Αφηρημένο

Τα microRNAs είναι μια κατηγορία φυσικά μικρά μη-κωδικοποίησης RNAs που στοχεύουν mRNA που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο και να ρυθμίζει πολύπλοκα σχήματα της γονιδιακής έκφρασης. Οι προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι στον ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη ο miRNA

miR-125b

εκφράζεται έντονα, με αποτέλεσμα την αρνητική ρύθμιση ορισμένων γονιδίων καταστολής του όγκου. Σε αυτή τη μελέτη, θα επεκτείνει περαιτέρω μελέτες μας δείχνουν ότι

miR-125b

καταστέλλει το πρωτεϊνικό προϊόν του ΙΝΚ4 Για την αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος, τα κύτταρα LNCaP και 22R

ν

1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με miR-125bm και τα επίπεδα του Mdm2 και p53 εξετάστηκαν στη συνέχεια. Σε σύγκριση με miR-NC, αγωγή κυττάρων LNCaP με

miR-125b

επάγεται μια δραματική αύξηση στην έκφραση Mdm2 και μια σημαντική μείωση του επιπέδου ρ53 (Σχήμα 2Α, άνω πλαίσιο). Ομοίως, στην 22R

ν

1 κύτταρα,

miR-125b

θεραπεία ενισχύεται επίσης έκφραση Mdm2 και μειωμένο επίπεδο p53 (Σχήμα 2Α, κάτω πίνακα). Όπως αναμενόταν, miR-125bm μεσολάβηση κάτω ρύθμιση της ρ53 επαγόμενης σημαντική μείωση δύο άμεσων τελεστές ρ53, ρ21 και Puma. Ομοίως, στο

miR-125b

-overexpressed PC-346c ξενομοσχεύματος όγκου, η έκφραση Mdm2 αυξήθηκε τρεις φορές και πρωτεΐνη ρ53 κάτω ρυθμισμένα κατά 83% σε σύγκριση με τον φορέα ελέγχου (Εικόνα 1Β). Για να επιβεβαιώσετε τα κατάντη αποτελέσματα από την αναστολή της p14

ARF, χρησιμοποιήσαμε

p14

ΤΑΠ

siRNA (sip14) να φιμώσουν P14

ARF σε LNCaP και 22R

ν

1 κύτταρα. Όπως φαίνεται από ανοσοστύπωση, sip14 θεραπεία μείωσε σημαντικά την έκφραση του p14

ARF πρωτεΐνης και στη συνέχεια ρυθμίζεται προς τα πάνω το επίπεδο Mdm2 και ρυθμίζεται προς τα κάτω την έκφραση της ρ53 (Σχήμα 2Β). Από p14

ARF συνδέεται άμεσα με το C-τερματικό του Mdm2, εξετάσαμε την επίδραση της

miR-125b

σχετικά με την αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης μεταξύ p14

ARF και Mdm2 από συνανοσοκαθίζησης στο 22R

κύτταρα κατά

1 καπάκι. Παρατηρήσαμε ότι Mdm2 μπορεί να ανιχνευθεί από αντι-Ρ14

ARF πρωτεΐνες αντισώματος-καταβυθίστηκε, όχι από πρωτεΐνες IgG-συζευγμένο ελέγχου, υποδεικνύοντας ότι η ενδογενής ρ14

ARF είναι ικανό να σχηματίσει ένα σύμπλοκο με Mdm2. Η θεραπεία με

miR-125b

κάτω-ρυθμίζονται P14

ARFprotein, με αποτέλεσμα τη μείωση της ανοσοκατακρημνίστηκε Mdm2 (Εικόνα 2C). Στο σύνολό τους, τα δεδομένα φαίνεται στην Εικόνα 2 παρέχουν αποδείξεις ότι

miR-125b

ρυθμίζει p14

ARF /Mdm2 σηματοδοτικό μονοπάτι /p53.

Α

) ανάλυση Western blot του Mdm2 και p53 σε miR-125bm επεξεργασμένο LNCaP (

πάνω

) και 1 κύτταρα (

κάτω

) 22R

ν

. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ miR-125bm ή miR-αρνητικό έλεγχο (MIR-NC) για 72 ώρες. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (50 μg) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των επιπέδων έκφρασης του Mdm2, ρ53, ρ21 και Puma.

Β

) ανάλυση Western blot της p14

ARF, Mdm2 και p53 σε

p14

ΤΑΠ

siRNA (sip14) κατεργασμένους LNCaP (

πάνω

) και 22R

ν

1 κύτταρα (

κάτω

). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με sip14 και τα κυτταρικά επίπεδα του p14 αναλύθηκαν

ARF, ρ53 και Mdm2. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

C

) ανάλυση συνανοσοκαθίζησης αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών μεταξύ p14

ARF και Mdm2 στην 22R

ν

1 κύτταρα. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με miR-125bm και 1,0 mg πρωτεΐνης ανοσοκαταβυθίστηκε με αντι-Ρ14

ARF αντίσωμα ή το IgG κουνελιού. Τα προκύπτοντα immunecomplexes χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση του επιπέδου της Mdm2 με ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας αντι-Mdm2 αντίσωμα. Εισόδου: 50 μg πρωτεΐνης από το συνολικό προϊόν λύσης κυττάρου. IP: ανοσοκατακρήμνιση. IB:. Ανοσοαποτύπωση

Η

miR-125b

διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CaP

Αφού καθόρισε τη ρύθμιση του p14

οδός ARF /Mdm2 /σηματοδότησης ρ53 από

miR-125b

, είμαστε δίπλα εξετάστηκε η επίδραση της ρύθμισης της p14

ARF από

miR-125b

στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων της ΚΓΠ. Για να γίνει αυτό, και οι δύο LNCaP κύτταρα και 22R

ν

1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με συνθετικό-125bm miR και κυτταρικός πολλαπλασιασμός προσδιορίστηκε με WST-1 προσδιορισμό. Όπως φαίνεται στα σχήματα 3Α και 3Β, όταν συγκρίνεται με τη θεραπεία miR-NC, επιμόλυνση με miR-125bm οδήγησε σε 1,5-πλάσια αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και στις δύο κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς σχηματισμού κλώνου. Παρόμοια με τα WST-1 αποτελέσματα,

miR-125b

διεγείρεται μία 1,0-πλάσια αύξηση στην κλωνογονική επιβίωση των κυττάρων LNCaP και 2,5-φορές αύξηση στην 22R

ν

1 κύτταρα, και η προσθήκη του αντι-

miR-125b

προκάλεσε μία δραματική μείωση στον αριθμό των αποικιών σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα και αντι-miR-NC κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). υποστηρίζουν αυτά τα δεδομένα ότι η ρύθμιση προς τα κάτω της p14

ARF από

miR-125b

διευκολύνει την ανάπτυξη των κυττάρων του Κεφ.

Τα κύτταρα επιμολυσμένα με 50 nM του miR-125bm ή 50 nM των miRNA αρνητικού ελέγχου (mIR-NC) για 5 ημέρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με WST-1 προσδιορισμό.

p14

ΤΑΠ

siRNA (sip14) χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως πολλαπλασιασμός σε σχέση με εκείνο του miR-NC-επεξεργασμένα κύτταρα, και εμφανίζεται ως μέση τιμή ± SD (η = 4).

Η

Anti-

miR-125b

Induced απόπτωση σε κύτταρα CaP που εκφράζουν λειτουργική ρ53

από

miR-125b

ρυθμίζει p14

ARF /Mdm2 σηματοδότησης και στη συνέχεια επηρεάζει το δίκτυο p53, αξιολογήσαμε την επίδραση της προς τα κάτω ρύθμιση του p14

ARF από

miR-125b

στην απόπτωση σε κύτταρα CaP p53-θετικά. Πρώτον, ελέγξαμε την απελευθέρωση του μιτοχονδριακού SMAC (δεύτερη μιτοχόνδρια προερχόμενο ενεργοποιητής της κασπάσης) και ενεργοποιημένου κασπάσης 3 (CAS-3) σε LNCaP και 22R

ν

1 κυτταρικές σειρές που εκφράζουν λειτουργική ρ53. Σε σύγκριση με τη θεραπεία miR-NC, miR-125bm προκάλεσε 10% μείωση του SMAC και 40% μείωση των ενεργοποιημένων Cas-3 σε κύτταρα LNCaP, και η μείωση ήταν 20% και 30% σε 22R

ν

1 κύτταρα αντιστοίχως (Σχήμα 4Α). Αυτές οι κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν επίσης σε αγωγή με αντι-

miR-125b

. Σε σύγκριση με θεραπεία αντι-miR-NC, προς τα κάτω ρύθμιση του

miR-125b

δραστηριότητα που επάγεται περίπου μία διπλάσια αύξηση στην SMAC και ενεργοποιημένα Cas-3 (Σχήμα 4Α). Από αντι-

miR-125b

ρυθμίζει προς τα πάνω SMAC και ενεργοποιείται κασπάσης 3, εμείς έτσι αναλύονται κατά των

miR-125b

επαγόμενη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία TUNEL. 22R

ν

κύτταρα 1 επιμολύνονται με miR-125bm ή αντι

miR-125b

. Δεν αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο παρατηρήθηκε στο miR-125bm επεξεργασμένο 22R

ν

1 κύτταρα. Σε αντίθεση, η αγωγή των 22R

ν

1 κύτταρα με αντι

miR-125b

προκάλεσε το 63% των κυττάρων να υποβληθούν σε απόπτωση (Σχήμα 4Β). Για να επικυρώσετε ότι

miR-125b

διαμορφώνει ρ53-εξαρτώμενη απόπτωση μέσω p14

ARF, 22R

ν

κύτταρα 1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αντι-

miR-125b

, ακολουθούμενη από

p14

ΤΑΠ

αποσιώπηση. Διαπιστώθηκε ότι αντίθετης φοράς να

p14

ΤΑΠ

(sip14) μειώθηκε δραματικά αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε

miR-125b

-inactivated 22R

ν

1 κύτταρα (Σχήμα 4C) . Όπως ήταν αναμενόμενο,

ρ14

ARF

αποσιώπηση διεγείρει τον πολλαπλασιασμό αυτών των 22R

ν

1 κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης αρκετών προ-αποπτωτικών παραγόντων εκτιμήθηκαν με ανάλυση στυπώματος Western. Πράγματι, η θεραπεία με αντι-

miR-125b

προκάλεσε αυξητική ρύθμιση του p14

ΤΑΠ πρωτεΐνη στα 22R

ν

1 κύτταρα, ενώ η προσθήκη sip14 οδήγησε σε προφανή αρνητική ρύθμιση του p14

ARF (60%), ρ53 (30%) και Bak1 (70%), σε σύγκριση με το σκαρφάλωμα θεραπεία siRNA (Εικόνα 4D). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν σθεναρά ότι

miR-125b

/P14

ARF στόχους σηματοδότησης του δικτύου p53, p53 ρύθμιση που εξαρτάται από τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση στα κύτταρα της ΚΓΠ.

Μια

) Ανίχνευση SMAC και ενεργού κασπάσης 3 (CAS-3) σε LNCaP (

αριστερά

) και 22R

ν

1 (

δεξιά

) κύτταρα. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ miR-125bm ή 50 ηΜ αντι-

miR-125β

(αντι-125b) για 5 ημέρες, και τα επίπεδα του SMAC και Cas-3 μετρήθηκαν με ανάλυση αποτύπωσης Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Οι αριθμοί κάτω από τις γέλες είναι οι μέσες μεταβολές πτυχής του SMAC και Cas-3 από τρεις ανεξάρτητες πηκτές σε σχέση με τα αντίστοιχα στοιχεία ελέγχου.

Β

) Ανίχνευση των αντι

miR-125b

επαγόμενη απόπτωση σε 22R

ν

1 κύτταρα. Τα κύτταρα επιμολύνονται χρησιμοποιώντας 50 nM αντι-

miR-125b

για 72 ώρες και αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία TUNEL. Η πράσινη πυρηνική φθορισμού δείχνει την αποπτωτική διάσπαση του πυρηνικού DNA (

αριστερά

). Για τον ποσοτικό προσδιορισμό του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου, 400 κύτταρα μετρήθηκαν και απόπτωση εκφράζεται ως% απόπτωσης (κύτταρα αποπτωτικά /400 × 100%). Η ποσοτική ανάλυση διεξήχθη τρεις φορές και το αποτέλεσμα εκφράσθηκε ως μέση ± SE (η = 3) (

δεξιά

). Κύτταρα κατεργασμένα με ακτινοβολία (IR, 6 Gy) χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος.

C

) δοκιμασία TUNEL των αποπτωτικών θάνατο του 22R

ν

1 κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αντι-

miR-125b ακολουθούμενο από

p14

ARF

αντίθετης φοράς (sip14). Αποτέλεσμα εκφράστηκε ως μέση τιμή ± SE (η = 3).

D

) αναλύσεις Western blot p14

ΤΑΠ, τα επίπεδα Bak1 p53 και 22R

ν

1 κύτταρα.

Αριστερά

: 22R

ν

κύτταρα 1 επιμολύνονται με αντι-

miR-125

?

δεξιά

: αντι-

miR-125

-επιμολυσμένα 22R

ν

1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με sip14. Και οι δύο αντι-miR-NC (αντι-NC) και αγωνίζομαι siRNA χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες.

Η

miR-125b

/P14

ΤΑΠ σηματοδότησης μεσολαβεί p53-ανεξάρτητη αναστολή της ανάπτυξης

στα παραπάνω πειράματα, θα επικυρωθεί ότι

miR-125b

/P14

ΤΑΠ σηματοδότηση εμπλέκεται σε p53-εξαρτώμενη μηχανισμούς στα κύτταρα της ΚΓΠ. Ωστόσο, μελέτες έδειξαν ότι η αδρανοποίηση της λειτουργίας ρ53 εμφανίζεται σε ένα τμήμα των ασθενών με μεταστατικό CaP [28], [29]. Μήπως

miR-125b

/P14

ΤΑΠ σηματοδότησης ρυθμίζουν την ανάπτυξη των κυττάρων και την απόπτωση σε αυτά τα p53-ανεπαρκή CAPS; Χρησιμοποιήσαμε p53-null κύτταρα PC3 καπάκι για να αντιμετωπίσει αυτό το ζήτημα. Εξετάσαμε την επίδραση των αλλοιωθεί

miR-125b

δραστηριότητας στα επίπεδα έκφρασης του p14

πρωτεϊνών ARF και Mdm2. Παρόμοιο με αυτόν του p53-λειτουργικά LNCaP και 22R

ν

1 κύτταρα, διαμόλυνση miR-125bm μειωμένη έκφραση του ρ14

ARF κατά 36% και την αύξηση της Mdm2 κατά 43% σε κύτταρα PC3 ενώ αντι-

miR-125b

προκαλέσει μια προφανή ρύθμιση προς τα άνω του p14

ARF και μια ελαφρά καταστολή του Mdm2 (Εικόνα 5Α). Είμαστε δίπλα ελεγχθεί αν

miR-125b

επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση των κυττάρων PC3. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα PC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αντι

miR-125b

και αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκε με την δοκιμασία TUNEL. Διαπιστώθηκε ότι η θεραπεία με αντι

miR-125b

προκάλεσε 50% αυτών των κυττάρων να υποβληθούν σε απόπτωση (Σχήμα 5Β). Από Bak1 αναφέρθηκε ότι μεσολαβεί Ρ14

ARF επαγόμενη απόπτωση σε ρ53-ελλειπή κύτταρα [30], αξιολογήσαμε την επίδραση της

Bak1

αποσιώπηση επί του πολλαπλασιασμού του miR-125bm επιμολυσμένα κύτταρα PC3. Διαπιστώθηκε ότι miR-125bm προκάλεσε μία 1,6-πλάσια αύξηση στην επιβίωση αυτών των κυττάρων PC3 (Εικόνα 5C), υποστηρίζοντας προηγούμενη παρατήρηση ότι ρ14

ARF /Mdm2 σηματοδότηση συμβάλλει σε ένα ρ53-ανεξάρτητου μηχανισμού [31]. Για να επιβεβαιώσετε τη ρύθμιση του p53-ανεξάρτητη απόπτωση από

miR-125b

/P14

ARF σηματοδότησης,

miR-125b

δραστηριότητα κατεστάλη με αντι-

miR-125b

και

p14

ΤΑΠ

σίγησε με RNAi. Παρατηρήσαμε ότι

p14

ΤΑΠ

αποσιώπηση μειώθηκε σημαντικά αποπτωτικό θάνατο του

miR-125b

-inactivated κύτταρα PC3 (Εικόνα 5D), και επίσης διεγείρει τον πολλαπλασιασμό τους (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης του p14

ARF και Bak1 αναλύθηκαν. Διαπιστώθηκε ότι

miR-125b

αδρανοποίηση που προκαλείται από μια ρύθμιση προς τα άνω του p14

ARF, ενώ

p14

ΤΑΠ

αποσιώπηση αντιστραφεί η αυξητική ρύθμιση του p14

ΤΑΠ (60%) και επίσης προκάλεσε μια ρύθμιση προς τα κάτω της Bak1 (Σχήμα 5Ε). Μια προηγούμενη μελέτη ανέφερε ότι τόσο Bcl-X

L και Mcl-1 μεσολαβούν Ρ14

ARF-διεγειρόμενη ρ53-ανεξάρτητη απόπτωση. Αυτές οι δύο αντι-αποπτωτικό παράγοντες έτσι αναλύθηκαν. Εμείς δεν τήρησε την εξέλιξή τους στο

miR-125b

-inactivated,

p14

ΤΑΠ

-silenced κύτταρα PC3 (Εικόνα 5D). Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι

miR-125b

/P14

ARF σηματοδότησης είναι σε θέση να ρυθμίζουν την ανάπτυξη και την απόπτωση σε κύτταρα CaP p53-ανεπαρκή.

Μια

) Ανίχνευση της p14 επίπεδα

ARF και Mdm2 στα κύτταρα PC3 p53-null. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ miR-125bm ή αντι

miR-125b

για 72 ώρες. Τα επίπεδα έκφρασης αμφοτέρων των ρ14

ARF και Mdm2 αναλύθηκαν με δοκιμασία κηλίδος Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Β

) Ανίχνευση των αντι

miR-125b

επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα PC3. Τα κύτταρα επιμολύνονται χρησιμοποιώντας 50 nM αντι-

miR-125b

για 72 ώρες και αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία TUNEL. Η πράσινη πυρηνική φθορισμού δείχνει την αποπτωτική διάσπαση του πυρηνικού DNA (

αριστερά

). Για τον ποσοτικό προσδιορισμό του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου, 400 κύτταρα μετρήθηκαν και απόπτωση εκφράζεται ως% απόπτωσης (κύτταρα αποπτωτικά /400 × 100%). Η ποσοτική ανάλυση διεξήχθη τρεις φορές και το αποτέλεσμα εκφράσθηκε ως μέση ± SE (η = 3) (

δεξιά

). Κύτταρα κατεργασμένα με ακτινοβολία (IR, 6 Gy) χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος.

C

)

MiR-125β

προωθεί την ανάπτυξη της p53-null,

Bak1

-silenced κύτταρα PC3. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 ηΜ miR-125m για 5 ημέρες και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία WST-1. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως η αναστολή της ανάπτυξης σε σχέση με εκείνο του miR-NC (μέση ± SD, η = 4). Ένθετο: έκφραση Bak1 στο

Bak1

-silenced κύτταρα PC3.

D

) TUNEL ανάλυση των αποπτωτικό θάνατο των κυττάρων PC3 που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αντι-

miR-125b ακολουθούμενο από

p14

ΤΑΠ

αντίθετης φοράς (sip14). Αποτέλεσμα εκφράστηκε ως μέση τιμή ± SE (η = 3).

E

) αναλύσεις Western blot p14

επίπεδα ARF και Bak1 στα κύτταρα PC3.

Top

: PC3 κύτταρα επιμολυσμένα με αντι

miR-125

?

κάτω

: αντι-

miR-125

επιμολυσμένα κύτταρα PC3 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με sip14. Και οι δύο αντι-miR-NC (αντι-NC) και αγωνίζομαι siRNA χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες.

Η

Συζήτηση

Πρόσφατες παρατηρήσεις της ανώμαλης έκφρασης των miRNAs σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους έχουν τονίσει τη σημασία της miRNAs σε πολλές βιολογικές διεργασίες [5].

MiR-125β

είναι ένα ευρέως συντηρημένες miRNA και βρέθηκε να είναι αυξημένα σε διάφορους τύπους καρκίνων, περιλαμβανομένου του πώματος [14], [15].