Αφηρημένο

Από τις αλλαγές στις βασικές μεμβράνες είναι οι κρίσιμοι δείκτες για την διαφοροποίηση κανονική, προκαρκινικές και καρκινικές παχέος ιστούς, άμεση απεικόνιση από αυτά τα προειδοποιητικά σημάδια είναι απαραίτητη για την έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου. Εδώ, σας παρουσιάζουμε ότι η δεύτερη αρμονική γενιάς (ΓΔΑ) μικροσκοπία να διερευνήσει τις αλλαγές των βασικών μεμβρανών σε διάφορες παχέος στάδια του καρκίνου. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν επίσης την ικανότητα να χρησιμοποιεί τις ποσοτικές αναλύσεις των εικόνων για την ποσοτικοποίηση αυτών των αλλαγών σε διαφορετικά στάδια του καρκίνου. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι SHG μικροσκοπία έχει τη δυνατότητα σε ετικέτα ελεύθερα απεικόνιση των αλλαγών των βασικών μεμβρανών για την αποτελεσματική διάκριση μεταξύ της κανονικής, προκαρκινικές και καρκινικές του παχέος ιστούς. Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη απόδειξη της δυναμικής των μεταβολών της βασικής μεμβράνης σε διάφορα παχέος στάδια του καρκίνου, χρησιμοποιώντας εξ ολοκλήρου εγγενή πηγή της αντίθεσης

Παράθεση:. Zhuo S, Yan J, Chen G, Shi H, Zhu Χ , Lu J, et al. (2012) Label-Δωρεάν απεικόνισης του υπογείου μεμβράνες διαφοροποιεί Κανονική, Προκαρκινικές, και καρκινικούς ιστούς παχέος εντέρου από Δεύτερης Αρμονικής Generation Μικροσκοπίας. PLoS ONE 7 (6): e38655. doi: 10.1371 /journal.pone.0038655

Επιμέλεια: Mitsunobu R. Κάνο, Πανεπιστήμιο του Τόκιο, Ιαπωνία

Ελήφθη: 13 Ιανουαρίου 2012? Αποδεκτές: 8 Μαΐου 2012? Δημοσιεύθηκε: 8 Ιουν 2012

Copyright: © 2012 Zhuo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από το Πρόγραμμα για Changjiang μελετητές και τα καινοτόμα ερευνητική ομάδα του Πανεπιστημίου (Grant Νο IRT1115), το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Grant Νο. 60908043, 30970783, 81101209), και το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Fujian (Grant Nos . 2011J01341, 2010J01136, 2010J01321). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος παχέος εντέρου είναι μία από τις κύριες αιτίες νοσηρότητας και θνησιμότητας σε ανθρώπινο [1]. Σε γενικές γραμμές, είναι εύκολα αντιμετωπίζεται αν διαγνωστεί σε μία από τις προ-επεμβατική στάδια [2], [3]. Ωστόσο, η ανίχνευση των πρώιμων βλαβών εξακολουθεί να είναι μια πρόκληση. Με την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος, κακοήθη κύτταρα μεταβάλλουν την βασικές μεμβράνες (διεπαφές κρύπτης και lamina propria), όπως είναι οι παραλλαγές στο μέγεθος βασική μεμβράνη και την πυκνότητα, η απώλεια της βασικής μεμβράνης [4], [5]. Αλλαγές στη βασική μεμβράνη είναι από τους πιο σημαντικούς δείκτες για παχέος την ανάπτυξη του καρκίνου [5], [6]. Ωστόσο, αυτές οι προειδοποιητικές πινακίδες έχουν μέχρι σήμερα μόνο ήταν ανιχνεύσιμη με ιστολογική εξέταση δειγμάτων βιοψίας του [4], [7]. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη νέων και μη επεμβατική

in situ

τροπικότητα απεικόνισης για την ανίχνευση αυτά τα προειδοποιητικά σημάδια έχει μεγάλη ιατρική σημασία.

Παχέος βλεννογόνο περιέχει την κρύπτη, η βασική μεμβράνη, και το propria lamina, όπως φαίνεται στο Σχ. 1. Θεωρείται επίσης στο σχήμα 1 ότι το

en πρόσωπο

τμήμα του βλεννογόνου του παχέως εντέρου μπορεί να παρατηρήσει ταυτόχρονα την κρύπτη, η βασική μεμβράνη, και το χόριο. Δεδομένου ότι η κρύπτη αποτελείται κυρίως από κυλινδρικά επιθηλιακά κύτταρα και καλυκοειδή κύτταρα που δεν είναι αποτελεσματικό στην παραγωγή (SHG) σήματα δεύτερης αρμονικής και χόριο αποτελείται κυρίως από κολλαγόνο που είναι ικανό να εκπέμπει ισχυρά σήματα SHG [8] – [10], μικροσκοπία SHG μπορεί να είναι χρήσιμη για την ανίχνευση των αλλαγών της βασικής μεμβράνης που δεν είναι προσβάσιμες από άλλες τεχνικές απεικόνισης. μικροσκοπία SHG είναι μία μη γραμμική οπτική τεχνική και έχει τα πλεονεκτήματα του να είναι ελεύθερο σήμανσης, εγγενής ανάλυση τριών διαστάσεων, εγγύς υπέρυθρο διέγερσης για ανώτερη οπτική διείσδυση, κατώτερο φωτογήρανσης, και ικανά να παρέχουν ποσοτικές πληροφορίες [11] – [15]. Μέχρι τώρα, δεν υπάρχουν αναφορές για να δοκιμάσετε τις δυνατότητες αυτής της τεχνικής για την ετικέτα-ελεύθερα οπτικοποίηση τις μεμβράνες ως δείκτες για τη διαφοροποίηση κανονική, προκαρκινικές και καρκινικές παχέος ιστούς, και αυτό είναι που μας παρακίνησε να εκτελέσετε αυτή την εργασία χρησιμοποιώντας αυτήν την τεχνική.

Αποτελέσματα

Παθολογία Αποτελέσματα

Από τις 72 παχέος δείγματα βιοψίας απεικονίζεται, 20 διαγνώστηκαν ως κανονικό, 28 με αδένωμα, και 24 με αδενοκαρκίνωμα. Για στατιστική ανάλυση, δείγματα ιστού χωρίστηκαν σε κανονική περίπτωση (n = 20), προκαρκινικών (αδένωμα, n = 28), και ο καρκίνος (αδενοκαρκίνωμα, n = 24).

SHG Εικόνες

για να εξετάσουν τις αλλαγές των βασικών μεμβρανών σε διάφορες παχέος στάδια του καρκίνου, ο εκπρόσωπος en πρόσωπο SHG εικόνες από την κανονική, προκαρκινικές και καρκινικές παχέος ιστούς φαίνονται αντίστοιχα στα Σχ. 2. Όπως αναμενόταν, η τεχνική απεικόνισης SHG μπορεί επίσης να απεικονίσει το περίγραμμα των βασικών μεμβρανών (κόκκινοι κύκλοι). Είναι φαίνεται στο Σχ. Οι 2 ότι οι μεγάλες μορφολογικές διαφορές στο περίγραμμα των μεμβρανών που παρατηρήθηκαν σε διάφορα στάδια του κόλου καρκίνου. Στην κανονική περίπτωση, παρατηρείται μια διάταξη κηρήθρα του στρογγυλού σχήματος τακτική μεμβράνες με ομοιόμορφο μέγεθος. Σε προκαρκίνο, οι σωληνοειδείς σε σχήμα μεμβράνες με μεγαλύτερο μέγεθος και χαμηλότερη πυκνότητα πληθυσμού που λαμβάνεται σε σύγκριση με κανονική περίπτωση. Στον καρκίνο, οι μεμβράνες που βρέθηκαν σε φυσιολογικά περίπτωση που λείπουν.

Η

Ποσοτική Ανάλυση Μεμβρανών Υπόγειο

Ο Πίνακας 1 δείχνει την μέση και SD του μήκους κύκλου της βασικής μεμβράνης και του πληθυσμού πυκνότητα μεμβράνες για κανονικά, προκαρκινικές και καρκινικές του παχέος ιστούς. Αναλυτικά, το μήκος κύκλος της βασικής μεμβράνης σε φυσιολογικά είναι 342,7 ± 27,2 μm (n = 60 περιοχές 20 βιοψίες), και προκαρκινικών είναι 695,8 ± 79,1 μm (n = 84 περιοχές από 28 βιοψίες), και ο καρκίνος είναι 1767,8 ± 166,3 μm (n = 72 περιοχές 24 βιοψίες). Επιπλέον, η πυκνότητα του πληθυσμού των μεμβρανών σε φυσιολογικά είναι 103,2 ± 10,6 /mm

2 (n = 60 περιοχές της 20 βιοψίες), σε προκαρκινικά στάδια είναι 27,1 ± 6,3 /mm

2 (n = 84 περιοχές από 28 βιοψίες), και ο καρκίνος είναι 0,3 ± 1,2 /mm

2 (η = 72 περιοχές 24 βιοψίες). Αυτά τα αποτελέσματα παρουσιάζουν την διάρκεια του κύκλου της βασικής μεμβράνης και την πυκνότητα του πληθυσμού των μεταβλητών βασικών μεμβρανών η οποία έδειξε σημαντικές διαφορές (

P

& lt? 0,05) μεταξύ της κανονικής, προκαρκινικές και καρκινικές κατηγορίες ιστών βασίζονται σε unparired δοκιμές Wilcoxon rank sum .

η

Συζήτηση

Αυτή η εργασία παρουσιάζει ότι SHG μικροσκοπία να διερευνήσει αποτελεσματικά τις αλλαγές των βασικών μεμβρανών σε διάφορες παχέος στάδια του καρκίνου. Ειδικότερα, SHG μικροσκοπία επιτρέπει την ταυτοποίηση των δύο μορφολογικών χαρακτηριστικών (το μήκος του κύκλου βασικής μεμβράνης, η πυκνότητα του πληθυσμού των βασικών μεμβρανών), τα οποία δείχνουν σημαντικές διαφορές στα διάφορα στάδια του κόλου καρκίνου. Οι παρατηρήσεις αυτές είναι αποτελούνται με ανοσοϊστοχημική αποτελέσματα (που φαίνεται στο Σχ. 3), και επίσης επιβεβαιώνουν το γεγονός [4], [16], ότι πριν από τον καρκίνο γίνει επεμβατική, στα στάδια γνωστή ως προκαρκινικών, κακοήθη κύτταρα μεταβάλλουν το περίγραμμα του βασικής μεμβράνης, αλλά δεν το κάνουν καταστρέφεται η βασική μεμβράνη? όπως ο καρκίνος γίνει επεμβατική, κακοήθη κύτταρα (δεν υπάρχουν σήματα ΓΔΑ) να αντικαταστήσει ίνες κολλαγόνου, με αποτέλεσμα την απώλεια της βασικής μεμβράνης.

Η

Όπως σημειώνεται, SHG μικροσκόπιο είναι ικανό ετικέτα ελεύθερα απεικόνιση των μεταβολών των βασικών μεμβρανών σε διαφορετικά στάδια του παχέος καρκίνο και, ως τέτοια, μπορεί να λειτουργήσει ως

in situ

ιστολογική εργαλείο που είναι ελεύθερο από την υποχρέωση επισήμανσης των συμβατικών μεθόδων. Επιπλέον, με βάση την ανάλυση της εικόνας, ήμασταν σε θέση να επιτύχει κάποια ποσοτικά στοιχεία σε διαφορετικά στάδια του καρκίνου. Έτσι, SHG μικροσκοπία μας δίνει τόσο μορφολογικά, όσο και ποσοτικά, το εργαλείο με το οποίο για την ανίχνευση των αλλαγών των βασικών μεμβρανών σε διαφορετικά στάδια του κόλου καρκίνου. Το σημαντικό αυτής της ικανότητας προκύπτει από το γεγονός ότι οι αλλαγές της βασικής μεμβράνης παίζουν σημαντικό ρόλο στην κολονική ανάπτυξη του καρκίνου [5], [6], και αυτές οι αλλαγές έχουν μέχρι στιγμής μόνο ήταν ανιχνεύσιμη με ιστολογική εξέταση βιοψίας δείγματα [4], [7]. SHG μικροσκόπιο καθιστά δυνατή την τήρηση αυτών των διακυμάνσεων, και μετρώντας τους επιτρέπει το μέγεθος της βασικής μεμβράνης και την πυκνότητα του πληθυσμού που θα καθοριστεί. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν την υπόσχεση της απεικόνισης SHG για κλινικές, και ως βιοϊατρική ερευνητικό εργαλείο για την μελέτη της δυναμικής των μεταβολών βασικής μεμβράνης σε διάφορα παχέος στάδια του καρκίνου. Επιπλέον, πρέπει να τονιστεί ότι αν και οι φλεγμονώδεις βλάβες δεν θεωρήθηκαν σε αυτό το έργο, SHG απεικόνιση θα πρέπει να είναι σε θέση να διακρίνουν μεταξύ καρκινικών και φλεγμονώδεις βλάβες λόγω της απώλειας των βασικών μεμβρανών σε καρκινικούς ιστούς. Στο πλαίσιο αυτό, βλέπει κανείς ότι SHG μικροσκόπιο έχει τη δυνατότητα στην ετικέτα ελεύθερα οπτικοποίηση τις αλλαγές των βασικών μεμβρανών ως δείκτες για τη διαφοροποίηση κανονική, προκαρκινικές και καρκινικές παχέος ιστούς.

Εν κατακλείδι, το έργο αυτό αποδεικνύει το δυναμικό της SHG μικροσκόπιο για την επισήμανση-ελεύθερα εικόνα τις αλλαγές των βασικών μεμβρανών, συμπεριλαμβανομένου του μεγέθους της βασικής μεμβράνης και την πυκνότητα του πληθυσμού, τους σημαντικούς δείκτες του παχέος ανάπτυξης καρκίνου. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη φορά για να δείξει πώς απεικόνιση SHG μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να απεικονίσει ποσοτικά τη δυναμική των αλλαγών βασικής μεμβράνης σε διαφορετικά στάδια του κόλου καρκίνου. Στο μέλλον το έργο, μια μεγάλης κλίμακας μελέτη θα διεξαχθεί για να προσδιοριστεί η ευαισθησία, η ειδικότητα, αρνητική προγνωστική αξία, θετική προγνωστική αξία σε σχέση με τα παραδοσιακά ιστολογική ανάλυση. Το πλεονέκτημα αυτής της τεχνικής έναντι των συμβατικών διαγνωστικών διαδικασιών είναι ότι οι ιστοί δεν απαιτείται να υποβληθούν σε φέτες, ενσωμάτωση παραφίνης ή ψύξης-απόψυξης διαδικασία, διατηρώντας έτσι τις δυνατότητες του

in vivo

απεικόνισης. Με την ικανότητα της ποσοτικοποίηση των αλλαγών της βασικής μεμβράνης, όπως φαίνεται στην παρούσα μελέτη, είναι προβλέψιμο ότι μια ενδοσκόπηση SHG με βάση [17] – [19] θα μπορούσε να διευκολύνει και να επωφεληθούν

in vivo

μελέτες και διάγνωση κατά τα έτη για να έρθει.

Υλικά και Μέθοδοι

ιστός Δείγμα

Ένα σύνολο από 72 φρέσκα παχέος δείγματα βιοψίας ελήφθησαν 30 – 2 ασθενείς υποβλήθηκαν σε ενδοσκοπική βιοψία. Πριν από τη μελέτη της συμμετοχής, όλοι οι ασθενείς υπέγραψαν μια ενημερωμένη συγκατάθεση και η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας της Fujian Επαρχιακό Όγκων Νοσοκομείο. Το δείγμα βιοψίας τοποθετήθηκε στο Glass Bottom πιάτων (MatTek, coverglass: 0,085 – 0,13 mm) για την απεικόνιση SHG. Σε αυτό το έργο, η προετοιμασία του δείγματος και την απεικόνιση SHG ολοκληρώθηκαν μέσα σε 1 ώρα μετά την ενδοσκοπική βιοψία.

Απεικόνιση των οργάνων

μικροσκόπιο SHG επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας ένα μη γραμμικό οπτικό σύστημα που έχει περιγραφεί στο παρελθόν [20] . Εν συντομία, SHG εικόνες αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό σάρωσης με λέιζερ μικροσκοπική σύστημα απεικόνισης (Zeiss LSM 510 META, Jena, Germany) συζευγμένο με ένα femtosecond Ti: sapphire laser (Coherent Mira 900-F) που λειτουργεί στα 800 nm. Η κατεύθυνση πόλωσης του φωτός λέιζερ είναι η οριζόντια πόλωση. Ένας αντικειμενικός εμβάπτισης ελαίου (× 63 και ΝΑ = 1,4) χρησιμοποιήθηκε για την εστίαση της δέσμης διέγερσης σε δείγματα ιστού (μέση ισχύς είναι μικρότερη από 15 mW) και χρησιμοποιήθηκε επίσης για τη συλλογή των υστέρων διασκορπισμένων ενδογενών σημάτων SHG. Οι εικόνες ελήφθησαν κατά 2,56 μικροδευτερόλεπτα ανά pixel. Μια λεπτή εστίαση στάδιο (HRZ 200 στάδιο, Carl Zeiss) χρησιμοποιείται για να μεταφράσει τα δείγματα μετά xy σάρωση των δειγμάτων για την απόκτηση μιας μεγάλης περιοχής της εικόνας, και να αλλάξετε τη θέση εστίασης για την εγγραφή διάφορες οπτικές ενότητες.

Ιστολογία Ανάλυση

Μετά την απεικόνιση SHG, τα δείγματα ιστού σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη και προετοιμάστηκαν για παθολογική εξέταση χρησιμοποιώντας τυποποιημένα πρωτόκολλα. H & amp? E-τομές και τομές χρωματίστηκαν με πρωτογενή αντισώματα στο κολλαγόνο IV ελήφθησαν από κάθε δείγμα, και επανεξετάζονται από πιστοποιημένο παθολόγο

Η ποσοτικοποίηση των Μεμβρανών Υπόγειο

Για την περαιτέρω ποσοτικοποίηση των αλλαγών της. μεμβράνες σε διαφορετικά στάδια του κόλου καρκίνου, τρία 415 μm με 490 μπι ορθογώνιες περιοχές σε κάθε βιοψία επελέγησαν για την ποσοτική ανάλυση. Στην εργασία αυτή, διεξήχθησαν δύο αναλύσεις. Πρώτον, μετρήθηκε το μήκος του κύκλου της βασικής μεμβράνης. Επιπλέον, για να απεικονίσει καλύτερα αυτήν την τιμή, εάν υπάρχει μια απώλεια βασικών μεμβρανών, το μήκος κύκλος της βασικής μεμβράνης ορίστηκε με το μήκος κύκλου της επιλεγμένης ορθογωνικής διατομής. Δεύτερον, υπολογίσαμε το συνολικό αριθμό των βασικών μεμβρανών ανά μονάδα επιφάνειας, δηλαδή, η πυκνότητα του πληθυσμού των βασικών μεμβρανών. Σε αυτό το έργο, κάθε ποσοτική ανάλυση έγινε σε όλες τις εξετάστηκαν βιοψίες.

Στατιστικές Αναλύσεις

Ποσοτικά στοιχεία συνοψίζονται με τη μέση τιμή και την τυπική απόκλιση (SD), που παρουσιάζεται ως «μέση τιμή ± SD» . Συνοπτικά στατιστικά στοιχεία για το μήκος κύκλου της βασικής μεμβράνης και της πυκνότητας του πληθυσμού των βασικών μεμβρανών (που σχετίζονται με παθολογική προσδιορισμός) προκύπτουν από πολλαπλά τμήματα από κάθε ένα από τα 72 κολονικής βιοψίας δείγματα που λαμβάνονται από τριάντα δύο ασθενείς. για τους σκοπούς της στατιστικής ανάλυσης, η μετρήσεις από μεμονωμένα τμήματα υποτίθεται ότι αποτελούν ανεξάρτητες παρατηρήσεις. με τα δεδομένα σε αυτή τη μελέτη (που χαρακτηρίζεται από φαινομενική ομοιογένεια των τιμών εντός των διαγνωστικών κατηγοριών), πιο πολύπλοκες στατιστικές τεχνικές κρίθηκαν περιττές, δεδομένου ότι δεν θα αλλάξουν τα μέσα του δείγματος, ούτε θα οδηγήσουν σε μεγαλύτερες τυπικές αποκλίσεις του δείγματος. σε αυτό το έργο, Wilcoxon τεστ rank-sum διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί αν υπάρχουν σημαντικές διαφορές στο μήκος κύκλο της βασικής μεμβράνης και την πυκνότητα του πληθυσμού των μεμβρανών μεταξύ της κανονικής, προκαρκινικών και καρκινικών ιστών (αταίριαστα σύγκριση ). Απαραμετρική δοκιμές Wilcoxon επιλέχθηκαν για τη σύγκριση ασύζευκτα λόγω του μικρού μεγέθους του δείγματος. Ακριβής

P

-τιμές υπολογίστηκαν, και οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν οι

P

-τιμές ήταν μικρότερη από 0,05.

Ευχαριστίες

οι συγγραφείς επιθυμούν να ευχαριστήσω τον συντάκτη και δύο ανώνυμους κριτικούς για εποικοδομητικές παρατηρήσεις τους, η οποία ήταν πολύ χρήσιμη για την ενίσχυση της παρουσίασης αυτού του εγγράφου.