Αφηρημένο

Προηγούμενες μελέτες πρότειναν γονίδιο που συμπληρώνουν την ομάδα αταξία-τηλαγγειεκτασία D (ATDC) ως ογκογονίδιο σε πολλούς τύπους καρκίνου. Πάντως, έκφραση και βιολογικές λειτουργίες του σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) παραμένουν ασαφείς. Εδώ, ερευνήσαμε πρότυπο έκφρασης του σε 109 περιπτώσεις ανθρώπινης δειγμάτων NSCLC με ανοσοϊστοχημεία και διαπίστωσε ότι ATDC υπερεκφράστηκε σε 62 από τα 109 δείγματα NSCLC (56,88%). ATDC υπερέκφραση συσχετίζονται με ιστολογικό τύπο (p & lt? 0,0001), την κατάσταση του όγκου (p = 0,0227) και ιστολογική διαφοροποίηση (p = 0,0002). Στη συνέχεια, υπερεκφράζεται ATDC σε φυσιολογικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κυτταρική γραμμή ΗΒΕ και απεμπλουτισμένο έκφρασή του σε NSCLC κυτταρικές γραμμές Α549 και Η1299. ΜΤΤ και δοκιμασία σχηματισμού αποικίας έδειξαν ότι ATDC υπερέκφραση προώθησε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ενώ η εξάντληση της ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων. Επιπλέον, η ανάλυση κυτταρικού κύκλου έδειξε ότι ATDC υπερέκφραση μείωσε το ποσοστό των κυττάρων στη φάση G1 και αύξησε το ποσοστό των κυττάρων στη φάση S, ενώ θεραπεία ATDC siRNA αύξησε το ποσοστό φάση G1 και μείωσε το ποσοστό φάσης S. Περαιτέρω μελέτη αποκάλυψε ότι η υπερέκφραση ATDC μπορούσε πλειορύθμιση κυκλίνη D1 και την έκφραση c-Myc σε κύτταρα ΗΒΕ ενώ εξάντληση του κάτω ρυθμισμένα κυκλίνη D1 και την έκφραση c-Myc σε Α549 και Η1299 κύτταρα. Επιπλέον, η υπερέκφραση ATDC συσχετίστηκε επίσης με αυξημένη δείκτη πολλαπλασιασμού, η κυκλίνη D1 και την έκφραση c-Myc σε ανθρώπινα δείγματα NSCLC. Περαιτέρω πειράματα έδειξαν ότι ATDC επάνω ρυθμισμένη κυκλίνη D1 και c-Myc έκφραση ανεξάρτητη από Wnt /β-κατενίνης ή μονοπάτι σηματοδότησης ρ53. Είναι ενδιαφέρον, ATDC υπερέκφραση αυξημένη δραστηριότητα λουσιφεράσης NF-κΒ δημοσιογράφος και το επίπεδο της πρωτεΐνης p-ΙκΒ. Αντίστοιχα, NF-κΒ αναστολέα μπλοκάρει την επίδραση της ATDC επί πάνω ρύθμιση της κυκλίνης D1 και c-Myc. Συμπερασματικά, αποδείξαμε ότι ATDC θα μπορούσε να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό του καρκίνου του πνεύμονα μέσω του NF-κΒ που προκαλείται ανοδική ρύθμιση της κυκλίνης D1 και c-Myc

Παράθεση:. Tang ZP, Dong QZ, Cui QZ, Παπαβασιλείου P, Wang ΕΔ , Wang EH (2013) Ομάδα αταξία-τελαγγειεκτασία D συμπληρωματικό γονίδιο (ATDC) Προωθεί τον Καρκίνο του πνεύμονα τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό Ενεργοποίηση NF-κΒ Pathway. PLoS ONE 8 (6): e63676. doi: 10.1371 /journal.pone.0063676

Επιμέλεια: Giuseppe Viglietto, Πανεπιστήμιο Magna Graecia, Ιταλία

Ελήφθη: 15 Νοεμβρίου του 2012? Δεκτές: 7, Απρίλη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 12 Ιουνίου 2013

Copyright: © 2013 Tang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (επιχορηγήσεις 81071905 και 81272606). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι μία από τις κύριες αιτίες των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο και, ειδικότερα, μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) αποτελεί την πλειοψηφία των περιπτώσεων διαγιγνώσκονται [1], [2] . Πολλαπλοί παράγοντες συμπεριλαμβανομένων των γενετικών, επιγενετικών και μικροπεριβάλλον, παίζουν σημαντικό ρόλο στην επιβίωση και αποικισμό των καρκινικών κυττάρων σε ένα μακρινό θέση ιστού, που οδηγεί στην μετάσταση [3]. Ωστόσο, παρά τις πολλές πειραματικές μελέτες, μια υποκείμενη μοριακό μηχανισμό που διέπει την μετάσταση των όγκων άτομο δεν έχει ακόμη πλήρως κατανοηθεί. Λόγω της περιορισμένης επιτυχίας των συμβατικών θεραπειών για την επίτευξη μακροπρόθεσμης επιβίωσης σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, οι ερευνητικές προσπάθειες έχουν επικεντρωθεί στις βιολογικές οδούς που εμπλέκονται στην πρόοδο του όγκου και νεοπλασματικών επιβίωση κυττάρου, προκειμένου για τον προσδιορισμό δυνητικών θεραπευτικών στόχων [4].

ομάδα αταξία-τηλαγγειεκτασία D γονίδιο που συμπληρώνει (ATDC) είναι ένα μέλος της οικογένειας τριμερούς μοτίβο (TRIM) [5]. TRIM πρωτεΐνες έχουν συνήθως μια σειρά συντηρημένων περιοχών συμπεριλαμβανομένων των πολλαπλών μοτίβα δακτύλου ψευδαργύρου και ένα μοτίβο φερμουάρ λευκίνης. Αυτές οι πρωτεΐνες έχει αποδειχθεί ότι συμμετέχουν στη ρύθμιση της ανάπτυξης των κυττάρων και την ανάπτυξη και έχουν ενοχοποιηθεί σε πολλές ανθρώπινες ασθένειες όπως λοίμωξη Ηΐν και λευχαιμία [6], [7]. Ειδικότερα, TRIM έχουν πρωτεΐνες, όπως TRIM8, TRIM22, TRIM38 και TRIM40 έχουν αναφερθεί να συμμετάσχουν στη ρύθμιση της ενεργοποίησης του NF-κΒ [8] – [11]. ATDC, επίσης γνωστή ως TRIM29, ταυτοποιήθηκε αρχικά σε μια αναζήτηση για το γονίδιο που είναι υπεύθυνο για την γενετική διαταραχή αταξία-τηλαγγειεκτασία και βρέθηκε να κατέχει λειτουργίες ραδιοευαισθησία καταστολέα [12]. Μεταγενέστερες μελέτες έδειξαν ότι ATDC υπερεκφράστηκε σε πολλαπλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων του παγκρέατος, του γαστρικού, της κύστης, του παχέος εντέρου, των ωοθηκών και του ενδομητρίου, καθώς επίσης και σε κυτταρικές πλάσμα μυελώματος [13] – [21]. Ότι, η έκφραση του προφανώς μειώνεται σε αρκετούς άλλους όγκους, όπως καρκίνους μελανώματος, μαστού, προστάτη, κεφαλής και λαιμού [22] – [27]. Μόνο μία αναφορά περιέγραψε την αυξημένη έκφραση mRNA ATDC σε συνδυασμό με την υψηλή ιστολογικό βαθμό, το μεγάλο μέγεθος του όγκου, την έκταση της εισβολής όγκου και μετάσταση λεμφαδένα σε καρκίνο του στομάχου [15]. Ωστόσο, για το καλύτερο της γνώσης μας, η έκφραση της πρωτεΐνης του ATDC και τη σχέση της με κλινικοπαθολογοανατομικές παράγοντες σε πρωτογενείς καρκίνους του πνεύμονα δεν έχουν χαρακτηρισθεί.

Μια πρόσφατη μελέτη στο παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα γραμμή κυττάρων έδειξαν ότι ATDC αλληλεπιδρά με ατημέλητα -2 και τα συστατικά του συμπλόκου καταστροφή β-κατενίνης για τη σταθεροποίηση β-κατενίνης και ενεργοποιούν σηματοδότηση Wnt, ένα κρίσιμο μονοπάτι που προάγει την εξέλιξη του όγκου σε πολλούς τύπους καρκίνου [13]. Άλλες μελέτες πρότειναν ότι ATDC δεσμεύει ρ53 στο κυτταρόπλασμα για να κατάσχω από πυρήνα με αποτέλεσμα τα κάτω ρύθμιση του γονιδίου στόχου p21 του [28]. Στο Α431 ανθρώπινο καρκίνωμα από πλακώδες επιθήλιο γραμμή, ATDC σημειώθηκε να αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη βιμεντίνη ενδιαμέσου νηματίου και με έναν αναστολέα της πρωτεϊνικής κινάσης C, λειτουργώντας έτσι ως ένα συστατικό της μεταγωγής σήματος C κινάσης πρωτεΐνης [29]. Συνολικά, αυτές οι προηγούμενες μελέτες δείχνουν ότι η ATDC μπορεί να λειτουργήσει ως ένα ογκογονίδιο να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και εισβολή. Ωστόσο, οι βιολογικοί ρόλοι των ATDC σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα δεν έχουν ακόμη καθοριστεί.

Για να αντιμετωπιστούν τα παραπάνω ερωτήματα, ελέγξαμε ATDC έκφρασης και του ιστού της διανομής στον καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρών κυττάρων με ανοσοϊστοχημεία και αναλύθηκαν σύνδεσή της με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. Ερευνήσαμε επίσης τους ρόλους των ATDC επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και του κυτταρικού κύκλου εξέλιξης χρησιμοποιώντας gain- ή απώλειας λειτουργίας προσεγγίσεων. Το πιο σημαντικό, θα διερευνηθούν οι δυνατότητες μηχανισμός με τον οποίο λειτουργεί ATDC να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα.

Μέθοδοι

Ασθενείς και δείγματα

Αυτή η μελέτη διεξήχθη με την έγκριση του θεσμικού συμβούλιο επιθεώρησης σε Κίνα Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Γραπτή συγκατάθεση δόθηκε από τους συμμετέχοντες για τις πληροφορίες τους να αποθηκεύονται στη βάση δεδομένων του νοσοκομείου για τα δείγματα τους για να χρησιμοποιηθούν σε αυτή τη μελέτη. Και όλα κλινική έρευνα έχει διεξαχθεί σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Τα πρωτογενή δείγματα όγκου συλλέχθηκαν από 109 ασθενείς με πλακώδες καρκίνωμα (SCC) ή αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα που υποβλήθηκαν σε πλήρη χειρουργική εκτομή στην Πρώτη συνδεδεμένες νοσοκομείο της Κίνας Ιατρικού Πανεπιστημίου μεταξύ 2001 και 2004. Μεγάλες καρκίνωμα, καρκίνωμα αδενοχοληδωτό τηλέφωνα ή άλλες NSCLC υπότυποι εξαιρέθηκαν από αυτή τη μελέτη. Συνέχεια πληροφορίες που λαμβάνονται από την εξέταση τα ιατρικά αρχεία των ασθενών. Κανένας από τους ασθενείς είχαν λάβει ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία πριν από τη χειρουργική εκτομή, και όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε θεραπεία με χημειοθεραπεία ρουτίνα μετά την εκτομή. Όλα τα 109 υποθέσεις εξετάστηκαν για ιστολογική υπότυπο, τη διαφοροποίηση και το στάδιο του όγκου. Η ιστολογική διάγνωση και βαθμού αξιολογήθηκαν σε αιματοξυλίνη και ηωσίνη τομές χρώση σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (WHO) της ταξινόμησης. 109 υποθέσεις, 46 (42,2%) ήταν SCC και 63 (57,8%) ήταν αδενοκαρκίνωμα. Λεμφαδενικές μεταστάσεις εντοπίστηκαν σε 44 (40,4%) από τους 109 ασθενείς. Το σύστημα σταδιοποίησης ΤΝΜ-p της Διεθνούς Ένωσης κατά του Καρκίνου (7η έκδοση) χρησιμοποιήθηκε για την ταξινόμηση των υποθέσεων.

Cell Culture και θεραπεία

κυτταρικές σειρές ΝΗΒΕ, Α549, Η1299, Η157 και Η460 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). κυτταρικές σειρές LH7 και LK2 αγοράστηκαν από τη Σαγκάη κυττάρων Τράπεζα της Κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών. Η κυτταρική σειρά BE1 δόθηκε ως δώρο από τον Dr. J Zheng (Τμήμα Παθολογίας, Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Ιατρικής Σχολής). Η κυτταρική σειρά BE1 ιδρύθηκε από τον Δρ J Zheng και ο Δρ WY Zhu το 1995 και τώρα θα μπορούσε να αγοραστεί από την Εθνική Πλατφόρμα της Πειραματικής Πόρων κυττάρων για τη Sci-Tech (Πεκίνο, Κίνα). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μια στείρα πιάτα καλλιέργειας ιστού και περάστηκαν κάθε 2 ημέρες χρησιμοποιώντας 0.25% θρυψίνη (Invitrogen). ΝΡ-κΒ αναστολέας ΒΑΥ 11-7082 (10 μΜ, 6 ώρες) αγοράστηκε από την Sigma Aldrich.

Ανοσοϊστοχημεία

χειρουργικά δείγματα όγκου μονιμοποιήθηκαν με 10% ουδέτερη φορμαλίνη, ενσωματωμένο σε παραφίνη και 4 μm πάχους τομές παρασκευάζονται. Η ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο συμπλόκου αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης (Ultra Sensitive TM, Maixin, Fuzhou, Κίνα). Οι τομές αποπαραφινώθηκαν με ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν με κλιμακούμενες σειρές αλκοόλ και βράζεται σε 0,01 Μ κιτρικού ρυθμιστικού (ρΗ 6,0) για 2 λεπτά σε ένα αυτόκλειστο. Η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείσθηκε χρησιμοποιώντας υπεροξείδιο του υδρογόνου (0,3%) πριν από την επώαση των τομών με φυσιολογικό ορό κατσίκας για να μειωθεί η μη ειδική πρόσδεση. Τομές ιστού στη συνέχεια επωάστηκαν με ATDC πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (1:150 αραίωση) (cat.17542-1-ΑΡ, Proteintech, IL, USA). Κουνέλι ανοσοσφαιρίνη (στην ίδια συγκέντρωση του ειδικού αντισώματος αντιγόνου) (cat.NC-100, Maixin, Fuzhou, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Η ανοσοϊστοχημική χρώση για Κί67 (1:200 αραίωση) (cat.MAB-0129, Maixin, Fuzhou, Κίνα), c-Myc (1:500 αραίωση) (cat.ab32, Abcam) και κυκλίνης D1 (1:100 αραίωση) ( cat.2978, Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA) πραγματοποιήθηκαν επίσης σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Χρώση για όλες πρωτογενή αντισώματα πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Βιοτινυλιωμένο κατσίκας IgG ορού αντι-ποντικού ή IgG βιοτινυλιωμένο κατσίκας αντι-κουνελιού ορό (έτοιμο προς χρήση) (cat.KIT-9922, Maixin, Fuzhou, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε ως το δεύτερο αντίσωμα. Μετά την πλύση, οι τομές επωάστηκαν με συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου στρεπταβιδίνη-βιοτίνη, ακολουθούμενο από 3, 3′-διαμινοβενζιδίνη τετραϋδροχλωρική να αναπτύξουν αντίδραση υπεροξειδάσης. Αντιχρωματισμός έγινε με αιματοξυλίνη, και οι τομές στη συνέχεια αφυδατώθηκαν με αιθανόλη προτού τοποθετηθεί.

Δύο ερευνητές ανεξάρτητα αξιολόγησε όλα τα διαφάνειες των όγκων. Πέντε τυχαία πεδία εξετάστηκαν ανά διαφάνεια, και 100 κύτταρα αξιολογήθηκαν ανά πεδίο υψηλής μεγέθυνσης (400 ×). Κανονική βρογχικό επιθήλιο στα τμήματα του όγκου χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός αρνητικός έλεγχος. Η ανοσοχρώση των ATDC βαθμολογήθηκε μετά από μια ημι-ποσοτική κλίμακα με την αξιολόγηση της έντασης χρώσης και το ποσοστό των κυττάρων σε αντιπροσωπευτικές περιοχές του όγκου σε σύγκριση με αυτή που παρατηρήθηκε στα κύτταρα ελέγχου. Θετική ανοσοχρώση ορίστηκε ως μια διακριτή κυτταροπλασματική χρώση των καρκινικών κυττάρων. Η ένταση της χρώσης κυτταροπλασματική ATDC ήταν περαιτέρω στρωματοποιημένη ως 0 (καμία χρώση), 1 (ασθενής) και 2 (ισχυρή). βαθμολογίες Ποσοστό ορίστηκαν ως 1 (1-25%), 2- (26-50%), 3 (51-75%) και 4 (76-100%). Οι βαθμολογίες κάθε δείγματος όγκου πολλαπλασιάζονται για να δώσουν ένα τελικό σκορ από το 0 έως 8 και η συνολική έκφραση της ATDC προσδιορίστηκε ως είτε αρνητικοί ή χαμηλή έκφραση (-), εάν η συνολική βαθμολογία ήταν & lt? 4, και ως θετική έκφραση ή υψηλή έκφραση (+), εάν το συνολικό σκορ ήταν ≥4.

η ανοσοϊστοχημική χρώση για Ki-67 αξιολογήθηκε και βαθμολογήθηκε ως ποσοστό των ανοσοδραστικών καρκινικών κυττάρων, με συνολικά 500 καρκινικών κυττάρων που εξετάστηκαν ανά διαφάνεια. Η διάμεση τιμή αυτής της σειράς (35%) χρησιμοποιήθηκε ως τιμή κατωφλίου για τη διαστρωμάτωση τους όγκους στην ομάδα με χαμηλή (& lt? 35%) δείκτη και το ένα με υψηλό δείκτη κυτταρικού πολλαπλασιασμού (≥35%). Η έκφραση του c-myc και η κυκλίνη D1 ορίστηκε ως υψηλό επίπεδο έκφρασης ή χαμηλό επίπεδο σύμφωνα με τα προηγούμενα κριτήρια [30], [31].

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (SYBR Green Μέθοδος)

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας SYBR Green PCR κύριο μείγμα με συνολικό όγκο 20 μΐ σε 7900HT Fast PCR πραγματικού χρόνου System (Applied Biosystems). Η συνθήκη αντίδρασης είναι ως εξής: 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 40 κύκλοι των 95 ° C για 5 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 30 δευτερόλεπτα. Ένα βήμα διαχωρισμού εφαρμόστηκε για να δημιουργηθεί μια καμπύλη τήξης για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα της ενίσχυσης. β-ακτίνη μεταγραφές ενισχύθηκαν και χρησίμευσε ως αναφορά. Τα σχετικά επίπεδα της έκφρασης του γονιδίου αντιπροσωπεύθηκαν ως γονίδιο ΔCt = Ct -Ct αναφοράς, και η πτυχή αλλαγή της γονιδιακής έκφρασης υπολογίστηκε με τη μέθοδο 2-ΔΔCt. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν

Το έναυσμα αλληλουχίες ήταν ως εξής: α.

β-ακτίνης προς τα εμπρός, 5′-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3 ‘, β-ακτίνη αντίστροφη, 5′-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3′ ? ATDC εμπρός, 5’-GCACCGGACACCATGAAGA-3 ‘, ATDC αντίστροφη, 5′-GGAGACGAGGGCTGGTATGA-3’.

Ανάλυση Western Blot

Σύνολο πρωτεΐνες από ιστούς NSCLC και κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα εκχυλίστηκαν σε ρυθμιστικού λύσης (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) και ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Bradford. Πενήντα μικρογραμμάρια πρωτείνης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE (12%). Μετά τη μεταφορά, το φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) μεμβράνες (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με τα ακόλουθα αντισώματα: ATDC (1:1000? Cat.17542-1-ΑΡ, Proteintech), β- ακτίνης (1:500? cat.612657), β-κατενίνης (1:1000? cat.610154) (BD Transduction Laboratories), κυκλίνη Α2 (1:1000? cat.4656S), κυκλίνη D1 (1:1000? cat. 2978), η κυκλίνη Ε1 (1:800? cat.4129), CDK2 (1:1000? cat.2546), CDK4 (1:1000? cat.2906), CDK6 (1:1000? cat.3136), p- Rb (Ser807 /811) (1:2000? cat.8516), Ρ21 (1:800? cat.2947), π-ΙκΒ (Ser32) (1:500? cat.2859) (Cell τεχνολογία σηματοδότησης, Boston, MA , USA), c-Myc (1:1000? cat.ab32, Abcam), ενεργή β-κατενίνης (1:500? cat.05-665, Millipore), p65 (1:500? sc-8008, Santa Cruz) . Μετά την επώαση με υπεροξειδάση συζευγμένο αντι-ποντικού (cat.sc-2005) ή κουνέλι (cat.sc-2004) IgG (Santa Cruz Biotechnology) στους 37 ° C για 2 ώρες, οι δεσμευμένες πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ECL (Thermo Fisher Scientific) και ποσοτικά με τη χρήση bioimaging Systems (UVP Inc., ορεινές, CA, USA). Τα σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης υπολογίστηκαν σε σχέση με β-ακτίνη ως μάρτυρας φόρτωσης.

πλασμίδιο Επιμόλυνση και μικρά παρεμβαλλόμενα RNA Θεραπεία

Το πλασμίδιο pCMV6-ATDC αγοράστηκε από ΟηΟεηε. pCMV6 κενό φορέα χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. On-στόχος συν siRNAs για ATDC (Μ-012409-01) και μη-στόχευση siRNA # 1 (D-001810-01) αγοράστηκαν από την Dharmacon (Lafayette, CO, USA). Το πλασμίδιο και siRNA επιμολύνθηκαν σε κύτταρα χρησιμοποιώντας Attractene Επιμόλυνση αντιδραστήριο (Qiagen, Hilden, Germany). Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 6 φρεατίων 24 ώρες πριν από το πείραμα. Τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης ATDC προσδιορίσθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Δοκιμή κυτταρικού πολλαπλασιασμού και Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού

Προσδιορισμός πολλαπλασιασμού κυττάρων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση κυττάρων Μετρώντας διάλυμα Kit-8 (Dojindo, Gaithersburg, MD) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μια συγκέντρωση 5 × 10

3 κύτταρα /100 μl /φρεάτιο σε 96 φρεατίων πλάκες καλλιέργειας και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 μΙ /φρεάτιο of Cell Μετρώντας διάλυμα Kit-8 κατά τη διάρκεια των τελευταίων 4 ωρών της καλλιέργειας . Η οπτική πυκνότητα των φρεατίων μετρήθηκε σε μήκος κύματος 450 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλακός.

Για την δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, τα κύτταρα φυτεύτηκαν σε τρία πιάτα κυτταρικής καλλιέργειας 6-cm (1 χ 10

3 κύτταρα ανά τρυβλίο ) και επωάστηκαν για 12 ημέρες. Οι πλάκες πλύθηκαν με PBS και βάφτηκαν με Giemsa. μετρήθηκε ο αριθμός των αποικιών με περισσότερα από 50 κύτταρα.

Κυτταρικού Κύκλου Ανάλυση

Κύτταρα (5 × 10

5) σπάρθηκαν σε 6 cm τρυβλίου καλλιέργειας ιστού. Μετά από 12 ώρες επώασης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ασιτία ορού για 24 ώρες πριν από την επιμόλυνση με υποδεικνυόμενες δόσεις των πλασμιδίων ή siRNA. Στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, σταθεροποιήθηκαν σε 1% παραφορμαλδεΰδη, πλύθηκαν με αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) και χρωματίστηκαν με 5 mg /ml ιωδιούχου προπιδίου σε PBS συμπληρωμένο με RNase Α (Roche, Indianapolis, ΙΝ) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα βαμμένα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τα συστήματα κυτταρομετρίας ροής BD

Luciferase Assay Reporter

προσδιορισμό γονιδίου αναφοράς επιμόλυνση και δραστικότητα λουσιφεράσης διεξήχθησαν ως εξής:. Κύτταρα σε συρρέουσα ανάπτυξη σε ένα δίσκο των 24 φρεατίων ήταν συν-επιμολυσμένα με τον ανταποκριτή λουσιφεράσης πυγολαμπίδας (0,2 μg) μαζί με τον ανταποκριτή λουσιφεράσης Renilla (Promega Co) (0.02 μg) για 12 ώρες χρησιμοποιώντας ένα αντιδραστήριο attractene (Qiagen) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που παρέχονται από τους κατασκευαστές. Τα πλασμίδια δημοσιογράφος του TOP /FLASH, ρ53 και NF-κΒ αγοράστηκαν από BioTime Βιοτεχνολογίας, Κίνα. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε σε κυτταρικά εκχυλίσματα χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας διπλής γονίδιο λουσιφεράσης αναφερθεί (Promega, CA, USA). Η σχετική δραστηριότητα του γονιδίου αναφοράς υπολογίστηκε διαιρώντας τα σήματα από ρεπόρτερ λουσιφεράσης πυγολαμπίδας από τα σήματα που λαμβάνονται από ρεπόρτερ λουσιφεράσης της Renilla.

Στατιστική Ανάλυση

SPSS έκδοση 16.0 για Windows χρησιμοποιήθηκε για όλα τα στατιστικά αναλύσεις. Η Chi-squared test χρησιμοποιήθηκε για να εξετάσει πιθανές συσχετίσεις μεταξύ της έκφρασης ATDC και κλινικοπαθολογική παράγοντες. t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθεί η διαφορά μεταξύ των ομάδων και p-τιμές βασίζονται σε δύο όψεων στατιστική ανάλυση, με τιμή p & lt? 0,05 ορισμό στατιστική σημασία

Αποτελέσματα

Η υπερέκφραση του ATDC πρωτεΐνες στη μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα ιστοί και τη σχέση της με κλινικοπαθολογοανατομικές Παράγοντες

για να διερευνήσει τα επίπεδα της πρωτεΐνης ATDC στον καρκίνο του πνεύμονα, εξετάσαμε την έκφραση ATDC σε ένα πάνελ των 109 δειγμάτων NSCLC και 20 ζεύγη ομόλογων φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία. Η υπερέκφραση του ATDC σημειώθηκε σε 62 (56,88%) από 109 δείγματα NSCLC, και η πρωτεΐνη ATDC ήταν πρωτίστως εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων του όγκου (Σχήμα 1 C-F). Αριθ ή αδύναμα σήματα χρώση ανιχνεύθηκαν στους φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων και των κανονικών βρογχικών επιθηλίων γειτονικά προς τον όγκο (Σχήμα 1Α-Β).

A. Αρνητική χρώση σε φυσιολογικό πνευμονοκύτταρα στις κυψελίδες των μη νεοπλασματικών πνευμονικού ιστού. B. Αρνητική χρώση σε φυσιολογικό βρογχικό επιθήλιο σε μη νεοπλασματικά πνευμονικού ιστού. Γ Αρνητική χρώση ATDC στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα. Δ Ασθενής χρώση ATDC στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα. Ε Ασθενής χρώση ATDC στο ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του πνεύμονα. ΣΤ Ισχυρή χρώση ATDC στον πνεύμονα καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων.

Η

Η σχέση μεταξύ της έκφρασης ATDC και πολλαπλές κλινικοπαθολογική παραμέτρους αναλύθηκε επίσης. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, παρατηρήθηκε μία σημαντική συσχέτιση μεταξύ ATDC υπερέκφραση και την έκταση του πρωτογενούς όγκου (Τ1 έναντι Τ2-T4:42.11% έναντι 64,79%, ρ = 0,0227), η ιστολογική διαφοροποίηση (διαφοροποίηση καλά έναντι μέτρια /κακή διαφοροποίηση: 31,43% έναντι 68,92%, p = 0,0002) και ιστολογικών τύπων (καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων έναντι αδενοκαρκίνωμα: 97,83% έναντι 26,98%, ρ & lt? 0,0001). Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά βρέθηκε μεταξύ ATDC υπερέκφραση και την ηλικία των ασθενών (p = 0,5449), το φύλο (p = 0,3696), κομβικό κατάσταση (p = 0,2327) ή το στάδιο TNM (p = 0,5085).

Η

ATDC προωθεί τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές

η έκφραση της ATDC αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR και προσδιορισμούς στυπώματος Western σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών καρκίνου του πνεύμονα και σε ένα κανονικό βρογχικών επιθηλιακών κυτταρική σειρά HBE (Σχήμα 2α- ΣΙ). Βρήκαμε ότι τα επίπεδα τόσο ATDC mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε κυτταρικές γραμμές NSCLC ήταν πολύ υψηλότερη από εκείνη στην ΗΒΕ, ειδικά σε Α549 και κυτταρικές γραμμές Η1299. Προκειμένου να διερευνηθεί ένα πιθανό ρόλο του ATDC στην κυτταρική ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα, επιμολύναμε κατασκευάσουμε μια έκφραση ATDC cDNA σε κύτταρα ΗΒΕ και εφαρμόζεται μια πισίνα αποτελείται από τρία siRNAs ATDC στόχευση για να knockdown έκφραση ATDC τόσο Α549 και Η1299 κύτταρα (Σχήμα 2C-D). κύτταρα ΗΒΕ έδειξαν σημαντική αύξηση στην έκφραση ATDC μετά ATDC επιμόλυνση, ενώ ATDC ειδικό siRNA μπλοκάρει αποτελεσματικά την έκφραση ATDC σε Α549 και κυτταρικές γραμμές Η1299.

A. τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της ATDC αναλύθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών καρκίνου του πνεύμονα. Σημείωση η υψηλότερη έκφραση παρατηρείται σε Α549 κυτταρική γραμμή και το χαμηλότερο παρατηρείται σε ΗΒΕ κύτταρο. τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης Β του ATDC αναλύθηκαν με κηλίδα Western σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών καρκίνου του πνεύμονα. Σημείωση άμεση συσχέτιση του επιπέδου πρωτεΐνης (Β) με τις μεταγραφές (Α) σε κάθε κυτταρική σειρά. Γ πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση της αποτελεσματικότητας ATDC υπερέκφραση σε κύτταρα ΗΒΕ και αποδοτικότητα εξάντληση σε Α549 και κύτταρα Η1299 σε ένα μετεγγραφικό επίπεδο. Η ανάλυση στυπώματος Western Δ του ATDC αποδοτικότητα υπερέκφραση σε κύτταρα ΗΒΕ και αποδοτικότητα εξάντληση σε Α549 και κύτταρα Η1299 σε επίπεδο πρωτεΐνης. Η ζώνη χαμηλότερης MW σε Η1299 κύτταρα είναι ένα προϊόν αποικοδόμησης των πρωτεϊνών. Σημείωση άμεση συσχέτιση του επιπέδου της πρωτεΐνης (Δ) με τις μεταγραφές (C) σε κάθε κυτταρική σειρά.

Η

ΜΤΤ δοκιμασία έδειξε ότι η επιμόλυνση του ATDC cDNA σε κύτταρα ΗΒΕ προωθείται κυτταρική ανάπτυξη σε σύγκριση με τον έλεγχο (διαμόλυνση των κενών φορέων) (ΗΒΕ ελέγχουν έναντι ATDC cDNA: 1,06 ± 0,05 έναντι 1,41 ± 0,05, ρ & lt? 0,05). Η επίδραση της ATDC στην ικανότητα πολλαπλασιασμού αναλύθηκε επίσης με χρήση του προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας. ATDC υπερέκφραση σε κύτταρα HBE οδήγησε σε αξιοσημείωτη αύξηση του αριθμού των αποικιών (ελέγχου HBE έναντι ATDC cDNA: 221 ± 13 έναντι 441 ± 9, σ & lt? 0,05). Από την άλλη πλευρά, ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Α549 NC έναντι siATDC: 1,23 ± 0,03 έναντι 0,84 ± 0,03? Η1299 NC vs siATDC: 1,72 ± 0,01 έναντι 1,19 ± 0,02? Ρ & lt? 0,05) και την ικανότητα σχηματισμού αποικίας (Α549 NC έναντι siATDC: 400 ± 12 έναντι 150 ± 14? Η1299 NC έναντι siATDC: 258 ± 20 έναντι 119 ± 17? ρ & lt? 0,05) ήταν εξασθενημένα σε Α549 και Η1299 κυττάρων με ATDC knockdown (Σχήμα 3). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι συνολικά ATDC θα μπορούσε να ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα.

Α. ΜΤΤ δοκιμασία δείχνει ότι ATDC διαμόλυνση σε κύτταρα ΗΒΕ προάγει την ανάπτυξη των κυττάρων και ATDC knockdown στο Α549 και κύτταρα Η1299 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Π.Χ. Αξιολόγηση της κλωνογονικού δυνατότητες των κυττάρων που υπερεκφράζουν ATDC και ATDC εξαντλημένα κύτταρα μετρώντας τους αριθμούς των αποικιών. Μια αξιοσημείωτη αύξηση του αριθμού των αποικιών παρατηρήθηκε στα κύτταρα ΗΒΕ με ATDC υπερέκφραση σε σύγκριση με τον έλεγχο, και ο αριθμός των αποικιών που σχηματίζονται από Α549 και κύτταρα Η1299 σε επεξεργασία με ATDC siRNA ήταν πολύ μικρότερη από εκείνη των κυττάρων ελέγχου. Στήλες σε C αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή των 3 αντίγραφα? μπάρες αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση [13]. * Υποδηλώνει στατιστική σημαντικότητα σε διαφορά μεταξύ της ένδειξης 2 τιμές bar (p & lt? 0,05).

Η

ATDC Διευκολύνει G1 /S μετάβαση και Up-ρυθμίζει κυκλίνης D1 και c-Myc έκφραση σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα

η ανάλυση κυτταρικού κύκλου με φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων (FACS) διεξήχθη σε ATDC υπερεκφράζουν κύτταρα ΗΒΕ και ATDC εξαντλημένο Α549 και Η1299 κύτταρα (Σχήμα 4). ATDC υπερέκφραση μείωσε το ποσοστό των κυττάρων στη φάση G1 (ΗΒΕ έλεγχος έναντι ATDC cDNA: 68,04% ± 0,04% έναντι 57,74% ± 0,51%, ρ & lt? 0,05) και αύξησε το ποσοστό των κυττάρων στη φάση S (ΗΒΕ έλεγχος έναντι ATDC cDNA: 12,48% ± 0,74% έναντι 27,62% ± 0,61%, p & lt? 0,05). Αντιστρόφως, θεραπευτική αγωγή ATDC siRNA αύξησε τα κύτταρα στην G1 φάση (Α549 NC έναντι siATDC: 64,99% ± 0,57% έναντι 75,99% ± 2,72%? Η1299 NC έναντι siATDC: 52,66% ± 1,47% έναντι 63,80% ± 1,13%? Ρ & lt? 0,05 ) και μειωμένη των κυττάρων στη φάση S (Α549 NC έναντι siATDC: 29,59% ± 0,45% έναντι 9,24% ± 0,06%? Η1299 NC έναντι siATDC: 37,55% ± 3,13% έναντι 20,80% ± 3,11%? ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με έλεγχος. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ATDC μπορεί να προωθήσει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μέσω της G1 /S όριο

Σημείωση ATDC υπερέκφραση σε κύτταρα HBE αυξάνει κύτταρα φάσης S και μειώνει τα κύτταρα φάση G1. (P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο). ATDC knockdown στο Α549 και Η1299 κύτταρα αυξάνει κύτταρα φάσης G1 και μειώνεται κύτταρα φάσης S (p & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο).

Η

Για να διερευνηθεί ο μηχανισμός της προόδου του κυτταρικού κύκλου ρυθμίζονται από ATDC στον καρκίνο του πνεύμονα, εμείς εξέτασε την επίδραση της ATDC επί κυκλίνη Α, κυκλίνη D1, κυκλίνη Ε, CDK2, CDK4, CDK6, ρ-Rb και c-Myc σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, κηλίδωση Western ανάλυση αποκάλυψε ότι ATDC υπερέκφραση πάνω ρυθμισμένα τα επίπεδα πρωτεΐνης της κυκλίνης D1, CDK4, CDK6, ρ-Rb και c-Myc σε κύτταρα ΗΒΕ, ενώ knockdown του ATDC μειωμένη έκφραση αυτών των πρωτεϊνών σε Α549 και κύτταρα Η1299. Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι ATDC μπορεί να προωθήσει G1 /S μετάβαση μέσω up-ρύθμιση κυκλίνης D1 και έκφραση c-Myc.

ανάλυση κηλίδωσης Western αποκαλύπτει ότι ATDC επιμόλυνσης αυξάνει κυκλίνης D1 και την έκφραση του c-Myc στα κύτταρα HBE και knockdown του ATDC μειώνει τα επίπεδα πρωτεΐνης της κυκλίνης D1 και c-Myc τόσο Α549 και κύτταρα Η1299, χωρίς σημαντικές αλλαγές στην έκφραση κυκλίνης Α και κυκλίνη Ε.

Η

ATDC έκφραση συσχετίζεται με Κί67 Labeling Index, κυκλίνη D1 και c-Myc επίπεδα στον NSCLC ιστοί

Εμείς εξέτασε τη σχέση μεταξύ του επιπέδου της συνολικής πρωτεΐνης ATDC και το δείκτη πολλαπλασιασμού (επισήμανση Ki67) σε NSCLC. Βρήκαμε ότι οι περιπτώσεις με υψηλό επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης ATDC έτειναν να δείχνουν υψηλό δείκτη πολλαπλασιασμού, σε σύγκριση με εκείνα με ένα χαμηλό επίπεδο ATDC (p = 0.0022) (Σχήμα 6). Ανοσοχρώση για κυκλίνη D1 και c-Myc διεξήχθη επίσης σε δείγματα NSCLC και των ενώσεών τους με την έκφραση ATDC αναλύθηκαν (Σχήμα 6). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, ATDC υπερέκφραση συσχετίζεται με ένα υψηλό επίπεδο της κυκλίνης D1 (p = 0,0010) και η έκφραση c-Myc (p = 0,0150).

Η ανοσοϊστοχημική χρώση του ATDC (Α και Β), η κυκλίνη D1 (C και D), c-Myc (Ε και F) και Κί67 (G και Η) σε δείγματα NSCLC. Α, C, Ε και G υποδεικνύουν μια αντιπροσωπευτική περίπτωση με θετική ATDC καταδεικνύοντας ένα υψηλό επίπεδο κυκλίνης D1 και c-Myc, υψηλό δείκτη σήμανσης του Κί67, ενώ τα Β, D, F και Η αντιπροσωπεύουν μια υπόθεση με αρνητικά ADTC και αντίστοιχη αρνητική κυκλίνης D1 και c-Myc χρώση ή χαμηλό επίπεδο της επισήμανσης Κί67.

Η

ATDC Up-ρυθμίζει κυκλίνης D1 και c-Myc στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα Ανεξάρτητα από Wnt /β-κατενίνης ή p53 μονοπάτι σηματοδότησης

Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι η υπερέκφραση της ATDC οδηγεί σε wnt ενεργοποίηση σηματοδότησης σε αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος κυτταρικές σειρές. Αυτό εγείρει το ερώτημα κατά πόσον μεσολάβηση ATDC πάνω ρύθμιση της κυκλίνης D1 και c-Myc στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα προκύπτει από την ενεργοποίηση του Wnt μονοπατιού μεταγωγής σήματος στα οποία κυκλίνη D1 και c-Myc είναι κρίσιμα συστατικά. Για να ελεγχθεί αυτό, μετρήσαμε συνολικός β-κατενίνης και ενεργά επίπεδα β-κατενίνης με ανάλυση κηλίδος Western, και εξέτασε την Wnt δραστηριότητα λουσιφεράσης δοκιμασίες ρεπόρτερ σε κύτταρα ΗΒΕ υπερεκφράζουν ATDC και Η1299 και Α549 κύτταρα νοκ-κάτω του ATDC. Δεν εμφανείς αλλοιώσεις της Wnt επίπεδα δραστηριότητας και β-κατενίνης παρατηρήθηκαν σε αυτά τα κύτταρα με μεταβληθέντα επίπεδα του ATDC (Σχήμα 7Α-Β). Ως εκ τούτου, η επίδραση της ATDC επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα φαίνεται να είναι ανεξάρτητη από Wnt /β-κατενίνης μονοπατιού μεταγωγής σήματος.

A. Δεν υπήρχε σημαντική μεταβολή της δραστικότητας λουσιφεράσης Topflash μετά ATDC επιμόλυνση σε κύτταρα ΗΒΕ και μετά τη θεραπεία siRNA σε Α549 και κύτταρα Η1299. B. Δεν υπήρξε σημαντική αλλαγή του β-κατενίνης και της ενεργού επίπεδα πρωτεΐνης β-κατενίνης μετά ATDC επιμόλυνση σε κύτταρα ΗΒΕ και μετά τη θεραπεία siRNA σε Α549 και κύτταρα Η1299. Γ ATDC επιμόλυνση σε κύτταρα HBE ή εξάντληση του σε κύτταρα Α549 δεν άλλαξε το επίπεδο της δραστηριότητας της λουσιφεράσης p53. Δ ATDC επιμόλυνση σε HBE ή εξάντληση του σε κύτταρα Α549 δεν άλλαξε το επίπεδο της πρωτεΐνης του p53 γονιδίου-στόχου p21.

Η

Από ATDC αναφέρθηκε να αυξήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω αναστολής της ρ53 πυρηνικές δραστηριότητες, αναρωτηθήκαμε εάν ο ATDC μεσολάβηση πάνω ρύθμιση της κυκλίνης D1 και c-Myc σε πνεύμονα καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να οφείλεται στην ανασταλτική δράση της επί της πρωτεΐνης ρ53. Μεταξύ των κυτταρικών γραμμών 3 που χρησιμοποιήθηκε ανωτέρω, τα κύτταρα Η1299 έχουν καλά γνωστό ότι έχουν γονίδιο ρ53 χάνεται, ενώ ΗΒΕ και Α549 κύτταρα εκφράζουν άγριου τύπου ρ53. Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε την επίδραση της ATDC στην δραστικότητα της ρ53 σε ΗΒΕ και Α549 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7C-D, η υπερέκφραση του ATDC σε κύτταρα ΗΒΕ δεν μεταβλήθηκε σημαντικά τη δραστικότητα της λουσιφεράσης ρ53 αποκρίνεται ή την έκφραση του γονιδίου στόχου ρ53 ρ21. Ούτε η αλλαγή σημειώθηκε σε κύτταρα Α549 εξαντλημένο της ενδογενούς ATDC. Σε συνδυασμό με το γεγονός ότι ATDC ρυθμίζονται κυκλίνη D1 και το επίπεδο c-Myc σε κύτταρα Η1299 ρ53-ηυΙΙ, πιστεύαμε ότι η επίδραση του ATDC στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα θα μπορούσε να είναι ανεξάρτητα από τη δραστηριότητά ρ53.

ATDC Up-ρυθμίζει κυκλίνη D1 και c-Myc μέσω της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ Pathway

Δεδομένου ότι τόσο η κυκλίνη D1 και c-Myc ήταν κατάντη στόχοι του ΝΡ-κΒ, εξετάσαμε την έκφραση πρωτεΐνης του p65, ρ-ΙκΒ και η δραστικότητα της λουσιφεράσης του ΝΡ-κΒ για την αξιολόγηση εάν ATDC θα μπορούσε να ρυθμίσει την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ οδού (Σχήμα 8Α-Β). Φάνηκε ότι ATDC υπερέκφραση σε κύτταρα ΗΒΕ επάνω ρυθμισμένη δραστηριότητα λουσιφεράσης ΝΡ-κΒ, και αντίστοιχα, η εξάντληση ATDC σε Α549 και Η1299 κύτταρα ρυθμισμένα προς τα κάτω τη δράση του. Από την άλλη πλευρά, το επίπεδο της ρ-ΙκΒ ήταν ρυθμισμένη σε κύτταρα ΗΒΕ επιμολυσμένα με ATDC και ρυθμισμένα προς τα κάτω σε Α549 και κύτταρα Η1299 απηλαγμένου από ενδογενή ATDC, αν και δεν υπήρχε σημαντική μεταβολή του συνολικού επιπέδου p65 σε αυτά τα κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν μια πιθανή εμπλοκή της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ σε ATDC επάγεται πάνω ρύθμιση της κυκλίνης D1 και c-Myc. Bay 11-7082, η οποία αναστέλλει τη φωσφορυλίωση και αποικοδόμηση της IkBa να εμποδίσει την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ, χρησιμοποιήθηκε επίσης σε κύτταρα ΗΒΕ επιμολυσμένα με ATDC για να επιβεβαιωθεί η επίδραση της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 8C, NF-κΒ αναστολέα αντέστρεψε την επίδραση της ATDC επί κυκλίνης D1, c-Myc και π-Rb σε κύτταρα ΗΒΕ. Ως εκ τούτου, η ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ μπορεί να είναι ένα προαπαιτούμενο για ATDC επαγόμενη αυξητική ρύθμιση της κυκλίνης D1 και c-Myc.

A. ATDC υπερέκφραση επάνω ρυθμισμένη δραστηριότητα λουσιφεράσης ΝΡ-κΒ σε κύτταρα ΗΒΕ και εξάντληση ATDC ανέστειλαν δραστικότητα λουσιφεράσης ΝΡ-κΒ σε δύο Α549 και κύτταρα Η1299. B. ATDC διαμόλυνση αυξήθηκαν ρ-ΙκΒ έκφραση σε κύτταρα ΗΒΕ και εξάντληση ATDC μείωσε το επίπεδο της ρ-ΙκΒ σε Α549 και κύτταρα Η1299.