Abstract

Η κολχικίνη, ένα φυσικό προϊόν του

Colchicum autumnae

που χρησιμοποιούνται σήμερα για τη θεραπεία της ουρικής αρθρίτιδας, είναι μια στόχευσης τουμπουλίνης ένωση η οποία αναστέλλει τον σχηματισμό μικροσωληνίσκων μέσω στόχευσης γρήγορα διαιρούμενα κύτταρα. Αυτό το ξενοδοχείο τουμπουλίνης-στόχευση έχει οδηγήσει τους ερευνητές να διερευνήσουν τις δυνατότητες της κολχικίνης και αναλόγων όσο το δυνατόν θεραπείες του καρκίνου. Μια σημαντική μελέτη που διεξήχθη σε ένα ανάλογο της αλλοκολχικίνη, ZD 6126, σταμάτησε στη φάση 2 κλινικές δοκιμές λόγω της σοβαρής καρδιο-τοξικότητα που σχετίζεται με τη θεραπεία. Η μελέτη αυτή περιλαμβάνει την ανάπτυξη και τη δοκιμή των νέων αναλόγων αλλοκολχικίνη που κατέχουν μη τοξικά αντικαρκινικές ιδιότητες. Αυτή τη στιγμή έχουμε συντεθεί και να αξιολογήσει τις δραστηριότητες κατά του καρκίνου των δύο αναλόγων? Ν-ακετυλο-Ο-methylcolchinol (NSC 51046 ή NCME), που είναι δομικά όμοια με την ZD 6126, και (

S

) -3,8,9,10-tetramethoxyallocolchicine (Green 1), το οποίο είναι ένα νέο παράγωγο του αλλοκολχικίνη που είναι ισομερείς στο δακτύλιο Α. NSC 51046 βρέθηκε να είναι μη-επιλεκτική, καθώς επαγόμενη απόπτωση σε δύο BxPC-3 και PANC-1 παγκρεατικού καρκίνου κύτταρα και σε φυσιολογικά ανθρώπινα ινοβλάστες. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι η Πράσινη 1 ήταν σε θέση να προκαλέσει μέτρια autophagy προ-θανάτου σε αυτά τα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα και Ε6-1 κύτταρα λευχαιμίας, αλλά όχι σε φυσιολογικό ανθρώπινο ινοβλάστες. Σε αντίθεση με κολχικίνη και NSC 51046, Πράσινο 1 δεν φαίνεται να επηρεάζει τον πολυμερισμό της τουμπουλίνης που υποδεικνύει ότι έχει ένα διαφορετικό μοριακό στόχο. Πράσινο 1 προκαλείται επίσης αύξηση της αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) παραγωγή σε μιτοχόνδρια που απομονώθηκαν από καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. Επιπλέον,

in vivo

μελέτες αποκάλυψαν ότι η πράσινη 1 ήταν καλά ανεκτή σε ποντίκια. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι μια μικρή αλλαγή στη δομή του κολχικίνη έχει προφανώς αλλάξει το μηχανισμό δράσης και να οδηγήσει σε βελτιωμένη επιλεκτικότητα. Αυτό μπορεί να οδηγήσει σε καλύτερες θεραπείες επιλεκτική στη θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Larocque K, Ovadje P, Τζούρτζεβιτς S, M Mehdi, Πράσινη J, Pandey S (2014) Μυθιστόρημα Αναλογική της κολχικίνη Προκαλεί Επιλεκτική Pro-Θάνατος Autophagy και Νέκρωση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 9 (1): e87064. doi: 10.1371 /journal.pone.0087064

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 22 του Αυγ του 2013? Αποδεκτές: 19η Δεκεμβρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 23 Γενάρη του 2014

Copyright: © 2014 Larocque et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το Windsor και Seeds4Hope Grant Essex County Ιδρύματος Κέντρο Καρκίνου και το πρόγραμμα NSERC Discovery Grant. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Δρ. Siyaram Pandey είναι μέλος του διοικητικού συμβουλίου συντακτικής PLoS ONE. Ωστόσο, αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις πολιτικές PLoS ONE για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Στον Καναδά, υπολογίζεται ότι 187, 600 άτομα θα διαγνωστούν με καρκίνο και 75, 500 άνθρωποι θα πεθάνουν από καρκίνο το 2013 [1]. Από τον τεράστιο αριθμό των διαφορετικών τύπων καρκίνου, ο καρκίνος του παγκρέατος είναι ένα από τα πιο θανατηφόρα, καθώς είναι πολύ επιθετικό, ανθεκτικό σε θεραπεία, εξελίσσεται ταχέως και έχει έλλειψη σαφών συμπτωμάτων? Ως εκ τούτου, συνδέεται με την κακή πρόγνωση και διάγνωση στάδιο αργά [2], [3]. Οι τρέχουσες διαθέσιμες θεραπείες για τον καρκίνο του παγκρέατος περιλαμβάνουν χειρουργική επέμβαση, ακτινοβολία, και αρκετές χημειοθεραπείες, συμπεριλαμβανομένων των 5-φθοριοουρακίλη και gemcitabine [4]. Δυστυχώς, η αποτελεσματικότητα αυτών των επιλογών θεραπείας δεν είναι μακράς διαρκείας και τα οποία σχετίζονται με σοβαρές ανεπιθύμητες παρενέργειες, λόγω της μη-επιλεκτική στόχευση των μη καρκινικών κυττάρων [5]. Ενώ μεγάλη πρόοδος έχει γίνει σε πολλούς τύπους καρκίνου, του παγκρέατος περιπτώσεις και των θανάτων από καρκίνο είναι ακόμα σε άνοδο [6]. Είναι πολύ σημαντικό ότι μια επιλεκτική, ασφαλέστερη και μη τοξικά εναλλακτική λύση για τρέχουσες επιλογές θεραπείας έχει αναπτυχθεί για εκείνους που υποφέρουν από καρκίνο του παγκρέατος. Λευχαιμία είναι ένα άλλο θανατηφόρο τύπο καρκίνου που εμφανίζεται όταν βλαστικά κύτταρα του αίματος στο μυελό των οστών να εξελιχθεί σε μη φυσιολογικά κύτταρα. Εκτιμάται να διαγνωσθεί σε 5.800 Καναδούς το 2013, σκοτώνοντας 2.600. Αν και οι θεραπευτικές επιλογές είναι διαθέσιμες, εξακολουθεί να υπάρχει ανάγκη να αναπτυχθεί μια πιο αποτελεσματική και ασφαλέστερη εναλλακτική λύση.

Ιδιαίτερης σημασίας για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων είναι η ικανότητά τους να αποφύγουν τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (ΣΑΠ). Συγκεκριμένα, τα καρκινικά κύτταρα είναι σε θέση να παρακάμψει την απόπτωση, ΣΑΠ τύπου Ι, που εμπλέκονται στην ομοιοστατική ρύθμιση και την ανάπτυξη. Η απόπτωση δρα για να αποτρέψει κατεστραμμένα και μεταλλαγμένων κυττάρων από πολλαπλασιαζόμενα και συσσώρευση [7]. Autophagy, ΣΑΠ τύπου II, η οποία είναι μια καταβολική διαδικασία που περιλαμβάνει τη διάσπαση των κατεστραμμένων κυτταρικών συστατικών και μπορεί επίσης να παρέχει ενέργεια σε περιόδους στρες, έχει επίσης εμπλακεί στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων. Αυτή η διαδικασία της άρσης των κατεστραμμένων κυτταρικών συστατικών παρέχει τα κύτταρα με υλικά που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παραγωγή ενέργειας έως ότου αφαιρεθεί ο στρεσογόνος [8], [9]. Λόγω αυτής της διαδικασίας, autophagy έχει θεωρηθεί ότι είναι μόνο ένας μηχανισμός προ-επιβίωσης? Πρόσφατα, ωστόσο, οι ερευνητές βρήκαν ότι παρατεταμένη έκθεση σε στρεσογόνους παράγοντες μπορεί να οδηγήσει σε παρατεταμένη αυτοφαγία και στη συνέχεια, κυτταρικό θάνατο [10], [11]. Λόγω αυτής της διπλής χρήσης, υπάρχει ένα ερώτημα ως προς το αν είναι πιο ωφέλιμο να αναστέλλουν ή επάγουν αυτοφαγία προκειμένου να προκαλέσει θάνατο των καρκινικών κυττάρων, και οι ερευνητές επί του παρόντος εξετάζει και τις δύο κατευθύνσεις. Τέλος, νέκρωση είναι μια μορφή παθολογικής κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από την έκθεση σε μόλυνση, τοξίνες, ή τραύμα [12], [13]. Πρόσφατα, έχει βρεθεί ότι η νέκρωση, όπως απόπτωση, μπορεί επίσης να προγραμματιστεί και η επαγωγή του μπορεί να είναι μια άλλη στρατηγική στη θεραπεία του καρκίνου [14], [15]. Με την έρευνα σε επαγωγή κυτταρικού θανάτου, οι ερευνητές στρέφονται όλο και περισσότερο για την εξεύρεση ενώσεων και προϊόντων, με τον καρκίνο συγκεκριμένους στόχους, που μπορεί να οδηγήσει στην επαγωγή των προγραμμάτων κυτταρικού θανάτου σε καρκινικά κύτταρα επιλεκτικά, χωρίς επαγωγή κυτταρικού θανάτου σε μη καρκινικά κύτταρα, με τον τρόπο αυτό παρακάμπτοντας μερικές από τις τοξικότητες που σχετίζονται με τις τρέχουσες θεραπείες του καρκίνου.

η κολχικίνη είναι μια φυσική ένωση που μπορεί να απομονωθεί είτε από

Colchicum autumnale

(λιβάδι σαφράν) ή

Gloriosa superba

( δόξα κρίνος), δύο εκ των οποίων ανήκουν στην οικογένεια κρίνων [16]. Η κολχικίνη δεν είναι άγνωστη στον ιατρικό κόσμο, όπως έχει χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία της ουρικής αρθρίτιδας και έχει διερευνηθεί σε πολλές άλλες συνθήκες, συμπεριλαμβανομένων του κληρονομικού Μεσογειακού πυρετού [17], κίρρωση [18] και το σύνδρομο Sweet [19]. Πιο πρόσφατα, allocolchicines (παράγωγα κολχικίνης) και άλλα ανάλογα έχουν δείξει κάποια συναρπαστικά αποτελέσματα σε καρκινικά κύτταρα. Αυτό οφείλεται στην ικανότητα αλλοκολχικίνη για ανάσχεση μίτωση με αναστολή του πολυμερισμού τουμπουλίνης σε μικροσωληνίσκους [16], που εμποδίζουν την πρόοδο των κυττάρων μέσω του κυτταρικού κύκλου και που οδηγούν στην επαγωγή της απόπτωσης σε μεγάλο βαθμό. Αυτή η αναστολή του σχηματισμού των μικροσωληνίσκων είναι ιδιαίτερα χρήσιμο στην θεραπεία του καρκίνου επειδή τα καρκινικά κύτταρα πολλαπλασιάζονται γρήγορα και ανεξέλεγκτα. Ένα παράγωγο αλλοκολχικίνη, ZD 6126 η οποία είναι ένα προ-φάρμακο του Ν-ακετυλκολχινόλη, είχε κάποια συναρπαστικά αποτελέσματα, καθώς ήταν σε θέση να διαταράξει την κυτταροσκελετού των ενδοθηλιακών κυττάρων του όγκου και να προκαλέσουν απόπτωση (Σχ. 1) [20], [21]. ZD 6126 προκάλεσε νέκρωση των κυττάρων του όγκου σε

in vivo

μοντέλα ποντικών του ανθρώπινου πνεύμονα (Calu-6), του παχέος εντέρου (LoVo και ΗΤ-29), του προστάτη (PC-3), των ωοθηκών (SKOV-3), και του μαστού (MDA-MB-231) όγκους [22]. Δυστυχώς, αυτή η ένωση είχε σταματήσει σε κλινικές δοκιμές φάσης 2. ως αποτέλεσμα της συνδέεται καρδιο-τοξικότητα σε ανθρώπους [23]. Δεν είναι έκπληξη το γεγονός ότι αυτό το παράγωγο και άλλα παράγωγα ήταν τοξικά επειδή τουμπουλίνης και μικροσωληνίσκων είναι απαραίτητα για τον κυτταρικό κύκλο, όχι μόνο σε καρκινικά κύτταρα, αλλά επίσης και σε μη καρκινικά κύτταρα? Ως εκ τούτου, αυτή η μη-επιλεκτική στόχος είναι ένας από τους λόγους ότι τα μη καρκινικά κύτταρα είναι ευαίσθητα σε απόπτωση που επάγεται από παράγοντες που στοχεύουν τουμπουλίνης, που οδηγούν στις παρατηρούμενες παρενέργειες [24].

Η

Εδώ αναφέρουμε τα αντικαρκινική δράση των συνθετικών παραγώγων αλλοκολχικίνη? Ν-ακετυλο-Ο-methylcolchinol (NSC 51046 ή NCME), που είναι δομικά όμοια με την ZD 6126, και (

S

) -3,8,9,10-tetramethoxyallocolchicine (Green 1), το οποίο είναι ένα νέο παράγωγο του αλλοκολχικίνη που είναι ισομερείς στο δακτύλιο Α (Εικ. 1). Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε τις διαφορικές μηχανισμούς δύο παράγωγα αλλοκολχικίνη κατά της λευχαιμίας και παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα που προκαλούνται από ελαφρές τροποποιήσεις της χημικής τους δομής. NSC 51046 σαφώς επάγεται μη εκλεκτικά απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος (PANC-1 και BxPC-3) και μη-καρκινικές εμβρύου ινοβλάστες (NFF), ενώ Πράσινο 1 προκάλεσε autophagy προ-θανάτου και νέκρωση επιλεκτικά σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (PANC-1 ) και οξεία λευχαιμία Τ κυττάρων (Ε6-1 ή Jurkat), ενώ έχει μικρή επίδραση επί μη καρκινικά ανθρώπινους ινοβλάστες (NHF). Επιπλέον, σε αντίθεση με κολχικίνη, ZD 6126 και NSC 51046, Πράσινο 1 δεν φαίνεται να στοχεύουν τουμπουλίνης και έχει ένα διαφορετικό μοριακό στόχο. Είναι πολύ ενδιαφέρον το γεγονός ότι μια μικρή αλλαγή στη δομή του αλλοκολχικίνη έχει αλλάξει το μηχανισμό δράσης και να οδηγήσει σε βελτιωμένη επιλεκτικότητα του καρκίνου. Αυτά τα ευρήματα μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη καλύτερων, πιο επιλεκτική χημειοθεραπευτικά για τη θεραπεία του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture,

Οι ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτό μελέτη ήταν παγκρεατικό καρκίνωμα επιθηλιακό (PANC-1?. Cat Νο CRL-1469), του παγκρέατος αδενοκαρκίνωμα (BxPC-3?. Cat Νο CRL-1687) και οξεία Τ κυττάρων λευχαιμίας, κλωνοποιήσουν Ε6-1 (Jurkat? ΤΙΒ-152 ), οι οποίες όλες αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Οι φυσιολογικές κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν φυσιολογικά ανθρώπινους ινοβλάστες (NHF?. Cat Νο AG09309) και φυσιολογική εμβρυϊκή ινοβλάστες (NFF?. Νο Cat AG0443), οι οποίες και οι δύο αγοράστηκαν από την Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ . κύτταρα PANC-1 αναπτύχθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ, USA), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), (Gibco BRL, Mississauga, ΟΝ, Canada) και 10 mg /mL γενταμυκίνη ( Gibco BRL, Mississauga, ON, Καναδάς). BxPC-3 και Jurkat κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, ΟΝ, Canada), συμπληρωμένο με 10% FBS (Gibco BRL, Mississauga, ΟΝ, Canada) και 10 mg /mL γενταμυκίνη (Gibco BRL, Mississauga, ON, Canada). NHF και NFF κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ελάχιστο βασικό μέσο με ισορροπημένα άλατα Earle (ΜΕΜ /EBSS), (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ, USA) συμπληρωμένο με 15% FBS μη απαραίτητα αμινοξέα (Gibco BRL, Mississauga, ΟΝ, Canada) και 10 mg /mL γενταμυκίνη (Gibco BRL, Mississauga, ΟΝ, Canada). Όλες οι κυτταρικές σειρές αναπτύχθηκαν και διατηρούνται σε Forma Scientific CO

2 θερμοκοιτίδα εξοπλισμένο με ένα φίλτρο HEPA (Forma Scientific Inc, Marietta, Οχάιο) στους 37 ° C, 95% υγρασία και 5% CO

2

κυττάρων Θεραπεία

αλλοκολχικίνη παράγωγα, Ν-ακετυλο-Ο-methylcolchinol (NSC 51046) και (

S

) -3,8,9,10-tetramethoxyallocolchicine (Green 1) χρησιμοποιήθηκαν ως τα βασικά ενώσεις για τη μελέτη αυτή [25]. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις και διάρκειες NSC 51046 and Green 1, επανασυστάθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (Me

2SO). Πριν από τη θεραπεία, το απόθεμα συμπυκνώθηκε ενώσεις αραιώθηκαν περαιτέρω σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS). Εκτός από αλλοκολχικίνη παράγωγα, κολχικίνη (Sigma-Aldrich, ΟΝ, Canada) χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει αποτελέσματα των παραγώγων αλλοκολχικίνη στην ήδη γνωστή μηχανιστική αποτελεσματικότητα του colchicines. Paclitaxel (Sigma-Aldrich, ΟΝ, Canada) και Paraquat (PQ), (Sigma-Aldrich, ΟΝ, Canada) χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι σε διάφορα πειράματα.

Αξιολόγηση της Αποτελεσματικότητας της Πράσινης 1 και NSC 51046

WST-1 προσδιορισμό.

Για να μετρηθεί η βιωσιμότητα των κυττάρων, WST-1 βαφή ([2- (4-ιωδοφαινόλη) -3- (4-νιτροφαινυλ) -5- (2,4- δισουλφοφαινυλ) -2

Η

-tetrazolium, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) χρησιμοποιήθηκε. Αυτή η βαφή ανάγεται προς φορμαζάνη παρουσία των μεταβολικών ενζύμων, τα οποία είναι ενδεικτικά της δραστικής μεταβολικής δραστηριότητας σε βιώσιμα κύτταρα. Η ποσότητα της φορμαζάνης μπορεί να μετρηθεί μέσω απορρόφησης στα 450 nm. Ίδιος αριθμός κυττάρων σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων (PANC-1:4,000 κύτταρα /φρεάτιο? NHFs: 4000 κύτταρα /φρεάτιο), με συνολικό όγκο 100 μL. Μετά την προσκόλληση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις Πράσινης 1 ή NSC 51046. στο επιθυμητό σημείο χρόνου, η βαφή WST-1 προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 4 ώρες στους 37 ° C. Χρησιμοποιώντας ένα Wallac Victor

3 ™ 1420 Multilabel Counter (PerkinElmer, Woodbridge, ON, Καναδάς), τιμές απορρόφησης μετρήθηκαν στα 450 nm. Οι τιμές απορρόφησης των κατεργασμένων κυττάρων εκφράστηκε ως ποσοστό των τιμών απορρόφησης του μάρτυρα.

Trypan blue δοκιμασία αποκλεισμού.

Για την ποσοτικοποίηση του ποσοστού των νεκρών κυττάρων, κυανού τρυπανίου κυττάρων αδιαπέραστο βαφή επωάστηκε με επεξεργασμένα κύτταρα [26]. Ένα μίγμα 1:01 του εναιωρήματος κυττάρων και trypan blue χρωστικής (Sigma-Aldrich, ΟΝ, Canada) με πιπέτα σε ένα αιματοκυτταρόμετρο (Häusser Scientific, Horsham, ΡΑ) και ο αριθμός των κυττάρων (τα νεκρά κύτταρα χρωματίζονται μπλε και βιώσιμα κύτταρα παρέμειναν άνευ χρώσης) έγιναν με το χέρι ποσοτικά. Ο αριθμός των νεκρών κυττάρων εκφράστηκε ως ποσοστό του συνολικού αριθμού των κυττάρων. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism 6.0 και αναφέρονται ως μέσος όρος ± SD από δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Hoechst χρώση

Για να απεικονίσει την πυρηνική μορφολογία και την επαγωγή της απόπτωσης, χρωστική Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση των πυρήνων. Μετά τη θεραπεία με είτε Πράσινο 1 ή NSC 51046, τα κύτταρα επωάστηκαν με 10 μΜ του 33342 χρωστική Hoechst επί 10 λεπτά στους 37 ° C. Εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας Leica DM IRB ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού (Wetzlar, Γερμανία) στους 400Χ μεγέθυνση.

αννεξίνης V Δοκιμασία Σύνδεσης

Για να προσδιοριστεί εάν NSC 51046 και κολχικίνη ήταν επαγωγή απόπτωσης, ένα χρησιμοποιήθηκε αννεξίνη δοκιμασία σύνδεσης V. Μετά την αγωγή, PANC-1 κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν σε PBS και επαναιωρήθηκαν σε 50 μL αννεξίνης V ρυθμιστικό σύνδεσης (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2.5 mM ΟαΟ

2, ρΗ 7.4). Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με Αννεξίνη V-488 AlexaFluor Σύζευγμα (1:20) (Invitrogen, Canada), 10 μΜ χρωστική Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) και 1 μg /mL ιωδιούχου προπιδίου (Sigma-Aldrich, ON , Καναδάς) για 15 λεπτά στους 37 ° C. Εικόνες ελήφθησαν σε μεγέθυνση 400Χ χρησιμοποιώντας το μικροσκόπιο Leica DMI6000 φθορισμού (Leica Microsystems, Wetzlar, Γερμανία)

MDC Δοκιμασία

Για την ανίχνευση αυτοφαγία, monodansylcadaverine (MDC?. Sigma-Aldrich, ON, Καναδάς ) χρησιμοποιήθηκε. MDC έχει ενσωματωθεί αυτοφαγικά κενοτόπια, παράγοντας ένα λεκέ στικτή που παρατηρείται μέσω μικροσκοπίου φθορισμού. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν επί καλυπτρίδων και, μετά από ολονύκτια επώαση, υποβλήθηκαν σε θεραπεία με διάφορες δόσεις της Green 1. Μετά τη θεραπεία, τα κύτταρα επωάστηκαν με τελική συγκέντρωση 0.1 mM MDC (αραιωμένο σε PBS) για 35 λεπτά στους 37 ° C. Για περαιτέρω επιβεβαίωση της απώλεια της ακεραιότητας της κυτταρικής μεμβράνης και την επαγωγή του κυτταρικού θανάτου, τα κύτταρα αντι-χρωματίστηκαν με την κυτταρική μεμβράνη αδιαπέραστη πυρηνική χρώση, ιωδιούχο προπίδιο σε 1 μg /mL (Sigma-Aldrich, ΟΝ, Canada) για την επιβεβαίωση της επαγωγής κυτταρικό θάνατο. Οι εικόνες λήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Leica DM IRB ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού (Wetzlar, Γερμανία) στους 400Χ μεγέθυνση.

Κινητή Κυτταρολύματος Παρασκευή

Μετά την αγωγή με 5 μΜ Πράσινο 1 για διάφορες χρονικές περιόδους, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν σε PBS και επωάστηκαν σε 0.1% ρυθμιστικό διάλυμα ΝΡ40 (20 mM Tris HCI, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA) για 25 λεπτά σε πάγο (στροβιλισμό κάθε 5 λεπτά, για 15 δευτερόλεπτα). Το δείγμα στη συνέχεια φυγοκεντρείται στις 3000 rpm για 5 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο (που περιέχει το λύονται κυτταρικό υλικό) αποθηκεύεται στους -20 ° C μέχρι τη χρήση.

Western Blot

Τα δείγματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με χρήση SDS-PAGE. Ηλεκτροφορημένων πρωτεϊνών στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και δεσμεύτηκαν με 5% β /ο γάλα TBST (Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα με Tween-20) διάλυμα. Οι μεμβράνες μετά ανιχνεύθηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα σε 2% w /v TBST γάλα για όλη τη νύχτα στους 4 ° C για τους μικροσωληνίσκους που σχετίζονται ελαφριά αλυσίδα protein1 3 (LC3) έθεσε σε κουνέλι (1:500) (Novus Biologicals, Cat. Νο NB100- 2220, Littleton, CO, USA)? β-ακτίνης έθεσε στο ποντίκι (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Cat Νο sc-81178, CA, USA.)? Beclin-1 έθεσε σε κουνέλι (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Cat. Νο sc-11427, CA, USA). Μετά την επώαση, οι μεμβράνες πλύθηκαν σε TBST και επωάστηκαν ένα αντι-ποντικού (1:2000) ή μια αντι-κουνελιού (1:2000) ραφανιδική υπεροξειδάση δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο (Abcam, Cat Νο ab6728 & amp?. Ab6802, Cambridge, ΜΑ , USA) σε 2% w /v TBST γάλα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύσεις σε TBST, ζώνες έγιναν ορατές με αντιδραστηρίου ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Sigma-Aldrich, ΟΝ, Καναδάς) και πυκνομετρία διεξήχθη χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ.

τουμπουλίνης Δοκιμασία πολυμερισμός

Για να παρατηρηθεί η επίδραση της αλλοκολχικίνη παράγωγα για πολυμερισμό τουμπουλίνης, ένα κιτ προσδιορισμού πολυμερισμού τουμπουλίνης (Κυτταροσκελετός Inc. Cat. No. BK006P) χρησιμοποιήθηκε. Μία πλάκα 96 φρεατίων προ-θερμαίνεται στους 37 ° C για 30 λεπτά πριν από την έναρξη του προσδιορισμού. φρεάτια ελέγχου έλαβαν γενικές ρυθμιστικό τουμπουλίνης (80 mM PIPES ρΗ 6.9, 2 mM MgCl

2, 0,5 mM EGTA), και τα άλλα φρεάτια έλαβαν γενικό ρυθμιστικό τουμπουλίνης και είτε πράσινο 1, NSC 51046 ή κολχικίνη (Sigma-Aldrich, ON, Καναδάς). Όλα τα φρεάτια (συμπεριλαμβανομένου του ελέγχου) στη συνέχεια επωάστηκαν με 3 mg /mL σε ρυθμιστικό τουμπουλίνης πολυμερισμού της τουμπουλίνης (80 mM PIPES ρΗ 6.9, 2 mM MgCl

2, 0,5 mM EGTA, 1 mM GTP και 10,2% γλυκερίνη). Η OD

340 μετρήθηκε κάθε λεπτό για μία ώρα. καμπύλες πολυμερισμού παρήχθησαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 6.0. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

μιτοχονδριακού Απομόνωση και επιμέτρηση των δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS)

Παραγωγή

Τα μιτοχόνδρια απομονώθηκαν από μη επεξεργασμένα κύτταρα PANC-1 για να διερευνηθεί η επίδραση της Πράσινης 1 επί ROS παραγωγή και η δυνατότητα των μιτοχονδρίων ως στόχος της Green 1. τα κύτταρα πρώτα πλύθηκαν δύο φορές σε ψυχρό PBS, επαναιωρήθηκαν σε υποτονικό ρυθμιστικό διάλυμα (1 mM EDTA, 5 mM Tris-HCl, 210 mM μαννιτόλη, 70 mM σακχαρόζη, 10 μΜ Leu- pep, 10 μΜ pep-Α, 100 μΜ PMSF), ομογενοποιούνται, στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στις 3000 rpm για 5 λεπτά στους 4 ° C για την κατακρήμνιση του πυρηνικό κλάσμα. Το υπερκείμενο φυγοκεντρήθηκε στις 12.000 rpm για 15 λεπτά στους 4 ° C. Το κυτοσολικό υπερκείμενο απορρίπτεται και το σφαιρίδιο (που περιέχει μιτοχόνδρια) επαναιωρήθηκε σε ψυχρό ρυθμιστικό αντίδρασης και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 250 μΜ paraquat (PQ) ως θετικός έλεγχος, 2,5 μΜ Πράσινο 1 ή 10 μΜ κολχικίνης. Amplex Red (Molecular Probes, Eugene, OR), μαζί με υπεροξειδάση κρένου χρησιμοποιείται για την μέτρηση μιτοχονδριακή παραγωγή ROS. Τα μιτοχόνδρια που απομονώθηκαν όπως προαναφέρθηκε επαναιωρήθηκαν σε ψυχρό υποτονικό ρυθμιστικό διάλυμα και 20 μα πρωτεΐνης προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο σε ένα μαύρο 96 φρεατίων αδιαφανή πλάκα. Ο φθορισμός μετρήθηκε (Εχ. 560 nm και Em. 590 nm) κάθε 5 λεπτά για 5 ώρες χρησιμοποιώντας φασματόμετρο φθορισμού (SpectraMax Gemini XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Αναγνώσεις αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 6.0 και εκφράζεται ως σχετικές μονάδες φθορισμού (RFU) ανά μικρογραμμάριο πρωτεΐνης και αντιπροσωπεύουν δεδομένα που λαμβάνονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Ιη Vivo Αξιολόγηση του

(

S

) -3,8,9,10-tetramethoxyallocolchicine (Green 1)

Όλες οι διαδικασίες που αφορούν τα ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με το καναδικό Συμβούλιο για τις κατευθυντήριες γραμμές Φροντίδα ζώων και εγκρίθηκε από το Πανεπιστήμιο της Φροντίδας ζώων του Windsor Επιτροπή. Ηλικίας έξι εβδομάδων αρσενικούς ποντικούς CD-1 ηυ /ηυ ελήφθησαν από την Charles River Laboratories και στεγάζεται σε σταθερές εργαστηριακές συνθήκες ενός σκότους /12-ώρες φως, σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που περιγράφονται ζώο στο Πανεπιστήμιο του Windsor Ερευνητικής Δεοντολογίας διοικητικό συμβούλιο-AUPP #: 10-17. Μετά εγκλιματισμού, τα ποντίκια χωρίστηκαν σε δύο κύριες ομάδες, μία ομάδα εγχύθηκε υποδόρια σε δεξιά και αριστερά οπίσθια πλευρά με Me

2SO σε PBS (10 μL σε 200 μL PBS), ενώ η δεύτερη ομάδα έλαβε υποδόριες ενέσεις της Green 1 (10 mg /kg /ημέρα για έναν συνολικό όγκο 10 μL Πράσινης 1/200 μL PBS) τρεις φορές την εβδομάδα για μια περίοδο ενός μηνός. Για να εκτιμηθεί η τοξικότητα ενώ οι ποντικοί ήταν ζωντανοί, σωματικά βάρη μετρήθηκαν τρεις φορές την εβδομάδα για τη διάρκεια της μελέτης. Μετά την περίοδο της μελέτης, τα ζώα θανατώθηκαν και ελήφθησαν όργανα και ιστούς (ήπαρ, τα νεφρά και την καρδιά) τους και αποθηκεύτηκαν σε 10% φορμαλδεΰδη για ανοσοϊστοχημική και τοξικολογική ανάλυση

αιματοξυλίνη & amp.? Ηωσίνη (Η & amp? Ε) Χρώση

όργανα ποντίκια μονιμοποιήθηκαν σε 10% φορμαλδεΰδη, μετά την οποία είχαν υποβλήθηκαν σε κρυοτομή σε 10 μm τμήματα και τοποθετείται σε ένα SuperFrost /Plus μικροσκόπιο διαφάνειες (Fisherbrand, Fisher Scientific). Τμήματα των οργάνων βάφτηκαν σύμφωνα με ένα τυποποιημένο Η &? πρωτόκολλο Ε [27].

Στατιστική Ανάλυση

Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή (SD). Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση ενός 2-way ANOVA τεστ με GraphPad Prism 6.0 λογισμικό.

Αποτελέσματα

Επίδραση των αλλοκολχικίνη Παραγώγων για τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων

Για τους σκοπούς της η μελέτη αυτή, η βιωσιμότητα των κυττάρων καρκίνου του παγκρέατος (PANC-1) μετρήθηκε, μετά από θεραπεία με Πράσινη 1 ή NSC 51046, χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων WST-1. Μετά από 4 ωρών επώαση με τη χρωστική WST-1, η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm. Παράλληλα, μη-καρκινικές φυσιολογικών ανθρώπινων ινοβλαστών (NHFs) χρησιμοποιήθηκαν ως η κανονική ομόλογό κύτταρο σε αυτή τη μελέτη για να εξακριβωθεί η επιλεκτικότητα των ενώσεων προς τα καρκινικά κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τόσο NSC 51046 και πράσινο 1 ήταν σε θέση να μειώσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων PANC-1. Ωστόσο, παρατηρήθηκε ότι το πράσινο 1 ήταν επιλεκτική για καρκινικά κύτταρα, καθώς η βιωσιμότητα των κυττάρων PANC-1 μέτρια μειωμένη, ενώ η βιωσιμότητα των NHFs παρέμεινε ανεπηρέαστη. Από την άλλη πλευρά, η θεραπεία με NSC 51046 οδήγησε σε μείωση της βιωσιμότητας τόσο του καρκίνου και μη καρκινικά κύτταρα (Σχ. 2Α). Επιπλέον, Πράσινο 1 θεραπεία μείωσε τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων κυττάρων λευχαιμίας κυττάρων Τ και μείωσε την ακεραιότητα της μεμβράνης κυττάρου, όπως αποδεικνύεται από την αύξηση της trypan blue θετικά κύτταρα παρατηρήθηκαν μετά από θεραπεία (Εικ. 2Β). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η Πράσινη 1 είναι επιλεκτικό προς τα καρκινικά κύτταρα.

(Α) παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (PANC-1) και φυσιολογικών ανθρώπινων ινοβλαστών (NHFs) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις της Πράσινης 1 και NSC 51046 και μετά την αγωγή στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία, τα κύτταρα επωάστηκαν με βαφή WST-βιωσιμότητας 1 κύτταρο για 4 ώρες. Η απορροφητικότητα διαβάστηκε σε 450 nm και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ποσοστό επί τοις εκατό του ελέγχου. Οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD από τετραπλούν? (I) PANC-1 θεραπεία με NSC 51046 (Αλληλεπίδραση ανάμεσα σε κάθε συγκέντρωση: **** p & lt? 0,0001? Ελέγχου έναντι παράγοντα στήλη: **** p & lt? 0.0001)? (Ii) NHF αντιμετωπίζονται με NSC 51046 (Αλληλεπίδραση ανάμεσα σε κάθε συγκέντρωση: **** p & lt? 0,0001? Ελέγχου έναντι παράγοντα στήλη: **** p & lt? 0.0001)? (Iii) PANC-1 θεραπεία με πράσινη 1 (αλληλεπίδραση μεταξύ κάθε συγκέντρωση: p = 0,9955? Ελέγχου έναντι παράγοντα στήλη: **** p & lt? 0.0001)? (Iv) NHF αντιμετωπίζονται με πράσινο 1 (αλληλεπίδραση μεταξύ κάθε συγκέντρωση: p = 0,3642? Ελέγχου έναντι παράγοντα στήλη: * p = 0,0370) (Β) Μετά τη θεραπεία της ανθρώπινης οξείας Τ κυττάρων λευχαιμίας κύτταρα (Jurkat) με πράσινη 1, ένα μπλε τρυπάνης εξαιρουμένων δοκιμασία διεξήχθη. Τα κύτταρα βάφτηκαν με μπλε τρυπάνης κυτταρική μεμβράνη αδιαπέραστη βαφή και οι αριθμοί των trypan blue θετικών κυττάρων λήφθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως επί τοις εκατό του trypan blue θετικών κυττάρων, υποδεικνύοντας τα νεκρά κύτταρα με μη ανέπαφη κυτταρικών μεμβρανών. Οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD από δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Η

διαφορετικούς τρόπους από επαγωγή κυτταρικού θανάτου από αλλοκολχικίνη Παραγώγων

Για να διερευνήσει το ρόλο των παραγώγων αλλοκολχικίνη στην επαγωγή κυτταρικού θανάτου σε καρκινικά κύτταρα , οι πυρήνες των κυττάρων βάφτηκαν με 10 μΜ χρωστική Hoechst 33342 για 10 λεπτά μετά την αγωγή με είτε Πράσινο 1 ή NSC 51046 είτε για 48 ή 96 ώρες. Στις εικόνες που προκύπτουν (Εικ. 3Α), παρατηρήθηκε ότι NSC 51046 θεραπεία οδήγησε σε πυρήνες που εκτίθενται αποπτωτική μορφολογία, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων διόγκωση, συρρίκνωση και συμπυκνωμένους πυρήνες για τους δύο παγκρεατικό τύπους καρκινικών κυττάρων και των μη-καρκινικές κανονικό εμβρυϊκό ινοβλάστες (NFFs) , που αντιστοιχεί στα δεδομένα της βιωσιμότητας. Ωστόσο, ο καρκίνος και μη καρκινικά κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με πράσινο 1 δεν έδειξαν αυτή την αποπτωτική μορφολογία, υποδηλώνοντας ότι η Πράσινη 1 δεν διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. Η αποπτωτική επαγωγή από NSC 51046 επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας προσδιορισμό δέσμευσης αννεξίνης V. Annexin V συνδέεται με εξωτερικευμένη φωσφατιδυλοσερίνη, η οποία είναι ένας δείκτης της πρώιμη απόπτωση [28]. Στις εικόνες που προκύπτουν (Σχ. 3Β), διαπιστώθηκε ότι η αγωγή με τις δύο δόσεις του NSC 51046 οδηγούν στην εξωτερίκευση φωσφατιδυλοσερίνης όπως φαίνεται από την πράσινη φθορίζουσα χρώση. Επιπλέον, παρατηρήθηκε επίσης ότι η θεραπεία με κολχικίνη που προκαλείται αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, καθώς οδήγησε την πυρηνική κατακερματισμό, την εξωτερική ανάθεση της φωσφατιδυλοσερίνης και κυτταρικό θάνατο. Η έλλειψη αποπτωτική μορφολογία και η μείωση της βιωσιμότητας των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων σε επεξεργασία με πράσινο 1 μας οδήγησε να διερευνήσει άλλους τρόπους κυτταρικού θανάτου. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με monodansylcadaverine (MDC) για να προσδιοριστεί εάν υπήρχε αυτοφαγικά επαγωγή. Παρατηρήσαμε την επαγωγή της autophagy στις 48 ώρες σε όλα τα καρκινικά κύτταρα που εξετάστηκαν, συγκρίσιμη με αυτοφαγικά επαγωγή από θετικές μας ελέγχου για autophagy προ-επιβίωσης, Tamoxifen [10] (Σχ. 4Α). Επιπλέον, η χρώση με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) αποκάλυψε ότι, σε αντίθεση με Tamoxifen, Πράσινο 1 αντιμετωπίζονται καρκινικά κύτταρα ήταν θετικά για ιωδιούχο προπίδιο και επέδειξε μία μορφή προ-θάνατος του αυτοφαγία (Σχ. 4Α). Αυτή η δραστηριότητα της Green 1 ήταν ειδική για τα καρκινικά κύτταρα, όπως NHFs κατεργάζεται με πράσινο 1 δεν χρωματίστηκαν θετικά για την παρουσία αυτοφαγικά κενοτοπίων με MDC ή νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο με ΡΙ, επιβεβαιώνοντας την επιλεκτικότητα της Πράσινης 1 σε καρκινικά κύτταρα. Για να επιβεβαιωθεί η επαγωγή autophagy προκαλείται από την Green 1, Beclin-1 έκφραση και μετατροπή LC3-Ι LC3-ΙΙ αξιολογήθηκαν με στύπωμα Western αναλύσεις σε PANC-1 κύτταρα κατεργασμένα με 5,0 μΜ Πράσινο 1 για διάφορα χρονικά διαστήματα (Εικ. 4Β). β-ακτίνη μετρήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης. Πυκνομετρία διεξήχθη και τα δείγματα υποβάλλονται σε θεραπεία για 3 και 6 ωρών συγκρίθηκαν με τις αρχές του ελέγχου, ενώ το δείγμα σε αγωγή για 48 ώρες σε σύγκριση με τον έλεγχο 48 ωρών. Τα προκύπτοντα διαγράμματα δείχνουν ότι το πράσινο 1 θεραπεία προκάλεσε μια αύξηση στα επίπεδα Beclin-1 σε όλα τα χρονικά σημεία μετά τη θεραπεία. επίπεδα LC3-ΙΙ ήταν μέτρια αυξημένη στις 6 ώρες μετά την αγωγή με την Πράσινη 1.

Μετά τη θεραπεία με είτε Πράσινο 1 (Α) παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (BxPC-3 και PANC-1) και φυσιολογικά ανθρώπινα και ινοβλάστες εμβρύου ( NHFs και NFFs) επωάστηκαν με χρωστική Hoechst 33342 για να χαρακτηρίσει την πυρηνική μορφολογία και την ανίχνευση της επαγωγής της απόπτωσης. Έντονα χρωματισμένο, συμπυκνωμένο πυρήνες συνοδεύεται από αποπτωτικά σώματα είναι ενδεικτικά της απόπτωσης. (Β) κύτταρα PANC-1 επωάστηκαν με βαφή Annexin V για την επαλήθευση αποπτωτική επαγωγή που προκαλείται από NSC 51046. Τα κύτταρα βάφτηκαν αντίθετα με βαφή Hoechst 33342 και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) για να απεικονίσει την πυρηνική μορφολογία και κυτταρικό θάνατο. Οι εικόνες που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία με NSC 51046 και κολχικίνη.

Η

(Α) παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, τα ανθρώπινα κύτταρα λευχαιμίας (Jurkat) και NHFs επωάστηκαν με Monodansylcadaverine (MDC) για τη χρώση κενοτόπια αυτοφαγικά και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) για κυτταρικό θάνατο για να προσδιορισθεί αν αυτοφαγικά επαγωγή οδήγησε σε κυτταρικό θάνατο. Bright, διάστικτη χρώση είναι ενδεικτική της αυτοφαγία, όπως φαίνεται στο θετικό μας ελέγχου (Tamoxifen κατεργασμένα κύτταρα). Εικόνες ελήφθησαν σε μεγέθυνση 400Χ σε ένα μικροσκόπιο φθορισμού. (Β) αναλύσεις Western blot Beclin-1 έκφραση και LC3 μετατροπή διεξήχθησαν σε PANC-1 κύτταρα κατεργασμένα με 5,0 μΜ Πράσινο 1 σε διάφορα χρονικά σημεία. β-ακτίνη μετρήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Δείγματα αγωγή για 3 και 6 ωρών συγκρίθηκαν με τις αρχές του ελέγχου, ενώ το δείγμα σε αγωγή για 48 ώρες σε σύγκριση με τον έλεγχο 48 ωρών. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD από δύο ανεξάρτητα πειράματα και για τις δύο κηλίδες Western.

Η

ενδοκυτταρικούς στόχους της Πράσινης 1

Η κολχικίνη και ορισμένα από τα παράγωγά του είναι γνωστό ότι επάγουν απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα με αναστολή του πολυμερισμού της τουμπουλίνης και οδηγεί σε βλάβη του DNA, το οποίο δρα ως ένα σήμα για την έναρξη της διαδικασίας της απόπτωσης [29]. Όπως παρατηρούμε τις διαφορικές επιπτώσεις της Πράσινης 1 και NSC 51046 στην επαγωγή κυτταρικού θανάτου, θελήσαμε να διερευνήσουμε περαιτέρω τις πιθανές ενδοκυτταρική στόχους της Πράσινης 1, σε σύγκριση με NSC 51046 και κολχικίνη. Ειδικότερα, αξιολογήθηκαν οι επιδράσεις της κολχικίνης και των παραγώγων της για τον πολυμερισμό της τουμπουλίνης. Πράσινο 1, NSC 51046 ή κολχικίνη επωάστηκαν με τουμπουλίνη καθαρίστηκε από χοίρειο εγκέφαλο. Η OD

340 μετρήθηκε κάθε λεπτό για μία ώρα και το προκύπτον γράφημα δεικνύεται εις το σχήμα 5Α. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι NSC 51046 επάγεται ελαφρά αναστολή τουμπουλίνης στη χαμηλότερη δόση, η οποία αντιστοιχεί σε προηγούμενες μελέτες [31], [32]? Ωστόσο, παρατηρήθηκε ότι μια υψηλότερη δόση του NSC 51046 προκάλεσε ταχεία πολυμερισμό της τουμπουλίνης, η οποία ήταν απροσδόκητη. Όπως ήταν αναμενόμενο, η κολχικίνη ανέστειλε πολυμερισμού της τουμπουλίνης. Η θεραπεία με Πράσινη 1 σε υψηλότερες δόσεις οδήγησε σε ελαφρά αύξηση του πολυμερισμού της τουμπουλίνης, ενώ το κάτω πράσινο 1 δόση παρέμεινε σχετικά κοντά με το δείγμα ελέγχου (εικ. 5Α). Αυτό επιβεβαιώνει ότι η Πράσινη 1 και NSC 51046 έχουν διακριτά βιοχημικούς μηχανισμούς, όπως NSC 51046 στόχοι πολυμερισμού τουμπουλίνης σε πολύ μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι Πράσινο 1. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι μια απλή αλλαγή στις δομές αυτών των αναλόγων αλλοκολχικίνη έχει οδηγήσει σε πολύ διαφορετικές βιολογικές δραστηριότητες σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα.

(Α) παράγωγα Κολχικίνη (Green 1 και NSC 51046) επωάστηκαν με χοίρειο τουμπουλίνης για μια ώρα σε 96 φρεατίων πλάκα. Η απορρόφηση (OD

340 nm) λαμβάνεται κάθε λεπτό κατά τη διάρκεια της επώασης μία ώρα. Η κολχικίνη χρησιμοποιείται για σύγκριση με τα παράγωγα. (Β) Απομονωμένα μιτοχόνδρια από κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με πράσινο 1 και η παραγωγή ROS μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Amplex Red υπόστρωμα υπό την παρουσία υπεροξειδάσης χρένου (HRP). Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με τον έλεγχο χωρίς θεραπεία μιτοχόνδρια, τα μιτοχόνδρια αντιμετωπίζονται κολχικίνη και θετικός έλεγχος, paraquat (PQ). Οι ενδείξεις φθορισμού ελήφθησαν σε διαστήματα 5 λεπτών για 4 ώρες σε Ex. 560 nm και Em.590 nm και εκφράζονται ως σχετικές μονάδες φθορισμού (RFU).