Abstract

Η στοχευμένη διανομή των χημειοθεραπευτικών παραγόντων είναι μια νέα προσέγγιση για τη θεραπεία του καρκίνου , η οποία παρέχει αυξημένη επιλεκτικότητα και μειωμένη συστηματική τοξικότητα. Έχουμε αναπτύξει πρόσφατα μια πολλά υποσχόμενη σύστημα παροχής φαρμάκου, στο οποίο το αντικαρκινικό φάρμακο νταουνορουμπικίνη (Dau) συνδέθηκε

μέσω

οξίμης δεσμό προς ένα (GnRH-III) παράγωγο ορμόνης απελευθερώσεως γοναδοτροπίνης-III που χρησιμοποιείται ως ένα ήμισυ στόχευσης ( GLP-His-Trp-Lys (Ac) -His-Asp-Trp-Lys (Dau = AOA) -Pro-Gly-NH

2? Glp = πυρογλουταμικό οξύ, Αο = ακετύλιο? AOA = αμινοξυακετυλίου). Αυτό βιοσυζεύκτης ασκείται

in vitro

κυτταροστατική /κυτταροτοξική δράση στην ανθρώπινη μαστού, του προστάτη και του παχέος εντέρου κύτταρα, καθώς και σημαντικές

in vivo ανασταλτική δράση ανάπτυξης όγκου

επί καρκινώματος κόλου ποντικών που φέρουν. Σε προηγούμενες μελέτες μας, Η-Lys (Dau = AOA) -ΟΗ ταυτοποιήθηκε ως το μικρότερο μεταβολίτης που παράγεται με την παρουσία του ήπατος αρουραίου λυσοσωματικής ομογενοποίημα, το οποίο ήταν ικανό να συνδέεται με DNA

in vitro

. Για να πάρετε μια βαθύτερη κατανόηση του μηχανισμού δράσης του βιοσυζεύκτη, οι αλλαγές στο προφίλ έκφρασης πρωτεΐνης του ΗΤ-29 ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων μετά τη θεραπεία με τον βιοσυζεύκτη ή ελεύθερη δαουνορουβικίνη ερευνήθηκαν κατά μάζα πρωτεωμική φασματομετρία-based. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι αρκετές μεταβολισμός σχετίζονται πρωτεΐνες, μοριακών συνοδών και πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην σηματοδότηση είναι διαφορετικά εκφράζεται μετά στοχευμένη χημειοθεραπευτική αγωγή, που οδηγούν στο συμπέρασμα ότι ο βιοσυζεύκτης ασκεί κυτταροτοξική δράση της παρεμβαίνοντας με πολλαπλές ενδοκυτταρικές διεργασίες.

Citation : Schreier VN, Pethő L, Orbán Ε, Marquardt Α, Petre BA, Mező G, et al. (2014) Protein Expression Προφίλ του ΗΤ-29 ανθρώπινου καρκίνου του κόλου κυττάρων μετά κατεργασία με ένα κυτταροτοξικό Νταουνορουμπικίνη-GnRH-III Παράγωγα Bioconjugate. PLoS ONE 9 (4): e94041. doi: 10.1371 /journal.pone.0094041

Επιμέλεια: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Ιταλία

Ελήφθη: 9 Νοεμβρίου, 2013? Αποδεκτές: 10 Μαρτίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 9 Απρ 2014

Copyright: © 2014 Schreier et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Πανεπιστήμιο της Konstanz (Zukunftskolleg, το Project 879/08 και Νέων Ταμείο Μελετητής, το Project 462/12), το Εθνικό Ταμείο ουγγρική Science (OTKA ΝΚ 77485 και Κ 104045) και από την Εθνική Αρχή της Ρουμανίας για την Επιστημονική Έρευνα, CNCs -UEFISCDI (PN-II-RU-TE-2011-3-0038). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Receptor μεσολάβηση χορήγησης φαρμάκου είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για τη θεραπεία του καρκίνου, η οποία μπορεί να παρέχουν αυξημένη επιλεκτικότητα και μειωμένη συστημική τοξικότητα σε σύγκριση με την κλασική χημειοθεραπεία (δηλαδή, χορήγηση δωρεάν αντικαρκινικών φαρμάκων) [1] – [3] . Λαμβάνοντας υπόψη ότι οι υποδοχείς για ορισμένες ρυθμιστικών πεπτιδίων, όπως ορμόνη απελευθέρωσης γοναδοτροπίνης (GnRH? Γνωστή και ως ορμόνη απελευθέρωσης ωχρινοτρόπου ορμόνης, LHRH), είναι εντόνως εκφρασμένη σε μια ποικιλία καρκινικών κυττάρων με σχετικά περιορισμένη έκφραση σε φυσιολογικούς ιστούς, αντιπροσωπεύουν σημαντικό μοριακό στόχοι στη θεραπεία του καρκίνου [4]. Έτσι, GnRH παράγωγο πεπτίδια θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως τμήματα στόχευσης για την προσάρτηση και την επακόλουθη ειδική απελευθέρωση χημειοθεραπευτικών παραγόντων σε GnRH-υποδοχέα (GnRH-R) θετικά καρκινικά κύτταρα. Μετά την εσωτερικοποίηση τους με ενδοκυττάρωση με μεσολάβηση υποδοχέα, οι βιοσυζεύκτες είναι γενικά υποβάλλονται σε επεξεργασία σε λυσοσώματα, οδηγώντας στην απελευθέρωση του ελεύθερου φαρμάκου ή με το σχηματισμό των μεταβολιτών που περιέχει φάρμακο [5], [6].

Μια πολλά υποσχόμενη μητρική αναλόγου GnRH για να χρησιμοποιηθεί ως ένα ήμισυ στόχευσης είναι μύραινα GnRH-III (GLP-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH

2), η οποία συνδέεται με GnRH-R, έχει μια ασήμαντη επίδραση ενδοκρινικό σε θηλαστικά και ασκεί άμεση αντι-πολλαπλασιαστική δράση και στις δύο ορμονοεξαρτώμενου και ανεξάρτητη από τα καρκινικά κύτταρα [7] – [9]. Σε προηγούμενη εργασία μας, έχουν διάφορα παράγωγα βιοσυζεύκτες ανθρακυκλίνης-GnRH-III έχουν σχεδιάσει, συνθέσει και βιοχημικά χαρακτηριζόμενη [10] – [12]. Ένα από τα πιο ελπιδοφόρα συστήματα απελευθέρωσης φαρμάκου έχουν αναπτυχθεί μέχρι σήμερα στα εργαστήριά μας αποτελείται από την δαουνορουβικίνης αντικαρκινικού φαρμάκου (Dau) συνδεδεμένο

μέσω

οξίμη δεσμού σε ένα παράγωγο GnRH-III στην οποία το Ser στη θέση 4 αντικαταστάθηκε από Lys (Ac) [13]. Δαουνορουβικίνη (Σχήμα 1Α) είναι ένας χημειοθεραπευτικός παράγων ο οποίος παρεμβαίνει με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και διαίρεση με μηχανισμούς όπως παρεμβολής DNA, η αναστολή της τοποϊσομεράσης II, σχηματισμό ελευθέρων ριζών, υπεροξείδωση λιπιδίων, κλπ Παρά κλινικά οφέλη της, η χορήγηση του ελεύθερου Dau ακολουθείται από τοξικές παρενέργειες, η πιο σοβαρή από τις οποίες είναι η καρδιοτοξικότητα [14], [15]. Ως εκ τούτου, η προσάρτηση του Dau να ημίση στόχευσης GnRH που βασίζεται πρέπει να παρέχουν αυξημένη επιλεκτικότητα και η μειωμένη συστημική τοξικότητα [12]. Δείξαμε πρόσφατα ότι ο βιοσυζεύκτης GnRH-ΙΙΙ [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] (Εικόνα 1Β) που ασκείται

in vitro

κυτταροστατική /κυτταροτοξική δράση επί του ανθρώπινου μαστού, του προστάτη και του κόλου, με IC

50 τιμές σε χαμηλό εύρος μΜ. Είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι στις ΗΤ-29 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, ο βιοσυζεύκτης εξασκείται υψηλότερη κυτοστατική επίδραση (IC

50 = 7.4 ± 2.6 μΜ) από το γονικό βιοσυζεύκτη στην οποία Dau συνδέθηκε με το φυσικό πεπτίδιο ορμόνη (IC

50 = 27,8 ± 4,2 μΜ). Επιπλέον, στο καρκίνωμα του παχέος εντέρου φέρουν τα ποντίκια, GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] άσκησε σημαντική

in vivo

όγκου ανασταλτική της ανάπτυξης δράση (49,3% αναστολή της ανάπτυξης του όγκου σε σχέση με την ομάδα ελέγχου χωρίς αγωγή) [13]. Επιπλέον, Η-Lys (Dau = AOA) -ΟΗ ταυτοποιήθηκε ως το μικρότερο μεταβολίτης που περιέχει το φάρμακο που παράγεται με την παρουσία του ήπατος αρουραίου λυσοσωματικής ομογενοποίημα, το οποίο ήταν ικανό να συνδέεται με DNA

in vitro

[10], [13], έχει ως αποτέλεσμα ότι θα μπορούσαν να συμβάλουν στην κατανόηση της κυτταροτοξική δράση του βιοσυζεύκτη.

(Α) δαουνορουβικίνης και (Β) οξίμη δαουνορουβικίνη-GnRH-ΙΙΙ παράγωγο βιοσυζεύκτη δεσμός σύνδεσης, GnRH-ΙΙΙ [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)].

η

για να πάρετε μια βαθύτερη κατανόηση του μηχανισμού δράσης της GnRH-III [

4Lys (Ac ),

8Lys (Dau = AOA)] βιοσυζεύκτη, οι αλλαγές στο προφίλ έκφρασης πρωτεΐνης του ΗΤ-29 ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων μετά τη θεραπεία με τον βιοσυζεύκτη ή ελεύθερη Dau ερευνήθηκαν κατά μάζα πρωτεωμική φασματομετρία-based. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι αρκετές μεταβολισμός σχετίζονται πρωτεΐνες, μοριακών συνοδών και πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην σηματοδότηση είναι διαφορετικά εκφράζεται μετά στοχευμένη χημειοθεραπευτική αγωγή, που οδηγούν στο συμπέρασμα ότι ο βιοσυζεύκτης ασκεί κυτταροτοξική δράση της παρεμβαίνοντας με πολλαπλές ενδοκυτταρικές διεργασίες.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

RPMI-1640, ορό εμβρύου μόσχου (FCS) και 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich (Βουδαπέστη, Ουγγαρία). Μη γραμμική ακινητοποιημένη λωρίδες ρΗ κλίση (λωρίδες IPG, ρΗ 3-10 NL, 17 cm) αγοράσθηκαν από την Bio-Rad Laboratories (Μόναχο, Γερμανία), ενώ η εξάρτηση δικιγχονινικού οξέος (BCA) δοκιμασία ήταν ένα προϊόν Pierce (Rockford, Η.Π.Α.). ρυθμιστικού λύσης (0.15 Μ NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton-Χ100, 10 mM Tris-HCl ρΗ = 7.4, 5 mM DTT και αναστολείς πρωτεασών), ρυθμιστικό επανυδάτωση (7 Μ ουρία, 2 Μ θειουρία, 4% CHAPS, 40 mM Tris, 2% Servalyt 3-10), ρυθμιστικό διάλυμα εξισορρόπησης (6 Μ ουρία, 2% SDS, 30% γλυκερόλη, 2,5 mM Tris-HCl) και ρέον ρυθμιστικό (25 mM Tris, 192 mM γλυκίνη και 0,1% SDS) παρασκευάστηκαν στα εργαστήριά μας.

Σύνθεση και χημικών χαρακτηριστικών των GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] ΒΊοοοη

Ο βιοσυζεύκτης GnRH-III [ ,,,0],

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] παρασκευάστηκε με συνδυασμό πεπτιδική σύνθεση στερεάς φάσης και χημικά επιλεκτική πρόσδεση σε διάλυμα όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [13]. Εν συντομία, το παράγωγο aminooxyacetylated του GnRH-ΙΙΙ (GLP-His-Trp-Lys (Ac) -His-Asp-Trp-Lys (ΑΟΑ) -Pro-Gly-NH

2) συντέθηκε σε ρητίνη Rink Amide ΜΒΗΑ σύμφωνα με τη στρατηγική Fmoc /tBu, χρησιμοποιώντας μια ορθογώνια προστατευτική σύστημα για τα κατάλοιπα λυσίνης στις θέσεις 4 και 8 (πρωτόκολλο S1). Νταουνορουμπικίνη συνδέθηκε

μέσω

οξίμης δεσμού με το aminooxyacetylated παράγωγο GnRH-III, αντίδραση η οποία διεξήχθη σε διάλυμα (οξικό 0,2 Μ νάτριο, ρΗ 5) (Σχήμα S1). Μετά τον καθαρισμό του με ημι-HPLC, ο βιοσυζεύκτης (GLP-His-Trp-Lys (Ac) -His-Asp-Trp-Lys (Dau = AOA) -Pro-Gly-NH

2), που χαρακτηρίζεται με αναλυτική HPLC και φασματομετρία μάζας (πρωτόκολλο S2 και S3 και σχήμα S2)

Cells

ΗΤ-29.: κύτταρα καρκινώματος ανθρώπινου κόλον (ATCC ΗΤΒ-38) διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 που περιέχει 10% FCS , L-γλουταμίνη (2 mM) και γενταμικίνη (160 μg /mL). Οι κυτταρικές καλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2.

In vitro κυτταροτοξική δράση

Ο

in vitro

κυτταροτοξική δράση της GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] βχοσυζυγούς και δωρεάν Dau προσδιορίστηκε με ΜΤΤ-ανάλυση. Ένας αριθμός 3 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο απλώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων. Μετά από 24 ώρες επώασης στους 37 ° C, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 6, 24, 48 και 72 ώρες με τον βιοσυζεύκτη ή ελεύθερη Dau διαλυμένο σε μέσο χωρίς ορό (εύρος συγκέντρωσης: 2,6 × 10

-4-10

2 μΜ). Κύτταρα κατεργασμένα με μέσο χωρίς ορό για τα ίδια χρονικά διαστήματα, χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Μετά από αυτό, το διάλυμα ΜΤΤ προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Μετά από 3,5 ώρες επώασης, μοβ κρύσταλλοι που σχηματίζονται από μιτοχονδριακή αφυδρογονάση ένζυμο των ζωντανών κυττάρων. Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν για 5 λεπτά στα 1000 g και το υπερκείμενο απομακρύνθηκε. Οι κρύσταλλοι διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο και η οπτική πυκνότητα (OD) μετρήθηκε στα λ = 540 και 620 nm χρησιμοποιώντας ένα ELISA Reader (αναγνώστη Labsystems MS, Φινλανδία). OD

620 αφαιρέθηκε από OD

540 και το ποσοστό της κυτταροτοξικότητας υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση: όπου OD

θεραπευθεί και OD

ελέγχου αντιστοιχούσαν στις οπτικές πυκνότητες των επεξεργασμένων και ελέγχου κύτταρα, αντίστοιχα. Η κυτταροτοξικότητα% παραστάθηκε γραφικά ως συνάρτηση της συγκέντρωσης, που τοποθετούνται σε μία σιγμοειδή καμπύλη και το IC

50 αξία καθορίστηκε με βάση αυτήν την καμπύλη. IC

50 εκπροσώπησε την συγκέντρωση βχοσυζυγούς ή Dau απαιτείται για να επιτευχθεί 50% αναστολή

in vitro

.

Προετοιμασία κυτταρικά λύματα

Για να προετοιμάσει τα κυτταρικά λύματα , 5 × 10

5 ΗΤ-29 ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα ανά πηγάδι τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων. Μετά από 24 ώρες επώασης στους 37 ° C, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 72 ώρες με τον βιοσυζεύκτη (σε μια συγκέντρωση 3 μΜ) ή ελεύθερη Dau (σε συγκέντρωση 0,15 μΜ). Κύτταρα κατεργασμένα με μέσο κυτταρικής καλλιέργειας για την ίδια χρονική περίοδο, χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Μετά την επώαση, τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν για 5 λεπτά στις 1000 στροφές ανά λεπτό, πλύθηκαν με αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα, ρΗ = 7,3 και στη συνέχεια ένα όγκο 300 μL ρυθμιστικού διαλύματος λύσης προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Τα δείγματα επωάστηκαν για 30 λεπτά σε πάγο και στη συνέχεια οι απομονωμένες μίγματα πρωτεΐνης φυγοκεντρήθηκαν στα 16.000 g για 20 λεπτά στους 4 ° C. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη του διαλυτού κλάσματος προσδιορίστηκε με δοκιμασία BCA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Πρωτεΐνη Ο διαχωρισμός με δύο διαστάσεων-νάτριο Δωδεκυλ Θειικό-πολυακρυλαμιδίου Ηλεκτροφόρηση (2D-SDS-PAGE)

Από τα κυτταρολύματα, οι πρωτεΐνες (500 μg /δείγμα) για πρώτη φορά καταβυθίστηκε με πέντε όγκους παγωμένης ακετόνης στους -28 ° C για 4 ώρες. Μετά την διαλυτοποίηση τους σε ρυθμιστικό επανυδάτωση περιέχει 0.6% διθειοθρεϊτόλη (DTT), παθητική επανυδάτωση 17 cm μη γραμμικής IPG λωρίδες (ρΗ 3-10) πραγματοποιήθηκε για 14 ώρες σε RT. Η ισοηλεκτρική εστίαση (IEF) διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα όργανο κύτταρο Bio-Rad Protean IEF και τις ακόλουθες παραμέτρους: (i) 0-150 V σε 3 λεπτά, (ii) 150 V για 30 λεπτά, (iii) 150-300 V σε 15 λεπτά, (iv) 300 V για 30 λεπτά, (ν) 300 έως 3500 V σε 150 λεπτά, (vi) 3500 V για 12 ώρες. Για τη δεύτερη διάσταση, η κάθε λωρίδα IPG επωάστηκε πρώτα επί 20 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα εξισορρόπησης που περιέχει 1% DTT και για άλλα 20 λεπτά σε ρυθμιστικό εξισορρόπησης που περιέχει 2.5% ιωδοακεταμίδιο (ΙΑΑ). Οι λωρίδες στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε μια 12% SDS πηκτή και ηλεκτροφόρηση πραγματοποιήθηκε σε δύο στάδια: το τρέχον δόθηκε για πρώτη φορά στα 25 mA /πηκτή για ~ 30 λεπτά και στη συνέχεια σε 40 mA /γέλη, έως ότου η χρωστική παρακολούθησης έφθασε στο ανοδικό τμήμα της η γέλη. Μετά από αυτό το στάδιο διαχωρισμού, οι πρωτεΐνες το πρόθεμα για 1 ώρα με 12% τριχλωροξικό οξύ και χρωματίστηκαν όλη τη νύκτα με διάλυμα που περιέχει Coomassie Brillant Μπλε G-250. Μετά τον αποχρωματισμό του υποβάθρου με 25% μεθανόλη σε νερό (ν /ν), τα πηκτώματα σαρώθηκαν με ένα βαθμονομημένο πυκνόμετρο απεικόνισης GS-800 (Bio-Rad Laboratories GmbH, Μόναχο, Γερμανία) με τη χρήση του λογισμικού QuantityOne. Για κάθε δείγμα, τρεις επαναληπτικές 2D-πήγματα συγκριτικά αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό PDQuest 8.0 (Bio-Rad Laboratories GmbH, Μόναχο, Γερμανία), η οποία επέτρεψε την αυτόματη ανίχνευση με χειροκίνητη διορθώσεις και ποσοτικοποίηση της πρωτεΐνης κηλίδες. Η σημασία των διαφορών μεταξύ της πρωτεΐνης κηλίδων αξιολογήθηκε με t-test του Student και μια τιμή ρ μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε ως σημαντική. Πρόσθετες κριτήριο επιλογής ήταν μια φορές τιμή μεταβολής υψηλότερη από δύο.

In-γέλη τρυπτική πέψη

επιλεγμένα σημεία πρωτεΐνης χειροκίνητα αποκόπηκαν και υποβλήθηκαν σε in-gel τρυπτική πέψη όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [16]. Εν συντομία, αποχρωματισμού των πρωτεϊνικών κηλίδων επιτεύχθηκε εκτελώντας τα ακόλουθα βήματα, τα οποία επαναλήφθηκαν μέχρις ότου τα τεμάχια πηκτής ήταν διαφανείς: (i) επώαση των τεμαχίων γέλης με ακετονιτρίλιο-Milli-Q (3:02 ν /ν) μίγμα διαλυτών για 30 λεπτά? (Ii) την ξήρανση χρησιμοποιώντας SpeedVac (Eppendorf AG, Γερμανία) και (iii) την επανυδάτωση με 20 mM όξινου ανθρακικού αμμωνίου (ρΗ 8,0) για 15 λεπτά. Μετά από αυτό, ένα πρόσφατα παρασκευασμένο διάλυμα θρυψίνης (12,5 ng /μL του προσδιορισμού αλληλουχίας βαθμού τροποποιημένων θρυψίνη (Promega, Madison, WI, USA) σε 20 mM διττανθρακικού αμμωνίου, ρΗ 8.0) προστέθηκε στα αποξηραμένα τεμάχια γέλης και επωάστηκαν στους 4 ° C για 45 λεπτά. Στη συνέχεια, το διάλυμα θρυψίνης αντικαταστάθηκε από 20 mM διττανθρακικού αμμωνίου (ρΗ 8,0) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 12 ώρες. Τα τρυπτικά πεπτίδια εκχυλίστηκαν από τη γέλη με ένα μίγμα από ακετονιτρίλιο-0.1% TFA σε νερό Milli-Q (3:02, ν /ν) σε RT (3 χ 60 min).

Μάζα Φασματομετρίας Ανάλυση και πρωτεΐνη Αναγνώριση

Τρυπτική μιγμάτων πεπτιδίων αναλύθηκαν με αντίστροφης φάσης υγρής χρωματογραφίας tandem-νανοψεκασμού φασματομετρία μάζας (LC-MS /MS) χρησιμοποιώντας ένα φασματόμετρο μάζας LTQ-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific, Βρέμη, Γερμανία) και ένα Eksigent nanoHPLC (CA, USA). Τα χαρακτηριστικά της στήλης LC αντίστροφης φάσης ήταν 5 μm, 200 Α μέγεθος πόρων C18 ρητίνης σε ένα i.d. 75 μm χ μήκους 10 επί κομμάτι τριχοειδή διοξειδίου του πυριτίου (Hypersil Gold C18, Thermo Fisher Scientific, Βρέμη, Γερμανία). Μετά την έγχυση του δείγματος, η στήλη πλύθηκε για 5 λεπτά με 90% υγρό εκλούσεως Α (0.1% μυρμηκικό οξύ σε νερό) και 10% υγρό έκλουσης Β (0,1% μυρμηκικό οξύ σε ακετονιτρίλιο). Τα πεπτίδια εκλούστηκαν χρησιμοποιώντας μια γραμμική κλίση από 10-50% εκλούτη Β σε 25 λεπτά και έπειτα 50-80% εκλούτη Β σε 5 λεπτά, σε ένα ρυθμό ροής 300 ΝΙ /min. Το φασματόμετρο μάζας LTQ-Orbitrap λειτουργούσε σε κατάσταση δεδομένων που εξαρτάται στην οποία κάθε πλήρη MS σάρωση ακολουθήθηκε από πέντε MS /MS σαρώσεις, όπου τα πέντε πιο άφθονα μοριακά ιόντα επιλέγονται δυναμικά και κατακερματισμένη από σύγκρουση που προκαλείται διαστάσεως (CID) χρησιμοποιώντας μια κανονικοποιημένη ενέργεια σύγκρουσης του 35% στην παγίδα LTQ ιόντων. Δυναμική αποκλεισμού επετράπη. Φάσματα μάζας Tandem αναζητήθηκαν στη βάση δεδομένων SwissProt πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας Mascot (Matrix Science) με τις ακόλουθες παραμέτρους:. «θρυψίνη» διάσπαση με μία χαμένη διάσπαση, αλκυλίωση με ιωδοακεταμίδιο κυστεΐνη ως σταθερή τροποποίηση και οξείδωση μεθειονίνης ως μεταβλητή τροποποίηση

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Βελτιστοποίηση των συνθηκών επεξεργασίας των κυττάρων με την ΒΊοοοη και δωρεάν Νταουνορουβικίνη

Οι όροι επεξεργασίας των κυττάρων (δηλαδή, ο χρόνος επώασης και συγκέντρωση) με την GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] βχοσυζυγούς και δωρεάν Dau επιλέχθηκαν με βάση την

in vitro

δεδομένων κυτταροτοξικότητα. Τα ΗΤ-29 ανθρώπινου κόλον καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με τον βιοσυζεύκτη ή ελεύθερη Dau σε διαφορετικές συγκεντρώσεις για 6, 24, 48 και 72 ώρες, αντίστοιχα. Ελεύθερη Dau άσκησαν κυτταροτοξική δράση ακόμη και μετά από 6 ώρες, η οποία ήταν εντονότερη με το χρόνο. Η χαμηλότερη IC

50 αξίας (0,26 μΜ) καθορίστηκε μετά από 72 ώρες επώασης. Σε αντίθεση, ο βιοσυζεύκτης ήταν κυτταροτοξική μόνο μετά από 72 ώρες (IC

50 = 11,5 μΜ)? Ως εκ τούτου, ο χρόνος επεξεργασίας των 72 h χρησιμοποιήθηκε σε περαιτέρω μελέτες πρωτεομικής. Οι επιλεγμένες συγκεντρώσεις θεραπεία κυττάρων ήταν κάτω από τα IC

50 τιμές, δηλαδή 0,15 μΜ για δωρεάν Dau και 3 μΜ για βιοσυζεύκτη. Είναι σημαντικό να σημειωθούν οι διαφορετικές IC

50 τιμές και κατά συνέπεια διαφορετικές κυτταροτοξικές ιδιότητες των ελεύθερων και συζευγμένου Dau που θα μπορούσε να εξηγηθεί από τους μηχανισμούς της κυτταρικής πρόσληψης, δηλαδή παθητική διάχυση στην περίπτωση της ελεύθερης Dau

vs.

μεσολάβηση υποδοχέα ενδοκυττάρωση, η οποία ακολουθείται από ενδοκυτταρική επεξεργασία της GnRH-ΙΙΙ [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] βιοσυζεύκτης.

Αλλαγές στο Protein Expression Προφίλ των ΗΤ-29 ανθρώπινη κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου μετά χημειοθεραπευτική αγωγή

μετά την βελτιστοποίηση των συνθηκών θεραπείας, τα ΗΤ-29 ανθρώπινου κόλον καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 72 ώρες με τον GnRH-ΙΙΙ [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] βχοσυζυγούς ή δωρεάν Dau. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι τμήμα. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη του υπερκειμένου κλασμάτων προσδιορίστηκε με δοκιμασία BCA και ήταν κατά μέσο όρο 2.34 mg /mL για τα μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος, 2,94 mg /mL για Dau-θεραπεία και 3,18 mg /ml για κύτταρα βιοσυζεύκτης φάρμακο.

οι πρωτεΐνες στη συνέχεια διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση 2D-γέλης χρησιμοποιώντας 3-10 μη γραμμικής λωρίδες IPG και 12% πηκτώματα. Μετά τη χρώση Coomassie, τα μοτίβα γέλη συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό PDQuest 8.0. Διαφορετικά εκφρασμένες πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε in-gel τρυπτική πέψη, ακολουθούμενη από nanoLC-tandem φασματομετρικής ανάλυσης μάζας των τρυπτικών πεπτιδικών μιγμάτων και αναζήτησης της βάσης δεδομένων. Στο σχήμα 2, οι πρωτεΐνες αναλύονται υποδηλώνονται με ένα βέλος και εμφανίζονται μόνο στο πήκτωμα ελέγχου. Οι πρωτεΐνες βρέθηκε ότι εκφράζεται διαφορετικά μετά στοχευμένη χημειοθεραπευτική αγωγή (fold αλλαγή & gt? 2? Ρ & lt? 0,05? Πίνακας 1 και Πίνακας S1) μπορούν να ταξινομηθούν στις ακόλουθες λειτουργικές κατηγορίες: (i) μοριακών συνοδών, (ii) πρωτεΐνες του μεταβολισμού που σχετίζονται και (iii) πρωτεΐνες που συμμετέχουν στη σηματοδότηση.

(Α) χωρίς θεραπεία, (Β) βιοσυζεύκτη επεξεργασμένου και (C) δαουνορουβικίνη επεξεργασμένα καρκινικά κύτταρα. Εμφανίζεται μόνο στο πήκτωμα έλεγχο, βέλη και αριθμούς σημείο αναφέρει τα σημαντικά διαφορετικά σημεία της πρωτεΐνης.

Η

Μεταξύ των μοριακών συνοδών, η έκφραση του θερμικού σοκ 70 kDa πρωτεΐνη 1Α /1Β (Hsp70) βρέθηκε να είναι σημαντικά μειωμένη μετά την επεξεργασία με τον GnRH-ΙΙΙ [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] βιοσυζεύκτη, ενώ το ελεύθερο Dau δεν είχε καμία αξιοσημείωτη επίδραση στην έκφραση του σε ΗΤ-29 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα κόλου σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (πρωτεΐνη κηλίδα Ρ1). Προηγούμενες αναφορές έχουν δείξει ότι η επαγόμενη από στρες Hsp70 είναι ένα μοριακό συνοδό οριακά εκφράζεται σε μη τεταμένη φυσιολογικά κύτταρα, αλλά υπερεκφράζεται σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, αυξημένη έκφραση της Hsp70 σε καρκινικά κύτταρα έχει συσχετιστεί με την εξέλιξη της νόσου, μετάσταση, την αντίσταση στη χημειοθεραπεία και γενικά κακή πρόγνωση των ασθενών. Αυτές οι λειτουργίες μπορεί να εξηγηθεί από αντι-αποπτωτική ιδιότητες, βοηθώντας τα κύτταρα να επιβιώσουν στρεσογόνες συνθήκες, όπως η δράση των χημειοθεραπευτικών παραγόντων [17] – [19]. Η ρύθμιση προς τα κάτω της HSP70 έχει βρεθεί ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και επάγει την απόπτωση. Έτσι, Hsp70 έχει προταθεί ως ένα σημαντικό μοριακός στόχος στη θεραπεία καρκίνου και γίνονται προσπάθειες για την ανάπτυξη Hsp70 ρυθμιστές (π.χ., αναστολείς μικρού μορίου) [20] – [22]. Στην εργασία μας, η θεραπεία των ΗΤ-29 ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου κόλου με μία μόνο δόση του ελεύθερου Dau δεν επηρέασε την έκφραση της Hsp70 πρωτεΐνης. Είναι ενδιαφέρον ότι η προσάρτηση Dau σε ένα παράγωγο της GnRH-III που χρησιμοποιείται ως τμήμα στόχευσης οδήγησε σε βιοσυζεύκτη με ανασταλτικές ιδιότητες για την Hsp70 (Πίνακας 1).

Μια άλλη πρωτεΐνη με δραστικότητα συνοδού, η οποία βρέθηκε να εκφράζεται διαφορετικά σε ΗΤ-29 κυττάρων μετά την επεξεργασία τους με την GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] βιοσυζεύκτη, ήταν Calreticulin (πρωτεΐνη σημείο Ρ2). Οι επιπτώσεις αυτής της πρωτεΐνης στον καρκίνο έχουν πρόσφατα αναθεωρηθεί από Zamanian

et al.

[23]. υπερέκφραση του έχει αναφερθεί σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων (π.χ., του μαστού, της ουροδόχου κύστης, του οισοφάγου, του παγκρέατος, του παχέος εντέρου, του καρκίνου του στομάχου, κ.λ.π.) και βρέθηκε να συνδέεται με αυξημένη εισβολή, μετάσταση και φτωχή πρόγνωση [23]. Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα προηγούμενα ευρήματα, Calreticulin μπορούσε επίσης να αποτελέσει ένα θεραπευτικό στόχο τον καρκίνο, του οποίου η μειωμένη έκφραση μπορεί να παρέχει ένα θεραπευτικό όφελος. Στην παρούσα μελέτη, σε αντίθεση με την αγωγή με ελεύθερη Dau, η οποία δεν είχε καμία σημαντική επίδραση στην έκφραση Calreticulin, ο βιοσυζεύκτης εξασκείται μία ανασταλτική δράση (δηλαδή, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα, στα αυτά αντιμετωπίζονται βιοσυζεύκτη το επίπεδο Calreticulin ήταν μέσο όρο τέσσερις φορές μικρότερη? βλέπε πίνακα 1)

σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα και επεξεργασμένα Dau ΗΤ-29 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, η αγωγή με το βιοσυζεύκτη οδήγησε σε μειωμένη έκφραση πρωτεΐνης ισομεράσης δισουλφιδίου (PDI), μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη. η οποία διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην αναδίπλωση πρωτεϊνών καταλύοντας το σχηματισμό, θραύσεως και αναδιάταξη των ενδομοριακών δισουλφιδικών γεφυρών (πρωτεΐνη spot P3). PDI είναι γνωστό ότι λειτουργεί ως συνοδός που αναστέλλει την συσσωμάτωση των λανθασμένα πτυχωμένων πρωτεϊνών. Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι η έκφραση του PDI είναι αυξημένη σε καρκινικά κύτταρα και αυτή η πρωτεΐνη έχει προταθεί ως βιοδείκτη για ορισμένους τύπους καρκίνου, όπως ο καρκίνος του παχέος εντέρου ή του μαστικού ογκογένεση [24], [25]. Επιπλέον, Goplen

et al

. έχουν δείξει ότι η PDI έντονα εκφράζεται σε επεμβατικές κύτταρα γλοιώματος, παίζουν σημαντικό ρόλο στη μετανάστευση των κυττάρων του όγκου και την εισβολή, δράσεις που θα μπορούσαν να ανασταλούν αποτελεσματικά από ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ΡϋΙ, όπως επίσης και bacitracin [26].

Εκτός από μοριακές chaperones, η έκφραση του μεταβολισμού που σχετίζονται με πρωτεΐνες όπως UDP-γλυκόζη 6-αφυδρογονάση (UGDH) επηρεάστηκε από την χημειοθεραπευτική αγωγή (πρωτεΐνη spot Ρ4). Ενώ η ελεύθερη Dau είχε θετική επίδραση στην έκφραση UGDH, η εφαρμογή του βιοσυζεύκτη είχε ανασταλτική δράση. Η τελευταία μπορεί να συμβάλει στη θεραπεία του καρκίνου, αφού οι ανταγωνιστές UGDH προταθεί ως χρήσιμοι θεραπευτικοί παράγοντες [27], [28]. Αυτό βασίζεται στην εκτίμηση ότι αυξημένα γλυκοζαμινογλυκάνης σχηματισμό (π.χ., υαλουρονάνη), στην οποία UGDH παίζει καθοριστικό ρόλο, εμπλέκεται σε μια ποικιλία ασθενειών του ανθρώπου, συμπεριλαμβανομένης της εξέλιξης του όγκου [29].

Τόσο η βιοσυζεύκτη και δωρεάν Dau επηρέασε σημαντικά την έκφραση της πρωτεΐνης του επιδερμικού λιπαρού οξέος δέσμευσης (Ε-ΡΑΒΡ) (πρωτεΐνη κηλίδα Ρ5). Οι FABPs είναι πολυλειτουργικές πρωτεΐνες που εμπλέκονται στο μεταβολισμό των λιπιδίων, αλλά και στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, της ανάπτυξης και οδούς επιβίωση, καθώς και φλεγμονώδεις και μεταβολικές αποκρίσεις [30]. Επιπλέον, μεταβάλλονται πρότυπα έκφρασης FABP περιγράφηκαν για διαφορετικούς τύπους καρκίνου, γεγονός που υποδηλώνει ότι FABPs διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση. Για παράδειγμα, σε μια πρόσφατη μελέτη από Junqin Li

et al.

Έχει βρεθεί ότι E-FABP, καθώς και Ήπατος-FABP και καρδιάς ή των μυών-FABP, εμπλέκονται στην ανάπτυξη της επεμβατικής πορογενές καρκίνο του μαστού, αφού τα επίπεδά τους ήταν σημαντικά αυξημένα σε πορογενές καρκίνωμα διηθούντα σύγκριση με ιναδένωμα [31]. Αυξημένη έκφραση της Ε-FABP ανιχνεύθηκε επίσης σε καρκίνο του ενδομητρίου και στη χημειοθεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές [32], [33]. Έτσι, E-FABP μπορεί να αντιπροσωπεύουν ένα άλλο μοριακό στόχο στη θεραπεία του καρκίνου

Αν και δεν επηρεάζονται σημαντικά από την χημειοθεραπευτική αγωγή, την έκφραση της πρωτεΐνης ΟΤΡάσης ενεργοποίησης Ran-ειδική. (Ονομάζεται επίσης πρωτεΐνη Ran-πρόσδεσης 1? RanBP1) (πρωτεΐνη spot Ρ6) μειώθηκε μετά από αγωγή με τον βιοσυζεύκτη (2,21 φορές μεταβολής, p = 0.05). Ran είναι ένα μικρό ΘΤΡάσης που λειτουργεί ως μοριακός διακόπτης με σύνδεση είτε GTP ή το ΑΕΠ. Ένα βασικό ρυθμιστή αυτής της διαδικασίας είναι ΟΤΡάσης ενεργοποίησης πρωτεΐνη Ran-ειδική (RanBP 1), το οποίο καταλύει επίσης την υδρόλυση GTP του Ran. Έχει βρεθεί ότι Ran και Ran είναι δεσμευτικές πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε ένα ευρύ φάσμα των θεμελιωδών κυτταρικών διαδικασιών (π.χ., πυρηνοκυτταροπλασματικής μεταφορά, συναρμολόγηση μιτωτικής ατράκτου, πυρηνικό φάκελο και σχηματισμού συμπλόκου πυρηνικού πόρου) καθώς επίσης και σε κυτταρικό θάνατο, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη διαφοροποίηση των κυττάρων και κακοήθη μετασχηματισμό (βλέπε [34] για ανασκόπηση). Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι η έκφραση του Ran και RanBP1 αυξάνεται σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου και ότι η κατάργηση της RanBP1 μπορεί να οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο. Λαμβανόμενα μαζί αυτά τα αποτελέσματα, έχει προταθεί ότι τόσο Ran και Ran-ειδική πρωτεΐνη ΟΤΡάσης ενεργοποίησης είναι καλοί υποψήφιοι ως μοριακοί στόχοι στη θεραπεία του καρκίνου [34], [35].

Σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο ΗΤ-29 καρκινικά κύτταρα κόλου, η έκφραση της γουανίνης νουκλεοτιδίου δέσμευσης πρωτεϊνική υπομονάδα βήτα-2-σαν 1 (GNB2L1, επίσης γνωστή ως υποδοχέας της ενεργοποιημένης πρωτεΐνης κινάσης C 1, RACK1) (πρωτεΐνη κηλίδα Ρ7) επηρεάστηκε από τη θεραπεία με τον βιοσυζεύκτη, αλλά όχι σημαντικά (2,25 φορές η αλλαγή? p = 0,0773). Ωστόσο, η έκφραση αυτής της πρωτεΐνης ήταν σημαντικά διαφορετική στην βιοσυζεύκτη

vs.

Dau κατεργασμένων κυττάρων (p = 0,0113), ένα κατώτερο ποσό που ανιχνεύθηκαν στα κύτταρα αγωγή βιοσυζεύκτη. GNB2L1 έχει βρεθεί ότι παίζουν κρίσιμο ρόλο σε πολλές ενδοκυτταρικές οδούς μεταγωγής σήματος. Όσον αφορά τις πιθανές επιπτώσεις της στην ανάπτυξη και την πρόοδο του καρκίνου, έχει δειχθεί ότι προάγει τον πολλαπλασιασμό RACK1 μαστού καρκίνωμα και εισβολή /μετάσταση

in vitro

και

in vivo

και η έκφρασή της σχετίζεται με κακή πρόγνωση. Επιπλέον, η μείωση της έκφρασης RACK1 οδήγησε στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων

in vitro

[36]. Παρόμοια αποτελέσματα έχουν επίσης αναφερθεί στην περίπτωση άλλων τύπων καρκίνου όπως μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και καρκίνωμα κόλου [37].

Εν κατακλείδι, η θεραπεία με τον βιοσυζεύκτη δαουνορουβικίνη-GnRH-ΙΙΙ παράγωγο κατέληξε σε αλλαγές στο προφίλ έκφρασης πρωτεΐνης του ΗΤ-29 κύτταρα καρκίνου κόλου. Ειδικότερα, μοριακών συνοδών, πρωτεΐνες που σχετίζονται με το μεταβολισμό και πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη σηματοδότηση επηρεάστηκαν από τη στοχευμένη χημειοθεραπευτική αγωγή, η έκφρασή τους είναι ρυθμισμένα προς τα κάτω στα κύτταρα που κατεργάστηκαν βιοσυζεύκτη σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα και Dau-υποβάλλονται σε αυτήν. Προηγούμενες μελέτες έχουν καταδείξει τις επιπτώσεις αυτών των πρωτεϊνών στον καρκίνο, υποδεικνύοντας ότι κάτω ρύθμιση τους μπορεί να είναι θεραπευτικού οφέλους (π.χ., Hsp70, πρωτεΐνη δισουλφίδιο ισομεράση, κλπ). Πρόσφατη πρόοδος στην θεραπεία του καρκίνου έχει προτείνει τη σημασία της στόχευσης περισσότερες από μια πρωτεΐνες ή μονοπάτι σηματοδότησης. Μία πιθανή προσέγγιση για να επιτευχθεί αυτό θα μπορούσε να στοχευθεί χημειοθεραπεία του καρκίνου. Με βάση τα αποτελέσματά μας, μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι η GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] βχοσυζυγούς ασκεί κυτταροτοξική δράση του σε ΗΤ-29 του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα παρεμβαίνοντας πολλαπλές ενδοκυτταρικές διεργασίες και αποτελεί μια πολλά υποσχόμενη στοχευμένη χημειοθεραπευτικό παράγοντα.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Σύνθεση βιοσυζεύκτη ομολόγων που συνδέονται με οξίμη δαουνορουβικίνη-GnRH-III παράγωγο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0094041.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Χημικός χαρακτηρισμός της GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] βιοσυζεύκτη. (Α) προφίλ αναλυτικής HPLC και (Β) φάσμα μάζης παγίδας ESI-ιόντων. Ο κατακερματισμός των γλυκοζιδικών δεσμών υπό συνθήκες φασματομετρίας μάζας, με αποτέλεσμα την απώλεια της δαουνοσαμίνης, συμβολίζεται με αστερίσκο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0094041.s002

(ΔΕΘ)

Πίνακα S1. .

Χαρακτηριστικά των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών με αλλοιωμένη έκφραση οφείλεται στην χημειοθεραπευτική αγωγή των ΗΤ-29 κύτταρα καρκίνου κόλου

DOI: 10.1371 /journal.pone.0094041.s003

(DOC)

πρωτοκόλλου S1.

Σύνθεση aminooxyacetylated-GnRH-III παράγωγο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0094041.s004

(DOC)

πρωτόκολλο S2.

υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0094041.s005

(DOC)

πρωτόκολλο S3. ανάλυση φασματομετρίας μάζας

doi:. 10.1371 /journal.pone.0094041.s006

(DOC)