κυττάρων και μετάσταση μέσω AKT /mTOR, ERK και JAK2 /STAT3 Pathway. PLoS ONE 8 (5): e62823. doi: 10.1371 /journal.pone.0062823

Επιμέλεια: Zhongjun Zhou, Το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 15η Ιανουαρίου του 2013? Αποδεκτές: 26 Μαρτίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 17 Μάη 2013

Copyright: © 2013 Fang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81172435). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

νεφροκυτταρικό καρκίνωμα (RCC) είναι ο πιο κοινός τύπος καρκίνου του νεφρού, που αντιπροσωπεύουν περίπου το 90-95% νεοπλάσματα των νεφρών [1]. Παγκοσμίως, η θνησιμότητα που οφείλεται σε RCC έχει υπερβεί 100.000 ασθενείς κάθε χρόνο [2]. Περίπου 25-30% των ασθενών αναπτύσσουν μεταστάσεις κατά τη διάγνωση του RCC [3], με την επιβίωση ≥5 χρόνου που κυμαίνεται από 5% έως 10%, και η συνολική μέση επιβίωση λιγότερο από ένα έτος [4], [5]. Χειρουργική επέμβαση είναι η κύρια θεραπεία για την τοπική RCC, αλλά μόνη της έχει περιορισμένη όφελος σε ασθενείς με επιθετική νόσο [1]. Επιπλέον, η παραδοσιακή κυτταροτοξική χημειοθεραπεία και η ανοσοθεραπεία έχουν αποτύχει να αποδείξουν όφελος σε ασθενείς στην επικουρική [6]. Τα τελευταία χρόνια παρατηρείται μια ραγδαία ανάπτυξη της μοριακής στοχευμένη θεραπεία [7]. Μεταξύ των πρώτης γραμμής στοχευμένες θεραπείες, sunitinib και temsirolimus είναι η πιο αντιπροσωπευτική, η οποία μπορεί να εμποδίσει το σηματοδοτικό μονοπάτι των πολλαπλών κινασών τυροσίνης (RTK) και στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR) αντίστοιχα [8], [9]. Παρ ‘όλα αυτά, καμία από τις παρεμβάσεις θα πρέπει να θεωρούνται οικονομικά αποδοτικές σε ένα κατώτατο όριο προθυμίας-to-pay 30.000 λίρες ανά ποιότητα ζωής σταθμισμένων έτος [10]. Έτσι, υπάρχει μεγάλη ζήτηση για θεραπείες που μπορεί να παρατείνει την επιβίωση χωρίς μεγάλο βαθμό την αύξηση του κόστους ή διαβρώνουν την ποιότητα της ζωής των ασθενών.

Οι στατίνες (ή 3-υδροξυ-3-μεθυλγλουταρυλ συνενζύμου Α [HMG-CoA] αναγωγάσης αναστολείς) είναι μια ομάδα φαρμάκων, τα οποία είναι δομικά ανάλογα του HMG-CoA που αναστέλλουν τη μετατροπή του HMG-CoA σε μεβαλονικό [11], [12]. Πέρα μείωσης της χοληστερόλης ιδιοτήτων τους, οι στατίνες εμφανίζουν πολυάριθμες πλειοτροπικές επιδράσεις, συμπεριλαμβανομένων των αντι-φλεγμονής και ανοσορύθμιση [13], [14], μείωση του κινδύνου για τις διάφορες μορφές άνοιας [15], και μια μείωση στην πρωτεϊνουρία και η εξέλιξη της νεφρικής νόσου [16], [17]. Από σημασία, οι αναδυόμενες απόδειξη έδειξε ότι οι στατίνες μπορεί να εμφανίσει αντινεοπλασματικών αποτελεσμάτων σε μία ποικιλία καρκινικών κυττάρων [18], συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη [19] – [22], του καρκίνου του μαστού [23] – [25], ηπατικό καρκίνο [26], [ ,,,0],27] και του παχέος εντέρου [28], [29]. Είναι ενθαρρυντικό, μια αναδρομική μελέτη ένθετα-μαρτύρων που εμπλέκονται 500.000 βετεράνων ανέφερε ένα προστατευτικό ρόλο των στατινών κατά την ανάπτυξη του RCC [30]. Ωστόσο, η ακριβής επίδραση της σιμβαστατίνης έναντι κυττάρων RCC και των υποκείμενων μοριακών μηχανισμών δεν έχουν καθιερωθεί.

Στην παρούσα εργασία, τα δεδομένα μας καθορίζει τα ανασταλτικά της ανάπτυξης και προ-αποπτωτικά αποτελέσματα της σιμβαστατίνης σε RCC κύτταρα τόσο σε

vitro

και

vivo

. Εν τω μεταξύ, μπορούμε επίσης να διαπιστώσετε ότι η σιμβαστατίνη μπορεί ισχυρώς να μειώσει την μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων του RCC. Περαιτέρω διερεύνηση των υποκείμενων μηχανισμών δείχνει AKT /mTOR, ERK και JAK2 /SAT3 οδοί παίζουν βασικούς ρόλους σε αυτές τις ενέργειες. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν τις κλινικές επιπτώσεις της σιμβαστατίνης στη θεραπεία των ασθενών με RCC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Το πειραματικό πρωτόκολλο ζώων συμμορφωθεί με τους κανόνες διαχείρισης των ζώων της κινεζικό Υπουργείο Υγείας (έγγραφο αρ 55, 2001) και εγκρίθηκε από Φροντίδας ζώων και Χρήση Επιτροπής του Πανεπιστημίου Shandong. Ελεύθερα παθογόνων BALB /c γυμνά ποντίκια (βάρους 19 ± 2 g, SPF βαθμού, SCXK2011-0012 πιστοποιητικού) των παλαιών 4-5 εβδομάδων αγοράστηκαν από το Τμήμα Εργαστήριο Ζώων Επιστημών του Πανεπιστημίου του Πεκίνου (Πεκίνο, Κίνα). Όλα τα ζώα διατηρήθηκαν στο βασικό Εργαστήριο Καρδιαγγειακής αναδιαμόρφωση και Λειτουργία Έρευνα στην Qilu Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου της Shandong.

Οι κυτταρικές σειρές και τα αντιδραστήρια

κυτταρικές σειρές Ανθρώπινα Α498 και 786-Ο ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ μέσο υψηλής γλυκόζης (HyClone) με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) κάτω από τις συνθήκες 5% CO2 στους 37 ° C. Σιμβαστατίνη (άλας νατρίου, C25H39O6 · Na) αγοράστηκε από την Sigma (St. Louis, ΜΟ, USA), η οποία ενεργοποιείται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ανθρώπινη IL-6 αγοράστηκε από την R &? D Systems (Minneapolis, ΜΝ, USA). Αντισώματα έναντι φωσφο-mTOR, mTOR, φωσφο-ΑΚΤ (Ser473), ΑΚΤ, φωσφο-JAK2, JAK2, φωσφορομολυβδαινικής STAT3 (Tyr705 και Ser727), STAT3, PARP, GAPDH, και HRP-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού και αντι-ποντικού IgG ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ, USA). Αντισώματα έναντι casepas-3, bax, bcl-2 και survivin ελήφθησαν από ανοσο-τρόπο (Newark, DE, USA). Αντισώματα έναντι φωσφο-ΕΚΚ, ERK ελήφθησαν από Anbo (San Francisco, CA, USA).

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με 3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2 υλο) -2, βρωμιούχο 5-διφαινυλτετραζόλιο (ΜΤΤ). Εν συντομία, Α498 (2 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) και 786-O (1 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) σε 100 μΙ μέσου σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων. Μετά από 12 ώρες, το μέσο σε κάθε φρεάτιο αντικαταστάθηκε με το μέσο που περιέχει διάφορες συγκεντρώσεις της σιμβαστατίνης και η πλάκα επωάστηκε για 48, 72 και 96 ώρες. Ακολούθως, 20 μΐ ΜΤΤ (5 mg /ml) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Μετά από επώαση στους 37 ° C για 4 ώρες, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και 200 ​​μΙ DMSO προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Μετά την καθίζηση διαλύθηκε πλήρως, οι τιμές απορρόφησης προσδιορίστηκαν με την Microplate Reader (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Η επίδραση της σιμβαστατίνης στην κυτταρική μορφολογία

Όταν Α498 και 786 -Ο κύτταρα έφτασαν το 70% της συρροής, τα κύτταρα πλύθηκαν με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα (PBS) και μετά εκτέθηκαν σε 16 μΜ σιμβαστατίνη για 48 ώρες. Η μορφολογία των επεξεργασμένων κυττάρων παρατηρήθηκε κάτω από μικροσκόπιο και μικροφωτογραφίες ελήφθησαν με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή της Olympus.

Clone δοκιμασία σχηματισμού

Α498 και 786-Ο κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 6 φρεατίων. Μετά την επώαση όλη τη νύκτα, κάθε φρεάτιο προστέθηκαν σιμβαστατίνης (8 και 16 μΜ) και επωάστηκαν για 24 ώρες. Στη συνέχεια, το μέσο αντικαταστάθηκε με πλήρες μέσο χωρίς σιμβαστατίνη και επωάζονται κάτω από τις συνθήκες 5% CO

2 και 37 ° C για δύο εβδομάδες. Όταν ορατό κλώνοι που σχηματίζονται στις πλάκες, τερματίστηκε η επώαση. Οι κλώνοι πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και βάφτηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες επί 30 λεπτά. Η αποικία που περιέχουν περισσότερα από 50 κύτταρα μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο.

In vitro

μηδέν δοκιμασία

In vitro

δοκιμασία μηδέν διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31]. Α498 και 786-Ο κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων. Μετά από επώαση για 24 ώρες, κάθε φρεάτιο με το χέρι έξυσε με ένα ρύγχος πιπέτας 200 μΐ, πλύθηκαν με PBS τρεις φορές και επωάζονται στους 37 ° C με σιμβαστατίνη (8 και 16 μΜ). Η περιοχή μηδέν φωτογραφήθηκε 18 ώρες αργότερα. Η απόσταση μεταξύ δύο άκρων κυττάρων αναλύθηκαν με λογισμικό ImageJ

εισβολή και τη μετανάστευση δοκιμασία

Το σύστημα transwell (24 φρεάτια, μέγεθος πόρων 8 μm με πολυ-ανθρακικό μεμβράνη?. Corning Costar, Lowell, ΜΑ, USA) επιστρώθηκαν με 2 mg /ml Matrigel (BD Biosciences) χρησιμοποιήθηκε για τις σε

vitro δοκιμασίες

εισβολή. Ένα σύνολο 5 × 10

5 κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 100 μΙ μέσου χωρίς ορό και προστέθηκαν στα άνω θαλάμους. ΫΜΕΜ που περιέχει 20% FBS και η σιμβαστατίνη (8 και 16 μΜ) στη συνέχεια προστέθηκε στον κάτω θάλαμο. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα που παραμένουν στην άνω θαλάμους απομακρύνθηκαν με μια μπατονέτα ενώ τα κύτταρα που συνδέονται με την κάτω επιφάνεια σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και βάφτηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες. Ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν προς την κατώτερη πλευρά μετρήθηκε σε πέντε πεδία τυχαία υπό μικροσκόπιο φωτός. Ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε και αναλύθηκε στατιστικώς.

Για δοκιμασία μετανάστευσης, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε άνω θαλάμους χωρίς επιστρωμένο Matrigel. Το υπόλοιπο του ποσοτικού προσδιορισμού έγινε όπως την δοκιμασία εισβολής. Μετά από 18 ώρες, τα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια μετρήθηκαν επίσης σε πέντε τομείς τυχαία, τότε ο αριθμός των κυττάρων αναλύθηκε στατιστικώς.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Αυτή η δοκιμασία εκτελέστηκε για να ανιχνεύσει κυτταρικής απόπτωσης με Αννεξίνη V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences, San Jose, CA). Εν συντομία, συλλέχθηκαν κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 100 μΐ του ρυθμιστικού πρόσδεσης για να επιτευχθεί μια συγκέντρωση 1 × 10

6 /mL. Στη συνέχεια, 5 μΐ αννεξίνης V-FITC και το ιωδιούχο προπίδιο 5 μΐ (ΡΙ, 20 μg /mL) προστέθηκαν και οι σωλήνες επωάστηκαν για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σε σκοτάδι. Τέλος, ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης (400 μΙ) προστέθηκε σε κάθε σωλήνα αντίδρασης και τα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα αναλύθηκαν από το λογισμικό V2.9 WinMDI (το Ερευνητικό Ινστιτούτο Scripps, San Diego, CA, USA).

παρεμβολή RNA και παροδική επιμόλυνση

Μικρές παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) με στόχο την ανθρώπινη AKT , ERK1 /2 και STAT3 ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ, USA). κύτταρα Α498 (2 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 6 φρεατίων) μορφομετατράπηκαν με ΑΚΤ, ERK1 /2 και STAT3 χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, αντίστοιχα. Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με σιμβαστατίνη (8 μΜ) για ΜΤΤ, μετανάστευση, εισβολή και western αποτύπωση δοκιμασίες.

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA παρουσία αναστολέων πρωτεάσης. Πρωτεΐνη (50 μα) διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF χρησιμοποιώντας μια υγρή συσκευή μεταφοράς (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο γάλα και επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C με τα πρωτεύοντα αντισώματα, ακολουθούμενα από επώαση με τα δευτερεύοντα αντισώματα σημασμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας. Οι ζώνες πρωτεΐνης έγιναν ορατές με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Millipore). επίπεδα πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με χρήση αναγνώστη χημειοφωταύγεια ImageQuant LAS4000 (GE, USA). Τα επίπεδα πρωτεΐνης αναλύθηκαν με λογισμικό ImageJ.

μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου

Εν συντομία, συνολικά 5 × 10

6 κυττάρων Α498 αναμίχθηκαν με Matrigel και στη συνέχεια με ένεση υποδόρια στο πλευρό γυμνών ποντικών. Οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες (10 από κάθε ομάδα). Στη συνέχεια, οι ποντικοί έλαβαν σιμβαστατίνης σε δόση των 5 mg /kg /d από του στόματος καθετηριασμό για 5 εβδομάδες. Οι ποντικοί-μάρτυρες έλαβαν τον ίδιο όγκο φυσιολογικού ορού. Ο όγκος του όγκου και οι ποντικοί βάρος μετρήθηκε κάθε εβδομάδα. Όλα τα ποντίκια θανατώθηκαν 50 ημέρες μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων και όγκων συλλέχθηκαν.

Τερματικό δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης dUTP nick τέλος επισήμανση (TUNEL) δοκιμασίας

ξενομοσχεύματος όγκοι μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη, εγκλεισμένο σε παραφίνη και κατόπιν τεμαχίζεται σε τμήμα 6-μm για δοκιμασία TUNEL για τον εντοπισμό των αποπτωτικών κυττάρων. ΤΟΥΝΕΛ Προσδιορισμός απόπτωσης σετ (Beoytime, Πεκίνο, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση αποπτωτικά κύτταρα. Αυτά τα κύτταρα έγιναν ορατά με φθορίζον κόκκινο κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus).

Στατιστική ανάλυση

δύο tailed t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί στατιστικές διαφορές μεταξύ των τιμών θεραπείας και ελέγχου. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν ρ & lt? 0,05. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων.

Αποτελέσματα

σιμβαστατίνη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του νεφρού κυττάρων

Για να μελετηθούν οι επιδράσεις της σιμβαστατίνης στον πολλαπλασιασμό του RCC κυττάρων, Α498 και 786-O τα κύτταρα εξετέθησαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις σιμβαστατίνης για 48, 72 και 96 h σε δοκιμασία ΜΤΤ. Κατά συνέπεια, η σιμβαστατίνη αναστέλλεται σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των Α498 και 786-Ο κύτταρα σε ένα χρόνο- και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (* Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0,01) (Εικ. 1Α και 1Β). Η βιωσιμότητα των Α498 και 786-Ο κύτταρα μειώθηκε σε 52,6% και 38,8% μετά από αγωγή με σιμβαστατίνη (16 μΜ) για 72 ώρες, με την IC50 του 18.434 ± 1.26 μΜ και 16,311 ± 1,21 μΜ, αντίστοιχα.

Η επίδραση της σιμβαστατίνης στη βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. (Α) κύτταρα Α498 και (Β) 786-O κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σιμβαστατίνη για 48, 72 και 96 h. Σιμβαστατίνη ανέστειλε σημαντικά κυτταρική βιωσιμότητα και των δύο κυτταρικών σειρών σε μια δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. εκτέθηκαν μορφολογικές αλλαγές Α498 και 786-Ο κυττάρων που επάγεται από σιμβαστατίνη. Εικόνες (C) Α498 και 786-Ο κύτταρα πριν και μετά την προσθήκη της σιμβαστατίνης (D) (16 μm) ελήφθησαν σε 48 ώρες. Μετά από αγωγή με σιμβαστατίνη για 48 ώρες, σε αποπτωτικά σώματα (C) Α498 και (D) 786-O κύτταρα μπορούν να παρατηρηθούν με οπτικό μικροσκόπιο. (Ε) Ανασταλτική επίδραση της σιμβαστατίνης στη σχηματισμού αποικίας. (Στ) Ο αριθμός των αποικιών μετρήθηκε κάτω από μικροσκόπιο και αποικία ορίζεται ότι αποτελείται από τουλάχιστον 50 κύτταρα. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν μέσες ± ως SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων και την αντίστοιχη πρότυπο σφάλμα. * P & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.01

Η

Η επίδραση της σιμβαστατίνης στην κυτταρική μορφολογία των νεφρικών κυττάρων καρκίνου

Σύμφωνα με τα προηγούμενα ευρήματα [32], παρατηρήσαμε επίσης δύο φάσεις απόκρισης σε όγκο κύτταρα με τη σιμβαστατίνη. Η πρώιμη φάση είδε μια δραματική αλλαγή στην κυτταρική μορφολογία μέσα στις πρώτες 6 ώρες έως 24 ώρες. Η μεταγενέστερη φάση της απόκρισης σημειώθηκε μεταξύ 24 h έως 72 h, η οποία περιελάμβανε την απώλεια της ακεραιότητας της μεμβράνης πλάσματος. αλλαγή Μορφολογία Α498 και 786-Ο κύτταρα μετά από θεραπεία με σιμβαστατίνη (16 μΜ) για 48 ώρες φαίνεται στο Σχ. 1C και 1D. Όπως εκπροσωπείται, σιμβαστατίνη προκάλεσε κύτταρα να ανακαλέσει τις διαδικασίες τους και να χάσουν την ακεραιότητα της μεμβράνης του πλάσματος. Συρρίκνωση του κεντρικού σώματος κύτταρο γύρω από τους πυρήνες παρατηρήθηκε στη μεμβράνη του πλάσματος, υποδεικνύοντας απόπτωση συμβαίνει σε αυτά τα κύτταρα. Η αποπτωτική σώμα ήταν σαφώς ορατά μετά από αγωγή με σιμβαστατίνη (16 μΜ) για 48 ώρες.

σιμβαστατίνη αναστέλλει το σχηματισμό αποικιών σε νεφρικά καρκινικά κύτταρα

Επίσης εξετάσαμε τις επιδράσεις της σιμβαστατίνης στον σχηματισμό αποικιών κυττάρων του τα κύτταρα RCC. Η μελέτη μας έδειξε ότι η σιμβαστατίνη ανέστειλε το σχηματισμό αποικίας των Α498 και 786-Ο κύτταρα σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 1 Ε). Ο αριθμός των αποικιών μειώθηκε σημαντικά μετά κυττάρων RCC αγωγή με σιμβαστατίνη (8 και 16 μΜ), σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (* Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0,01). (Εικ. 1 F)

σιμβαστατίνη επάγει απόπτωση σε νεφρικά κύτταρα καρκίνου

για να επαληθεύσετε και να ποσοτικοποιηθούν τα αποπτωτικά κύτταρα που προκαλείται από σιμβαστατίνη, χρησιμοποιήσαμε χρώση Annexin V-συζευγμένο Alexa Fluor 488 και ιωδιούχο προπίδιο για να αναλύσει το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων. Τα ποσοστά της πρόωρης και αργότερα αποπτωτικά κύτταρα που εμφανίζεται στην κάτω δεξιά (LR) και άνω δεξιά (UR) τεταρτημόριο των ιστογραμμάτων αντίστοιχα (Σχ. 2Α και 2Β). Το συνολικό ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων (UR + LR) αυξήθηκε από 2,64% σε μη-σιμβαστατίνης κατεργασία Α498 κυττάρων σε 7,82% και 10,15% σε κύτταρα σιμβαστατίνη φάρμακο (8 και 16 μΜ, αντίστοιχα) μετά από 48 ώρες (* Ρ & lt? 0,05, ** P & lt? 0,01) (Σχήμα 2C).. Βρήκαμε το παρόμοιο φαινόμενο σε 786-O κύτταρα, και το συνολικό ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε από 6,32% σε 9,68% και το 17,6% (* Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0,01) (Εικ 2Δ).. Θεραπεία της Α498 και 786-Ο κυττάρων με 8 και 16 μΜ σιμβαστατίνης για 48 ώρες επαγόμενη απόπτωση σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, και ήταν σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Η σημαντική διέγερση απόπτωσης μετά τη σιμβαστατίνη έδειξε αντικαρκινικό αποτέλεσμα του σε κύτταρα RCC.

(Α) Α498 και (Β) 786-O κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σιμβαστατίνη (0, 8 και 16 μΜ) για 48 ώρες και χρωματίστηκαν με FITC-Αηηβχίην και PI. Το ποσοστό των επιζώντων κυττάρων δείχθηκε στο κάτω αριστερό τεταρτημόριο? το ποσοστό των πρώιμο στάδιο της απόπτωσης και όψιμου σταδίου των κυττάρων απόπτωσης παρουσιάστηκαν στην κάτω δεξιά και πάνω δεξιά τεταρτημόρια, αντίστοιχα. (C, D) Ο ποσοτικός προσδιορισμός της απόπτωσης που επάγεται από σιμβαστατίνη υπολογίστηκε. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. * P & lt? 0.05, ** P & lt?. 0.01

Η

Μετανάστευση και την εισβολή αναστέλλονται από σιμβαστατίνης σε καρκινικά κύτταρα νεφρικών

Ο προσδιορισμός μηδέν υλοποιήθηκε για να ανιχνεύσει την επίδραση της σιμβαστατίνης στη μετανάστευση των νεφρικών καρκινικών κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α και 3Β, η μετανάστευση των κυττάρων Α498 ήταν συγκρατούνται από σιμβαστατίνης με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Και το παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε επίσης σε 786-Ο κύτταρα (Σχ. 3C και 3D). Για να δοκιμαστεί περαιτέρω η επίδραση της σιμβαστατίνης στην κυτταρική μετανάστευση και εισβολή, Α498 κύτταρα κατεργασμένα με την αυξανόμενη συγκέντρωση της σιμβαστατίνης εφαρμόσθηκαν στην μετανάστευση transwell και Matrigel-θεωρητικές δοκιμασίες transwell εισβολή. αποτέλεσμα μας έδειξαν ότι η σιμβαστατίνη μπορεί να αναστέλλει σημαντικά τη νεφρική μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή (* Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0,01) (Εικ. 4Α και 4Β) με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Βρήκαμε την ίδια επίδραση της σιμβαστατίνης σε 786-Ο κύτταρα (* P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01). (Εικ. 4C και 4D)

(Α) δοκιμασία Scratch των κυττάρων Α498 που έλαβαν θεραπεία με 0, 8 και 16 μm σιμβαστατίνης. (Β) Η αναστολή της μετανάστευσης μετασχηματίστηκε με το ποσοστό της αρχικής απόστασης μεταξύ των δύο άκρων. Οι σιμβαστατίνη-κατεργασμένα κύτταρα Α498 έδειξε ένα χαμηλότερο ρυθμό κλεισίματος τραύματος από τα κύτταρα ελέγχου. δοκιμασίας (C) Scratch 786-Ο κύτταρα επεξεργασμένα με 0, 8 και 16 μm σιμβαστατίνης. (Δ) Οι σιμβαστατίνη επεξεργασμένο 786-O κύτταρα παρουσίασαν χαμηλότερο ποσοστό κλεισίματος του τραύματος από τα κύτταρα ελέγχου.

Η

(Α) Η θεραπεία με 0, 8 και 16 μm σιμβαστατίνης έδειξε ανέστειλε τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων Α498. (Β) Ο αριθμός των κυττάρων Α498 που μετανάστευσαν με επιτυχία και εισέβαλε μετρήθηκε. (Γ) Η μετανάστευση και εισβολή του 786-O κύτταρα ανεστάλη μετά τη θεραπεία με διαφορετικές συγκεντρώσεις σιμβαστατίνης. (Δ) Η μείωση του αριθμού των 786-Ο κύτταρα έδειξε τη μεγάλη ανασταλτική επίδραση της σιμβαστατίνης σχετικά με την κινητικότητα των κυττάρων. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01

Η

σιμβαστατίνη αναστέλλει την ανάπτυξη των όγκων και να προκαλέσουν τα καρκινικά κύτταρα απόπτωση σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος

Για να καθοριστεί εάν η σιμβαστατίνη αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου σε

vivo

, κύτταρα Α498 (5 × 10

6) ενέθηκαν υποδορίως σε κάθε πλευρά γυμνών ποντικών. αναστολή της ανάπτυξης όγκου ήταν διακριτή σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με σιμβαστατίνη σε δόση 5 mg /kg /d, σε σύγκριση με τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με PBS (* Ρ & lt? 0,05) (Εικ. 5Α, 5Β και 5C). Επιπλέον, δεν υπήρξε σημαντική τοξικότητα σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με σιμβαστατίνη (5 mg /kg /d) αξιολογώντας τα ποντίκια βάρους 2 ομάδων (Εικ. 5D). Για να κατανοηθεί καλύτερα εάν η σιμβαστατίνη θα μπορούσε να επάγει απόπτωση κυττάρων RCC σε

vivo

, τομές παραφίνης των ξενομοσχευμάτων όγκου Α498 από γυμνούς ποντικούς εφαρμόστηκαν στο τερματικό άκρο δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης επισήμανση dUTP nick (TUNEL) δοκιμασίας. Ο αυξημένος αριθμός των TUNEL θετικών κυττάρων έδειξε σαφώς ότι η σιμβαστατίνη θα μπορούσε να προκαλέσει απόπτωση των RCC στο

vivo

(* p & lt? 0,05). (Σχ. 5Ε και 5F)

Εικόνες της εκτομή όγκοι (Α) και τα γυμνά ποντίκια (C) λήφθηκαν από την ομάδα ελέγχου και αγωγής. Τα βέλη δείχνουν προς τις ξενομοσχεύματα. (Β) Γραφήματα αντιπροσωπεύει το μέσο όρο των όγκων του όγκου των ξενομοσχευμάτων Α498 αντιμετωπίζονται με ή χωρίς σιμβαστατίνη. καμπύλη βάρους (D) Φορέας άτριχων ποντικών που φέρουν όγκους Α498 που έλαβαν θεραπεία με σιμβαστατίνη. χρώση (Ε) Εκπρόσωπος ΤΟΥΝΕΛ (κόκκινο φθορισμού) του Α498 νεφρική ξενομοσχευμάτων καρκίνου. (F) Μπαρ γράφημα που δείχνει την ποσοτικοποίηση των κυττάρων θετικών Α498 TUNEL σε xenogafts όγκου. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD, * ρ & lt?. 0.05

Η

Επιδράσεις της σιμβαστατίνης στην έκφραση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την απόπτωση των κυττάρων

Η έκφραση των προ-αποπτωτική πρωτεΐνη Bax έχει συχνά που συνδέονται με την αυξημένη απόπτωση, ενώ η αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 έχει συσχετιστεί με την αναστολή της απόπτωσης σε κύτταρα στόχους [33], [34]. Μετά από κατεργασία με αυξημένες συγκεντρώσεις σιμβαστατίνης για 48 ώρες, ανιχνεύσαμε την έκφραση Bax και Bcl-2 σε κύτταρα RCC. Σε συμφωνία με την αυξημένη απόπτωση σε Α498 και 786-O, το επίπεδο της Βαχ ανυψώθηκε ενώ το επίπεδο της Bcl-2 μειώθηκε (Σχ. 6Α). Ο λόγος του επιπέδου της πρωτεΐνης Bax /Bcl-2 είναι ο καθοριστικός παράγοντας για τη μετάδοση του σήματος απόπτωσης. Με τη σύγκριση της έντασης των ζωνών τους, βρήκαμε την αναλογία του Βαχ /Bcl-2 αυξήθηκε με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (* Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0,01) (σχήμα 6Β).. Με την αυξημένη αναλογία του Βαχ /Bcl-2, το κατάντη casepase-3 για την απόπτωση ενεργοποιήθηκε. Όπως φαίνεται, η έκφραση της survivin και προ-κασπάσης-3 μειώθηκε, ενώ η έκφραση της διασπασμένης κασπάσης-3 και διάσπαση της PARP ανυψώθηκε.

(Α) και Α498 786-Ο κύτταρα αναλύθηκαν για Bcl-2, Βαχ, πλήρους μήκους κασπάσης 3 και διασπασμένη κασπάση 3, πλήρους μήκους PARP και διασπασμένη PARP με κηλίδωση Western ανάλυση με GAPDH ως ένας έλεγχος. (Β) Βαχ /Bcl-2 αναλογίες Α498 και κύτταρα 786-O. Η τιμή πυκνότητας της κάθε ζώνης προσδιορίστηκε με ImageJ. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01. (C-H) Τα επίπεδα του mTOR, ΑΚΤ, ERK και φωσφορυλιωμένη μορφές τους αναλύθηκαν με western αποτύπωση. Η ποσοτικοποίηση της ρ-mTOR /mTOR, ρ-ΑΚΤ /ΑΚΤ και Ρ-ΕΚΚ /ERK προσδιορίστηκε με ανάλυση πυκνομετρίας.

Η

σιμβαστατίνη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση των κυττάρων του RCC μέσω ΑΚΤ /mTOR και ERK μονοπάτι

κηλίδωση Western χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει τον υποκείμενο μηχανισμό με τον οποίο η σιμβαστατίνη ασκείται δράσεις της. mTOR συχνά απορυθμίζεται σε καρκινικά κύτταρα, η οποία είναι υπό έρευνα ως πιθανός στόχος για τους ασθενείς RCC [35]. ΑΚΤ, καθώς η ανάντη του mTOR, παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση και την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων και μπορεί να φωσφορυλιώσει άμεσα mTOR [36]. Ως εκ τούτου, μπορούμε να διερευνήσει την επίδραση της σιμβαστατίνης στη ρύθμιση του μονοπατιού AKT /mTOR. Μετά Α498 και 786-Ο κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σιμβαστατίνη (8 και 16 μΜ) για 24 και 48 ώρες, τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της ΑΚΤ και mTOR ήταν ουσιαστικά καταστέλλεται. Οι αναλογίες του ρ-ΑΚΤ /ΑΚΤ, καθώς και ρ-mTOR /mTOR μειώθηκαν επίσης σε ένα χρόνο- και δοσο-εξαρτώμενες τρόπο (Σχ. 6C, 6D, 6Ε και 6F). ERK, που είναι η συχνότητα με παρεκκλίνοντα ενεργοποιείται σε καρκινικά κύτταρα, προάγει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση [37]. Στη συνέχεια εξετάσαμε τις επιδράσεις της σιμβαστατίνης στην ενεργοποίηση ERK, και βρήκε σιμβαστατίνη ανέστειλε φωσφορυλίωση της ERK σε μια χρονο- και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο και στις δύο Α498 και 786-Ο κύτταρα (Εικ. 6G και 6Η).

Για να διερεύνηση του ρόλου της ΑΚΤ και ERK στον πολλαπλασιασμό και την κινητικότητα των κυττάρων RCC, χρησιμοποιήσαμε siRNA για knockdown ΑΚΤ και την έκφραση του γονιδίου ERK1 /2 σε κύτταρα Α498. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7Α και 7Β, η ανάλυση western αποτύπωση έδειξε μία σημαντική μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης του ΑΚΤ και ERK1 /2 στα κύτταρα επιμολυσμένα με ΑΚΤ και ERK1 /2 campared στα κύτταρα επιμολυσμένα με mock siRNA. Στη συνέχεια, αξιολογήθηκε η σιμβαστατίνη επαγόμενη απόπτωση και αντι-μετάσταση της δραστηριότητα σε κύτταρα Α498 που διαμολυσμένους με ΑΚΤ ή ERK1 /2 siRNA. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι knockdown του ΑΚΤ και /ή 2 κατέστειλε σημαντικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ERK1, τη μετανάστευση και εισβολή (Σχ. 7C, 7D, 7Ε και 7F), υποδεικνύοντας ότι η ΑΚΤ και /2 παιχνίδι ERK1 σημαντικούς ρόλους στον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή σε κύτταρα RCC . Επιπλέον, η σιμβαστατίνη αναστέλλεται σημαντικά τον πολλαπλασιασμό και κινητικότητα σε ΑΚΤ ή ERK1 /2 knockdown κυττάρων, τα οποία δείχνουν ότι η αναστολή της ΑΚΤ ή ERK μονοπάτι σηματοδότησης θα μπορούσε να ενισχύσει το αντικαρκινικό αποτέλεσμα της σιμβαστατίνης.

(Α, Β ) κύτταρα Α498 επιμολύνονται και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με σιμβαστατίνη (8 μΜ), και τα επίπεδα της ΑΚΤ και ERK αναλύθηκαν με κηλίδωση Western με GAPDH ως ένας έλεγχος. Μετά από επιμολυσμένα με ΑΚΤ ή ERK siRNA, κύτταρα Α498 επωάστηκαν απουσία ή παρουσία σιμβαστατίνης (8 μΜ) για 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ (C, D), και μετανάστευση κυττάρων και εισβολή μετρήθηκε με transwell δοκιμασίας (E, F). * Ρ & lt? 0,05 ή ** ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Mock). # P & lt? 0,05 ή ## π & lt? 0,01, σε σύγκριση με τα κύτταρα επιμολυσμένα με ΑΚΤ ή ERK siRNA

Η

σιμβαστατίνη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση των κυττάρων του RCC μέσω της IL-6 που προκαλείται από μονοπάτι JAK2 /STAT3

Προηγουμένως, οι στατίνες έχουν αναφερθεί ότι ασκούν πλειοτροπικές επιδράσεις στην κυτταρική signalings και τις λειτουργίες που εμπλέκονται στη φλεγμονή [38]. Έτσι, εικάζουν εάν η σιμβαστατίνη εξασκεί όγκου κατασταλτική δράση μέσω της διαμόρφωσης της φλεγμονής προαγωγής όγκων. Συσσωρευμένα στοιχεία έχουν αναφερθεί η οδός προφλεγμονώδεις JAK2 /STAT3 διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στη μετάσταση του καρκίνου, την απόπτωση και την αγγειογένεση [39]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η IL-6 είναι μία κυτοκίνη που μπορεί να ενεργοποιήσει σηματοδότηση JAK2 /STAT3 σε καρκινικά κύτταρα, η οποία έχει μια σημαντική επίδραση στην ογκογένεση [40]. Για να αξιολογηθεί το κατά πόσον η IL-6 μπορεί να επάγει τον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων RCC, μπορούμε άνευ ορού κυττάρων Α498 για 12 ώρες και στη συνέχεια να τα καλλιεργήθηκαν απουσία ή παρουσία IL-6 επί 48 ώρες. Στη συνέχεια, η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ, ενώ η ικανότητα των κυττάρων μετάσταση μετρήθηκε με Transwell δοκιμασίας. Βρήκαμε ότι η IL-6 μπορεί να επάγει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση των κυττάρων Α498. Επιπλέον, η IL-6 που προκαλείται από τον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση σε κύτταρα Α498 μπορεί να κατασταλεί από σιμβαστατίνη (8 μΜ) (Σχ. 8Α και 8Β).

(Α, Β) κύτταρα Α498 υποβλήθηκαν σε αγωγή με IL-6 ( 10 ng /ml) για 48 ώρες, και η κυτταρική ζωτικότητα και κινητικότητα εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας την ΜΤΤ και Transwell δοκιμασίας αντίστοιχα. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. * Ρ & lt? 0,05 ή ** ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα χωρίς IL-6. (C-H) σιμβαστατίνη ανέστειλε την φωσφορυλίωση της Jak2, STAT3 (Tyr705) και STAT3 (Ser727) σε νεφρικά καρκινικά κύτταρα σε μια δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Ποσοτική ανάλυση του p-JAK2 /JAK2, π-STAT3 (Tyr705) /STAT3 και p-STAT3 (Ser727) /αναλογία STAT3 ήταν που εμφανίζονται σε κάθε κάτω πίνακα.

Η

Στη συνέχεια, θα διερευνήσει κατά πόσον η σιμβαστατίνη αναστέλλει την φωσφορυλίωση του JAK2 και STAT3 που προκαλείται από IL-6 σε κύτταρα RCC. Α498 και 786-Ο κύτταρα προεπεξεργασμένα με σιμβαστατίνη (8 και 16 μΜ) για 12, 24 και 48 ώρες, και στη συνέχεια αυτά τα κύτταρα επωάστηκαν με IL-6 (10 ng /ml) για 10 λεπτά. Western αναλύσεις κηλίδωσης έδειξαν ότι η σιμβαστατίνη ανέστειλε σημαντικά την IL-6 που προκαλείται φωσφορυλίωση των JAK2 και STAT3 τόσο σε Tyr705 και Ser727 χώρο (Εικ. 8C-8Η).

Για να εκτιμηθεί κατά πόσον STAT3 εμπλέκεται στη σιμβαστατίνη απόπτωση και αντι -metastasis των κυττάρων του RCC. Εφαρμόσαμε siRNA με νοκ ντάουν γονιδιακής έκφρασης STAT3 σε κύτταρα Α498. Μετά από επιμολυσμένα με STAT3 siRNA ή ολιγονουκλεοτίδια ελέγχου, τα κύτταρα Α498 υποβλήθηκαν σε αγωγή με σιμβαστατίνη (8 μΜ) ή τον έλεγχο. Όπως φαίνεται στο Σχ. 9Α, knockdown του STAT3 κατέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των Α498 κυττάρων (Σχ. 9Β και 9C), υποδεικνύοντας ότι STAT3 παίζει σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό και την κινητικότητα σε κύτταρα Α498. Επιπλέον, η συνδυασμένη θεραπεία με σιμβαστατίνη (8 μΜ) και STAT3 siRNA μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων και την κινητικότητα των κυττάρων Α498, σε σύγκριση με τα κύτταρα που κατεργάζονται μόνο με STAT3 siRNA. Συνεπώς, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η IL-6 που προκαλείται από μονοπάτι JAK2 /STAT3 συσχετίστηκε με την επιβίωση και τη μετάσταση στα κύτταρα RCC, και η αναστολή της IL-6 /μονοπάτι που προκαλείται JAK2 STAT3 σηματοδότησης θα μπορούσε να ευαισθητοποιήσει κύτταρα RCC με τη σιμβαστατίνη.

(Α) κύτταρα Α498 επιμολύνονται με STAT3 siRNA και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με σιμβαστατίνη (8 μΜ), και τα επίπεδα της STAT3 αναλύθηκε με κηλίδωση Western με GAPDH ως ένας έλεγχος. (B, C) Μετά από επιμολυσμένα με STAT3 siRNA, κύτταρα Α498 επωάστηκαν απουσία ή παρουσία σιμβαστατίνης (8 μΜ) για 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με ΜΤΤ δοκιμασία, (Β), και μετανάστευση κυττάρων και εισβολή μετρήθηκε με transwell δοκιμασίας (C). * Ρ & lt? 0,05 ή ** ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Mock). # P & lt? 0,05 ή ## π & lt?. 0.01, σε σύγκριση με τα κύτταρα επιμολυσμένα με STAT3 siRNA

Η

σιμβαστατίνη αναστέλλει τη φωσφορυλίωση της ΑΚΤ, ERK και STAT3 σε όγκους ξενομοσχεύματος

Για να προσδιοριστεί εάν η επίδραση της σιμβαστατίνης στην ανάπτυξη ξενομοσχεύματος Α498 όγκων περιλαμβάνει την αναστολή της ΑΚΤ, ERK1 /2 και δραστικότητα STAT3. Western blotting ανάλυση του ΑΚΤ, ERK1 /2 και STAT3 ενεργοποίηση έδειξε ότι τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της ΑΚΤ, ERK1 /2 και STAT3 ήταν ουσιαστικά κατασταλεί σε Α498 ξενομοσχεύματος μετά την αγωγή με σιμβαστατίνη σε

vivo

(Εικ. 10). Συνολικά, η μελέτη μας έδειξε ότι η σιμβαστατίνη θα μπορούσαν να εμποδίσουν την ανάπτυξη νεφρικών όγκων σε

vivo

που αφορούν την αναστολή της ΑΚΤ, η δραστηριότητα ERK1 /2 και STAT3.

κηλίδωση Western ανάλυση για την φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ, ERK και STAT3 επίπεδα σε ξενομόσχευμα όγκου που συλλέγονται από γυμνούς ποντικούς δεχθέντες αγωγή με ή χωρίς σιμβαστατίνη. Ο ποσοτικός προσδιορισμός της ρ-ΑΚΤ /ΑΚΤ, ρ-ΕΚΚ /ERK και αναλογία ρ-STAT3 /STAT3 προσδιορίστηκε με ανάλυση πυκνομετρίας. * Ρ & lt?. 0.05 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Συζήτηση

Οι λεκέδες είναι αναστολείς της HMG-CoA αναγωγάσης, τα οποία χρησιμοποιούνται ευρέως για τη θεραπεία των διαταραχών των λιπιδίων, ειδικά υπερχοληστερολαιμία [41]. Πρόσφατα, πολυάριθμα πειραματικά δεδομένα έχουν δείξει ότι οι στατίνες επιδεικνύουν κατά του όγκου αποτελέσματα έναντι διαφόρων καρκινικών κυττάρων διαφορετικών προελεύσεων [42].