Αφηρημένο

μηδενικής βαρύτητας προκαλεί αρκετές αλλαγές στις μεταβολικές και λειτουργικές πτυχές του ανθρώπινου σώματος και τα πειράματα στο χώρο της πτήσης έχουν δείξει μεταβολές στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου. Αυτή η μελέτη αναφέρει την ευρεία προφίλ έκφρασης γονιδιώματος ενός ορθοκολικού καρκίνου κυτταρική γραμμή-DLD-1, και ένα λεμφοβλάστης λευχαιμική κυτταρική σειρά-MOLT-4, υπό προσομοιωμένες μικροβαρύτητα σε μια προσπάθεια να κατανοήσει τις βασικές διαδικασίες και κυτταρικές λειτουργίες που απορρυθμισμένης μεταξύ δύο κυτταρικές σειρές . Altered μορφολογία των κυττάρων, μειωμένη κυτταρική βιωσιμότητα και μία αποκλίνον προφίλ του κυτταρικού κύκλου σε σύγκριση με τους ελέγχους τους στατικό παρατηρήθηκαν σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές υπό μικροβαρύτητα. Η διαδικασία του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα DLD-1 επηρεάστηκε σημαντικά με μειωμένη βιωσιμότητα, μειωμένη ικανότητα σχηματισμού αποικιών, ένα αποπτωτικό πληθυσμό και απορύθμιση των γονιδίων του κυτταρικού κύκλου, ογκογονίδια, και την εξέλιξη του καρκίνου και προγνωστικοί δείκτες. ανάλυσης μικροσυστοιχιών DNA αποκάλυψε 1801 (ρυθμίζεται προς τα πάνω) και 2542 (μειωτικά) γονίδια (& gt? 2 φορές) σε DLD 1-καλλιεργειών υπό μικροβαρύτητας, ενώ MOLT-4 καλλιέργειες που εκφράζονται διαφορικά 349 (ρυθμίζεται προς τα πάνω) και 444 (μειωτικά) γονίδια (& gt? 2 φορές) υπό μικροβαρύτητας. Η απώλεια στην ικανότητα πολλαπλασιασμού των κυττάρων επιβεβαιώθηκε με την αρνητική ρύθμιση της διαδικασίας του κυτταρικού κύκλου, όπως καταδεικνύεται από λειτουργική ομαδοποίηση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών DNA χρησιμοποιώντας όρους γονίδιο οντολογίας. Το ευρύ προφίλ έκφρασης του γονιδιώματος έδειξε επίσης σημαντική απορρύθμιση των υστέρων μεταγραφική γονιδιακή αποσιώπηση μηχανήματα και πολλαπλά γονίδια microRNA υποδοχής που είναι πιθανοί καταστολείς όγκων και πρωτο-ογκογονιδίων, συμπεριλαμβανομένων

MIR22HG

,

MIR17HG

και

MIR21HG

. Η

MIR22HG

, ένα γονίδιο καταστολής όγκων ήταν ένα από τα υψηλότερα απορυθμίζεται γονίδια στα δεδομένα μικροσυστοιχιών δείχνει ένα 4.4 log προς τα πάνω ρύθμιση φορές κάτω από μικροβαρύτητας. Real time PCR επικύρωσε την απορύθμιση στο γονίδιο υποδοχής επιδεικνύοντας 4,18 log προς τα πάνω ρύθμιση φορές του miR-22 microRNA. δεδομένων των μικροσυστοιχιών έδειξαν επίσης απορύθμιση των άμεσων στόχων του miR-22,

SP1

,

CDK6

και

CCNA2

Η

Παράθεση:. Vidyasekar P, Shyamsunder P , Arun R, Santhakumar R, Καπάντια ΝΚ, Kumar R, et al. (2015) Genome Ευρεία Έκφραση προφίλ των Γραμμών Cancer Cell Καλλιεργημένα στη μικροβαρύτητα αποκαλύπτει σημαντικές Δυσλειτουργία του κυτταρικού κύκλου και microRNA γονιδίων Δικτύων. PLoS ONE 10 (8): e0135958. doi: 10.1371 /journal.pone.0135958

Επιμέλεια: Zheng Li, Ένωση Medical College Hospital του Πεκίνου, Κίνα

Ελήφθη: 26 Φεβρουαρίου 2015? Αποδεκτές: 28, Ιούλη του 2015? Δημοσιεύθηκε: 21 του Αυγούστου, 2015

Copyright: © 2015 Vidyasekar et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού και της υποστήριξη αρχείων Πληροφορίες

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από άμυνας Οργανισμός Ανάπτυξης Έρευνας (DLS /81/48222 /LSRB-189 /ID /2009 και DLS /81/48222 /LSRB- 273 /SH & amp? ΗΗ /2013) για RSV. url: https://www.drdo.gov.in/drdo/boards/lsrb/fplsrb.htm

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μικροβαρύτητας στις διαστημικές πτήσεις έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζει τη φυσιολογία ενός κυττάρου σημαντικά [1]. Κανονική βαρύτητα (1 g) επηρεάζει 2-διαστάσεων καλλιέργεια με απόθεση κύτταρα στην επιφάνεια της πλάκας καλλιέργειας ιστού (TCP) όπου εξαρτώμενα από αγκίστρωση κύτταρα προσκολλώνται και πολλαπλασιάζονται ως μια μονοστιβάδα με πολύ περιορισμένο αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου. Η έλλειψη βάρους και μειωμένη επιτάχυνση (λιγότερο από 1 g) στο χώρο, αφαιρεί την επίδραση της βαρύτητας, επιτρέποντας καλλιέργειες κυττάρων στο διάστημα για να έχουν απρόσκοπτη κυκλοφορία του μέσου καλλιέργειας, ένα διάτμηση ελεύθερο περιβάλλον και, καθώς τα κύτταρα δεν δεσμεύονται από οποιαδήποτε κατευθυντική δύναμη, ανεμπόδιστη κίνηση των κυττάρων εντός του μέσου. Υπό αυτές τις συνθήκες τα κύτταρα τείνουν να συγχωνευτούν και τη μορφή συσσωματωμάτων δημιουργία τριών διαστάσεων (3D) περιβάλλον όπου μπορούν να αλληλεπιδρούν σε πολλαπλά επίπεδα [2]. Η επίδραση της μειωμένης βαρύτητας δεν περιορίζεται σε αλλαγές στις συνθήκες καλλιέργειας, όπως το μοναδικό περιβάλλον μπορεί να παράγει αλλαγές στην βασική φυσιολογία του κυττάρου. Ενώ ο μηχανισμός δράσης του πώς η βαρύτητα, ή η έλλειψή της, επηρεάζει μοριακή και κυτταρική λειτουργίες είναι ακόμα ασαφής, έχει διαπιστωθεί ότι η μικροβαρύτητα ή μηδενικής βαρύτητας επηρεάζει ζωτικές διεργασίες του κυττάρου και το σημαντικότερο, μικροβαρύτητα έχει δειχθεί ότι μεταβάλλει την ανάπτυξη του καρκίνου και την εξέλιξη [3-5]. Ωστόσο, διαφορετικές μορφές καρκίνου αντιδρούν διαφορετικά σε μικροβαρύτητας από την απώλεια ή την ενίσχυση κυτταρικές διαδικασίες και λειτουργίες. Σε αυτή τη μελέτη καλλιεργημένες κυτταρικές γραμμές αντιπροσωπευτικές των στερεών και αιματολογικών όγκων-DLD-1, MOLT-4 και HL-60 σε ένα περιστρεφόμενο σύστημα κυτταρικής καλλιέργειας (Συντονιστικά Κέντρα Διάσωσης) ότι προσομοιωμένο μικροβαρύτητα. Το Συντονιστικά Κέντρα Διάσωσης είναι ένα μηχανικό σύστημα που προσομοιώνει μειωμένης βαρύτητας στη γη από την ακύρωση της κατεύθυνσης φορέα μέσω της συνεχούς περιστροφής ενός Λόγος Πλοίου High Aspect (HARV). Αυτό διατηρεί τα κύτταρα σε μια διαρκή ελεύθερη πτώση και διάτμηση ελεύθερο περιβάλλον που επιτρέπει στα κύτταρα να ενώνονται και να σχηματίζουν συσσωματώματα 3D [2]. Τα μεγέθη αυτά διατηρούνται σε ελεύθερη πτώση και την εμπειρία συνθήκες μειωμένης βαρύτητας για το υπόλοιπο της περιόδου καλλιέργειας. Υποθέσαμε ότι φυσιολογικές αλλαγές στις λειτουργίες των κυττάρων, όπως πολλαπλασιασμό κυττάρου και η βιωσιμότητα θα μπορούσαν να επιβεβαιωθούν με μεταβολές στα θεμελιώδεις διαδικασίες του κυττάρου όπως γονιδιακή έκφραση. Για να αφορούν φυσιολογικές αλλαγές όπως μια αλλαγμένη προφίλ του κυτταρικού κύκλου με κακή ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου για τα γονίδια του κυτταρικού κύκλου, ογκογονίδια και την ανάπτυξη του καρκίνου και των δεικτών προόδου διεξήχθη. Γονιδίωμα ευρύ προφίλ έκφρασης με μικροσυστοιχίες DNA από αυτές τις κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν υπό μικροβαρύτητα αποκάλυψε την απορύθμιση των διαφόρων οδών στον καρκίνο και το σημαντικότερο, επιβεβαιώνονται με παρατηρούμενες φυσιολογικές αλλαγές στο κύτταρο. Χρησιμοποιήσαμε επίσης το προφίλ γονιδιακής έκφρασης για να διερευνήσει απορρύθμισης σε οδούς κεντρική με τον καρκίνο, όπως το σύστημα σηματοδότησης Notch και απορρύθμισης σε μετα μεταγραφικής γονιδιακής σίγησης μηχανήματα. Το προφίλ της γονιδιακής έκφρασης αποκάλυψε επίσης απορύθμιση των γονιδίων του ξενιστή microRNA στο μικροβαρύτητας συμπεριλαμβανομένης της σημαντικής ογκοκατασταλτικό, miR-22 στο DLD-1.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

DLD-1 είναι ένα επιθηλιακό, προσκολλημένη κυτταρική σειρά που προέρχεται από ένα ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα (Dukes τύπος C). MOLT-4 είναι ένα Τ λεμφοβλάστης, κυτταρικό εναιώρημα σειρά που προέρχεται από μια οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία, ενώ η κυτταρική γραμμή HL-60 είναι μία promyeloblast προέρχεται από οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία. Οι κυτταρικές γραμμές προέρχονται από το Εθνικό Κέντρο για την επιστήμη των κυττάρων, Pune της Ινδίας και διατηρήθηκαν σε DMEM-F12 (DLD-1) ή RPMI1640 (MOLT-4, HL-60) μέσο συμπληρωμένο με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό (Life Technologies, USA) στους 37 ° C σε ένα υγροποιημένο 5% CO2 επωαστή σε 25 χιλιοστά

3 πλάκες καλλιέργειας ιστού (TCP) και σε 10 ml

3 αναλογία διαστάσεων πλοίων υψηλής (HARV) μέσα σε ένα περιστρεφόμενο σύστημα κυτταρικής καλλιέργειας (Συντονιστικά Κέντρα Διάσωσης). Οι κυτταρικές σειρές εισήχθησαν στο HARV 10ml μέσω 5ml σύριγγες και ταχύτητα περιστροφής 27 στροφές ανά λεπτό (RPM) τυποποιήθηκε με βάση το άθροισμα των DLD-1 κύτταρα φορτωμένα σε 0,5 x 10

6 κύτταρα μέσα σε 24 έως 48 ώρες . Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε HARV για μέγιστο χρονικό διάστημα 72 ώρες με επιπλέον μέσο εγχέεται στο HARV κάθε 16 έως 24 ώρες για την αποφυγή αφρισμού ή φυσαλίδες αέρα. Περιεχόμενο της HARV μεταφέρθηκαν σε 60 χιλιοστά TCP, χωρίς διαστάσεως συσσωματώματα κυττάρων, για τη συνήθη παρατήρηση μικρογραφική και άλλες δοκιμασίες που βασίζονται σε κύτταρα χρησιμοποιώντας σιφώνια 10ml. 0.25% θρυψίνη-ΕϋΤΑ χρησιμοποιήθηκε για την διάσταση των αδρανών κύτταρο και καλλιέργειες μονοστοιβάδας όταν απαιτείται.

Σύνολο εκχύλιση RNA και cDNA μετατροπή

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα χρησιμοποιώντας κιτ RNeasy (Qiagen, Germany) . 2 × 10

6 κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με PBS. RNA απομονώθηκε από αυτά τα κύτταρα σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 1.5 μg ολικού RNA μετατράπηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας MMLV-RT (Thermo επιστημονικούς, USA) και ολιγο-dT εκκινητές (ΝΕΒ, USA). miRNA μετατροπή σε cDNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας stem-loop ανάστροφης μεταγραφάσης (RT) εκκινητές χωρίς διθειοθρεϊτόλη (DTT) και το στάδιο μετουσίωσης RNA για τη διατήρηση της ακεραιότητας του εκκινητή stem-loop.

ανάλυση μικροσυστοιχιών

ανάλυση μικροσυστοιχιών εκτελέστηκε με δείγματα RNA από DLD-1 και MOLT-4 κυτταρικές σειρές που καλλιεργούνται υπό μικροβαρύτητας και υπό στατικές συνθήκες στις επαναλήψεις. δεδομένα έκφρασης για κάθε δείγμα που λαμβάνεται στην Array Affymetrix GeneChip Human PrimeView. Ο υβριδισμός διεξήχθη για μία διάρκεια 16 ωρών σε 60 rpm στους 48 ° C και σαρώνονται για την Scanner GeneChip μικροσυστοιχιών 3000 7G. Πρώτες δεδομένα εκχυλίζεται μετά τη σάρωση των διαφανειών και συνόλων ακατέργαστα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας GeneSpring GX 12,6 λογισμικό που ακολουθείται από διαφορική γονιδιακή έκφραση (DE), φορές μεταβολής & amp? ανάλυση διασποράς.

Γονιδιακή οντολογία ανάλυση

Τα γονίδια DE μελετήθηκαν για την υπεραφθονία τους σε διαφορετικές Gene οντολογίας (GO) όρους, καθώς και μονοπάτια χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης μικροσυστοιχιών David (Η βάση δεδομένων για το σχολιασμό, οπτικοποίηση και Ολοκληρωμένη Discovery) [6]. Δύο εργαλεία στο πρόγραμμα DAVID χρησιμοποιήθηκαν, γονίδιο λειτουργικό εργαλείο ταξινόμησης και το λειτουργικό εργαλείο σχολιασμού ομαδοποίηση. Το εργαλείο λειτουργική σχολιασμού DAVID χρησιμοποιήθηκε για να τονίσει σχετικούς όρους GO συνδέονται με την υποβληθείσα λίστα γονίδιο με την ομαδοποίηση παρόμοιων, περιττές, και ετερογενές περιεχόμενο σχολιασμό από τους ίδιους ή διαφορετικούς πόρους σε ομάδες σχολιασμού βασίζεται στην υπόθεση ότι παρόμοιες επισημάνσεις θα πρέπει να έχουν παρόμοιες μέλη του γονιδίου. εμπλουτισμός του γονιδίου βασίζεται στη σειρά των υποβληθέντων γονιδίων που σχετίζεται σε μεγάλο βαθμό με ορισμένους όρους, η οποία είναι στατιστικά μετράται από Fisher Ακριβής στο σύστημα DAVID. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε το σκορ εμπλουτισμό ομάδα που είναι ο γεωμετρικός μέσος όλων των p-τιμές των μεμονωμένων μελών σε ένα αντίστοιχο σύμπλεγμα σχολιασμό. Μια υψηλότερη βαθμολογία δείχνει μια άκρως εμπλουτισμένο σύμπλεγμα το οποίο με τη σειρά του δείχνει την βιολογική σημασία του συμπλέγματος στη λίστα.

πραγματικού χρόνου PCR ενίσχυση

πραγματικού χρόνου PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας SYBR πράσινο πραγματικού χρόνου PCR κιτ από την Qiagen σε Mastercycler Eppendorf, ΕΡ realplex (Eppendorf, Γερμανία). Σχετική έκφραση mRNA προσδιορίστηκε με κανονικοποίηση προς την έκφραση ενός γονιδίου housekeeping, βήτα-ακτίνη και U6 για γονιδιακή έκφραση microRNA. Primer λίστα παρέχεται στον Πίνακα S1.

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα λύθηκαν με Ραδιόφωνο ανοσο Βροχόπτωση (RIPA) ρυθμιστικό, αναμιγνύεται με ρυθμιστικό Laemmli δείγματος (1 ×) και βραστά. Οι πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε 12% SDS-PAGE και ηλεκτροστυπώθηκαν σε BioRad, μεμβράνη νιτροκυτταρίνης 0,22 μΜ (BioRad Laboratories, USA). Η μεμβράνη αποκλείσθηκε με Τρις-ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα συν 0,2% Tween 20 (TBS-T) που περιείχε 3% BSA (Sigma Aldrich, USA) που ακολουθείται από επώαση πρωτογενές αντίσωμα επί μία νύκτα και πλύση με ρυθμιστικό ΤΒδ-Τ. Δευτερεύον αντίσωμα (αντι-ποντικού, συζυγές HRP, 1: 10.000 Sigma Aldrich USA) αραιωμένο σε ρυθμιστικό διάλυμα μπλοκαρίσματος επωάζεται για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και πλύθηκε πάλι με ΤΒδ-Τ. Αντίσωμα αντιδραστικές πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν μέσω ενισχυμένης χημειοφωταύγειας, Amersham ECL Plus δυτική αντιδραστήρια κηλίδωση ανίχνευση (GE υγειονομικής περίθαλψης, UK). Οι αντισωματικοί λεπτομέρειες παρέχονται στον Πίνακα S1.

Η κυτταρομετρία ροής για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν σε PBS πριν στερέωση σε ψυχρή αιθανόλη 70%, το οποίο προστίθεται στάγδην στο σφαιρίδιο, ενώ περιδίνηση. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν για 30 λεπτά στους 4 ° C. Σταθερή κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε PBS και περιδινήθηκαν σε 250g σε μια φυγόκεντρο. Τα κύτταρα επωάστηκαν με 50 μΐ ενός αποθέματος /ml 100 μg ΚΝάσης και 200 ​​μΙ ιωδιούχου προπιδίου (από 50 μg /ml μητρικό διάλυμα). Ένα BD FACSCalibur (USA) κυτταρόμετρο ροής χρησιμοποιήθηκε για να αναλύσει το πληθυσμό κυττάρων για μεταβολές του κυτταρικού κύκλου.

CFU- δοκιμασία

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μεθυλο κυτταρίνη σε 10Χ τελική συγκέντρωση του (0,3 mL κυττάρων σε 3 κ.εκ. μεθυλ κυτταρίνη). Οι σωλήνες στροβιλίσθηκαν για να εξασφαλιστεί κύτταρα και συστατικά αναμίχθηκαν καλά. Μεθυλ κυτταρίνη διανεμήθηκε χρησιμοποιώντας μια σύριγγα των 3 cc και ομοιόμορφα στο πιάτο με ήπια ανάδευση. Οι καλλιέργειες επωάστηκαν στους 37 ° C, 5% CO2 σε αέρα και ≥95% υγρασία. Οι αποικίες στη συνέχεια χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες (0,5 mg /ml σε 1% μεθανόλη) για 20 λεπτά και ξηραίνεται μετά από πλύση σε αποσταγμένο νερό αέρα. Χρωματισμένες αποικίες έγιναν ορατές κάτω από μια Nikon έκλειψη Ti μικροσκόπιο αντίθεσης φάσεων.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σε επαναλήψεις και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση ± δ.ϋ. Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε με χρήση Student t-test με το πρόγραμμα Prism 5 (λογισμικό GraphPad, USA).

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Πολιτισμός κυττάρων σε μικροβαρύτητας

Διαθεσιμότητα μια επιφάνεια για να προσκολληθούν για τα κύτταρα στο TCP είναι ένα ερέθισμα για την ανάπτυξη για προσκολλημένα κύτταρα όπως DLD-1 και ως εκ τούτου, στατικές καλλιέργειες σε TCP ήταν συρρέοντα (Σχήμα 1Α). Αργή περιστροφές ανά λεπτό (RPM) του HARV (16 RPM, Σχήμα 1Β) δεν επιτρέπουν στα κύτταρα να συγχωνευτούν αλλά τα κύτταρα θα μπορούσαν να σχηματίζουν συσσωματώματα σε 27 RPM (Σχήμα 1C). Χρώση με AO /EB δεν έδειξαν κυτταρικό θάνατο σε στατικές καλλιέργειες TCP (Σχήμα 1D), αλλά αποκάλυψε θάνατο των κυττάρων σε καλλιέργειες μικροβαρύτητας της DLD1 σε 16 RPM (Σχήμα 1 Ε). Η βιωσιμότητα των κυττάρων βελτιώθηκε όταν τα κύτταρα συγκεντρώνονται σε 27 RPM (Σχήμα 1 F). Όταν αυτά τα συσσωματώματα κυττάρων ενζυματικώς διαχωρίστηκαν και καλλιεργήθηκαν σε ένα TCP μετά από 48 ώρες σε μικροβαρύτητα, τα κύτταρα έλαβαν 48 ώρες για να προσκολληθούν (Σχ 1G, Ημέρα 2) ενώ τα κύτταρα από στατικές καλλιέργειες προσκολλάται εντός 24 ωρών (Σχήμα 1G, Ημέρα 1) και παράγονται συρρέουσα καλλιέργειες από ημέρα 4. Μικροβαρύτητας έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζουν διάφορες λειτουργίες κυττάρων [7] και η έκφραση ή τη λειτουργία του μορίων κυτταρικής προσκόλλησης θα μπορούσε να επηρεαστεί [8] μείωση του αριθμού των DLD-1 κύτταρα που θα μπορούσαν να τηρούν την TCP. Όταν τέτοια συσσωματώματα κυττάρων απλώνονται σε TCP χωρίς ενζυματική διάσπαση, η μορφολογία των κυττάρων DLD-1 μετεβλήθη (Σχ 1Η και 1Θ). Χρώση κρυσταλλικού ιώδους των κυττάρων που αναπτύσσονται σε στατική καλλιέργεια μονοστοιβάδας δείχνει την τυπική μορφολογία των DLD-1 κύτταρα (Σχ 1Η) ενώ κυτταρικών συσσωματωμάτων περιβληθούν πρότυπο ανάπτυξης παρόμοιο με μια καλλιέργεια εκφυτεύματος και κυττάρων περιφερικού περιείχε ένα μεγάλο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα (Σχήμα 1Θ). Η διευρυμένη κύτταρο ίσως λόγω των κυτταροσκελετικών αλλαγές κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης σε μικροβαρύτητα [9] ή τα κύτταρα, έχοντας χάσει τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, μπορεί να συσσωρεύεται προ-μιτωτική πρωτεΐνη στο κυτταρόπλασμα με πολυπλοειδία στον πυρήνα [9] αυξάνεται σε μέγεθος. Μια δοκιμασία σχηματισμού αποικίας (CFA) την DLD 1-καλλιέργειες σε μικροβαρύτητα μετατοπίζεται σε στατικό TCP μετά από ενζυματική διάσπαση (Σχήμα 1J και 1K) αποκάλυψε την μειωμένη πιθανότητα του DLD-1 κύτταρα να σχηματίσουν αποικίες (Εικόνα 1K) σε σύγκριση με στατικά κύτταρα (Σχ 1J). Η μειωμένη πολλαπλασιαστική ικανότητα των καλλιεργειών σε μικροβαρύτητα επιβεβαιώθηκε με έναν προσδιορισμό κυτταρικής βιωσιμότητας χρησιμοποιώντας ΜΤΤ. Στατικές καλλιέργειες ήταν 41% πιο βιώσιμη από 27 καλλιέργειες RPM και 75% πιο βιώσιμη από 16 καλλιέργειες RPM σε μικροβαρύτητας (Σχήμα 2Α). Όταν αυτά τα αποτελέσματα λαμβάνονται μαζί, μικροβαρύτητα φαίνεται να επηρεάζει σημαντικά την βιωσιμότητα και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων DLD-1. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του ΡΙ που φορτώνονται κυττάρων DLD-1 καλλιεργούνται υπό μικροβαρύτητα συγκρίθηκε με το προφίλ του κυτταρικού κύκλου των καλλιεργειών σε στατική TCP και στατικά ανάρτησης στο υπόστρωμα άγαρ (Σχήμα 2Β, 2C και 2D). Από την έλλειψη αγκυροβόλιο, στατικές καλλιέργειες αιωρήματος κυττάρων σε άγαρ αθροίζει επίσης παρόμοια με την Συντονιστικά Κέντρα Διάσωσης, ωστόσο, η προσομοίωση της μικροβαρύτητας είναι απούσα. DLD-1 καλλιεργειών σε μικροβαρύτητα είχαν σημαντικό πληθυσμό κυττάρων στην υπο G0 φάση αν και ένας μεγάλος πληθυσμός κυττάρων ήταν ακόμη βιώσιμα σε μικροβαρύτητα (Σχήμα 2C). Στατική μονοστοιβάδα, πολιτισμών TCP ήταν απολύτως βιώσιμο (Σχήμα 2Β) και σημαντικά, οι στατικές καλλιέργειες αναστολή δεν αποδεικνύουν μια φάση υπο G0 και έπρεπε προφίλ παρόμοιο με το στατικό έλεγχο (Σχήμα 2D). Σχήμα 2Ε δείχνει το μέσο όρο του πληθυσμού φάση υπο G0 στις τρεις συνθήκες καλλιέργειας σε επαναλήψεις της ανάλυσης του κυτταρικού κύκλου, η οποία επιβεβαίωσε ότι η μειωμένη βιωσιμότητα ήταν μια αποκλειστική επίδραση της μικροβαρύτητας στα συσσωματώματα κυττάρων DLD-1. Η κυτταρική γραμμή MOLT-4 μεγαλώνει ως καλλιέργεια εναιωρήματος και δεν αθροίζει ευνοϊκά στην μικροβαρύτητας σε υψηλές ή χαμηλές στροφές, δείχνοντας μεμονωμένα κύτταρα στο HARV (Σχήμα 2F, 16 RPM HARV). Ωστόσο, η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε κατά 20% σε σύγκριση με το στατικό έλεγχο και στα δύο RPM σε 48 ώρες (Σχ 2G), η οποία συσχετίζεται με μειωμένη αριθμούς κυττάρων κάτω από μικροσκοπική παρατήρηση μετά από 48 ώρες (Σχ 2F, 16 RPM HARV). Η κυτταρομετρία ροής ανιχνεύεται ένα μικρό αποπτωτικό πληθυσμού (Sub φάση G0) στην ανάλυση του κυτταρικού κύκλου των MOLT-4 καλλιέργειες σε μικροβαρύτητας στα 16 RPM (Σχήμα 2Η και 2Θ)

Ένα καλλιέργειες κυττάρων DLD-1.? Στατική καλλιέργεια (έλεγχος) Β DLD-1 μικροβαρύτητας πολιτισμό σε 16 RPM πολιτισμού C DLD-1 μικροβαρύτητας σε χρώση 27RPM Διαφορικές για την ανίχνευση αποπτωτικών πληθυσμού D DLD-1Static μονοστρωματικές καλλιέργειες Ε μικροβαρύτητας καλλιέργειες DLD1 σε 16 RPM F μικροβαρύτητας καλλιέργειες DLD1 σε 27 RPM G δοκιμασία προσκόλλησης κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό Top πάνελ-στατικές καλλιέργειες, κάτω πολιτισμών πάνελ μικροβαρύτητας μετατοπίζεται σε στατικές αλλαγές TCP Η Μορφολογική στο DLD-1? Κρυσταλλικό ιώδες χρώση των κυττάρων DLD-1 σε στατική καλλιέργεια μονοστιβάδας Ι χρώση κρυσταλλικού ιώδους των DLD-1 κύτταρα μετά τη μεταφορά του κυττάρου συσσωματωμάτων από μικροβαρύτητα να δοκιμασία ικανότητα σχηματισμού TCP J Colony? Στατικές καλλιέργειες Κ σχηματισμού αποικιών δοκιμασία την ικανότητα? DLD-1 κύτταρα μετά τη μεταφορά των κυτταρικών αδρανών υλικών από μικροβαρύτητας στο TCP

Η

Μια ανάλυση βιωσιμότητας κυττάρων για κύτταρα DLD-1? Βιωσιμότητα μετρήθηκε για καλλιέργειες μικροβαρύτητας (16 RPM και 27 RPM) και στατικές καλλιέργειες χρησιμοποιώντας ΜΤΤ Β ανάλυση κυτταρικού κύκλου για τα κύτταρα DLD-1? Στατική ανάλυση C κυτταρικού κύκλου? Μικροβαρύτητας D ανάλυση κυτταρικού κύκλου? Στατική αναστολές για υποστρώματα άγαρ EL Η μέση υπο πληθυσμού G0 σε επαναλήψεις της ανάλυσης του κυτταρικού κύκλου για μικροβαρύτητας, στατική και στατικές καλλιέργειες αναστολή της DLD-1 κύτταρα F MOLT-4 της κυτταρικής καλλιέργειας Στατική και μικροβαρύτητας καλλιέργειες MOLT-4 G Βιωσιμότητα δοκιμασία βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε για καλλιέργειες μικροβαρύτητας (16 RPM και 27 RPM) και στατικές καλλιέργειες χρησιμοποιώντας ΜΤΤ Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου? Στατική ανάλυση κυτταρικού κύκλου μου? πολιτισμών μικροβαρύτητας του MOLT-4.

Η

Real Time PCR για την έκφραση του γονιδίου ανάλυση

Για να επηρεάζουν τις βασικές διαδικασίες του καρκίνου, όπως ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και του κυτταρικού κύκλου, μικροβαρύτητας πρέπει να επηρεάζει σημαντικά τις θεμελιώδεις λειτουργίες της το κύτταρο όπως γονιδιακή έκφραση. Μετρήσαμε τα επίπεδα mRNA των σημαντικών γονιδίων που εμπλέκονται στον κυτταρικό κύκλο και εξέλιξης του καρκίνου για να ελέγξετε για απορύθμιση τους στο πλαίσιο μικροβαρύτητας. τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου της κυκλίνης επηρεάζουν σημαντικά την εξέλιξη του καρκίνου και μετάσταση, καθώς μπορούν να κατευθύνουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ή απόπτωση. Cdk είναι απαραίτητα για G1 /S και G2 /M μεταπτώσεων φάσης του κυτταρικού κύκλου και την έκφραση του γονιδίου απορυθμισμένη τους μπορούν να επηρεάσουν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Η μεταγραφή του

CDK1

ρυθμίζεται έτσι ώστε να λειτουργεί κατά τη διάρκεια της μιτωτικής πρόφαση και μετάφαση [10].

CDK1

έκφραση ρυθμίζεται προς τα κάτω σε MOLT-4 και υπερεκφράζεται σε DLD-1 (5 φορές πάνω από στατικό έλεγχο) (Σχήμα 3Α). Η έκφραση των γονιδίων θεμελιώδης για την ανάπτυξη και την πρόοδο του καρκίνου, οι οποίες περιλαμβάνουν ογκογονίδια και δυναμικό καρκινικοί δείκτες αρχέγονων κυττάρων, ήταν απορυθμίζεται σε μικροβαρύτητα.

CD117

(υποδοχέα τυροσινικής κινάσης-c-kit) η έκφραση ρυθμίζεται αυξητικά κατά 11,2 φορές σε MOLT-4 και μειωτικά κατά 0,2 φορές σε DLD-1 κάτω από μικροβαρύτητας (Σχήμα 3Α). έκφραση Υψηλής c-kit προστατεύει τα κύτταρα καρκινώματος κόλου κατά την απόπτωση και ενισχύει το διηθητικό τους δυναμικό [11]? Ως εκ τούτου, c-kit ρύθμιση προς τα κάτω στο DLD-1 κάτω από μικροβαρύτητας μπορεί να είναι σημαντική. DLD-1 συστατικά εκφράζει πάνω από το

MYC

γονίδιο [12] υπό κανονικές συνθήκες. Η υπερέκφραση του

MYC

ευαισθητοποιεί τα κύτταρα σε απόπτωση και κάτω μικροβαρύτητας

MYC

γονιδιακή έκφραση αυξήθηκε περαιτέρω σε DLD-1 με 3 φορές (Σχήμα 3Α). ΜΟΙ.Τ4 εκφρασμένη μείωσε τα επίπεδα του

MYC

(0,4 φορές) σε μικροβαρύτητας (Σχήμα 3Α).

JunB

κωδικοποιεί ένα μεταγραφικός ρυθμιστής των γονιδίων του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και είναι μέρος της άμεσης οικογένειας πρώιμου γονιδίου [13]. Ένα από τα πιο σημαντικά γονίδια να απορυθμίζεται στις δύο κυτταρικές σειρές σε μικροβαρύτητα,

JunB

ρυθμίζεται αυξητικά σε μικροβαρύτητα κατά 2,1 και 1,2 φορές σε MOLT-4 και DLD-1 αντίστοιχα (Σχήμα 3Α).

CDK1

Κυτταρικός γονίδιο της κινάσης κύκλο,

CD117

-proto-ογκογονίδιο,

JunB

-transcription παράγοντα και άμεσου πρώιμου γονιδίου,

MYC

-proto-ογκογονιδίου έκφραση σε DLD-1 και MOLT-4 B Real time PCR ανάλυση σε HL-60

CCNE1

και

CDK2

,

CCNB1

και

CDK1

, ογκογονίδια:.

CD117

και

MYC

, Καρκίνος προγνωστικοί δείκτες

CD105

,

CD90

και

CD71

γονιδιακή ανάλυση της έκφρασης σε HL-60, ένα προμυελοκυτταρική λευχαιμία γραμμή

Ως πρόσθετο έλεγχο για όγκο αίματος (και της ανάρτησης) πολιτισμούς, ελέγξαμε τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων του κυτταρικού κύκλου γονίδια και ογκογονίδια σε ένα προμυελοκυτταρική λευχαιμία κυτταρική γραμμή, HL-60. Real time PCR αποκάλυψε την ρύθμιση προς τα επάνω του

CCNE1

και

CDK2

σε HARV καλλιέργειες με

CDK2

είναι σημαντικά up-ρυθμίζεται (1,1 και 1,8 φορές αντιστοίχως) (Σχήμα 3Β) .

CCNB1

και

CDK1

γονιδιακή έκφραση ήταν απορυθμίζεται με

CDK1

είναι μέχρι ρυθμιζόμενη 1,5 φορές και

CCNB1

κάτω ρυθμίζονται κατά 0,8 φορές (Εικόνα 3Β). Σημαντικά, τα ογκογονίδια proto

CD117

και

MYC

ήταν εξαιρετικά μέχρι ρυθμίζονται μικροβαρύτητας κατά 4,7 φορές και 10,8 φορές, αντίστοιχα (Σχήμα 3Β). Παρόμοια με την κυτταρική γραμμή DLD-1, HL-60 επίσης εκφράζει επί της

MYC

γονίδιο συστατικώς υπό πρότυπες συνθήκες. Οι προγνωστικοί δείκτες

CD71

,

CD105

και

CD90

ήταν δυσρυθμισμένη υπό μικροβαρύτητας κατά 0,75 φορές (μειωτικά), 1,4 φορές (ρυθμίζεται προς τα πάνω) και 2,1 φορές (ρυθμίζεται προς τα πάνω), αντίστοιχα ( Σχήμα 3Β). Ενδογλίνη (

CD105)

βοηθά νεοαγγείωση στον καρκίνο [14] και

CD90

έκφραση υποδηλώνει μία θετική πρόγνωση ως λευχαιμικά προγονικά κύτταρα σε AML που είναι ικανό να διατηρεί την ασθένεια in vitro και in vivo δεν εκφράζουν CD90 [15]. Πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση ενός δείκτη υποψηφίου κυτταρικού κύκλου, ογκογονίδιο, παράγοντας μεταγραφής και πρόοδο του καρκίνου έδειξε τόσο αυξητική ρύθμιση και αρνητική ρύθμιση. Καθώς το κυτταρικό κύκλο ρυθμίζεται από ένα πλήθος παραγόντων, πολλοί από τους οποίους θα μπορούσε να επηρεαστεί από μικροβαρύτητας, μια «συλλογική» προς τα κάτω ρύθμιση ή απορρύθμιση των διαδικασιών που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο μπορεί να επικυρώσει την παρατηρούμενη φυσιολογική διακοπή ή μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων κάτω από μικροβαρύτητας. Προς το σκοπό αυτό, ένα γονιδίωμα ευρεία έκφραση προφίλ χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες DNA διεξήχθη. Το γονιδιακό προφίλ του επέτρεψε επίσης μας να προβούμε σε εικασίες σχετικά με την επίδραση της μικροβαρύτητας στις κεντρικές οδούς του καρκίνου, όπως το σύστημα σηματοδότησης Notch, και τα επίπεδα έκφρασης των νέων ρυθμιστικών αρχών, όπως microRNA.

ανάλυση μικροσυστοιχιών της DLD-1 και MOLT- 4 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μικροβαρύτητα

ανάλυση Microarray αποκάλυψε 1.801 και 2.542 γονίδια πάνω και κάτω, ρυθμίζονται περισσότερο από 2 φορές σε DLD-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μικροβαρύτητα σύγκριση με στατικό έλεγχο. MOLT-4 καλλιέργειες υπό μικροβαρύτητα εκφράζονται διαφορικά ένα σύνολο 349 και 444 γονιδίων πάνω και κάτω ρυθμίζονται πάνω από 2 φορές, αντίστοιχα. Ο Πίνακας 1 αντιπροσωπεύει μια μικρή λίστα των κοινών γονιδίων απελευθερωμένης μεταξύ των δύο κυτταρικές σειρές. Ένας πλήρης κατάλογος των εξαιρετικά απορύθμιση των γονιδίων μεταξύ των δύο κυτταρικές σειρές παρέχεται σε S2, S3 και S4 πίνακες. Τα εξαιρετικά απορυθμίζεται γονίδια αντιπροσωπεύονται στα δικαιολογητικά πίνακες πληροφοριών περιέχουν ενδιαφέροντα υποψήφια γονίδια, όπως το ριβονουκλεοτιδικής αναγωγάσης Μ2 (

RRM2

) υπομονάδα η οποία είναι η πιο κάτω ρύθμιση γονιδίων σε DLD-1 κάτω από μικροβαρύτητας. RRM2 υπερέκφραση μπορεί να σχετίζεται με τον καρκίνο του ορθού Colo (CRC) εξέλιξη και μπορεί να παίξει σημαντικό ρόλο στην διείσδυση και την μετάσταση του CRC [16]. Χρησιμεύει ως προγνωστικός βιοδείκτη και προβλέπει κακή επιβίωση του παχέος εντέρου [17]. Ενώ και οι δύο κυτταρικές σειρές παρουσίασαν αλλαγές στην βιωσιμότητα των κυττάρων του κυτταρικού κύκλου και, μικροβαρύτητα προκάλεσε μεγαλύτερη ανταπόκριση από το στερεό κυτταρική γραμμή όγκου DLD-1. Υπο θανατηφόρα στρες μπορεί να ωθήσει ένα κύτταρο σε μια κατάσταση που είναι παρόμοια με την κυτταρική γήρανση [18]. Το άγχος που προκαλείται από την πρόωρη γήρανση (SIPS) μπορεί να συμβεί μετά από βλάβη του DNA, το οξειδωτικό στρες και θεραπεία με αναστολείς αποακετυλάσης ιστόνης [18]. Το φαινόμενο της SIPS μπορεί να εξηγήσει την απώλεια της κυτταρικής βιωσιμότητας σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. ανάλυση μικροσυστοιχιών αποκάλυψε την προς τα κάτω ρύθμιση του γονιδίου του ρετινοβλαστώματος (

RB1 ​​

? -0,42 μεταβολή log φορές) σε DLD-1 κυττάρων υπό μικροβαρύτητα και καθώς η παρουσία της πρωτεΐνης RB1 είναι απαραίτητη για SIPS [19], η αντίδραση των DLD-1 κύτταρα σε μικροβαρύτητα μπορεί να μην είναι μέσα SIPS και των σχετικών οδών της. Αντίθετα MOLT-4 κύτταρα παρουσιάζουν υπερέκφραση RB1 (0,47 log αλλαγή φορές) υπό μικροβαρύτητας και την απώλεια της βιωσιμότητας των κυττάρων μπορεί να αποδοθεί σε SIPS. Αυτό θα μπορούσε επίσης να εξηγήσει τη σχετικά μικρότερο αριθμό γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά σε κύτταρα MOLT-4 σε σύγκριση με το προφίλ γονιδιακής έκφρασης των κυττάρων DLD-1 υπό μικροβαρύτητα. Άλλες βιοδείκτες γουλιές, απολιποπρωτεΐνης J και ινωδονεκτίνη, που υπερεκφράζονται σε αντιγραφική γήρανση και SIPS [19], δεν ήταν εκφράζονται διαφορικά σε DLD-1 ή MOLT-4 υπό μικροβαρύτητα. Ο μηχανισμός γουλιές δεν είναι απολύτως κατανοητή ακόμη και αν μικροβαρύτητας μπορεί να είναι ένα έναυσμα για μονοπάτια SIPS πρέπει να επιβεβαιωθεί. Τα στοιχεία που συζητήθηκαν στην παρούσα έκδοση έχουν κατατεθεί στη γονιδιακή έκφραση Omnibus NCBI και είναι προσβάσιμη μέσω του αριθμού ένταξη GEO Σειρά GSE69271 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69271) . Τα διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων από τα δεδομένα μικροσυστοιχιών μελετήθηκαν για την υπεραφθονία τους σε διαφορετικές Γονιδιακή Οντολογία (GO) όρους, καθώς και μονοπάτια χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης μικροσυστοιχιών DAVID. Η βαθμολογία εμπλουτισμός των επιμέρους όρων GO ότι τα γονίδια που σχετίζονται με αυτή χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των διαδικασιών που ήταν σημαντικά απορυθμισμένη. GO ή ανάλυση λειτουργικών εμπλουτισμός διεξήχθη με πάνω από 2 φορές-διαφορικά εκφρασμένα γονίδια σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Λειτουργική ταξινόμηση των γονιδίων που βασίζεται στην ομοιότητα σε λειτουργία ή την οικογένειά πραγματοποιήθηκε.

Η

Εκκαθάριση των υποψηφίων γονιδίων που επιλέγονται από

δεδομένων μικροσυστοιχιών

ανάλυση μικροσυστοιχιών αποκάλυψε την προς τα πάνω ρύθμιση του

CCNB1

και η ρύθμιση προς τα κάτω του

ROMO1

και

HES1

γονίδια όταν MOLT-4 κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό μικροβαρύτητας (Σχήμα 4Α). Ομοίως, η ανάλυση μικροσυστοιχιών κατέδειξε την ρύθμιση προς τα κάτω του

CDK2

γονιδίου και η ρύθμιση προς τα άνω του

STAT3

και

HEY1

γονίδια στο DLD-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό μικροβαρύτητας (Σχήμα 4Β). ανάλυση μικροσυστοιχιών αποκάλυψε ότι και οι δύο κυτταρικές σειρές συνήθως έδειξε την ρύθμιση προς τα κάτω των

CCNE1

και την προς τα πάνω ρύθμιση του

CD71

και

CD44

γονίδια (Σχήμα 4C, σχήμα 5Α). Αξίζει να σημειωθεί ότι η απορρύθμιση του γονιδίου υποδοχής microRNA-22 και τους στόχους της ήταν επίσης κάτω μικροβαρύτητας (Σχήμα 5Β). mRNA έκφραση αυτών των υποψηφίων γονιδίων εκπρόσωπος του κυτταρικού κύκλου, μεταγραφική ρύθμιση και τον καρκίνο εξέλιξης επικυρώθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR. Η κυκλίνη Β1 η οποία έχει αναφερθεί ως ιδιοσυστασιακά υπερεκφράζεται σε ανθρώπινο ορθοκολικούς καρκίνους [20] υπερεκφράζεται σε MOLT-4 κύτταρα τα οποία έδειξαν μία 7,5 φορές αύξηση του

CCNB1

έκφραση του mRNA υπό μικροβαρύτητα (Σχήμα 4Α). Χαμηλότερα έκφραση του

ROMO1

οδηγεί σε αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων [21] και MOLT-4 κύτταρα εξέφρασαν 0,5 φορές λιγότερο

ROMO1

από την στατική ελέγχου (Εικόνα 4Α). Μεταγραφικά και ελεγκτές αντιγραφή ρυθμίζουν ογκογονίδια και προγνωστικοί δείκτες και εκδηλώσεις επιρροή του κυτταρικού κύκλου.

HES1

είναι ένας μεταγραφικός καταστολέας και εμπλέκεται στην επιδιόρθωση του DNA [22] και

HES1

γονιδιακή έκφραση ελέγχεται από το Notch και το σύστημα σηματοδότησης Ιούνιο [23].

HES1

γονιδιακή έκφραση ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά 0,7 φορές σε MOLT-4 (Σχήμα 4Α) υπό μικροβαρύτητα.

CDK2

γονιδιακής έκφρασης σε κύτταρα DLD-1 ήταν 0.5 φορές χαμηλότερη σε σύγκριση με στατικό έλεγχο (Εικόνα 4Β), ενώ

HEY1

, ένας μεταγραφικός ρυθμιστής ήταν ιδιαίτερα επάνω ρυθμίζεται από 10,3 φορές (Σχήμα 4Β). μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 (

STAT3

) είναι ένας ογκογόνος παράγοντας μεταγραφής ο οποίος ενεργοποιείται και παρεκκλίνοντα εκφράζεται σε πολλούς καρκίνους του παχέος [24] και τα γονίδια αυξορρύθμιση επικυρώνεται με RT-PCR (Σχήμα 4Β). γονιδιακή έκφραση της κυκλίνης Ε1 ρυθμίζεται προς τα κάτω και στις δύο κυτταρικές σειρές υπό μικροβαρύτητα (Σχήμα 4C). Η κυκλίνη Ε1 ελέγχει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μέσω της G1 φάσης από την αλληλεπίδρασή του με εξαρτώμενων από κυκλίνη κινάση 2 [25]. Ομοίως, και οι δύο κυτταρικές γραμμές εξέφρασαν μείωσε τα επίπεδα του

CD71

, το οποίο κωδικοποιεί μια διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη που είναι υπεύθυνο για την κυτταρική πρόσληψη σιδήρου (σχήμα 4Γ). DLD-1 εκφράζεται σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα (0,42 φορές) σε μικροβαρύτητας. Υψηλότερη έκφραση του

CD71

συνδέεται με αρνητική πρόγνωση για πολλούς συμπαγείς όγκους και μερικά λεμφώματα [26,27] και πολυάριθμες μελέτες έχουν βρει μια θετική συσχέτιση μεταξύ αποθήκευσης σιδήρου και του κινδύνου των όγκων όπως σε ορθοκολικό καρκίνωμα [28 ]. Σημαντικά, η

CD44

γονίδιο ρυθμίζεται αυξητικά στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4C, Σχήμα 5Α). Ενώ οι περισσότερες ισομορφές του

CD44

σχετίζονται με την κακοήθη μορφή της νόσου, ορισμένες μορφές

CD44

εμποδίζει τα καρκινικά κύτταρα από το άπλωμα του πρωτογενούς θέσης [29]. Όπως

CD44

εκφράζεται και στις δύο καρκίνων του παχέος εντέρου και λεμφοειδούς και η ανάλυση του mRNA συνεπάγεται πολλαπλές παραλλαγές, ερευνήσαμε τα επίπεδα πρωτεΐνης του στην DLD-1 και MOLT-4 καλλιέργειες σε μικροβαρύτητα. Western blotting για πρότυπο ισομορφή

CD44

δείχνει υψηλότερα επίπεδα της πρωτεΐνης στις δύο κυτταρικές σειρές πάνω στατικού ελέγχου (Σχήμα 5Α). Πυκνομετρική ανάλυση των ζωνών και εξομάλυνση με τις τιμές της β-ακτίνης καταδεικνύει σημαντική ρύθμιση προς τα επάνω του

CD44

πρωτεΐνης σε μικροβαρύτητας. microRNA έχουν ταυτοποιηθεί ως πιθανοί ογκογονίδια ή καταστολείς των όγκων [30]. Το γονίδιο ξενιστή miR-22,

MIR22HG

ήταν ιδιαίτερα ρυθμίζεται αυξητικά σε DLD-1 (Log πάσο 4.4), αλλά δεν εκφράζονται διαφορικά σε MOLT-4 (Σχήμα 5Β). miR-22 λειτουργεί ως καταστολέας των όγκων μέσω μετα-μεταγραφική ρύθμιση του p21 για τον προσδιορισμό της κυτταρικής τύχης [31]. Είναι καταστέλλει την πρόοδο του καρκίνου με την επαγωγή κυτταρικής γήρανσης [32] και ελέγχει ΕΥΗ-1 έκφραση ογκογονιδίου σε μεταστατικά κύτταρα καρκίνου του μαστού [33]. Ορισμένοι στόχοι του miR-22, όπως

SP1

,

CDK6

και

CCNA2

ήταν επίσης σημαντικά μειωτικά (Σχήμα 5Β), ενώ άλλες, όπως η p21 (

CDKN1A

) δεν απορυθμίζεται σημαντικά. Η farnesoid υποδοχέα Χ ρυθμίζει miR-22, το οποίο στοχεύει

CCNA2

στο κόλον και καρκίνο του ήπατος κύτταρα [34]. Real time PCR για miR-22 microRNA παρουσίασαν επίσης 4,18 log προς τα πάνω ρύθμιση φορές σε κύτταρα DLD-1 σύμφωνα με μικροβαρύτητας (Σχήμα 5Β), επιβεβαιώνοντας την πτυχή της αλλαγής που παρατηρείται στην ανάλυση μικροσυστοιχιών. Real Time PCR για miR-22 targets-

CCND1

και

CDKN1A

όμως, δεν παρουσιάζουν σημαντική απορρύθμιση με -0,09 log φορές (ρύθμιση προς τα κάτω) και 0,11 log φορές (μέχρι κανονισμό) αλλαγή, & Gt? & Gt? & Gt?