Αφηρημένο

Σκοπός

ταχεία πρόοδος στην κατανόηση της βιολογίας του καρκίνου έχουν μετατραπεί ανάπτυξης φαρμάκων οδηγώντας έτσι στην έγκριση των στοχευμένων θεραπειών και για την ανάπτυξη των μοριακών εξετάσεων για την επιλογή των ασθενών που θα ανταποκρίνονται σε θεραπείες.

KRAS

κατάσταση έχει αναδειχθεί ως αρνητικός παράγοντας πρόβλεψης του κλινικού οφέλους από την αντι-EGFR αντισώματα σε καρκίνο του παχέος εντέρου, και η χρήση αντι-EGFR αντισώματα περιορίστηκε σε

KRAS

όγκους άγριου τύπου. Προκειμένου να διασφαλιστεί η ευρεία πρόσβαση σε όγκο μοριακό προφίλ, το γαλλικό Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (INCA) έχει δημιουργήσει ένα εθνικό δίκτυο 28 περιφερειακών κέντρων μοριακής γενετικής. Παράλληλα, ένα πανεθνικό εξωτερικής αξιολόγησης της ποιότητας για

KRAS

δοκιμές (MOKAECM) χορηγήθηκε για την ανάλυση επαναληψιμότητα και το κόστος.

Μέθοδοι

96 ΟΝΑ κυτταρική σειρά και 24 δείγματα DNA από παραφίνη παραφίνη ιστούς όγκων εστάλησαν σε 40 γαλλικά εργαστήρια. Συνολικά 5448

KRAS

αποτελέσματα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν και μια μελέτη μικρο-κοστολόγηση έγινε σε χώρους για 5 κοινές μεθόδους από μια ανεξάρτητη ομάδα οικονομολόγων υγείας.

Αποτελέσματα

το έργο αυτό παρέχεται μια βασική εικόνα της ακρίβειας και της αξιοπιστίας των

KRAS

ανάλυση σε συνήθεις συνθήκες δοκιμών σε εθνικό επίπεδο. Inter-εργαστηριακές τιμές Κάππα ήταν Το γαλλικό σύστημα δημόσιας ασφάλισης υγείας αποφάσισε να παράσχει στοχευμένη θεραπεία για καρκίνο του παχέος εντέρου, σύμφωνα με τη σύσταση του ΕΜΕΑ. Παράλληλα, η γαλλική κυβέρνηση και το Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (INCA) έχουν δημιουργήσει ένα εθνικό δίκτυο 28 περιφερειακών κέντρα γενετικής μοριακής να εφαρμόσουν ρουτίνα μοριακών δοκιμών για καρκίνο του παχέος εντέρου. Περισσότερα από ένα εργαστήριο μπορεί να σχετίζεται με ένα περιφερειακό κέντρο.

Κάθε εργαστήριο θα αναπτυχθεί

KRAS

δοκιμή σύμφωνα με τις δικές του γνώσεις και τα τοπικά διαθέσιμα μέσα. Ο αριθμός των δοκιμών αυξήθηκε από 1.100 το 2007 σε 10.012 το 2008 και 17.246 το 2009. Από τότε, ο αριθμός των δοκιμών ήταν σταθερή και κάλυψε την αναμενόμενη επίπτωση των ασθενών με μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου στη Γαλλία. Ένα ίδρυση του € 2,5 Μ αφιερώθηκε σε

KRAS

δοκιμές. Αυτή η οργάνωση φάνηκε αποδοτική λαμβάνοντας υπόψη την παγκόσμια αύξηση στο κόστος του φαρμάκου. Ήταν απαραίτητο να αποδείξει ότι

KRAS

αποτελέσματα των δοκιμών ήταν να αναπαραχθούν μεταξύ μοριακής εργαστήρια. Κάθε εργαστήριο χρησιμοποιώντας μια ή περισσότερες μέθοδος γονοτύπησης αξιολογήθηκε από ένα εξωτερικό πρόγραμμα ελέγχου ποιότητας, η πολυκεντρική πρόγραμμα:

KRAS

ανίχνευση Oncogene μετάλλαξη στην θεραπεία του καρκίνου μεταστατικού κολοορθικού με EGFR αντισώματα (MOKAECM). Το έργο MOKAECM συστάθηκε ως εξωτερικός έλεγχος της ποιότητας και των εργαστηρίων ήταν ελεύθεροι να επιλέξουν και να αναπτύξουν τη δική τους μέθοδο για

KRAS

δοκιμές.

Προηγούμενη συγκριτικές μελέτες αξιολογήθηκαν μία τεχνολογία [3]

, [4], [5]. Άλλοι σύγκριση διαφορετικές τεχνικές με μια δοκιμασμένη τεχνολογία ανά περιοχή. Και στις δύο περιπτώσεις, η ευρωστία μιας τεχνολογίας που χρησιμοποιείται με διαφορετικά επίπεδα εμπειρίας δεν μπορεί να αξιολογηθεί [6] [7]. Μια εθνική αξιολόγηση του

KRAS

δοκιμές μετάλλαξης που συνδέουν πραγματικές πρακτικές που συνδέονται με την αξιολόγηση του κόστους δεν έχει γίνει ποτέ μέχρι τώρα.

Ο πρώτος στόχος του έργου MOKAECM ήταν να αξιολογηθεί σε εθνικό επίπεδο, η απόδοση του

KRAS

δοκιμές για κλινική χρήση (ευαισθησία και αναπαραγωγιμότητα). Το δεύτερο ήταν να εκτιμηθεί και να συγκρίνουν τα έξοδα που σχετίζονται με κάθε τεχνολογία. Καθώς η μελέτη αυτή καλύπτει μια εθνική επικράτεια, συμπεριλαμβανομένων όλων των Ίνκας επισημανθεί μοριακή εργαστήρια, μπορούμε να συμπεράνουμε την εθνική απόδοσης για

KRAS

δοκιμή από τη μελέτη MOKAECM.

Υλικά και Μέθοδοι

μελέτη

Αυτή η μελέτη σχεδιάστηκε για να αξιολογήσει

KRAS

του γονότυπου σε 40 γαλλικά εργαστήρια που σχετίζονται με ένα από τα κέντρα γενετικής 28 μοριακή, χρησιμοποιώντας κυτταρική σειρά και φορμόλη σταθερό εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) όγκου δείγματα. Συστήματα ADN ήταν κεντρικά έτοιμοι για τον έλεγχο της ομοιογένειας και τυφλά αποστέλλονται σε όλους τους συμμετέχοντες για

KRAS

δοκιμές με τη χρήση τεχνολογιών καθημερινή πρακτική. Αποτελέσματα φορτώθηκαν και αποθηκεύονται σε μια ειδική βάση δεδομένων και αναλύθηκαν από στατιστικός (GC) από το HEGP νοσοκομείο Κλινική Μονάδα Έρευνας

τηλέφωνα Γραμμές

ATCC κυτταρικές σειρές (H1573: p.G12A? Η358. : p.G12C? Α427: p.G12D? LS123: p.G12S? SW620: p.G12V? Lovo: p.G13D? SW46: Άγρια Τύπος) έχουν ειδικά αγοραστεί για τη μελέτη και

KRAS

G12R, ελήφθη με ρετροϊική μόλυνση 292FT κυττάρων με ένα φορέα που περιέχει το

KRAS

c.34G & gt?. υποκατάσταση C (JCP)

καρκίνο του παχέος εντέρου ιστοί δείγματα

Είκοσι τέσσερις όγκους χαρακτηρίστηκαν και επιλέχθηκαν από ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική εκτομή για καρκίνο του παχέος εντέρου κατά τη Ambroise Pare Νοσοκομείο (Boulogne-Billancourt, France). Η επιτροπή Δεοντολογίας της Ile de France II εγκρίθηκε η μελέτη και οι ασθενείς ενημερώθηκαν και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε σύμφωνα με το γαλλικό δίκαιο. Η μελέτη διεξήχθη στη Γαλλία. Η διάγνωση του ορθοκολικού αδενοκαρκινώματος αξιολογήθηκε από έναν παθολόγο (JFE), οι οποίοι επιλέγονται τα μπλοκ FFPE για τις επόμενες μοριακή ανάλυση. εκχύλιση του DNA έγινε στο Ambroise Pare Νοσοκομείο χρησιμοποιώντας το Qiamp DNA Mini Kit (Qiagen). Οι όγκοι χαρακτηρίζονται για

KRAS

από τρία διαφορετικά εργαστήρια, χρησιμοποιώντας τρεις διαφορετικές τεχνολογίες. επιλεγμένα Τα εργαστήρια αυτά βασίστηκαν στην εμπειρία τους με τις δοκιμές KRAS και στην επικύρωση σπίτι της μεθόδου που χρησιμοποιείται. Επιλεγμένα δείγματα δεν έδειξε καμία διαφορά.

Αξιολόγηση της Κυτταρικότητα

Η αξιολόγηση της κυτταροβρίθειας πραγματοποιήθηκε σε αιματοξυλίνη, ηωσίνη και σαφράν (HES) ολισθαίνει και στα δύο άκρα του μπλοκ FFPE που χρησιμοποιείται για την εκχύλιση του DNA. Διαφάνειες σαρώθηκαν σε Mirax σάρωσης, (Zeiss, Göttingen, Γερμανία). Για να επικυρώσετε το περιεχόμενο των καρκινικών κυττάρων, οι σαρωμένες εικόνες εξετάστηκαν από επτά ανεξάρτητους παθολόγους από διάφορα κέντρα. Όταν παρατηρήθηκαν αποκλίσεις, διαφάνειες εξετάστηκαν και συναίνεση βρέθηκε

μεθοδολογία που χρησιμοποιήθηκε

Διαφορετικές in-house αναπτύχθηκαν μέθοδοι:. Άμεση αλληλουχίας Sanger (n = 15 εργαστήρια), αλληλομόρφων συστήματα καθετήρα διακρίσεων [ ,,,0],8], [9] (n = 13), Snap Shot [10] (n = 7), Pyrosequencing [11] (η-5), HRM ακολουθούμενη από αλληλούχιση [12] (η = 5). Ένα εργαστήριο που χρησιμοποιείται το TheraScreen®: κιτ εμπορική K-RAS Κιτ μετάλλαξης. Πέντε εργαστήρια δοκιμάζονται περισσότερο από μία μέθοδο.

Τριάντα εργαστήρια έφερε ολόκληρο το πρωτόκολλο τους για

KRAS

ανίχνευσης μετάλλαξης, δεν υπήρχε ομοιογένεια πρακτική εκτός από εργαστήρια που χρησιμοποιούν

KRAS

ανιχνευτές TaqMan® (βλέπε Πληροφορίες S1). Οι λεπτομερείς διαδικασίες με εκκινητές θέσεις είναι διαθέσιμες κατόπιν αιτήματος.

Στατιστική Προσέγγιση και Ανάλυση Δεδομένων

ποσοστό σφάλματος ορίστηκε ως το άθροισμα των false positives, ψευδώς αρνητικά, μη ανταποδοτική και δοκιμές λάθος κλήση μετάλλαξη. Για να ταιριάζει με τα κριτήρια που χρησιμοποιούνται από την Ευρωπαϊκή EQA, όλα τα σφάλματα στο πρώτο θεωρείται εξίσου σημαντική, αν και η επίπτωση για τους ασθενείς μπορεί να διαφέρουν. Όλα τα δείγματα που επιλέγονται να μην έχει καμία προεπιλογή ενίσχυσης και κάθε συμμετέχων υπέβαλε ένα αποτέλεσμα που θα θεωρηθεί ως η τελική έκθεση αποστέλλεται στον ογκολόγο. Σε ένα δεύτερο στάδιο θα θεωρείται κλινικά σημαντική λάθη ως ψευδώς θετικά και τα αρνητικά αποτελέσματα θεωρώντας ότι σε περίπτωση αποτυχίας θα πρέπει να ζητηθεί ένα νέο δείγμα, αν και αυτό θα οδηγήσει σε περαιτέρω καθυστέρηση για τον ασθενή.

Ποσοστό επιτυχίας ορίστηκε ως το άθροισμα της πραγματικής θετικά και τα αρνητικά αλήθεια.

Εμείς αξιολογούνται τόσο αναπαραγωγιμότητα (δια- και ενδο-εργαστήριο) και την ακρίβεια διάγνωσης (ευαισθησία και ειδικότητα) των διαφόρων τεχνικών για

KRAS

του γονότυπου. Για κάθε μεταλλαγμένη κυτταρική σειρά, υπήρχαν τέσσερις διαφορετικές αραιώσεις (5%, 20%, 50%, 100%) με τρεις επαναλήψεις ανά αραίωση. ελήφθησαν όλα τα δεδομένα υπόψη.

Για τα έξι τεχνικές, που χρησιμοποιούνται από τουλάχιστον δύο εργαστήρια, εκτιμήθηκε διεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα χρησιμοποιώντας μια γενίκευση των στατιστικών Cohen Kappa για τη μέτρηση της συμφωνίας μεταξύ πολλαπλών συναλλαγματικών [13] . Στην πραγματικότητα, κάθε ένα από τα 96 δείγματα που βαθμολογήθηκε από

m

εργαστήρια – με

m

που κυμαίνονται από 2 έως 15, σύμφωνα με την τεχνική-σε ένα από τα οκτώ αμοιβαία αποκλειόμενες κατηγορίες. Καθώς υπήρχαν αποτυχίες (αδυναμία για την τεχνική για να δώσει μια κατάσταση μετάλλαξης), ο υπολογισμός λαμβάνοντας υπόψη τα δεδομένα που λείπουν. διαστήματα εμπιστοσύνης για την πραγματική γενικευμένη συντελεστή Kappa υπολογίστηκαν με τη μέθοδο της αναδειγματοληψία εκκίνησης, για να λάβουν την αντιστοιχία ενδο-cluster υπόψη [14].

Για την αξιολόγηση των ενδο-εργαστήριο αναπαραγωγιμότητας για μια δεδομένη

KRAS

τεχνική γονοτυπική, υπολογίσαμε μια στατιστική Κάππα για κάθε εργαστήριο, όπως περιγράφηκε παραπάνω, με βάση τα εις τριπλούν δείγματα. Στη συνέχεια, συνοψίζονται τα αποτελέσματα, παρέχοντας μέσο όρο των συντελεστών Κάππα, με το εύρος των συντελεστών Kappa στα εργαστήρια.

ακρίβεια διάγνωσης για την ανίχνευση της κάθε συγκεκριμένης μετάλλαξης (κατηγορηματική κανόνας του χρυσού) εκτιμήθηκε για κάθε τεχνική και κάθε εργαστήριο. Τα υλικά που χρησιμοποιούνται στους δύο γύρους μπορεί να θεωρηθεί ως χρυσός κανόνας υλικά (κυτταρικές σειρές, επικυρωμένη DNAs όγκου). Ήταν δυνατό να αξιολογηθεί μια ευαισθησία και ειδικότητα για κάθε εργαστήριο με κυτταρική σειρά υλικό και δείγματα FFPE DNA. Για κάθε τεχνική, ευαισθησία και ειδικότητα για την ανίχνευση της μετάλλαξης (δυαδική χρυσό πρότυπο) υπολογίστηκαν συνδυάζοντας δεδομένα από όλα τα εργαστήρια. Μια αναλογία εκτιμητή για την διακύμανση του συμπλέγματος δυαδικών δεδομένων που λαμβάνει συσχετίσεις ενδο-cluster υπόψη χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του 95% CI [15]. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του SAS έκδοση λογισμικού 9.1

Οικονομική Αξιολόγηση

Πέντε τεχνολογίες συγκρίθηκαν:. «Άμεση αλληλουχίας», «Snapshot», «Pyrosequencing», «High Resolution τήξης» (HRM ), «TaqMan®». Το κόστος υπολογίστηκε από την άποψη του εργαστηρίου από μελέτες microcosting και του χρόνου κίνησης. Υπολογίσαμε σταθερό και μεταβλητό κόστος που συνδέεται με κάθε μια από τις πέντε τεχνολογίες: εργασία, αναλώσιμα (π.χ. αντιδραστήριο και άλλα αναλώσιμα) και του εξοπλισμού και εξαιρούνται τα γενικά έξοδα. τιμή αγοράς που χρησιμοποιείται για τις προμήθειες και τον εξοπλισμό με ένα 5-ετή γραμμική απόσβεση και εργασίας εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας συνολικής μισθοδοσίας [16].

Κόστος Ανάλυση Ευαισθησίας

Μια ανάλυση ευαισθησίας οδηγήθηκε για να πάρετε μια σειρά του κόστους με την κίνηση διαφόρων παραμέτρων. Οι παράμετροι ήταν σχετικά με τις τιμές (5% και ± 10%) και εργαστηριακές αριθμός πράξεων (Πληροφορίες S1).

Αποτελέσματα

Ανάλυση της Κυτταρικής Γραμμής Αποτελέσματα

Ενενήντα έξι δείγματα κυττάρων-line DNA εστάλησαν σε 40 γαλλικά εργαστήρια, πέντε εργαστήρια χρησιμοποίησαν δύο διαφορετικές μεθόδους ελέγχου που οδηγεί σε 4320 αποτελέσματα. Από τις 6 εργαστήρια δεν θα μπορούσε τεχνικά να ανιχνεύσει την p.G12R μετάλλαξη (Πληροφορίες S1), τα δείγματα p.G12R δεν ελήφθησαν υπόψη και 3780 τα αποτελέσματα τελικά αναλύεται. Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με τις αναμενόμενες γονότυπους. Το συνολικό ποσοστό σφάλματος ήταν 10,6% (399/3780), κυρίως λόγω των ψευδών αρνητικών αποτελεσμάτων (89%, 357/399). Μεταξύ αυτών, 307 δοκιμές αντιστοιχούσαν σε ποσοστό κυττάρων όγκου από 5% ενώ το 50 εμπλέκονται δείγματα με υψηλότερες αναλογίες όγκου των κυττάρων. Τα 42 υπόλοιπα λάθη ήταν αναλυτικής αποτυχία (n = 25? 6%), ψευδώς θετικά (n = 2? 0,5%) και το λάθος μετάλλαξη (n = 15? 4%). Αλληλουχίας που παράγονται όλα τα ψευδώς θετικά αποτελέσματα και έδειξαν μια ψευδώς θετικό ποσοστό 0,4% (2/540). Λάθος κλήσεις μετάλλαξη σημειώθηκαν για αλληλουχίας (0,8%, 11/1260) και το στιγμιότυπο (0,7%, 4/588).

Για τεχνικές εκτελούνται κατά περισσότερο από 2 εργαστήρια, ευαισθησία κυμάνθηκε από 76% έως 96% και ειδικότητα από 95% έως 100% (Πίνακας 1). Όσον αφορά τα δείγματα όγκου 5%, η χαμηλότερη ευαισθησία βρέθηκε για αλληλούχιση και HRM με συνολικό ποσοστό ανίχνευσης της τάξεως του 40% σε σύγκριση με το 89,7% βρέθηκαν για Pyrosequencing. Ένα τεχνικό ποσοστό αποτυχίας του 1,6% παρατηρήθηκε για Taqman ανιχνευτές οφείλεται σε μια μη-ερμηνεία από 3 εργαστήρια των εις τριπλούν δειγμάτων που αντιστοιχούν σε p.G12V (SW480 100%) ομόζυγη δείγματα. Ενδο-εργαστήριο και διεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα ήταν σχεδόν τέλεια συμφωνίες (& gt? 0.8 για όλες τις μεθόδους). Και δεν εξαρτώνται από τον τύπο μετάλλαξης (Πίνακας 2)

Η

Ανάλυση του όγκου αποτελέσματα των δειγμάτων

Όσον αφορά ιστούς FFPE, 1128 δεδομένα παρήχθησαν και αναλύθηκαν από 24 μεμονωμένα δείγματα όγκου (n = 47 μεθόδους, 40 διαφορετικά εργαστήρια). Το συνολικό ποσοστό σφάλματος ήταν 1,8% (20/1128) με 1 ψευδώς θετικά, 7 ψευδώς αρνητικά, 9 αναλυτική αποτυχίες και 3 λάθος κλήσεις μετάλλαξη. Μεμονωμένα δείγματα όγκων σωστές κλήσεις κυμαίνεται από 100% έως 76,6%, πράγματι, όλα τα εργαστήρια σωστά ο γονότυπος 16/24 δείγματα και ένα δείγμα (α

KRAS

δείγμα p.G12A) δημιουργούνται λάθη από 11 εργαστήρια. Τα δείγματα 6 άγριου τύπου ήταν σωστά γονότυπο εκτός από μία περίπτωση ήταν ένα ψευδώς θετικό αναφέρθηκε από τις διακρίσεις αλληλομόρφων qPCR μέθοδος που βασίζεται με ένα blocker PNA. Τριάντα δύο από 47 σύνολα αποτελεσμάτων (εργαστήριο /μέθοδος) δημιουργείται 0 σφάλματος (68%), 13 γίνονται 1 (28%), 2 γίνονται 2 και ένα που γίνεται 3 (Πίνακας 3). Τα τρία λάθη ήταν 3 αναλυτική αποτυχίες χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία Pyrosequencing. Το εργαστήριο αυτό χρησιμοποιείται επίσης άμεση αλληλούχιση με ένα ψευδώς αρνητικό αποτέλεσμα. Αν κλινικά σχετικές μεταβολές (ψευδώς θετικές και αρνητικές) και εάν τα καλύτερα αποτελέσματα λαμβάνονται υπόψη κατά περισσότερες από μία μέθοδος δοκιμάστηκε, το 82,5% των εργαστηρίων δεν υπέπεσε σε πλάνη και το ποσοστό επιτυχίας κυμάνθηκε από 100 έως 91,6. Τα υπόλοιπα λάθη ήταν 6 ψευδώς αρνητικά και ένα ψευδώς θετικό σε 7 εργαστήρια. (Πίνακας S1).

Η

Το κόστος ανά τεμάχιο

Microcosting αξιολογήθηκε στην ιστοσελίδα (n = 10 εργαστήρια) από μια ανεξάρτητη ομάδα οικονομολόγων υγείας. Οι δαπάνες που αναγράφονται ανά είδος ανά δοκιμή και το συνολικό ανά δοκιμή (Πίνακας 4). Πρώτα κόστους εργασίας κυμάνθηκε από € 3,7 (TaqMan) σε € 11.4 (snapshot) ανά δοκιμή λόγω της διαφορετικής διάρκειας χειρισμό ανά δείγμα από 7,2 (TaqMan) στα 22,1 λεπτά (snapshot). Μικρές διαφορές μεταξύ των εργαστηρίων που χρησιμοποιούν πανομοιότυπα τεχνολογία παρατηρήθηκαν οφείλονται σε ελαφρά διαφοροποίηση στα πρωτόκολλα και με διαφορετικές συσκευές που επηρεάζουν το κόστος της αποδοτικότητας και της εργασίας. Επιπλέον, ο αριθμός των δειγμάτων που τρέχουν ανά παρτίδα προκαλεί επίσης διακύμανση του κόστους εργασίας. Δεύτερον, το κόστος του εξοπλισμού ανά δοκιμή κυμαίνονταν από € 1,0 έως € 9,7 ανάλογα με τα εργαστήρια και τις τεχνολογίες. Απευθείας αλληλούχιση ήταν το πιο ακριβό τεχνολογία με περισσότερα από 7 € ανά δοκιμή. Pyrosequencing, HRM και TaqMan ήταν οι λιγότερο δαπανηρές τεχνολογίες με λιγότερο από 2 € ανά δοκιμή. Sequencer, Pyrosequencer και qPCR θερμοκυκλωτής παράγεται το 84% του κόστους του εξοπλισμού. το κόστος του μηχανήματος ανά δοκιμή ποικίλλουν ανάλογα με τη διάρκεια των γύρων, οι τιμές αγοράς και το μέγιστο αριθμό δειγμάτων ανά παρτίδα.

Η

Τρίτον, αναλώσιμα βραβεία ανά δοκιμή κυμαίνονταν από € 5,6 έως € 19,0. Αριθμός επαναλήψεων, το είδος των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται, τις τεχνικές διαδικασίες και διαπραγματεύσεις για τις τιμές εξηγούνται οι περισσότερες από τις διαφορές που παρατηρούνται από εργαστήρια που χρησιμοποιούν την ίδια τεχνολογία. Αυτές οι διαφορές ήταν ιδιαίτερα σημαντικό για την τεχνική στιγμιότυπο. Ένα στιγμιότυπο εργαστήριο αναπαραχθεί πειράματα και χρησιμοποιούνται πιο ακριβά αντιδραστήρια, που οδηγεί σε τριπλάσιο αναλώσιμα κόστος σε σύγκριση με το δεύτερο εργαστήριο που μελετήθηκαν.

Συνολικό κόστος

Το συνολικό κόστος ανά δοκιμή κυμαίνονταν από € 10,6 σε € 34,8 ( Πίνακας 4). Επιπλέον, το συνολικό κόστος για HRM πρέπει να ληφθούν υπόψη τα έξοδα αλληλουχίας υπόψη. Περίπου τα δύο τρίτα των δειγμάτων ανιχνεύθηκαν ως άγριου τύπου γονίδια KRAS από HRM και δεν απαιτούν αλληλουχίας. Παρατηρήσαμε μια αύξηση του κόστους των υστέρων «HRM» αλληλουχίας από € 7 έως € 13 σε σχέση με το άμεσο κόστος αλληλουχίας παρά παρόμοιες τεχνολογίες. Ως εκ τούτου, η παγκόσμια συνολικό κόστος ανά δοκιμή HRM κυμάνθηκαν από € 27,0 σε € 28,0.

Κόστος Ανάλυση Ευαισθησίας

Η ανάλυση ευαισθησίας επιβεβαίωσε ότι TaqMan ήταν λιγότερο ακριβά από ό, τι άλλες τεχνολογίες (Σχήμα 1). Το εκτιμώμενο κόστος για TaqMan ήταν βέλτιστη κατά περίπτωση βάση. Εντός των χειρότερες συνθήκες (πέντε δείγματα ανά παρτίδα και 10% των τιμών markup) τιμές TaqMan ανά δοκιμή κυμαίνονταν από € 15,7 σε € 20.1. κόστος Pyrosequencing ανά δοκιμή ήταν χαμηλότερες από 20,1 € εάν τουλάχιστον 15 δείγματα ανά παρτίδα έτρεξαν.

Bleu διαμάντια σπάνια περίπτωση το κόστος βάσης.

Η

Συζήτηση

Η χρήση αντι-EGFR μονοκλωνικά αντισώματα περιορίζεται στο 60 με 70% KRAS άγριου τύπου μεταστατικό ορθοκολικό όγκους, κάνοντας κατάλληλη ταυτοποίηση των μεταλλάξεων KRAS ένα σημείο κλειδί για την κλινική πρακτική [17], [18]. Επιπλέον, περιορίζοντας τη χρήση των αναστολέων EGFR σε ασθενείς με άγριου τύπου KRAS μπορεί να είναι μια πιθανή λύση για την εξοικονόμηση κόστους [19]. Για να εξασφαλιστεί η προσβασιμότητα δοκιμές, η Inca έχει χορηγήσει 28 περιφερειακά κέντρα μοριακής γενετικής έως 2,5 Μ € [20]. Ο στόχος του δικτύου σε εθνικό επίπεδο ποιοτικού ελέγχου που ονομάζεται MOKAECM, υποστηριζόμενη από την Inca, ήταν να αξιολογήσει τα διάφορα in-house αναπτύξει μεθόδους με τις μοριακές εργαστήρια για τον έλεγχο του KRAS σε συνήθεις συνθήκες. Εδώ, παρόμοιες κυτταρικές σειρές (4296) και FFPE δείγματα όγκων συστήματα ADN (1152) εστάλησαν των διαφόρων συμμετεχόντων και 5448 τα αποτελέσματα του KRAS του γονότυπου υποβλήθηκαν και αναλύθηκαν. Όσον αφορά τη δοκιμή κυτταρικές σειρές, ο λόγος σφάλματος ήταν 10,6%, η αποκοπή ανίχνευση κυμαινόταν από 5 έως 20% και 86% των ψευδών αρνητικών σχετίζονταν με την αραίωση 5%. 1152 FFPE αποτελέσματα των δειγμάτων αναλύθηκαν σε αυτή τη μελέτη, το 68% των συνόλων δοκιμής (μέθοδος /εργαστήρια) που έχουν αναγνωριστεί σωστά το μεταλλάξεων κατάσταση KRAS σε όλα τα δείγματα FFPE. Αυτό το αποτέλεσμα είναι συγκρίσιμο με το σκορ αναφερθεί στο ευρωπαϊκό σύστημα KRAS Eaq (70%) [21]. Πρόσφατα, για την ανάλυση μετάλλαξη KRAS στον καρκίνο του παχέος εντέρου, αυθαίρετα όρια για τη σωστή

KRAS

ταυτοποίηση μετάλλαξης ορίστηκε στο 97% [22]. Λαμβάνοντας υπόψη τα καλύτερα αποτελέσματα για τα εργαστήρια δοκιμών περισσότερες από μία μέθοδο, το μέσο ποσοστό επιτυχίας για τα δείγματα FFPE ήταν 98,5 και κυμάνθηκε 100 έως 91,6% (Πληροφορίες S1). Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με τα αποτελέσματα μιας μελέτης έτρεξε σε 10 εργαστήρια στην Ολλανδία [23]. Επιπλέον, κατέστη δυνατό να επιτευχθεί μια συνολική βαθμολογία εκδήλωση δοκιμή τουλάχιστον 80% ορίστηκε ικανοποιητική κατά τη δοκιμή μεγαλύτερο αριθμό κρουσμάτων στην «Κλινική Πράξη Εργαστήριο Βελτίωσης» του 1988. Λαμβάνοντας υπόψη τα αποτελέσματα από τις δύο δοκιμές θέτει το 96% των Γάλλων εργαστηρίων είχε μια ικανοποιητική βαθμολογία άνω του 80% που δείχνει σαφώς την ποιότητα του ελέγχου KRAS στη Γαλλία παρά το μεγάλο πίνακα μεθόδων. Επιπλέον, μεταξύ των 1.152 όγκους που δοκιμάστηκαν, μόνο το 20 λάθη έχουν αναφερθεί. Αυτό το επίπεδο σφάλματος είναι ικανοποιητική.

Από την εθνική προοπτική, σε 1152 δοκιμές όγκων σε αυτή τη μελέτη, 20 λάθη (0.017 CI 95% [0,01 – 0,027]) έχουν αναφερθεί με 11 από αυτούς που σχετίζονται με ένα μόνο δείγμα . Ως εκ τούτου, το διορθωμένο ποσοστό σφάλματος ήταν 0,7% CI 95% [0.03% -0.13%] ανά δοκιμή και ανά όγκο. Μια παρέκταση δείχνει ότι στη Γαλλία, από τις 18.000 όγκων αναλύονται κάθε χρόνο, 54-234 όγκων θα μπορούσε να misgenotyped.

λάθη Γονοτυπικές μπορεί να προκληθεί από διάφορα ζητήματα, όπως το είδος της σταθεροποιητικό, τη διαδικασία διατήρησης, την αξιολόγηση της η περιεκτικότητα καρκινικών κυττάρων και, τέλος, οι επιδόσεις της μεθόδου που χρησιμοποιήθηκε για τη δοκιμή. Εδώ, εξαγωγή DNA έγινε σε κεντρικό επίπεδο και το περιεχόμενο των καρκινικών κυττάρων ελέγχθηκε από 7 ανεξάρτητους παθολόγους, επομένως, μόνο

KRAS

μέθοδοι προσδιορισμού του γονότυπου συγκρίθηκαν. Όλα τα επιλεγμένα δείγματα είχαν μια πρώτη επικύρωση της κατάστασης KRAS τους διενεργείται από τρία εργαστήρια αναφοράς χρησιμοποιώντας τρεις διαφορετικές μεθόδους. Πολλές διαφορετικές τεχνικές, συμπεριλαμβανομένων των εμπορικά διαθέσιμων κιτ, έχουν αναπτυχθεί και δοκιμαστεί, αλλά η απουσία μιας αναγνωρισμένης μεθόδου αναφοράς που κάνει την αξιολόγηση των νέων τεχνολογιών είναι ένα δύσκολο έργο.

δοκιμές γραμμή κυττάρων μπορεί να μην αντικατοπτρίζει τις πρακτικές ρουτίνας, αλλά χρησιμοποιήθηκε ως μια δοκιμή επικύρωσης σε βέλτιστες συνθήκες για τη σύγκριση της ευαισθησίας και της ειδικότητας μεταξύ των διαφόρων τεχνολογιών. Για δείγματα με περιεκτικότητα σε κυτταρική σειρά όγκου πάνω από 20%, που μπορεί να θεωρηθεί κλινικά σχετική, τα αποτελέσματα των αναλύσεων έδειξαν σχεδόν τέλεια συμφωνίες. Για δείγματα κάτω από 20%, τα αποτελέσματα ήταν πιο ετερογενής, ειδικά για άμεση αλληλούχιση. Σύμφωνα με την εμπειρία μας, HRM prescreening δεν διάσωση δείγματα χαμηλής περιεκτικότητας σε όγκο. Η χαμηλότερη ευαισθησία των μεθόδων προσδιορισμού αλληλουχίας σε σύγκριση με τους άλλους δεν ήταν μια έκπληξη [24], [25], [26], αλλά τα αποτελέσματά μας επισημαίνουν επίσης ότι η απόδοση μπορεί να εξαρτάται από τη μέθοδο βελτιστοποίησης και το επίπεδο εμπειρογνωμοσύνης. Πράγματι 7 εργαστήρια που χρησιμοποιούν αλληλουχίας ή HRM-αλληλουχίας είχε χαμηλό σκορ σφάλμα (& lt? 10%) στη σειρά κυτταρική γραμμή, συμπεριλαμβανομένων 5% δειγμάτων κυτταρική σειρά και χωρίς λάθος στη σειρά όγκου. Ευαισθησία φαίνεται να σχετίζονται με ένα ζευγάρι – μεθοδολογία /εργαστήριο-εμπειρία – και όχι αυστηρά με μια μέθοδο, ως εκ τούτου, την επικύρωση και αποκοπής ανίχνευσης πρέπει να εκτιμάται σε κάθε εργαστήριο. Όταν οι χαμηλές μεθόδους ευαισθησία που χρησιμοποιούνται για προσδιορισμό του γονότυπου, macrodissection αποκοπής πρέπει να επιλέγονται κατάλληλα και σαφή preanalytic συστάσεις πρέπει να δοθεί σε παθολόγους πριν από την εκχύλιση του DNA. Ανεξάρτητα από τη μέθοδο ανίχνευσης, ο τύπος μετάλλαξης θα μπορούσαν να επηρεάσουν την ευαισθησία. Το ποσοστό των σφαλμάτων ήταν περίπου 3% με την p.G12V σε περισσότερο από 20% με p.G12S και p.G12A. Αλληλόμορφες ποσοτικοποίηση των ΟΝΑ 7 κυτταρική σειρά χρησιμοποιώντας Pyrosequencing δεν έδωσε καμία σχετική εξήγηση για την μειωμένη ευαισθησία που παρατηρείται για ορισμένες μεταλλάξεις, και θερμοδυναμική συνέπειες στη συμπεριφορά τήξης του DNA θα μπορούσε, εν μέρει, να εξηγήσει αυτή την παρατήρηση. Στη σειρά FFPE το ποσοστό σφάλματος ήταν 20/1128 (1,7%) έναντι 399/3780 (10,6%) σε κυτταρικές σειρές, για την οποία τα λάθη οφείλονταν κυρίως στο 5% των καρκινικών κυττάρων ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. Το ποσοστό σφάλματος ήταν 2,6% για τις κυτταρικές σειρές σε παρόμοιες συνθήκες περιεχόμενο όγκου (ψευδώς αρνητικά λόγω 5% δείγματα εξαιρούνται) γεγονός που υποδηλώνει ότι στερέωση του ιστού δεν ήταν εμπόδιο για να

KRAS

δοκιμές. Ωστόσο, η σταθεροποίηση θα μπορούσε κάπως να επηρεάσουν τα επίπεδα αποτυχίας: 0,8% (9/1128) σε δείγματα FFPE έναντι 0,6% στην κυτταρική σειρά ΟΝΑ (25/3780). Η χρήση των μεθόδων που βασίζονται στην ενίσχυση των μικρών αμπλικονίων θα μπορούσε να είναι μια δυνατότητα για να μειώσει το επίπεδο των μη ανταποδοτική αποτελέσματα [27]. Σε αυτή τη μελέτη, οι μέθοδοι που βασίζονται στις διακρίσεις αλληλομόρφων βασίζονται σε μικρά θραύσματα ενίσχυση και σε πραγματικό χρόνο PCR έδειξε καμία βλάβη κατά έως και 4% για τις μεθόδους άμεση αλληλούχιση. Τέλος, στη σειρά FFPE, 14% των σφαλμάτων βρέθηκαν σε ένα μόνο δείγμα για το οποίο το περιεχόμενο των καρκινικών κυττάρων ήταν 50% μετά από εξέταση HES αλλά την ποσοτικοποίηση των μεταλλαγμένα αλληλόμορφα από Pyrosequencing πρότεινε ότι τα μεταλλαγμένα κύτταρα θα μπορούσαν να αντιπροσωπεύουν μόνο το 20% του συνόλου. Αυτή η δύναμη εν μέρει να εξηγήσει τις διαφορές που παρατηρήθηκαν για αυτό το δείγμα, αλλά επίσης υποδηλώνει ότι οι γενετικές παραλλαγές δεν είναι εξίσου ανιχνεύονται. Ένα FFPE ψευδώς θετικό δείγμα ταυτοποιήθηκε με αλληλόμορφο ειδική ενίσχυση με έναν αποκλειστή ΡΝΑ. Δεν επικυρώθηκε από άλλο εργαστήριο, χρησιμοποιώντας παρόμοια τεχνολογία και συνεπώς θεωρήθηκε ως ένα ψευδώς θετικό. Επιπλέον, η κλινική αξία των μεταλλαγμένων υπο-κλώνος μένει να αποδειχθεί [28], [29], [30], [31], [32].

Εκτιμήσεις Κόστους Περιορισμοί

Αυτή η μεθοδολογία της εκτίμησης του κόστους ήταν το ένα χέρι, αφού η ίδια ανεξάρτητη ομάδα αξιολόγησε όλη την τεχνολογία απευθείας στα εργαστήρια. Πέντε τεχνολογίες μελετήθηκαν με microcosting σε δέκα εργαστήρια που εκπροσωπούν το ένα τρίτο του συνόλου των γαλλικών «πλατφόρμες», η οποία πραγματοποιείται το 25% του συνόλου

KRAS

δοκιμές μεταλλάξεις για τον ορθοκολικό ασθενείς με μεταστατικό στη Γαλλία το 2009. Παρά το γεγονός ότι, το επίπεδο των αποδεικτικών στοιχείων θα μπορούσε να είναι καλύτερο, δεδομένου ότι βασίστηκε σε 2 παρατηρήσεις ανά τεχνολογία, αλληλομόρφων των διακρίσεων με τη χρήση ανιχνευτών TaqMan ήταν περίπου δύο ή τρεις φορές λιγότερο ακριβά από ό, τι οποιαδήποτε άλλη τεχνολογία που μελετήθηκαν. διακύμανση του κόστους μέσα σε μια τεχνολογία ή μεταξύ των τεχνολογιών θα μπορούσε να οφείλεται σε διαφορετικές διαδικασίες. Πράγματι, οι μέθοδοι δεν ήταν απολύτως όμοια, ακόμα και σε εργαστήρια που χρησιμοποιούν παρόμοια τεχνολογία, και διάφορους βαθμούς της βελτιστοποίησης έχουν αναφερθεί. Ένα παράδειγμα ήταν η διαχείριση της διαδικασίας δοκιμής – ο αριθμός των θετικών και αρνητικών μαρτύρων, ο αριθμός των επαναλήψεων και ο αριθμός των προστιθέμενων σταδίων στη διαδικασία όπως η μετανάστευση πήγματος των προϊόντων PCR. Αυτά τα επιπλέον έξοδα αποτιμήθηκαν. Σχετικά με τον εξοπλισμό του κόστους μια υπόθεση κορεσμού ορίστηκε σε ποσοστό οκτώ ώρες εργασίας την ημέρα κατά τη διάρκεια των πέντε ετών. Αυτό δεν θα μπορούσε να είναι η πραγματική κατάσταση για μερικά εργαστήρια και το εκτιμώμενο κόστος υποτιμάται πραγματικό κόστος για τα εργαστήρια. Επιπλέον, σύμφωνα με την υπόθεση του κορεσμού του εξοπλισμού, υποτίθεται ότι το προσδόκιμο ζωής των μηχανών ήταν παρόμοια για οποιοδήποτε είδος μηχανής, δεν υπήρχαν διαθέσιμες πληροφορίες σχετικά με την πραγματική διάρκεια ζωής των μηχανών. Συνολικά microcosting δεδομένα υποδηλώνουν ότι η «in-house» το κόστος των τεχνολογιών ήταν πολύ χαμηλότερες από τις εμπορικές εξαρτήσεις, με εξαίρεση τον εξοπλισμό και το κόστος εργασίας.

Συμπέρασμα

Ο γαλλικός πληθυσμός ήταν 65.027.000 κατοίκων το 2011. Είκοσι οκτώ περιφερειακά κέντρα γενετικής μοριακής που καλύπτει όλα τα εδάφη και το συντονισμό των 46 εργαστήρια συμμετέχουν τώρα στην ανάλυση σε 16.000

KRAS

δοκιμές για μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου κάθε χρόνο. Το σύνολο του δικτύου σε εθνικό επίπεδο διαχειρίζεται η INCA. Αυτό το πρόγραμμα ποιοτικού ελέγχου ήταν η πρώτη σε εθνικό επίπεδο εμπειρίας με 120 παρόμοια δείγματα που αναλύθηκαν από 40 διαφορετικά εργαστήρια. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι, όταν τα κλινικά σχετικές αποτελέσματα θεωρούνται 82,5% των εργαστηρίων εντοπιστεί σωστά το

KRAS

κατάστασης μεταλλάξεων σε όλα τα δείγματα FFPE. Το έργο αυτό δείχνει επίσης ότι, ενώ όλες οι μέθοδοι είναι κατάλληλες για

KRAS

δοκιμές με μέσο κόστος € 35 ανά δοκιμή εξαιρουμένων των προαναλυτικές βήματα, υπάρχουν διαφορές όσον αφορά την ευαισθησία και την ευρωστία. Η επιλογή της μεθόδου είναι πιθανό να εξαρτώνται από τον εξοπλισμό και τεχνική εμπειρογνωμοσύνη διατίθενται σε τοπικό επίπεδο. Αυτό το ποιοτικό πρόγραμμα παρείχε μια βασική εικόνα του

KRAS

δοκιμές στη Γαλλία. Έδειξε ότι είναι δυνατό, με μειωμένο κόστος για να ορίσετε ένα πανεθνικό πρόγραμμα, εντόπισε σφάλματα στις διαδικασίες ελέγχου για ορισμένα εργαστήρια υπογραμμίζοντας τη σημασία της βελτιστοποίησης, in-house διαδικασίες επικύρωσης και ελέγχου της ποιότητας, χρησιμοποιώντας ένα μεγάλο πίνακα των μεταλλάξεων.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πληροφορίες S1.

Λεπτομέρειες του υλικού και μεθόδων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0068945.s001

(DOC)

Πίνακα S1.

Εμφανίζει τις πληροφορίες λεπτομερή γονότυπους για δείγματα FFPE από το εργαστήριο (Ν = 40). Το καλύτερο

KRAS

αποτελέσματα κρατήθηκαν για εργαστηριακή χρήση περισσότερων από μία τεχνολογία

doi:. 10.1371 /journal.pone.0068945.s002

(XLSX)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε γαλλικό Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου και το ΚΒΕΚ 2008, Audrey Didelot, Claire Mulot, Karine Pallier για οικονομική και τεχνική υποστήριξή τους. Ευχαριστούμε τους παθολόγους που παρέχουν κριτική για τις 24 HES διαφάνειες για το ποσοστό των κυττάρων του όγκου αξιολόγηση Frédéric Bibeau (Κέντρο Val d’Aurelle, Μονπελιέ), Pascale Cervera (Νοσοκομείο St-Antoine, Παρίσι), Françoise Piard (CHU de Dijon), Jean-Christophe Sabourin (CHU de Rouen), Jannick Selves (Νοσοκομείο Purpan, Τουλούζη) και Frédérique Penault-Llorca (Κέντρο Αριστείας Jean Perrin, Clermont-Ferrand)

Τα μέλη της συνεργατικής ομάδας MOKAECM είναι:. Marie-Pierre Gaub? Isabelle Soubeyran? Hugues Begueret? Frédérique Penault-Llorca? Agnès Hardouin? Françoise Piard? Jean Mosser? Cédric Le Marechal? Chantal Delvincourt? Christine Clavel? Christophe Φεράν? Olivier Schischmanoff? Nathalie Θέου-Anton? Antoinette Lemoine-Corbel? Lascols Olivier? Hugues De Το?