Αφηρημένο

φυτοχημικά είναι μια πλούσια πηγή των παραγόντων χημειοπροφύλαξη, αλλά τα αποτελέσματά τους για τη διαμόρφωση της οδού σηματοδότησης /β-κατενίνης Wnt έχουν παραμείνει σε μεγάλο βαθμό μη διερευνώνται. Ανωμάλως ενεργοποιούνται σηματοδότηση Wnt μπορεί να οδηγήσει στην ανώμαλη σταθεροποίηση του β-κατενίνης, ένα βασικό βήμα αιτιολογικός σε ένα ευρύ φάσμα καρκίνων. Εδώ αναφέρουμε τη διαμόρφωση του λιθίου χλωριούχο ενεργοποιημένης σηματοδότηση κανονικών Wnt /β-κατενίνης με φυτοχημικά που έχουν αντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδη ή χημειοπροληπτική ιδιότητες. Οι ενώσεις πρώτα υποβλήθηκαν σε διαλογή με έναν καρκίνο του τραχήλου της μήτρας που προέρχεται σταθερό Wnt ρεπόρτερ σηματοδότηση HeLa κυτταρική γραμμή. Θετικές επιτυχίες στη συνέχεια αξιολογήθηκαν για την αποικοδόμηση β-κατενίνης, η καταστολή της β-κατενίνης πυρηνικό εντοπισμό και ρύθμιση προς τα κάτω του κατάντη ογκογόνο στόχων του Wnt μονοπατιού /β-κατενίνης. Η μελέτη μας δείχνει μια νέα πορεία υποβάθμισης της πρωτεΐνης β-κατενίνης στα κύτταρα HeLa από Avenanthramide 2p (πολυφαινόλες), και Τριπτολΐδης (ένα τριεποξείδιο διτερπένιο), αντιστοίχως, από βρώμη και ένα κινέζικο φαρμακευτικό φυτό. Τα ευρήματα παρούσα Avenanthramide 2p ως πιθανή chemopreventive διαιτητική ένωση που χρήζει περαιτέρω μελέτης με χρήση

in vivo

μοντέλα των καρκίνων? παρέχουν επίσης μια νέα προοπτική για το μηχανισμό δράσης της Τριπτολΐδης

Παράθεση:. Wang D, Wise ML, Li F, Dey Μ (2012) φυτοχημικά περίσταση ανώμαλη ενεργοποίηση της β-κατενίνης στα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 7 (12): e50508. doi: 10.1371 /journal.pone.0050508

Επιμέλεια: Yuntao Wu, George Mason University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8 Σεπτεμβρίου, 2012? Αποδεκτές: 22η Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 3 Δεκεμβρίου 2012

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Το έργο χρηματοδοτήθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας χορηγούν R00AT4245 (σε MD), USDA /SD-AES επιχορήγηση 328100/318000 (για MD), SDSU AES 3AH203 Ταμείο (στο FL) και ΝΙΗ AI076125 επιχορήγηση (με FL). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα μέλη της οικογένειας Wnt εκκρινομένων παραγόντων αναπτύξεως παίζουν σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης ρυθμίζοντας τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση, την πολικότητα των ιστών, και οργανογένεσης, και να συμβάλλει στην ανάπτυξη του ουροποιογεννητικού συστήματος. Στο κανονικό μονοπάτι Wnt, β-κατενίνης λειτουργεί ως το κεντρικό στοιχείο [1]. Η σύνδεση του Wnt στον υποδοχέα της (κατσαρωμένα) και συν-υποδοχέα λιποπρωτεΐνης χαμηλής πυκνότητας (LRP5 /6) αναστέλλει το σχηματισμό του συμπλόκου πρωτεΐνης που περιλαμβάνει αξίνη, την κινάση συνθάση γλυκογόνου-3 (GSK-3), και το αδενωματώδη πολυποδίαση coli ( APC). Αυτή η αναστολή έχει ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση του β-κατενίνης στο κυτταρόπλασμα το οποίο στη συνέχεια μετατοπίζεται στον πυρήνα [2]. Στο πυρήνα β-κατενίνης συνδέεται προς τον παράγοντα Τ-κυττάρων (TCF) που οδηγεί σε μεταγραφή γονιδίων στόχων Wnt [3]. Αυτή η παρεκκλίνουσα σηματοδότηση β-κατενίνης έχει παρατηρηθεί σε ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων της πλειοψηφίας των καρκίνων του παχέος, περίπου το ήμισυ των καρκίνων του προστάτη και το ένα τρίτο των μελανωμάτων [4].

Η β-κατενίνης επιταχύνει επίσης τον ιό των ανθρώπινων θηλωμάτων τύπου 16 με τη μεσολάβηση του τραχήλου της μήτρας καρκινογένεση σε διαγονιδιακά ποντίκια

[

5

]

.

Περιέργως β-κατενίνης πιστεύεται ότι επηρεάζουν την μεταστατική δυναμικό των καρκινικών κυττάρων επηρεάζοντας χρωματίνης αναδιαμόρφωση [6], καθώς και ρυθμίζουν την οξειδωτική αντίδραση στρες στα κύτταρα [7]. Ως εκ τούτου, η εξασθένηση του συστατική ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης β-κατενίνης έχει γίνει ένας ελκυστικός στόχος για αντικαρκινική θεραπεία και την πρόληψη.

Φυσικά απαντώμενες ενώσεις αντιπροσωπεύουν ελκυστικοί υποψήφιοι για ανάπτυξη ως παράγοντες προφύλαξης όταν υποστηρίζεται από ευρήματα τεκμηριωμένες και μηχανιστικές έρευνα. Ειδικότερα, διαιτητικές ουσίες παρακάμψει την ανάγκη για πρόσθετη εισαγωγή ξένων ενώσεων σε υγιή ασυμπτωματικά άτομα. Διαιτητικά παράγοντες είναι επίσης γενικά λιγότερο τοξικές, περισσότερο εύκολα βιοδιαθέσιμο, πιο προσιτή, και λιγότερο δαπανηρή σε σύγκριση με συνθετικά μέσα. Στη διάρκεια των τελευταίων ετών, πολλά εργαστήρια έχουν εντοπίσει πολλές φυτοχημικά που έχουν δυνητικά χρήσιμες βιολογικές ιδιότητες? Ωστόσο, μόνο λίγα ομάδες έχουν αξιολογηθεί άμεσα την ικανότητα αυτών των παραγόντων να διαταράξει β-κατενίνης μεσολάβηση σηματοδότηση Wnt [4]. Στη μελέτη αυτή αναφέρει την διαμόρφωση του χλωριούχου λιθίου (LiCl) ενεργοποιημένα Wnt /β-κατενίνης σηματοδότησης από φυτοχημικά με γνωστό αντιοξειδωτικό, αντιφλεγμονώδες και chemopreventive ιδιότητες. Προτείνεται ότι η χρόνια επίμονη φλεγμονή είναι ένας αιτιολογικός παράγοντας για μια ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων. Ενώ εξάλειψη ή /και τον εμβολιασμό είναι λογικές στρατηγικές, τέτοιες προσπάθειες μπορεί να αποτύχει για την πρόληψη του καρκίνου σε περιπτώσεις που αφορούν επίμονη φλεγμονή με την αναδιοργάνωση των ιστών και επιγενετικές αλλαγές. Επειδή τα πάνω ρύθμιση του Wnt συνδέτες οικογένειας και προς τα κάτω ρύθμιση των ενδογενών αναστολέων Wnt συμβαίνουν κατά τη διάρκεια του πρώιμου σταδίου της καρκινογένεσης, αντι-φλεγμονώδεις παράγοντες με το δυναμικό να αναστέλλουν την κανονική Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι είναι υποψήφιοι παράγοντες για τη χημειοπρόληψη [8].

avenanthramides (Avns) είναι μια ομάδα φυσικά πολυφαινόλες που βρίσκονται μοναδικά, μεταξύ των καλλιεργειών τροφίμων, στη βρώμη, ένα δημοφιλές υγιεινή δημητριακών [9], [10]. AVN 2p, 2στ, και 2γ είναι τρεις κύριες μορφές που έχουν εντατικά μελετηθεί και φαίνονται να κατέχουν ανώτερη αντι-ερεθιστικές και αντιοξειδωτικές ιδιότητες [11], [12], [13], [14]. Η βιοδιαθεσιμότητα του Avns έχει αποδειχθεί σε ζώα και ανθρώπους [11], [15]. Οι τρεις AVN ομοειδών φαίνεται να επιβιβάζονται και να κατανέμεται μεταξύ των ιστών διαφορικά. Η σειρά κατάταξης της συγκέντρωσης στο πλάσμα κατά AVN από τον τύπο είναι 2p αυτο απενεργοποίησης. Β Σχηματική αναπαραστάσεις του λεντοϊού παραγωγή 7TFP με επιμόλυνση, μόλυνση λεντοϊού, και σταθερή ρεπόρτερ επιλογή κυτταρικής σειράς. Γ Επικύρωση εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση Wnt απόκριση ανταποκριτή από το σταθερό παραγωγό κυτταρική γραμμή μετά την επαγωγή LiCI (8 ώρες) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δραστικότητα λουσιφεράσης. Οι πτυχώσεις του Wnt δραστηριότητας ρεπόρτερ σε σχέση με τον αρνητικό μάρτυρα (αγωγή με όχημα) παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE

Η

Αποτελέσματα

Παραγωγή και Βελτιστοποίηση Σταθερό Reporter HeLa 7TFP γραμμή κυττάρων για τη διαλογή υψηλής Περιεχόμενο φυτοχημικών για αντικαρκινικές ιδιότητες

για την ταυτοποίηση φυσικά, χημικές ρυθμιστές του σηματοδότηση Wnt, έχουμε αναπτύξει μια δοκιμασία υψηλής περιεκτικότητας για τη μέτρηση της ενεργοποίησης, πυρηνική μετατόπιση και την επακόλουθη δέσμευση της β-κατενίνης στην TCF μεταγραφική συγκρότημα σε κύτταρα HeLa. Η αναστολή του συμπλόκου GSK-3 στο κυτταρόπλασμα οδηγεί σε παραγωγή ανώμαλων β-κατενίνης η οποία στη συνέχεια μετατοπίζεται στον πυρήνα να συνδεθεί με το TCF-συγκρότημα ενεργοποίησης κατάντη ενεργοποίηση των γονιδίων οδού Wnt. Χρησιμοποιήσαμε μία κυτταρική γραμμή HeLa σταθερά μεταφέρουν ένα λεντοϊού κασέτα 7TFP ρεπόρτερ που περιέχει ένα γονίδιο αναφοράς λουσιφεράσης πυγολαμπίδας που ελέγχεται από τον υποκινητή του γονιδίου TCF (Εικ. 1Α). Για να αποδειχθεί λειτουργική σημασία της κυτταρικής σειράς αναφοράς HeLa 7TFP, χρησιμοποιήσαμε LiCl, ένα φαρμακολογικό αναστολέα της GSK-3 [31], [39], σαν ένας ενεργοποιητής Wnt. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1C, 8 ώρες μετά τα κύτταρα 7TFP θεραπεία LiCl έδειξε μια δοσοεξαρτώμενη διέγερση της απόκρισης σηματοδότηση Wnt όπως υποδεικνύεται από την δραστικότητα λουσιφεράσης Firefly. Στα 50 mM, LiCl προκάλεσε μια σχεδόν 1.000 επαγωγή ρεπόρτερ φορές σε σχέση με τον αρνητικό έλεγχο (DMEM). Ως εκ τούτου, για όλα τα επόμενα πειράματα LiCl χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση 50 mM. Εμείς επικυρωθεί περαιτέρω την ικανότητα του συστήματος δοκιμής για την αναγνώριση ενώσεων που επηρεάζουν σηματοδότηση Wnt χρησιμοποιώντας ένα γνωστό αναστολέα του σηματοδότηση Wnt, ένα συνθετικό μικρό μόριο FH535 λαμβάνεται από τη Sigma Chemicals (St. Louis, ΜΟ) (αυτόνομο δεδομένα επικύρωσης δεν φαίνονται). Ως εκ τούτου, η FH535 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος αναφοράς για όλα τα μετέπειτα πειράματα όπως φαίνεται στα Σχ. 2-6.

Reporter και τις δραστηριότητες της λουσιφεράσης Renilla μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας λουσιφεράσης Διπλή Glo. Οι Κανονικοποιημένη ποσοστιαίες τιμές σε σχέση με τον έλεγχο LiCl φαίνεται ως η μέση ± S.E (n = 4). Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ της ένωσης

– επεξεργασία

κύτταρα και LiCl που προκαλείται από τον έλεγχο:. *** P≤0.001, ** p≤0.01, * p ≤ 0,05

Η

Επιλογή των ενώσεων για την ικανότητά τους να αναστέλλουν μεταγραφική επαγωγή των σηματοδότηση Wnt

για τον εντοπισμό των φυσικών διαμορφωτών της κανονικής Wnt σηματοδότησης και περαιτέρω επικύρωση σύστημα προσδιορισμού ρεπόρτερ μας, πραγματοποιήσαμε πιλοτικά και επικεντρώθηκε διαλογή με πέντε ενώσεις από εργαστήριο συλλογής φυσικό προϊόν μας. Χρησιμοποιώντας περισσότερο από 25% αναστολή στην υψηλότερη δοκιμαζόμενη συγκέντρωση σε συνδυασμό με εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση καμπύλη αναστολής σε σύγκριση με LiCl θετικό έλεγχο, προσδιορίσαμε τρία συστατικά που ρυθμίζεται προς τα κάτω TCF διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση σηματοδότηση Wnt (Εικ. 2). Avns 2ρ και 2στ εξασθενημένα 30% της ενεργοποίησης σε 40 μΜ συγκεντρώσεις, ενώ το ίδιο επίπεδο εξασθένησης επιτεύχθηκε με 22,24 ηΜ Τριπτολΐδης. Το συνθετικό FH535 επιτευχθεί μεγαλύτερος βαθμός Wnt εξασθένησης σηματοδότηση σε συγκέντρωση 10 μΜ. Αυτό δεν έδειξε καμία δραστικότητα σε νανομοριακές επίπεδα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Θα πρέπει να αναφερθεί ότι δεν προφανές κυτταρικά κυτταροπαθητικά αποτελέσματα παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης κατά 12 h έκθεση των κυττάρων σε όλες τις εξετασθείσες ενώσεις. Εμείς δεν παρατηρούμε σημαντικές αλλαγές στην μεταγραφική επίπεδα ενεργοποίηση σε απόκριση AVN 2ρ ή Τριπτολΐδης με παρατεταμένη επωάσεις (12 ώρες) σε σύγκριση με 8 θεραπείες h.

Εξασθένηση των HeLa κυτταρικού πολλαπλασιασμού από Test Πράκτορες

ενεργοποίηση σηματοδότηση Wnt έχει συνδεθεί με ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των κυττάρων κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης [3]. Στο πείραμα διαλογής μας χρησιμοποιώντας σταθερή Wnt ρεπόρτερ κύτταρα HeLa, 2ρ, 2f και Τριπτολΐδης κατέστειλε LiCl ενεργοποιημένα TCF-διαμεσολαβούμενη μεταγραφή εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Δεδομένου ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων απορυθμισμένη είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα των καρκινικών κυττάρων, προσδιορίστηκαν οι αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις των δοκιμών τριών ενώσεων θετικά στη δοκιμασία διαλογής (Σχ. 2). Τόσο Τριπτολίδη και AVN 2p έδειξε σημαντική, εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση ανασταλτική δράση (Εικ. 3). AVN 2στ δεν επιδεικνύουν ανασταλτική δράση κατά τη διάρκεια 24 ώρες πολιτισμού, ως εκ τούτου, μόνο 2ρ και Τριπτολΐδης μελετήθηκαν σε επόμενα πειράματα.

HeLa κύτταρα καλλιεργήθηκαν με μέσο καλλιέργειας MTS. Η απορρόφηση διαβάστηκε στα 490 nm και τα δεδομένα εκφράστηκαν ως επί τοις εκατό βιωσιμότητα των κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο DMSO (όχημα). Οι Κανονικοποιημένη ποσοστιαίες τιμές σε σχέση με τον έλεγχο DMSO φαίνεται ως η μέση ± S.E (n = 4). Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ της ένωσης

– επεξεργασία

κύτταρα και έλεγχος:. *** P≤0.001, ** p≤0.01, * p ≤ 0,05

Η

AVN 2ρ και Τριπτολΐδης προώθησε Cellular

β-κατενίνης

πρωτεΐνη Υποβάθμιση

Περαιτέρω μηχανιστική διερεύνηση Wnt διαταραχή της σηματοδότησης από Τριπτολΐδης και 2p πραγματοποιήθηκαν. Από Wnt ενεργοποίησης που κατεστάλη από τις ενώσεις σηματοδότησης, απαιτεί κυτταρική παραγωγή β-κατενίνης και την σύνδεση του με συγκρότημα μεταγραφή TCF στον πυρήνα [3], εξετάσαμε την ικανότητα των ενώσεων για την ενίσχυση της αποικοδόμησης της κυτταρικής πρωτεΐνης β-κατενίνης. Εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση LiCl προκαλούμενη αποικοδόμηση της πρωτεΐνης β-κατενίνης παρατηρήθηκε σε απάντηση 2ρ και τριπτολίδης σε κύτταρα HeLa (Σχ. 4Β). Μειωμένη έκφραση του β-κατενίνης παρατηρήθηκε επίσης σε FH535 επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 4Β). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η ενδογενής έκφραση ακτίνης δε μεταβλήθηκε σε κύτταρα κατεργασμένα με 2ρ ή FH535, υποδεικνύοντας ότι η παρατηρούμενη μείωση της β-κατενίνης δεν οφειλόταν σε τοξικότητα του φαρμάκου (Εικ. 4Α).

A. έκφραση της πρωτεΐνης β-κατενίνης: κηλίδα Western ήταν διπλό ανιχνεύθηκε με αντι ανθρώπινο β-κατενίνης ποντικού (1:2000 ν /ν) και κουνελιού αντι ανθρώπινο β-ακτίνης (1:5000 ν /ν) αντισώματα, πλύθηκαν σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα, και περαιτέρω επωάστηκαν με Dylight 680 αντι-ποντικού (1:5000 ν /ν) και Dylight 800 αντι-κουνελιού (1:5000 ν /ν) αντισώματα. LI-COR οδύσσεια Infrared System Imaging χρησιμοποιήθηκε στην ανίχνευση σημάτων ανοσοαποτύπωση. B. Η πυκνομετρική ανάλυση των επιπέδων της πρωτεΐνης β-κατενίνης (μέση ± SE, η = 3): β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος οικοκυρική για ομαλοποίηση. Αστερίσκος υποδεικνύει τα επίπεδα έκφρασης της β-κατενίνης στα κύτταρα ενώσεις-θεραπεία που είναι σημαντικά διαφορετική από εκείνη του LiCl που προκαλείται από τον έλεγχο:. *** P≤0.001, ** p≤0.01, * p ≤ 0,05

Η

AVN 2p και Τριπτολΐδης κατήργησε πυρηνικό εντοπισμό

β-κατενίνης

η

Wnt απάντηση σηματοδότηση εξαρτάται από την πυρηνική εντόπιση της β-κατενίνης, όπου αλληλεπιδρά με TCF /LEF οικογένεια των μεταγραφικών παραγόντων για να ενεργοποιήσετε μονοπάτι Wnt. Ως εκ τούτου, θα θέλαμε να επιβεβαιώσει εάν κυτταρική υποβάθμιση της β-κατενίνης από 2P και Τριπτολΐδης (Εικ. 4) λογικά οδηγεί σε μείωση του πυρηνικού εντοπισμού της β-κατενίνης.

Όπως καταδεικνύεται στο Σχ. 5Α, πυρηνικό εντοπισμό του β-κατενίνης ανεστάλη σημαντικά σε κύτταρα HeLa σε επεξεργασία τόσο με τις ενώσεις σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Ποσοτική ανάλυση του αριθμού των κυττάρων που παρουσιάζουν χρώση πυρηνικής β-κατενίνης από 100 τυχαία μετρήθηκαν κύτταρα από αγωγή ή τον έλεγχο LiCl υποστηρίζεται περαιτέρω παρατήρηση μας (Εικ. 5Β). Περίπου το 30% των μη κατεργασμένων κυττάρων κατείχαν την πυρηνική μετατόπιση της β-κατενίνης σε αντίθεση με 14% σε 2p- και 8% σε Τριπτολΐδης-κατεργασμένα κύτταρα.

A. Μικροσκοπική ανίχνευση β-κατενίνης εντοπισμός με ανοσοφθορισμό: κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μόνο με φορέα (DMSO, άνω πλαίσιο), 15 μΜ FH535 (δεύτερη από επάνω), 80 μΜ AVN 2ρ (τρίτη από επάνω) ή 22 ηΜ Τριπτολΐδης (κάτω) πριν σε 50 mM ϋΟΙ επαγωγή για το καθένα.