PLoS One: Μυθιστόρημα καρκίνο του παγκρέατος Γραμμές κυττάρων που προέρχονται από γενετικώς τροποποιημένα μοντέλα ποντικών της Αυθόρμητη αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος: Εφαρμογές στην Διάγνωση και Therapy

Ιούλιος 13th, 2014 elhealth του καρκίνου άρθρα

Αφηρημένο

Ο καρκίνος του παγκρέατος (PC) παραμένει μία από τις πιο θανατηφόρες ανθρώπινες κακοήθειες με κακή πρόγνωση . Παρ ‘όλες τις προόδους στην προκλινική έρευνα, δεν υπήρξαν σημαντικές μετάφραση των νέων θεραπειών στις κλινικές. Η ανάπτυξη του με γενετική μηχανική ποντικού (GEM) μοντέλα που παράγουν αυθόρμητο αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος (PDAC) αύξησαν την κατανόησή μας της παθογένεσης της νόσου. Αν και αυτά τα μοντέλα ποντικού PDAC είναι ιδανικά για τη μελέτη πιθανές θεραπείες και ειδικές γενετικές μεταλλάξεις, υπάρχει ανάγκη για την ανάπτυξη συγγενή κυτταρικές σειρές από αυτά τα μοντέλα. Σε αυτή τη μελέτη, περιγράφουμε την επιτυχή δημιουργία και το χαρακτηρισμό τρεις κυτταρικές γραμμές που προέρχονται από δύο (PDAC) μοντέλα ποντικιών. Η κυτταρική σειρά ΟΗΕ-KC-6141 προήλθε από έναν όγκο στο πάγκρεας ενός Kras

G12D? Pdx1-Cre (KC) ποντίκι σε 50 εβδομάδες της ηλικίας, ενώ ΟΗΕ-KPC-960 και UN-KPC-961 κυτταρικές σειρές ήταν που προέρχεται από όγκους του παγκρέατος του Kras

G12D? Trp53

R172H? Pdx1-Cre (KPC) ποντίκια σε 17 εβδομάδες της ηλικίας. Τα καρκινικά μεταλλάξεις αυτών των μητρικών ποντίκια μεταφέρθηκαν στις κυτταρικές σειρές κόρη (δηλαδή

Kras

G12D

μετάλλαξη παρατηρήθηκε σε όλες τις τρεις κυτταρικές σειρές, ενώ

Trp53

μετάλλαξη παρατηρήθηκε μόνο σε KPC κυττάρων γραμμές). Οι κυτταρικές σειρές έδειξαν χαρακτηριστική πλακόστρωτο επιθηλιακά μορφολογία στον πολιτισμό, και σε αντίθεση με το παρελθόν καθιερωμένη κυτταρική γραμμή PDAC ποντίκι Panc02, εξέφρασε την πόρου CK19 δείκτη. Επιπλέον, αυτές οι κυτταρικές γραμμές εξέφρασαν τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά δείκτες Ε-καδερίνης και Ν-καδερίνης, και επίσης, MUC1 και MUC4 βλεννίνες. Επιπλέον, αυτές οι κυτταρικές γραμμές ήταν ανθεκτικά στο χημειοθεραπευτικό φάρμακο γεμσιταβίνη. εμφύτευσή τους

in vivo

παράγονται υποδόρια καθώς και όγκους στο πάγκρεας (ορθοτοπική). Οι γενετικές μεταλλάξεις σε αυτές τις κυτταρικές σειρές μιμούνται τη γενετική επιτομή της ανθρώπινης PDAC, η οποία τους προσφέρει την πολύτιμη μοντέλα με υψηλό δυναμικό της μεταφραστικής ενδιαφέρον για την εξέταση διαγνωστικοί δείκτες και θεραπευτικά φάρμακα

Παράθεση:. Torres MP, Rachagani S, Souchek JJ, Mallya Κ, Johansson SL, Batra SK (2013) Μυθιστόρημα καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές σειρές που προέρχονται από γενετικώς τροποποιημένα μοντέλα ποντικών της Αυθόρμητη αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος: Εφαρμογές στην διάγνωση και θεραπεία. PLoS ONE 8 (11): e80580. doi: 10.1371 /journal.pone.0080580

Επιμέλεια: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20, Αυγ του 2013? Αποδεκτές: 14 Οκτ 2013? Δημοσιεύθηκε: 20 του Νοέμβρη του 2013

Copyright: © 2013 Torres et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο ήταν, εν μέρει, χρηματοδοτήθηκε από το NIH (tmen U54 CA163120, EDRN UO1, CA111294, SPORE Ρ50 CA127297, RO1 CA133774, RO1 CA78590, και RO3 CA167342). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Παρά τις πολλές προόδους στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην καρκίνο του παγκρέατος (PC) παθογένεια κατά τη διάρκεια των τελευταίων τεσσάρων δεκαετιών, η νόσος παραμένει ένα από τα κορυφαία κακοηθειών με χειρότερη πρόγνωση [1]. Αυτές οι δυσοίωνες στατιστικές είναι μια διαρκής υπενθύμιση της επείγουσας ανάγκης για την αποσαφήνιση ακόμα ανεξερεύνητο μηχανισμούς της παθολογίας PC που θα συμβάλει στη βελτίωση της διάγνωσης και της θεραπείας σχήματα. Για το σκοπό αυτό, η ανάπτυξη προκλινικά μοντέλα είναι ζωτικής σημασίας, επειδή είναι κρίσιμης σημασίας για την αξιολόγηση νέων θεραπευτικών στρατηγικών [2]. Ξενομοσχεύματος όγκων σε αθυμικά γυμνά ποντίκια είναι χρήσιμα προκλινικά μοντέλα, αλλά δεν μπορούν να παρέχουν το ρόλο των ανοσολογικών μηχανισμών που μπορεί να προσθέσει ή να παρεμβαίνει στη δράση των θεραπευτικών υποψηφίων. Πιο πρόσφατα, γενετικά τροποποιημένα ποντίκια (GEM) μοντέλα που παράγουν αυθόρμητο παγκρεατικά αδενοκαρκινώματα (PDAC) έχουν προχωρήσει σε μεγάλο βαθμό κατανόηση της παθογένεσης PC και επίσης, επέτρεψε την εξέταση νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων [3] – [6]. Επιπλέον, συγγενή κυτταρικές σειρές μπορούν να απομονωθούν από όγκους του παγκρέατος που παράγονται από τα μοντέλα GEM και χρησιμοποιούνται για

in vitro

και

in vivo

προσδιορισμούς διαλογής. Η ανάλυση των λειτουργιών και των χαρακτηριστικών των συγκεκριμένων γενετικών μεταλλάξεων και βιοδεικτών PC παρούσα σε αυτές τις κυτταρικές σειρές μπορεί να ρίξει φως σχετικά με το σχεδιασμό των πολλά υποσχόμενων διαγνωστικές και θεραπευτικές στρατηγικές.

Οι μεταλλάξεις στο

KRAS

CDKN2A

TP53

, και

Smad4 /DPC4

γονίδια παρατηρούνται συνήθως σε όγκους PDAC από ασθενείς PC [7]. Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα αποτελέσματα, αρκετά μοντέλα ποντικού που παράγουν αυθόρμητο PDAC, έχουν κατασκευαστεί κατά την τελευταία δεκαετία [3], [4], [6]. Η παρούσα μελέτη επικεντρώνεται σε ποντίκια που φέρουν

Kras

και

Trp53

μεταλλάξεις. Ο ρόλος των ογκογόνων

Ras

στο PC εξετάστηκε κατευθύνοντας ενδογενή έκφραση του

Kras

G12D

στα προγονικά κύτταρα του παγκρέατος σε Kras

G12D? Pdx1-Cre (KC ) ποντίκια [3], ενώ ο ρόλος του ενδογενούς έκφρασης του

Trp53

R172H

και

Kras

G12D

εξετάστηκε στο πάγκρεας του Kras

G12D? Trp53

R172H? Pdx1-Cre (KPC) ποντίκια [4]. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι αυθόρμητες παγκρεατικών όγκων που παράγονται από αυτά τα μοντέλα ποντικού ανακεφαλαίωση των κλινικών, ιστοπαθολογικά και γονιδιωματικών χαρακτηριστικά της ανθρώπινης PDAC.

κυτταρικές σειρές ποντικού PDAC με μεγαλύτερη κλινική σημασία για PC είναι άκρως απαραίτητο. Οι διαθέσιμες σήμερα κυτταρική σειρά Panc02 έχει χρησιμοποιηθεί κατά τη διάρκεια των τριών τελευταίων δεκαετιών [8]. Προήλθε από PDAC όγκων που διεγείρονται από την εμφύτευση 3-μεθυλ-χλωρανθρένιο (3-MCA)-κορεσμένο νήματα από βαμβάκι στο πάγκρεας του C57BL /6 ποντίκια. Παρά την ευρεία χρήση της στην αξιολόγηση των διαφόρων θεραπευτικών στρατηγικών, τα κύτταρα στερούνται Panc02 ισχυρή κλινική σημασία για το PC λόγω της απουσίας του μεταλλάξεων φάσματος σε σύγκριση με την ανθρώπινη ασθένεια. Κατά συνέπεια, η επιτυχία στη μετάφραση θεραπείες που υποδεικνύεται από αυτό το μοντέλο ήταν περιορισμένη. Σε αυτό το χειρόγραφο, περιγράφουμε την παραγωγή και τον χαρακτηρισμό τριών νέων PDAC κυτταρικές σειρές που προέρχονται από αυθόρμητες μοντέλα ποντικών του PC. Μία κυτταρική γραμμή που προέρχεται από έναν ποντικό KC σε 50 εβδομάδες ηλικία, και άλλοι δύο προέρχονται από ποντικούς KPC σε 17 εβδομάδες της ηλικίας. Η επιτυχής καθιέρωση και

in vitro

και

in vivo

χαρακτηρισμός αυτών των κυτταρικών σειρών είναι περιεκτικά περιγράφεται, συμπεριλαμβανομένου σημειωτές σήμερα γνωστό για παγκρεατικών όγκων.

Υλικά και Μέθοδοι

Καθιέρωση Κυτταρικών γραμμών

Το πλήρες μέσο συνίσταται από ϋΜΕΜ που περιέχει θερμικά αδρανοποιημένο FBS, L-γλουταμίνη (200 mM), 100Χ μη απαραίτητα αμινοξέα (100 mM), όξινο ανθρακικό νάτριο, ρυθμιστικό HEPES, γενταμικίνη (50 mg /ml), και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (100 μg /ml). Αμέσως μετά την εκτομή του όγκου, 200 mg παγκρεατικού ιστού όγκου μεταφέρθηκε σε ένα τρυβλίο Petri που περιέχει αποστειρωμένο PBS και Γενταμυκίνη (20 μg /ml).

Τα συλλεχθέντα ιστοί πλύθηκαν 3 φορές με PBS-γενταμυκίνης και μεταφέρθηκαν σε ένα τρυβλίο Petri που περιέχει το πλήρες μέσο. Ο όγκος λεπτώς αλεσμένα με ένα αποστειρωμένο νυστέρι και μεταφέρθηκαν σε ένα αποστειρωμένο σωλήνα φυγοκέντρησης με το πλήρες μέσο που περιέχει κολλαγενάση Ρ (Roche, Indianapolis, ΙΝ) (10 mg /ml) .Το μίγμα επωάστηκε στους 37 ° C για 30 λεπτά. Οι σωλήνες αναστράφηκαν κάθε τρεις λεπτά για να διασφαλιστεί η σωστή ανάμιξη. Μετά από δύο κύκλους πλυσίματος σε πλήρες μέσο, το σφαιρίδιο που ελήφθη μετά τη φυγοκέντρηση αιωρήθηκε στο πλήρες μέσο. Αφού αφέθηκε το σωληνάριο να σταθεί για 2 λεπτά, κυτταρικό εναιώρημα χωρίς υπολείμματα ιστός μεταφέρθηκε σε ένα νέο αποστειρωμένο δίσκο 10 εκ Petri.

Μετά από επώαση όλη τη νύκτα στους 37 ° C σε 5% CO

2, το μέσο ήταν αντικαταστάθηκε με φρέσκο μέσο. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν άπαξ συρροή. Για να εμποδίσει την ανάπτυξη των ινοβλαστών, διαφορικής θρυψινοποίηση διεξήχθη, όπου θρυψίνη προστέθηκε στα κύτταρα και μετά από 10 sec, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και προστέθηκε φρέσκο μέσο. Επιπλέον, το μέσο συμπληρώθηκε με τοξίνη χολέρας (400 ng /ml) για τις πρώτες 7 περάσματα όπως έχει αναφερθεί στο παρελθόν ότι έχει μια ενισχυμένη μιτογονικό αποτέλεσμα επί των επιθηλιακών κυττάρων, αλλά όχι σε ινοβλάστες [9]. Μετά από 10 περάσματα, οι κυτταρικές σειρές μεταφέρθηκαν σε κανονικό πλήρες μέσο (δηλαδή DMEM μέσο συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 μg /ml πενικιλλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη) και διατηρήθηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2 σε υγροποιημένο επωαστή. Τρεις κυτταρικές σειρές δημιουργήθηκαν με επιτυχία. Η κυτταρική γραμμή που προέρχεται από ένα Kras

G12D? Pdx1-Cre (KC) ποντίκι ονομάστηκε ΟΗΕ-KC-6141 και οι δύο κυτταρικές σειρές που προέρχονται από Kras

G12D? Trp53

R172H? Pdx1-Cre (KPC ) ποντίκια που ονομάζεται ΟΗΕ-KPC-960 και UN-KPC-961 (ΟΗΕ χαρακτηρίζει το Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο).

In vitro

χαρακτηρισμό και ογκογόνο μελέτες έγιναν μετά από 35 περάσματα σε καλλιέργεια κυττάρων. Το μυϊκό PDAC κυτταρική σειρά Panc02 περιλήφθηκε στις

in vitro

λειτουργικές δοκιμασίες.

αλληλουχίας των γραμμών κυττάρων για

Kras

και

p53

Μεταλλάξεις

Οι υπο-συρρέουσες καλλιέργειες ΟΗΕ-KC-6141, UN-KPC-960, και του ΟΗΕ-KPC-961 λύθηκαν με διάλυμα λύσης κυττάρου που περιέχουν βήτα-μερκαπτοαιθανόλη και το συνολικό RNA απομονώθηκε με RNeasy MINIKIT (Qiagen, Germantown , MD). cDNA συντέθηκε από ολικό RNA χρησιμοποιώντας ολίγο (dT) 18 εκκινητή και SuperScript II αντίστροφη μεταγραφάση (τεχνολογίες Ζωή ™, Carlsbad, CA). PCR ενίσχυση του μυϊκού

Kras

κωδικόνιο 12 (εξόνιο 1) και

p53

κωδικόνια 172 (εξόνιο 5) διεξήχθη με τη χρήση σετ εκκινητών για κάθε γονίδιο (

Kras

-seqF: 5′-ACTTGTGGTGGTTGGAGCTG-3 ‘,

Kras

-seqR: 5′-TGACCTGCTGTGTCGAGAAT-3′,

p53

-seqF: 5′-CACGTACTCTCCTCCCCTCA-3 »και

p53

-seqR: 5′-ATTTCCTTCCACCCGGATAA-3 ‘), το οποίο καταλήγει σε 168 bp (

Kras

) και 229 bp (

p53

) τα προϊόντα PCR. Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν με κιτ καθαρισμού PCR προϊόν (Qiagen, Germantown, MD) και τα καθαρισμένα PCR προϊόντα αλληλουχήθηκαν χρησιμοποιώντας

Kras

-seqR: 5′-TGACCTGCTGTGTCGAGAAT-3 ‘για το

Kras

και

p53

-seqF: 5′-CACGTACTCTCCTCCCCTCA-3 »για

p53

γονίδιο

ανάπτυξη κινητική

για την κινητική ανάπτυξη μελέτες, κάθε κυτταρική σειρά. σπάρθηκε εις τετραπλούν σε μία πλάκα 96 φρεατίων (1000 κύτταρα /φρεάτιο) σε πλήρες μέσο. Μετά από ολονύκτια επώαση, το μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο συμπληρωμένο με 1% FBS και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (100 μg /ml). Κάθε μέρα, 10 μΙ του κυτταρικού πολλαπλασιασμού Αντιδραστήριο WST-1 (Roche, Indianapolis, ΙΝ) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και μετά από 3 ώρες επώασης, τιμές απορρόφησης μετρήθηκαν στα 450 nm. Οι τιμές απορρόφησης αφαιρέθηκαν από τις τιμές που καταγράφονται στο μήκος κύματος αναφοράς (600 nm), όπως υποδεικνύεται από τον κατασκευαστή. Η διαδικασία επαναλήφθηκε για 7 ημέρες. Ο χρόνος διπλασιασμού (T

D) για κάθε κυτταρική σειρά υπολογίστηκε κατά τη διάρκεια της εκθετικής φάσης ανάπτυξης, χρησιμοποιώντας τον τύπο Τ

D = 0.693t /ln (N

T /N

0), όπου t = χρονική διαφορά σε ώρες, Ν

t = τιμή απορρόφησης σε χρόνο t, και Ν

0 = τιμή απορρόφησης σε αρχικό χρόνο [10].

Real Time PCR

RNA απομονώθηκε και καθαρίστηκε από το UN-KC-6141, τα κύτταρα του ΟΗΕ-KPC-960, ΟΗΕ-KPC-961, Panc02, και ΝΙΗ3Τ3 (ινοβλάστες ποντικού) χρησιμοποιώντας το RNeasy MINIKIT (Qiagen, Germantown, MD). cDNA συντέθηκε από ολικό RNA χρησιμοποιώντας ολίγο (dT) 18 εκκινητή και SuperScript II αντίστροφη μεταγραφάση (τεχνολογίες Ζωή ™, Carlsbad, CA) όπως περιγράφεται από εμάς σε προηγούμενη δημοσίευση [11]. Real-time PCR διεξήχθη στο LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Indianapolis, ΙΝ). Η ενίσχυση έγινε σε μια διαδικασία δύο σταδίων (95 ° C για 5 λεπτά που ακολουθείται από 45 κύκλους των 95 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 60 ° C για 10 δευτερόλεπτα, και 72 ° C για 10 sec) με τη χρήση του LightCycler 480 SYBR Green Ι Master Mix (Roche Diagnostics, Indianapolis, ΙΝ) και cDNA από κάθε δείγμα.

GAPDH

χρησιμοποιήθηκε ως το γονίδιο εσωτερικού ελέγχου με τα οποία κανονικοποιήθηκαν όλα τα γονίδια. Η πολλαπλή μεταβολή στη γονιδιακή έκφραση του

αμυλάση

και

CK19

mRNA σε κυτταρικές σειρές καρκίνου συγκρίθηκαν σε σχέση με τα επίπεδα του mRNA που εξάγεται από την κανονική πάγκρεας ποντικού με τη χρήση του 2

-ΔΔCt μέθοδο, ενώ η πολλαπλή μεταβολή του

MUC1

και

MUC4

συγκρίθηκαν σε σχέση με την mRNA που εξάγεται από την κυτταρική σειρά ινοβλαστών ποντικού ΝΙΗ3Τ3. Η αλληλουχία των εκκινητών που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη παρατίθενται στον Πίνακα 1.

Αντισώματα

Το αντι-CK19 υβριδώματος (Troma-ΙΙΙ) που αναπτύχθηκε από τον Dr. Rolf Kemler ελήφθη από η Αναπτυξιακών Μελετών Hybridoma Bank αναπτύχθηκε υπό την αιγίδα του NICHD και διατηρείται στο Πανεπιστήμιο της Αϊόβα (Iowa City, IA). Αντίσωμα έναντι ποντικού Ε-καδερίνης ελήφθησαν από την Cell Signaling (Danvers, ΜΑ). αντισώματος Ν-καντερίνη ήταν ένα είδος δώρο από τον Δρ Keith R. Johnson από UNMC (Omaha, NE). β-ακτίνης και τα αντισώματα αμυλάση αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Για συνεστιακή μελέτες οι δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα σε Alexa Fluor® (568, 488) ελήφθησαν από την Life Technologies ™ (Carlsbad, CA). Τα δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση στυπώματος Western αποκτήθηκαν από την GE Healthcare Life Sciences (Uppsala, Sweden). Αντι-ποντικού MUC1 αντίσωμα (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού που αναγνωρίζει την κυτταροπλασματική ουρά του MUC 1) αγοράστηκε από την Abcam® (Cambridge, ΜΑ, USA). Το αντι-MUC4 (πολυκλωνικό 4Α-κουνελιού) αντίσωμα σχεδιάστηκε σε αυτό το εργαστήριο και αναπτύχθηκε από GenScript (Piscataway, NJ, USA) όπως έχει περιγραφεί προηγουμένως [12].

Ομοεστιακή Μικροσκοπία

η πρωτεϊνική έκφραση αναλύθηκε με συνεστιακή μικροσκοπία. 2 × 10

5 κύτταρα εναιωρούνται σε πλήρες μέσο σπάρθηκαν σε καλυπτρίδες από γυαλί τοποθετείται σε ένα 12-φρεατίων. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε παγωμένο μεθανόλης. Μετά από έκπλυση σε PBST και κλείδωμα με 10% ορό κατσίκας (Jackson Immunoresearch Labs, West Grove, ΡΑ), τα κύτταρα επωάστηκαν με αντισώματα για αμυλάσης (1: 500), CK19 (1: 1000), Ε-καδερίνης (1:50 ), Ν-καντερίνη (1:20), και MUC1 (1: 100) όλη τη νύκτα. Αυτά πλύθηκαν τέσσερις φορές με PBST, 5 λεπτά ανά πλύση. Τα κύτταρα επωάστηκαν με τα αντίστοιχα δευτεροταγή αντισώματα (ποντικού /κουνελιού) συζευγμένο με Alexa Fluor (568, 488) (Life Technologies ™, Carlsbad, CA) και μετά από επανάληψη των βημάτων πλύσης, τα γυάλινες καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν σε γυάλινα πλακίδια με vectashield τοποθέτηση μέσο (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Τα κύτταρα απεικονίστηκαν σε ένα συνεστιακό λέιζερ μικροσκόπιο LSM 510 (Carl Zeiss GmbH, Thornwood, ΝΥ) στα αντίστοιχα μήκη κύματος με μεγέθυνση × 63.

Ανάλυση Western Blot

Για ανάλυση κηλίδος western , τα κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 6-φρεατίων σε πλήρες μέσο. Στο -80% συρροή, τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα προσδιορισμού ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) που περιέχει πρωτεάση και αναστολείς φωσφατάσης. Τα λύματα υποβλήθηκαν σε αρκετούς κύκλους ψύξης-απόψυξης για να εξασφαλιστεί η πλήρης λύση. Η συγκέντρωση των προϊόντων λύσης προσδιορίστηκε με την μικρο-δικιγχονικού κιτ εκτίμησης πρωτεΐνης οξέος (Bio-Rad, Hercules, CA). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης ρυθμίστηκαν και διαλύματα παρασκευάστηκαν υπό αναγωγικές συνθήκες (δηλ β-μερκαπτοαιθανόλη). πηκτές SDS-αγαρόζης 2% χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της έκφρασης MUC4. 40 μg από προϊόντα λύσης πρωτείνης φορτώθηκαν και η πηκτή τρέξει για 4 ώρες στους 100 Ε-καδερίνης και Ν-cadherin επίπεδα έκφρασης V. αναλύθηκαν με SDS-PAGE. 40 μg από προϊόντα λύσης πρωτείνης φορτώθηκαν και ο διαχωρισμός έγινε σε 80 mA για 1 ώρα. Αποφασισμένοι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν πάνω σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου, μπλοκαριστεί σε 5% γάλα σε PBS, και επωάστηκαν με τα πρωτογενή αντισώματα όλη τη νύχτα. Μετά από πλύση με PBST, προστέθηκαν οι αντίστοιχες δευτερογενή αντισώματα και μετά την επανάληψη των σταδίων πλύσης, οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με λουμινόλη (Thermo Scientific, Middletown, VA) μετά από έκθεση σε φιλμ ακτίνων Χ.

Δοκιμασία Κυτταροτοξικοί

Η κυτταροτοξική δράση του χημειοθεραπευτικού φαρμάκου γεμσιταβίνη σε κυτταρικές σειρές KC και KPC συγκρίθηκε με το κυτταροτοξικό αποτέλεσμα επί Panc02. Το ενέσιμο διάλυμα της Γεμσιταβίνη, Gemzar® (Eli Lilly Company, Indianapolis, IN) παρασχέθηκε ευγενώς από το φαρμακείο στο Lied Κέντρο Μεταμοσχεύσεων στο UNMC. Για τη δοκιμασία κυτταροτοξική, 1 × 10

4 κύτταρα εναιωρούνται σε πλήρες μέσο σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96 φρεατίων. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις διαλύματος γεμσιταβίνη (100 ηΜ-100 μΜ) σε φρεάτια εις τετραπλούν. Μετά από επώαση των κυττάρων με Γεμσιταβίνη για 48 ώρες, μέσα που περιέχουν θειαζολύλιο μπλε αντιδραστήριο βρωμιούχου τετραζολίου (Sigma Aldrich, St Louis, ΜΟ) προστέθηκε στα κύτταρα. Μετά από 4 ώρες επώασης, οι κρύσταλλοι φορμαζάνης που παράγεται από μεταβολικώς δραστικά κύτταρα διαλύθηκαν με 100 μΙ DMSO. Οι τιμές απορρόφησης στα 540 nm χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό ποσοστά κυτταροτοξικότητα. Η μέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση μισό (IC-50) της γεμσιταβίνη προσδιορίστηκε σε κάθε κυτταρική σειρά από παρεμβολή τιμές στο γράφημα (% κυτταροτοξικότητα εναντίον Γεμσιταβίνη Συγκέντρωση).

μελέτες ογκογένεσης

Η καρκινογένεση από τη οι κυτταρικές σειρές προσδιορίστηκε μετά από ορθοτοπική εμφύτευση των κυτταρικών σειρών PC ποντίκι (UN-KC-6141 /UN-KPC-960 /UN-KPC-961) στην κεφαλή του παγκρέατος μετά από 35 περάσματα. Με βάση το υπόβαθρο ποντίκια από όπου παρήχθησαν οι κυτταρικές σειρές, UN-KC-6141 κύτταρα (1 × 10

6) εγχύθηκαν σε ποντίκια C57BL /6, ενώ τα κύτταρα του ΟΗΕ-KPC-960 και UN-KPC-961 ( 1 × 10

6) ενέθηκαν σε μικτά φόντο (δηλ B6.129) ποντικοί (Ν = 7). κύτταρα ποντίκι PC αιωρήθηκε σε 50 μΐ αποστειρωμένου PBS εγχύθηκαν ορθοτοπικά χρησιμοποιώντας την ίδια διαδικασία που περιγράφεται από εμάς [13], [14]. Υποδόρια ανάπτυξη του όγκου αξιολογήθηκε μόνο με την κυτταρική γραμμή ΟΗΕ-KPC-961. 5 × 10

6 κύτταρα εγχύθηκαν (Ν = 12) σε μικτό B6.129 ποντικούς φόντο στην πλάγια στήθος. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε με ψηλάφηση μετρήσεις καλίμπρας /Vernier σε περίπτωση υποδόριων όγκων. Καθ ‘όλη τη πείραμα, τα ζώα δόθηκαν με τροφή και νερό κατά βούληση και υποβάλλεται σε ένα σκοτεινό κύκλο 12 ωρών φωτός /. Οι μελέτες σε ζώα εκτελέστηκαν σύμφωνα με τις Η.Π.Α. Υπηρεσία Δημόσιας Υγείας «Κατευθυντήριες γραμμές για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου» στο πλαίσιο εγκεκριμένου πρωτοκόλλου από το Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο Θεσμικών Φροντίδα των ζώων και της Επιτροπής Χρήση (IACUC). Μετά ευθανασία, παγκρεατικών όγκων αποκόπηκαν, ζυγίστηκαν και μονιμοποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) για την H & amp? Χρώση Ε. Μικτό μεταστατικές βλάβες εξετάστηκαν σε απομακρυσμένα όργανα και υποβάλλονται σε επεξεργασία για ιστολογική ανάλυση

χρώση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η & amp? Ε).

Μετά τον καθορισμό των ιστών σε 10% φορμόλη για τουλάχιστον 48 ώρες, οι ιστοί εγκλείστηκαν σε παραφίνη και σειριακές τομές ιστού (πάχους 4 μm) κόπηκαν. Οι τομές απαλλάχθηκαν από την παραφίνη με χρήση EZ-DeWaxTM (Bio GENEX, San Roman CA, USA) και επανυδατώθηκαν σταδιακά. Στη συνέχεια, οι τομές βάφτηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η & amp? Ε). Λεκέδες και εξετάστηκαν από πιστοποιημένο παθολόγο

Στατιστικά

Σημαντικές διαφορές στις πειραματικές τιμές προσδιορίζονται με υπολογισμό του p-τιμές χρησιμοποιώντας η JMP® Στατιστική Discovery λογισμικού (Cary, NC). t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της αντίστοιχης

p-value

(

p-τιμές

& lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές).

Αποτελέσματα

In vitro

δημιουργία κυτταρικών σειρών KC και KPC

κυτταρικές σειρές ποντίκι υπολογιστή δημιουργήθηκαν με επιτυχία από τις αυθόρμητες όγκους του παγκρέατος που παράγονται από την Kras

G12D? Pdx1-Cre (KC) και η Kras

G12D? Trp53

R172H? Pdx1-Cre (KPC) ποντίκια σε 50 εβδομάδες και 17 εβδομάδες της ηλικίας, αντίστοιχα. Μία κυτταρική γραμμή που προέρχεται από τα ποντίκια KC ονομάστηκε ΟΗΕ-KC-6141, και δύο άλλες κυτταρικές σειρές που προέρχονται από τα ποντίκια KPC ονομάστηκαν ΟΗΕ-KPC-960 και UN-KPC-961. Και οι τρεις κυτταρικές σειρές αυξήθηκαν πάνω από 50 περάσματα σε φυσιολογικά μέσα χωρίς σημάδι γήρανσης. μονοστρωματικές καλλιέργειες και των τριών κυτταρικών σειρών έδειξε χαρακτηριστική πλακόστρωτα μορφολογία με κλειστό σχηματισμό επαφή νησιού (Εικόνα 1Α). Για να βεβαιωθείτε ότι αυτές οι κυτταρικές σειρές διατηρήθηκαν οι γενετικές μεταλλάξεις των αντίστοιχων γονική ποντίκια τους (KC και KPC), η κατάστασης μεταλλάξεων του

Kras

(Εικ. 1Β) και

Trp53

(Εικ. 1Γ εξετάστηκε) τόπους. Όπως ήταν αναμενόμενο, οι τρεις κυτταρικές σειρές πραγματοποιηθεί το

Kras

G12D

σημείο μετάλλαξης, ενώ ΟΗΕ-KPC-960 και UN-KPC-961 μετέφερε το

Trp53

R172H

ενεργοποίηση μετάλλαξης .

(Α) Ανεστραμμένη εικόνες μικροσκοπίου (4Χ) του ΟΗΕ-KC-6141, UN-KPC-960, και του ΟΗΕ-KPC-961 κυτταρικές σειρές PDAC μετά από 35 περάσματα. Οι τρεις κυτταρικές σειρές που εμφανίζονται τυπικά πλακόστρωτα επιθηλιακά μορφολογία. Γενετική ανάλυση της αλληλουχίας των (Β)

Kras

G12D

και (C)

Trp53

R172H

μετάλλαξη σε κυτταρικές σειρές PC ποντίκι. Μπλε σκιασμένες περιοχές αντιπροσωπεύουν το κωδικόνιο όπου βρίσκεται η μετάλλαξη. Ένα κίτρινο ορθογώνιο δείχνουν την νουκλεοτιδική υπεύθυνη για την μετάλλαξη. Μια πάγκρεας από ένα (tag ποντίκι ΟΗΕ-KPC-1207) Pdx1-Cre ποντικών χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας για

Kras

μετάλλαξη.

Οι αύξησης της κινητικής των τριών αυτών ποντίκι υπολογιστή κυτταρικές γραμμές ήταν σε σύγκριση με κύτταρα Panc02 (Σχήμα 2Α). ΟΗΕ-KPC-961 κύτταρα πολλαπλασιάστηκαν ο ταχύτερος με χρόνο διπλασιασμού (Τ

Δ) 33 h (

& lt? 0,0001 σε σύγκριση με Panc02). ΟΗΕ-KPC-960 και Panc02 μεγάλωσε σε παρόμοια ποσοστά (Τ

Δ ≈ 60 ώρες), ενώ ΟΗΕ-KC-6141 έδειξε ότι το βραδύτερο ρυθμό ανάπτυξης (Τ

D 70 h) (Σχήμα 2Β).

(Α) τα κύτταρα σπάρθηκαν σε φρεάτια εις τετραπλούν από πλάκες 96-φρεατίων και την ανάπτυξή τους ακολούθησε καθημερινά μετρώντας την απορρόφηση μετά από επώαση με WST-1 αντιδραστηρίου. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση απορρόφηση (λ

Δείγμα = 450 nm, λ

Ref = 600 nm) των τεσσάρων επαναλήψεων ± τυπικό σφάλμα. Στατιστικά στοιχεία υπολογίστηκαν σε σύγκριση με την καμπύλη ανάπτυξης για Panc02 (*

& lt? 0,01, **

& lt? 0.001, ***

& lt? 0,0001 ). (Β) χρόνος διπλασιασμού (Τ

D) του κυτταρικού πληθυσμού υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση Τ

D = (0.693t) /ln (N

T /N

0) όπου t = χρονική διαφορά σε ώρες κατά τη διάρκεια της λογαριθμικής φάσης, Ν

t = τιμή απορρόφησης σε χρόνο t, και Ν

0 = τιμή απορρόφησης κατά την αρχική περίοδο.

KC και KPC-κυτταρικές σειρές που προέρχονται έχουν ductal- όπως χαρακτηριστικά

είναι

PDACs πιστεύεται ότι προέρχονται από τα επιθηλιακά κύτταρα του παγκρεατικού πόρου [7]. Η εξωκρινές πάγκρεας περιέχει τόσο acinar και κύτταρα των πόρων. Τα παγκρεατικά κυψελοειδή κύτταρα που χαρακτηρίζονται από έκφραση αμυλάσης και έλλειψη έκφρασης του είτε κυτοκερατίνης 19 (CK19) ή βλεννίνες, και τα κύτταρα των πόρων που χαρακτηρίζονται από έκφραση του CK19 και βλεννινών αλλά χωρίς έκφραση της αμυλάσης [15], [16]. Πράγματι, προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει όγκους του παγκρέατος από KC και KPC ποντίκια εξέφρασε CK19 και συχνά, βλεννίνη, υποδεικνύοντας πορογενές κληρονομιά τους [3], [4]. Για να επικυρώσετε το αν προέρχεται-κυτταρικές σειρές μας KC και KPC είχε αυτά τα χαρακτηριστικά του πόρου, εξετάσαμε αμυλάση και η έκφραση CK19 σε πραγματικό χρόνο PCR και συνεστιακής μικροσκοπίας. Panc02 κύτταρα περιλαμβάνονται σε αυτές τις αναλύσεις για σύγκριση, και φυσιολογικό παγκρεατικό ιστό χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση σχετικής γονιδιακής έκφρασης. Real-time PCR πειράματα έδειξαν υψηλή έκφραση του δείκτη πορογενές CK19 σε τρεις νέες PDAC κυτταρικές γραμμές μας (

& lt? 0.005) σε σύγκριση με Panc02 (Εικ. 3Α). Προς έκπληξή μας, τα κύτταρα Panc02 δεν έδειξε καμία έκφραση CK19, παρόλο που έχει αριθμό αναφοράς ποντικού πορογενές κυτταρική γραμμή PDAC για σχεδόν τρεις [8] δεκαετίες. Καμία από τις τέσσερις κυτταρικές σειρές έδειξαν έκφραση αμυλάσης, ενώ η κανονική πάγκρεας εκφράζεται αυτό το δείκτη acinar. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με συνεστιακή ανάλυση μικροσκόπιο (Σχ. 3Β).

(Α) σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση του

Η αμυλάση

και

CK19

στα κύτταρα PDAC ποντίκι. Αυτές οι μεταγραφές mRNA συγκρίθηκαν σε σχέση με τα επίπεδα του mRNA σε φυσιολογικούς πάγκρεας. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση πολλαπλάσια αύξηση τριών αντιγράφων ± τυπικό σφάλμα. Στατιστικά στοιχεία υπολογίστηκαν σε σύγκριση με το φυσιολογικό πάγκρεας (*

& lt? 0.005, **

& lt? 0,0001). (Β) Η έκφραση της πρωτεΐνης του αμυλάσης και CK19 αξιολογήθηκαν σε κυτταρικές σειρές ποντικού PDAC με συνεστιακή ανάλυση. Αμυλάση οπτικοποιήθηκε μετά από χρώση με ένα δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με Alexa Fluor® 568 (κόκκινη φθορίζουσα) και CK19 οπτικοποιήθηκε μετά από χρώση με Alexa Fluor® 488 (Green Fluorescent). πυρήνες κυττάρων χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ.

κυτταρικές σειρές KC και KPC έχουν επιθηλιακά-μεσεγχυματικά χαρακτηριστικά

Ο επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση προκαλεί απώλεια της κυτταρικής προσκόλλησης, η οποία αντιστοιχεί σε E-cadherin μειορύθμιση και αυξημένη έκφραση του Ν-cadherin, που οδηγεί στην έναρξη της PDAC μετάσταση [17]. Εξετάσαμε E-cadherin και την έκφραση Ν-cadherin από συνεστιακή μικροσκοπία και κηλίδα western αναλύσεις στις τρεις νεοϊδρυθείσα κυτταρικές σειρές KC και KPC. έκφραση Ε-καδερίνης παρατηρήθηκε σε ΟΗΕ-KC-6141, UN-KPC-960, και του ΟΗΕ-KPC-961 κύτταρα, ενδεικτική της επιθηλιακής τη φύση τους (Εικ. 4Α-Β). Σε αντίθεση, τα κύτταρα Panc02 έδειξε ελάχιστη έκφραση Ε-καδερίνης. Το πρότυπο της έκφρασης Ν-καδερίνης ήταν παρόμοιο, όντας πιο εμφανή στις κυτταρικές γραμμές KC και KPC, σε σύγκριση με την έκφραση σε κύτταρα Panc02 (Σχ. 4C-D).

(Α) Ομοεστιακή εικόνες μικροσκοπία του Ε -cadherin (Alexa Fluor® 568, Red φθορισμού) έκφραση σε κυτταρικές σειρές ποντικού. πυρήνες κυττάρων χρωματίστηκαν με DAPI. (Β) ανάλυση κηλίδας Western Ε-καδερίνης σε κυτταρικές σειρές ποντικού. προϊόντα λύσης πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (C) Ομοεστιακή microsocopy εικόνες Ν-cadherin (Alexa Fluor® 488, πράσινη φθορίζουσα) έκφραση σε κυτταρικές σειρές ποντικού. πυρήνες κυττάρων χρωματίστηκαν με DAPI. (Δ) Ανάλυση Western blot της Ν-καδερίνης σε κυτταρικές σειρές ποντικού. προϊόντα λύσης πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

κυτταρικές σειρές KC και KPC εκφράζουν υψηλά επίπεδα του MUC 1 και MUC4

Οι διαφορετικοί τύποι βλεννινών που εκφράζονται στο πάγκρεας κατά την διάρκεια της εξέλιξης PC [12 ], [18]. Επιπλέον, πρόδρομος PC βλάβες σε γενετικά μοντέλα ποντικού PDAC όπως τα ποντίκια KC και KPC, είναι γνωστό ότι παράγουν βλεννίνες [3], [4]. Πρόσφατα, επίσης, έχουν δείξει ότι το πάγκρεας του KC ποντίκια, η έκφραση της MUC1, MUC4 και MUC5AC σταδιακά αυξήθηκε σε σχέση με την ανάπτυξη PDAC [12]. Εξετάσαμε αν η έκφραση αυτών των βλεννών μπορούν να επιβεβαιωθούν τα KC και KPC-κυτταρικές σειρές που προέρχονται. Για το σκοπό αυτό, σε πραγματικό χρόνο PCR, western blot, και συνεστιακή μικροσκοπία αναλύσεις διεξήχθησαν. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα σχετικά επίπεδα μεταγραφής των διαμεμβρανικών βλεννινών

MUC1

(

& lt? 0.001) και

MUC4

(

& lt? 0,05) ήταν σημαντικά υψηλότερη στην UN-KC-6141, UN-KPC-960 και UN-KPC-961 κύτταρα (Εικ. 5Α) σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες). Σε κύτταρα Panc02, τα επίπεδα σχετική μεταγραφή του

MUC1

και

MUC4

ήταν αυξημένα, αλλά δεν ήταν στατιστικά σημαντικές. Παρ ‘όλα αυτά, τα κύτταρα Panc02 και οι δύο κυτταρικές σειρές που προέρχονται από ποντίκια KPC έδειξαν υψηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης MUC4 από το KC-κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται (Εικ. 5Β). Από την άλλη πλευρά, MUC1 πρωτεΐνη σε Panc02 ήταν χαμηλότερη από ό, τι στα KC και KPC προερχόμενα κύτταρα (Σχ. 5C). Προς έκπληξή μας, MUC5AC δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε κανένα από τις κυτταρικές γραμμές, είτε στο μεταγραφής ή σε επίπεδα πρωτεΐνης (τα δεδομένα δεν φαίνονται), και αυτό μπορεί να είναι συνέπεια του εξελικτικές αλλαγές που συνδέονται με την κυτταρική καλλιέργεια.

(Α ) σε πραγματικό χρόνο ανάλυση PCR του

MUC1

και

MUC4

στο PDAC κυτταρικές σειρές ποντικού. Οι μεταγραφές mRNA κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα mRNA στην κυτταρική γραμμή ινοβλαστών ποντικού ΝΙΗ3Τ3. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση πολλαπλάσια αύξηση τριών αντιγράφων ± τυπικό σφάλμα. Στατιστική έννοιες υπολογίστηκαν σε σύγκριση με ΝΙΗ3Τ3 (*

& lt? 0,05, **

& lt? 0.001, **

* ρ

& lt? 0,0001). (Β) Ανάλυση Western blot της MUC4 σε κυτταρικές σειρές ποντικού. λύματα Πρωτεΐνη για ανάλυση MUC4 αναλύθηκαν με SDS πηκτές αγαρόζης 2%. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης και λύθηκε σε 10% SDS-PAGE. (C) Ομοεστιακή μικροσκοπία εικόνες της MUC1 (Alexa Fluor® 568, Red φθορισμού) έκφραση σε κυτταρικές σειρές ποντικού. πυρήνες κυττάρων χρωματίστηκαν με DAPI.

κυτταρικές σειρές KC και KPC είναι ανθεκτικά σε Γεμσιταβίνη

Παρά τις πρόσφατες αναφορές ότι ασθενείς PC δείχνουν μεγαλύτερη επιβίωση, όταν αντιμετωπίζονται με FOLFIRINOX (ένα συνδυασμό των οξαλιπλατίνη, ιρινοτεκάνη, φθοριοουρακίλη και λευκοβορίνη) αντί γεμσιταβίνη [19], η τελευταία εξακολουθεί να είναι το πιο χρησιμοποιούμενο φάρμακο στον υπολογιστή χημειοθεραπεία [20]. Ως εκ τούτου, με τη χρήση της δοκιμασίας ΜΤΤ, εξετάσαμε Τζεμσιταμπίνη κυτταροτοξικότητα στο UN-KC-6141, UN-KPC-960, ΟΗΕ-KPC-961 και τα κύτταρα Panc02 (Σχ. 6Α). κύτταρα Panc02 ήταν οι πιο Γεμσιταβίνη ανθεκτικά με ημιμέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση (IC-50) 15 μm μετά από 48 ώρες της θεραπείας (Εικ. 6Β). Οι τιμές IC-50 από τις κυτταρικές σειρές KC και KPC κυμαίνονταν από 0,5 μΜ έως 5 μΜ. Αν και τα κύτταρα Panc02 ήταν πιο ανθεκτικά στην Γεμσιταβίνη, αυτά IC-50 τιμές είναι κατά την αντίστοιχη περιοχή από ανθρώπινα κύτταρα PC [21], [22]. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε υψηλότερες συγκεντρώσεις Γεμσιταβίνη (30-100 μΜ) (Εικ. 6Α), τα κύτταρα του ΟΗΕ-KPC-961 έδειξε μεγαλύτερη αντοχή Γεμσιταβίνη από τα κύτταρα Panc02.

(Α) Γεμσιταβίνη κυτταροτοξικότητα σε κυτταρικές σειρές PDAC ποντίκι προσδιορίσθηκε με την κυτταροτοξική δοκιμασία ΜΤΤ. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε φρεάτια τετραπλούν και επωάζονται με διαφορετικές συγκεντρώσεις γεμσιταβίνη (100 ηΜ-100 μΜ) για 48 ώρες. Μετά την αντικατάσταση των μέσων ενημέρωσης με το αντιδραστήριο ΜΤΤ και διάλυση των κρυστάλλων φορμαζάνης με DMSO, κυτταροτοξικότητα υπολογίστηκε με βάση τις τιμές απορρόφησης (λ = 540nm) σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με μόνο μέσα ενημέρωσης. Τα παρουσιαζόμενα δεδομένα είναι μέσος όρος των κυτταροτοξικότητες σε φρεάτια εις τετραπλούν ± τυπικό σφάλμα. Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε σε σύγκριση με Panc02 (*

& lt? 0,01, **

& lt? 0.001, ***

& lt? 0,0001). (Β) Η μισή μέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση (IC-50) της γεμσιταβίνη σε κάθε κυτταρική σειρά καθορίστηκε μετά από παρεμβολή στις γραφικές παραστάσεις της% κυτταροτοξικότητα εναντίον συγκέντρωσης.

Τα μεταμοσχευμένα κυτταρικές σειρές KC και KPC προκαλέσουν παγκρέατος όγκοι σε ποντίκια

Η δημιουργία των κυτταρικών σειρών KC και KPC στον πολιτισμό έδωσε την ευκαιρία να εξετάσει ογκογενετικότητας τους σε κατάλληλο υπόβαθρο του ποντικιού από την οποία προήλθαν. Τα ΗΕ-KC-6141 κύτταρα ελέγχθηκαν στα C57BL /6 ποντίκια, ενώ ΟΗΕ-KPC-960 και UN-KPC-961 κύτταρα εξετάστηκαν σε ποντικούς και των μικτών φόντο B6.129. Ένα μήνα μετά ορθοτοπική εμφύτευση κυττάρων UN-KC-6141 σε C57BL /6 ποντίκια, οι όγκοι που σχηματίζονται στο πάγκρεας (Σχ. 7Α), και μεταστατικές αλλοιώσεις στο ήπαρ, σπλήνα, παρατηρήθηκαν, μικρά έντερα, μεσεντερικοί λεμφαδένες και περιτοναϊκό τοίχωμα. Όγκου επίπτωση για την UN-KC-6141 κυττάρων ήταν 100%. Οι δύο KPC-προερχόμενα κύτταρα (UN-KPC-960 και UN-KPC-961) που σχηματίζεται επίσης όγκους μετά από ορθοτοπική εμφύτευση (Εικ. 7Α), αλλά εκείνοι εμφανίστηκαν σε βραδύτερους ρυθμούς και οι όγκοι πήρε πάνω από δύο μήνες για να αναπτυχθούν. Τα συγκριτικά πιο αργή κινητική ανάπτυξη του όγκου των κυττάρων KPC μπορεί να έχει προκληθεί από γενετικές διαφορές μεταξύ των κυττάρων KC και KPC, καθώς και τα διαφορετικά υπόβαθρα των αντίστοιχων ποντίκια που τους φιλοξενούν. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κύτταρα του ΟΗΕ-KPC-961 φάνηκε να είναι πιο ογκογόνο (συχνότητα εμφάνισης όγκων 86%) από ό, τι τα κύτταρα του ΟΗΕ-KPC-960 (συχνότητα εμφάνισης όγκου 43%). (Β) αιματοξυλίνη & amp?

Χρόνιες ασθένειες