Αφηρημένο

Ιστορικό

Σε καρκίνο του παχέος εντέρου μια διακριτή υποομάδα των όγκων επιδεικνύουν τον φαινότυπο νησί methylator CpG (CIMP). Ωστόσο, μια συναίνεση για το πώς να σκοράρει CIMP δεν έχει επιτευχθεί, και παραλλαγή στον ορισμό μπορεί να επηρεάσουν την αναφερόμενη επικράτηση CIMP σε όγκους. Έτσι, προσπαθήσαμε να συγκρίνουμε τη στιγμή πρότεινε ορισμούς και cut-offs για τους δείκτες της μεθυλίωσης και πώς επηρεάζει την κατάταξή CIMP στον καρκίνο του παχέος εντέρου.

Μέθοδοι

multiplex απολίνωση-εξαρτώμενη ενίσχυση ανιχνευτή μεθυλίωσης-ειδική (MS -MLPA), με επακόλουθη ανάλυση θραύσμα, χρησιμοποιήθηκε για να διερευνήσει τη μεθυλίωση των δειγμάτων όγκου. Συνολικά, 31 CpG περιοχές, που βρίσκονται σε 8 διαφορετικά γονίδια (RUNX3, MLH1, NEUROG1, CDKN2A, IGF2, CRABP1, SOCS1 και CACNA1G) διερευνήθηκαν σε 64 διακριτές καρκίνους του παχέος εντέρου και του καρκίνου κυτταρικές σειρές 2 του παχέος εντέρου. Ο πίνακας γονίδιο Ogino περιλαμβάνει όλα τα γονίδια 8, εκτός από το πάνελ Weisenberger των οποίων ερευνήθηκαν μόνο 5 από τα 8 γονίδια περιλαμβάνονται. Συνολικά, 18 εναλλακτικών συνδυασμών βαθμολόγησης των CIMP θετικότητα για probe-, γονίδιο- και πάνελ επίπεδο αναλύθηκαν και συγκρίθηκαν.

Αποτελέσματα

Για 47 δείγματα (71%), η CIMP κατάσταση ήταν σταθερή και ανεξάρτητη από τα κριτήρια που χρησιμοποιούνται για τη βαθμολόγηση? 34 δείγματα ήταν συνεχώς σκόραρε ως CIMP αρνητική, και 13 (20%) σκόραρε με συνέπεια ως CIMP θετική. Μόνο τέσσερις από 31 ανιχνευτές (13%) διερευνήθηκαν έδειξαν καμία διαφορά στον αριθμό των θετικών δειγμάτων χρησιμοποιώντας τα διάφορα cut-off. Εντός των πλαισίων παρατηρήθηκε μια τάση ότι η αύξηση της αυστηρότητας γονίδιο επίπεδο οδήγησε σε μεγαλύτερη διαφορά σε CIMP θετικά δείγματα από την αύξηση της αυστηρότητας ανιχνευτή επιπέδου. Μια σημαντική διαφορά μεταξύ των θετικών δειγμάτων με τη χρήση «η πιο αυστηρές σε σύγκριση με τις« λιγότερο αυστηρές »κριτήρια (20% έναντι 46%, αντίστοιχα? P & lt? 0.005). Καταδείχθηκε

Συμπεράσματα

μια στατιστικά σημαντική μεταβολή στη συχνότητα των CIMP ανάλογα με τα cut-offs και τα γονίδια που περιλαμβάνονται σε ένα πάνελ βρέθηκε, με διπλάσιες δείγματα θετικά από τουλάχιστον σε σύγκριση με πιο αυστηρές ορισμό που χρησιμοποιείται

Παράθεση:. Berg Μ, Hagland ΥΕ, Søreide K (2014) Σύγκριση των CpG νησί Methylator φαινότυπο (CIMP) Συχνότητα στον Καρκίνο του παχέος εντέρου, χρησιμοποιώντας διαφορετικές Probe- και Gene-Specific Scoring Εναλλακτικές λύσεις για Συνιστάται πάνελ Multi-Gene. PLoS ONE 9 (1): e86657. doi: 10.1371 /journal.pone.0086657

Επιμέλεια: Hassan χείλος, Πανεπιστήμιο Howard, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Σεπτεμβρίου, 2013? Αποδεκτές: 16 Δεκ του 2013? Δημοσιεύθηκε: 21 Ιανουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Berg et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη ήταν εν μέρει χρηματοδοτείται από επιχορηγήσεις από το Ίδρυμα Καρκίνου Folke Hermansen (επιχορήγηση # 424508 έως KS για MB ως μεταδιδακτορικός υπότροφος) (https://www.folke-fondet.org), Mjaaland Ταμείου Καρκίνου (επιχορήγηση # 424506 έως KS ), το Νοσοκομείο Συμβούλιο Έρευνας του Πανεπιστημίου Stavanger και επιχορηγήσεων από το Ινστιτούτο Χειρουργικής Επιστημών, Πανεπιστήμιο του Μπέργκεν. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι μια γενετική ασθένεια που προκαλείται από τη συσσώρευση των μοριακών αλλαγών και τροποποιήσεων στο DNA που οδηγεί την ογκογένεση [1]. Η σωστή μοριακός χαρακτηρισμός του καρκίνου Γονο- και φαινοτύπων είναι σημαντικό να αποκαλύψει δείκτες για την έγκαιρη ανίχνευση, πρόγνωση ή πρόβλεψη, καθώς και να αυξήσει την κατανόηση των διεργασιών ασθένεια που μπορεί να δώσει πληροφορίες για θεραπευτική παρέμβαση. Καρκίνος του παχέος εντέρου είναι ένα καλά ερευνηθεί καρκίνος μοντέλο, για τις οποίες οι όγκοι έχουν πλέον διαχωριστεί σε τρεις φαινοτυπικά υποομάδες, ανάλογα με τον κυρίαρχο τύπο των γενετικών ανωμαλιών: χρωμοσωμική αστάθεια (CIN) αναφέρεται σε αλλαγές στο επίπεδο χρωμόσωμα (π.χ. αριθμός αντιγράφων αλλαγών)? μικροδορυφορική αστάθεια (MSI) αναφέρεται σε μεταβολές στην ζευγών βάσεων-επαναλήψεις (π.χ. αλλαγή βάσης στο δινουκλεοτίδιο επαναλάβει CA

6), και? CpG νησί methylator φαινότυπο (CIMP) υποδηλώνει μια παρεκκλίνουσα φάσμα μεθυλίωσης (π.χ. υπο- ή υπερ μεθυλιώνονται κυτοσίνες στην περιοχή του υποκινητή), σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα [2], [3].

δοκιμών CpG-νησί μεθυλίωση έχει έχουν προταθεί ως εργαλείο για την ανίχνευση του καρκίνου, την πρόγνωση και την ανίχνευση του υπολειμματικού νόσου σε τόσο αίμα ή άλλα σωματικά υγρά [4], και υποδεικνύει ότι κατάσταση μεθυλίωσης είναι κλινική σημασία [5] – [9]. Επιπλέον, η μεθυλίωση ειδικές δοκιμασίες είναι εμπορικά διαθέσιμα σήμερα για την ανίχνευση καρκίνου του παχέος εντέρου, είτε ως δοκιμή για τη μεθυλίωση των βιμεντίνης σε δείγματα κοπράνων ή δοκιμή για μεθυλίωση του

SEPT9

στο αίμα [6], [10].

Τα τελευταία χρόνια, η προσοχή έχει επικεντρωθεί στην βιολογία και πιθανή κλινική σημασία της CpG νησιού methylator φαινότυπο (CIMP) σε CRC [11], [12]. Ενώ είναι γενικά αποδεκτό ότι υπάρχουν αιτιολογικά και κλινικά διακριτές υποομάδες [13], [14], ο ακριβής ορισμός της CIMP μένει να αποδειχθεί, τόσο μεθοδολογικά όσο και σε μοριακό επίπεδο [15]. Η αυξανόμενη χρήση των τεχνολογιών υψηλής απόδοσης και για μελέτες μεθυλίωση έχουν δείξει μεγάλη επίδραση και πρότεινε διάφορα πάνελ,

π.χ.

να βοηθήσει στη διάκριση του ορθοκολικού όγκου από επιθηλιακά κύτταρα, διαφοροποιούνται μεταξύ των σταδίων της νόσου, προγνωστικές ομάδες και υποομάδες που συνδέονται με άλλα μοριακά χαρακτηριστικά [16] – [18]. Η έλλειψη συναίνεσης για τον προσδιορισμό του φαινοτύπου CIMP οφείλεται εν μέρει στο γεγονός ότι η αιτία της αλλαγμένης σχέδιο μεθυλίωσης παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστος [13], [19].

Ως συνέπεια, πολλαπλά πάνελ γονιδίων, εργαστηριακές τεχνικές, και οι οριακές τιμές δείκτη είναι σήμερα σε χρήση, το σύνολο των οποίων μπορεί να οδηγήσει σε διαφορές στην αναφερόμενη επικράτηση της CIMP [20]. Δεδομένου ότι δεν υπάρχει παγκόσμιο πρότυπο ή συναίνεση για την ποσοτικοποίηση του φαινοτύπου, για την ίδρυση πραγματικός επιπολασμός της είναι μια πρόκληση και δυσχεραίνει τη σύγκριση μεταξύ των μελετών. Έτσι, οι στόχοι αυτής της μελέτης ήταν να δοκιμαστεί συστηματικά διάφορα κριτήρια για τον καθορισμό CIMP στον ορθοκολικό καρκίνο δείγματα, και να διερευνήσει τη διαφορά στη συχνότητα CIMP όταν μεταβάλλοντας τα επίπεδα βαθμολογίας.

Μέθοδοι

Ανθρώπινο Υλικό και Μελέτης Ηθική

καρκινικού ιστού λήφθηκε από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση στο Τμήμα γαστρεντερικού Χειρουργικής, το Stavanger Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο, Νορβηγία. Οι ασθενείς είχαν προσληφθεί σε μια προοπτική μελέτη του λεμφαδένα φρουρού, και όλα συναινέσει για τη μελέτη της συμμετοχής πριν από την ένταξη και την ανάκτηση ιστών. Η Δυτική Νορβηγία Αρχή Περιφερειακής Υγείας ενέκρινε τη χρήση της ανθρώπινης συμμετεχόντων αφού έγγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση, έγκριση # 197,04. Όλα τα δεδομένα αντιμετωπίζονται σύμφωνα με τη δήλωση του Ελσίνκι.

Ο ιστός λήφθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21], και τα νωπά-κατεψυγμένα βιοψίες αποθηκεύονται στους -80 βαθμούς Κελσίου. Ένα σύνολο του δείγματος των 64 σταδίου ΙΙ και ΙΙΙ των ασθενών, και 2 του παχέος εντέρου καρκινικές κυτταρικές σειρές (Caco2 και ΗΤ29), τέθηκαν αυθαίρετα επιλεγεί για την αξιολόγηση στην παρούσα μελέτη.

Απομόνωση DNA

Φρέσκο ​​κατεψυγμένο καρκίνο περιλήφθηκαν δείγματα ιστού, από ένα ίσο αριθμό ασθενών. Επίσης, ένα δείγμα αναφοράς του φυσιολογικού επιθηλίου του παχέως ελήφθη εξασφαλίζοντας μία σημαντική απόσταση έξω από το περιθώριο εκτομή του όγκου του παχέος εντέρου. Τα δείγματα DNA εξήχθησαν χρησιμοποιώντας DNeasy Mini κιτ ή AllPrep DNA & amp?. RNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Γερμανία)

μεθυλίωσης-ειδικά Multiplex πρόσδεση εξαρτώμενη Probe Amplification (MS-MLPA) για CIMP Κατάσταση

από όλα τα δείγματα 64 ΟΝΑ, 100 ng DNA μετουσιώθηκαν σε συνολικό όγκο 5 μl ρυθμιστικού διαλύματος Tris-EDTA, και περαιτέρω εκτελείται όπως συνιστάται από τον προμηθευτή (MRC-Ολλανδία, Άμστερνταμ, Κάτω Χώρες).

multiplex απολίνωση-εξαρτώμενη ενίσχυση ανιχνευτή μεθυλίωσης-ειδική (MS-MLPA) είναι μια μέθοδος για την ταυτόχρονη ανίχνευση μεθυλίωσης σε διάφορες θέσεις σε μία αντίδραση [22], [23]. Εν ολίγοις, ένα μίγμα ανιχνευτή-mix (ME042-B1 CIMP, για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τα ειδικά δοκιμαστικά δείγματα βλέπε πίνακα S1) και ρυθμιστικό προστέθηκαν στο μετουσιωμένο DNA, και ανιχνευτές αφέθηκαν να υβριδοποιηθούν με το DNA στους 60 ° C για 16 ώρες . Κάθε δείγμα διαιρέθηκε σε δύο σωλήνες, στα οποία συνδέθηκε το ήμισυ, και ο άλλος συνδέθηκε και πέψη χρησιμοποιώντας τη μεθυλίωση ευαίσθητο ένζυμο περιορισμού

HhaI

. Αμφότερα τα δείγματα στη συνέχεια υποβάλλεται σε μία αντίδραση PCR χρησιμοποιώντας ένα θερμικό ανακυκλωτή (GeneAmp 2700, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), και η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε θραύσμα ενός τριχοειδούς sequencer (ΑΒΙ 3130

XL

, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). DNA από φυσιολογικό βλεννογόνο του κόλου χρησιμοποιήθηκε σαν κανονικός αναφοράς. Η έξοδος από την ανάλυση, μετά από δια- και ενδο-δείγμα εξομάλυνση, είναι ένα ποσοστό της μεθυλίωσης στο δείγμα.

Ανάλυση Δεδομένων του MLPA Δεδομένων

αναλύθηκαν Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα από την ανάλυση τεμάχιο χρησιμοποιώντας το Coffalyser.NET ™ Λογισμικό, beta έκδοση, (MRC-Ολλανδία, Άμστερνταμ, Κάτω Χώρες). Εν ολίγοις, η μεθυλίωση της κάθε θέσης σε κάθε δείγμα σε σχέση με την αναφορά υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Coffalyser.net ™, με τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις.

Όλα τα μέτρα ποιοτικού /παράμετροι ήταν εντός ικανοποιητικό εύρος. Όλα τα δείγματα ομαλοποιήθηκαν ενάντια πολλαπλές εκτελέσεις του δείγματος αναφοράς (μεταξύ του δείγματος κανονικοποίησης), και επιπλέον, όλοι οι ανιχνευτές προσαρμόστηκαν σε ανιχνευτές αναφοράς μέσα σε κάθε δείγμα (ενδο δείγμα ομαλοποίησης).

Για μεθυλίωση βαθμολόγησης όλων των ανιχνευτών σε όλα δείγματα, ο λόγος του ύψους της κορυφής της πέψη έναντι αχώνευτος δείγμα υπολογίστηκαν χωριστά σε Coffalyser, και το ποσοστό της μεθυλίωσης χρησιμοποιείται για περαιτέρω ανάλυση.

Ορισμοί και cut-offs.

για να διερευνήσουν διαφορές στη CIMP συχνότητα, η οποία εξαρτάται από το βαθμό της μεθυλίωσης, διαφορετικές παράμετροι βαθμολόγησης ελέγχθηκαν.

Δύο πάνελ των γονιδίων ερευνήθηκαν. Η βαθμολόγηση του πίνακα Ogino περιλαμβάνει 8 γονίδια (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

,

SOCS1

,

CDKN2A

,

MLH1

και

CRABP1

), ενώ ο πίνακας Weisenberger περιλαμβάνει 5 από τα προαναφερθέντα γονίδια (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

και

SOCS1

). Για τον πίνακα Weisenberger (ονομάζεται Weisenberger εφεξής) ένα θετικό αποτέλεσμα για τρία ή περισσότερα από τα πέντε γονίδια θεωρείται CIMP θετική, ενώ για τον πίνακα Ogino ελέγχθηκαν δύο διαφορετικούς ορισμούς? CIMP θετικότητα αν 5 από 8 γονίδια ήταν θετικό (που ονομάζεται Ogino 5/8), και θετικότητα CIMP εάν 6 από 8 γονίδια ήταν θετικό (Ogino 6/8).

Επιπλέον, διάφορα cut-offs για να σημειώσει θετικό μεθυλίωση για κάθε ανιχνευτή, καθώς και διαφορετικούς ορισμούς της συνολικής κατάστασης μεθυλίωσης για ένα συγκεκριμένο γονίδιο ερευνήθηκαν: Όλες οι θέσεις /ανιχνευτές βαθμολογήθηκαν χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά επίπεδα μεθυλίωσης (≥20% ή ≥30%) για τον καθορισμό μιας συγκεκριμένης θέσης /ανιχνευτή όπως μετουσιωμένο. Τρεις διαφορετικές cut-off ελέγχθηκαν για τον ορισμό μεθυλίωση για κάθε γονίδιο? είτε τουλάχιστον 33% (1/3) των ανιχνευτών ήταν μετουσιωμένο? τουλάχιστον το 66% (2/3) ήταν μεθυλιωμένα, ή? που έχει τουλάχιστον ένα ή περισσότερα μεθυλιωμένων ανιχνευτές εντός του γονιδίου.

Για κάθε γονίδιο, αρκετές θέσεις μεθυλίωσης μελετήθηκαν, που κυμαίνονται από 3 έως 6 θέσεις ανά γονίδιο. Ο αριθμός των θέσεων μεθυλίωσης για τα γονίδια που εξετάστηκαν ήταν ως εξής: 3 ερευνά το καθένα για

RUNX3

,

CACNA1G

και

IGF2

? 4 ανιχνευτές το καθένα για

MLH1

,

CRABP1

,

SOCS1

και

CDKN1A

, και? 6 ανιχνευτές για

NEUROG1

.

Για την απόφαση CIMP, οι τρεις ομάδες είχαν χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με όλα τα probe- και γονιδιακών σοφός cut-offs, Σχήμα 1. Αυτό οδήγησε σε ένα σύνολο 18 εναλλακτικοί ορισμοί βαθμολόγησης για CIMP. Οι διαφορές σε θετικά δείγματα παρατηρήθηκαν, και η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε.

Η

Οι «πιο αυστηρά κριτήρια» για τη βαθμολόγηση των CIMP ορίστηκαν ως μεθυλίωσης τουλάχιστον 30% σε επίπεδο αισθητήρα, τουλάχιστον το 66% θετικά ανιχνευτές μέσα σε ένα γονίδιο, και 6 από 8 θετικών γονιδίων στον πίνακα Ogino. Οι «τουλάχιστον αυστηρά κριτήρια» ορίστηκαν ως 20% μεθυλίωση σε επίπεδο ιχνηλάτη, μία ή περισσότερες θετικές ανιχνευτές μέσα σε ένα γονίδιο, και 3 5 γονιδίων σημειώνονται ως θετικά στον πίνακα Weisenberger.

Στατιστική ανάλυση.

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με SPSS V21 (IBM Corp., Armonk, NY, ΗΠΑ).

Ο αριθμός των θετικών δειγμάτων που προκύπτουν από καθένα από τα διαφορετικά κριτήρια βαθμολόγησης σε σχέση με τη χρήση της δοκιμής McNemars σε ένα 2 × 2 πίνακα. Όλες οι δοκιμασίες ήταν δύο όψεων, και η στατιστική σημαντικότητα ενδείκνυται για τιμές p & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Probe-σοφός Cut-off

Για κάθε αισθητήρα, η σχετική μεθυλίωση του δείγματος, σε σύγκριση με ένα κανονικό αναφοράς, δόθηκε ως ποσοστό. Η αποκοπή για να σημειώσει ένα ανιχνευτή όπως μεθυλιωμένο δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας τόσο 20% και 30% μεθυλίωση δείγματος vs αναφοράς, Σχήμα 2. Οι δύο cut-off ελέγχθηκαν για όλα τα ανιχνευτές στη δοκιμασία. Συνολικά, χρησιμοποιώντας 30% ως cut-off, ο αριθμός των θετικών δειγμάτων για τις 31 διαφορετικές ανιχνευτές που δοκιμάστηκαν, κυμαίνεται από 0 (0%) έως 63 (95%), ενώ με τη χρήση 20% ως cut-off, η διακύμανση ήταν από 0 (0%) σε 64 (97%). Η μέση μεταβολή στο σκοράρισμα των θετικών δειγμάτων μεταξύ 20% και 30% cut-offs ήταν 3 (5%), που κυμαίνεται από ένα ελάχιστο από το 0 έως το μέγιστο των 8 δειγμάτων (0-12%). Τέσσερις από 31 ανιχνευτές (13%), σε δύο διαφορετικά γονίδια, δεν έδειξαν καμία διαφορά στον αριθμό των θετικών δειγμάτων με τη χρήση των δύο cut-offs (03-037010228 στο

MLH1

, 16 – 011.256.544, 16 έως 011.256.960 και 16-011257200 στο

SOCS1

). Η μεγαλύτερη μεταβολή παρατηρήθηκε για ανιχνευτή 09-021965200 στο

CDKN2A

, στην οποία 8 ασθενείς (12%) βαθμολογήθηκαν με διαφορετικό τρόπο με τη χρήση των δύο διαφορετικών cut-offs. Τρεις ανιχνευτές (16-011256544, 16-011256960 και 16-011257200 στο

SOCS1

) δεν έχει κανένα θετικά δείγματα, χρησιμοποιώντας κάποιο από τα κριτήρια, όπως το ποσοστό μεθυλίωσης κυμάνθηκε 0-5%.

ο άξονας προς τα αριστερά δείχνει τον αριθμό των θετικών δειγμάτων, και ο άξονας στη δεξιά δείχνει το ποσοστό των θετικών δειγμάτων.

η

Gene-σοφός Cut-offs

ο αριθμός ανιχνευτών διερευνήθηκαν για κάθε γονίδιο κυμαινόταν από 3 έως 6. Τρεις διαφορετικές ρυθμίσεις εντός του γονιδίου ελέγχθηκαν? μία ή περισσότερες θετικές ανιχνευτές, περισσότερο από 33% θετικών ανιχνευτές ή μεγαλύτερη από 66% θετική ανιχνευτές. Και οι τρεις ρυθμίσεις ελέγχθηκαν τόσο για έναν ανιχνευτή-σοφός cut-off του 20% και 30%.

Αυτό οδήγησε σε έξι χαρακώσεις ανά γονίδιο, για τα οποία η μέση του 44,8% των δειγμάτων βαθμολογήθηκαν ως θετικά πάνω οι 8 γονίδια. Το μέσο ποσοστό των θετικών δειγμάτων μεταξύ των γονιδίων, για κάθε στείλει κριτήρια, κυμάνθηκε από 34,3% έως 57,0%, με τη χρήση της πιο αυστηρές (30% ανιχνευτής cut-off, 66% θετική ανιχνευτές ανά γονίδιο), και τουλάχιστον αυστηρά κριτήρια (20% καθετήρα αποκοπής, ≥1 θετικό ανιχνευτή ανά γονίδιο), αντίστοιχα, Πίνακας 1.

η

SOCS1 είχε το χαμηλότερο αριθμό των θετικών δειγμάτων, με μέση βαθμολογία των θετικών δειγμάτων του 5,8%, που κυμαίνονται από 0 σε 18,2%, ενώ η μέση βαθμολογία των θετικών δειγμάτων για IGF2 ήταν 96,0% για τα εναλλακτικά κριτήρια 6, που κυμαίνονται 92,4 έως 97,0%, Πίνακας 1 /Εικόνα 3.

η

CDKN2A

έδειξαν μεγαλύτερη διακύμανση θετικά δείγματα χρησιμοποιώντας τις 6 εναλλακτικά κριτήρια. Ο αριθμός των θετικών δειγμάτων κυμαίνονταν από 39 δείγματα, που κυμαίνονται από 5 έως 44, χρησιμοποιώντας τις πιο αυστηρές και λιγότερο αυστηρά κριτήρια, αντίστοιχα. Αντίθετα,

RUNX3

και

IGF2

έδειξε την παραμικρή μεταβολή? και στις δύο περιπτώσεις μόνο 3 ασθενείς βαθμολογήθηκαν διαφορετικά στη διάρκεια των 6 διαφορετικά κριτήρια. Για

RUNX3 Τετάρτη 24 ασθενείς βαθμολογήθηκαν ως θετικά με τα πιο αυστηρά κριτήρια, σε σύγκριση με 27 ασθενείς με λιγότερο αυστηρά κριτήρια. Για

IGF2

τον αριθμό των θετικών δειγμάτων ήταν 61 και 64, με τη χρήση των περισσότερο και λιγότερο αυστηρά κριτήρια, αντίστοιχα.

CIMP συχνότητες

Το αποτέλεσμα, όσον αφορά τον αριθμό των θετικά δείγματα, χρησιμοποιώντας κάθε μία από τις τρεις ομάδες, συμπεριλαμβανομένων των διαφορετικών συνδυασμών καθετήρα-σοφός και γονίδιο-σοφός χαρακώσεις, παρουσιάζονται στον πίνακα 2 /Εικόνα 4.

Η

τα πιο αυστηρά κριτήρια, με τη χρήση ένας ανιχνευτής αποκοπής του 30%, και απαιτώντας ότι 2 από τρεις (& gt? 66%) των ανιχνευτών μέσα σε ένα ορισμένο γονίδιο πρέπει να είναι θετικό, εκτός από τη χρήση του πίνακα Ogino 6/8, επέστρεψε 13 (20%) CIMP-θετικά δείγματα. Αντιθέτως, χρησιμοποιώντας ανιχνευτή cut-off είναι 20%, που απαιτεί τουλάχιστον μία ή περισσότερες θετικές ιχνηλάτη εντός ενός γονιδίου, και στον πίνακα Weisenberger (3 στα 5 θετικών γονιδίων), επέστρεψε 30 (45%) CIMP-θετικών δειγμάτων.

Όταν χρησιμοποιείτε τις λιγότερο αυστηρά κριτήρια για probe- (20%) και γονίδιο- (≥1 θετικά γονίδια) επίπεδο, 24 δείγματα (36%) βαθμολογήθηκαν ως θετικά χρησιμοποιώντας Ogino 6/8-πάνελ, 29 θετικά (44%) με χρήση Ogino 5/8-panel και 30 θετικά (46%) χρησιμοποιώντας τον πίνακα Weisenberger. Αυτά probe- και γονίδιο κριτήρια επίπεδο είχε ως αποτέλεσμα την μεγαλύτερη διακύμανση μεταξύ των πινάκων, με αποτέλεσμα σε 6 ασθενείς (9,1%) που βαθμολογείται με διαφορετικό τρόπο. Για 47 δείγματα ασθενών (71%), η κατάσταση CIMP ήταν σταθερή και ανεξάρτητη από τα κριτήρια που χρησιμοποιούνται για τη βαθμολόγηση? 34 δείγματα ήταν συνεχώς σκόραρε ως CIMP αρνητική, και 13 σημείωσε ως θετική CIMP.

Μια σημαντική διαφορά μεταξύ των θετικών δειγμάτων με τη χρήση της πιο αυστηρές (20%) σε σύγκριση με τα λιγότερο αυστηρά κριτήρια (46%) αποδείχθηκε, p & lt? 0.005. Κατά τη σύγκριση των λιγότερο αυστηρά κριτήρια τόσο σε ανιχνευτή επιπέδου (20%) και το γονίδιο-επίπεδο (≥1 θετική καθετήρα) μεταξύ των τριών πινάκων, μόνο η Ogino 6/8 σε σύγκριση με τον πίνακα Weisenberger έδειξαν σημαντική διαφορά (p = 0,031) . Αντίθετα, τα πιο αυστηρά κριτήρια για probe- και γονίδιο επίπεδο δεν επέστρεψε σημαντικές διαφορές μεταξύ των πινάκων.

Έλεγχος για διαφορές στο εσωτερικό κάθε ένα από τα πάνελ, έδειξε ότι η αύξηση της αυστηρότητας σε γονίδιο-επίπεδο από τις λιγότερο αυστηρές (≥1) με την πιο αυστηρή (66%), διατηρώντας σταθερό το επίπεδο ανιχνευτή, οδήγησε σε σημαντική διαφορετικό αριθμό των θετικών δειγμάτων. Από την άλλη πλευρά, κρατώντας το επίπεδο γονίδιο σταθερή, ενώ η αλλαγή του επιπέδου ανιχνευτή, είχε ως αποτέλεσμα σημαντική διαφορετικά θετικά δείγματα για τα ≥1 κριτήρια, εντός του πίνακα Weisenberger μόνο. ​​

Συζήτηση

Ανεξάρτητα της μεθοδολογίας που χρησιμοποιήθηκε, τα κριτήρια βαθμολόγησης των CIMP θα πρέπει να ορίζεται σε τρία επίπεδα? ποια γονίδια θα πρέπει να ελέγχεται, πώς sites πολλοί μεθυλίωσης θα πρέπει να επηρεάζεται για το γονίδιο να είναι μεταγραφικά αδρανοποιημένο, και σε ποιο βαθμό θα πρέπει να μεθυλιωθεί ένα site μεθυλίωση να επηρεάσει την κατάσταση μεταγραφή του γονιδίου.

Αυτή η μελέτη διαπίστωσε μια σημαντική διαφορά στη συχνότητα CIMP σε καρκίνο του παχέος εντέρου χρησιμοποιώντας μεθοδολογία MS-MLPA, κατά τη σύγκριση διαφορετικών κριτηρίων που χρησιμοποιούνται για τον ορισμό μεθυλιωμένα δείγματα. Παρά το γεγονός ότι ένα μεγάλο ποσοστό των δειγμάτων (71%) ήταν σταθερά σκόραρε (εκ των οποίων 13 ήταν CIMP θετικό) χωρίς καμία αλλαγή, σύμφωνα με κριτήρια που χρησιμοποιήθηκαν, ενώ το υπόλοιπο επηρεάστηκαν από την αλλαγή των κριτηρίων βαθμολόγησης που. Αξίζει να σημειωθεί ότι, μόνο τέσσερις από τις 31 ανιχνευτές (13%) διερευνήθηκαν έδειξαν καμία διαφορά στον αριθμό των θετικών δειγμάτων χρησιμοποιώντας τα διάφορα cut-off. Το μεγαλύτερο παραλλαγή παρατηρήθηκε για έναν από τους ανιχνευτές του

CDKN2A

γονίδιο. Για τα 8 γονίδια διερευνώνται,

RUNX3

και

IGF2

ήταν πιο συνεπής με μικρή διακύμανση μεταξύ των δειγμάτων, ενώ σημαντική διακύμανση σημειώθηκε για

CDKN2A

, σύμφωνα με τα αποτελέσματα που αναφέρθηκαν από Ogino et al. [20]. Τα κριτήρια που χρησιμοποιούνται σαν αποτέλεσμα σημαντικά διαφορετικό αριθμό των θετικών δειγμάτων όταν χρησιμοποιούνται για τις δύο προτεινόμενες πάνελ για να καθορίσει την κατάσταση CIMP στη βιβλιογραφία, δηλαδή η Ogino- και τα πάνελ Weisenberger [20], [24].

Τα ευρήματα θέτουν αρκετές σημαντικές συνέπειες. Για το ένα, αποδεικνύει διακύμανση μεταξύ της συχνότητας του CIMP ανάλογα με τα cut-offs και γονιδίων ερευνήθηκε σε ένα πάνελ. Αυτό θα πρέπει να σημειωθεί, όταν οι ερευνητές χρησιμοποιούν CIMP ως μέρος της ταξινόμησης προτείνεται για καρκίνο του παχέος εντέρου. Δεύτερον, αποδεικνύει μεταβλητότητα στη μεθυλίωση εντός και μεταξύ των γονιδίων. Αυτό μπορεί είτε να σχετίζεται με την πραγματική διαφορές στο εσωτερικό των γονιδίων και των ανιχνευτών που ερευνήθηκαν, ή που σχετίζονται με την τεχνική που χρησιμοποιείται για την αναγνώριση. Αν ισχύει το πρώτο, ο λόγος για τους οποίους ορισμένες περιοχές είναι (πιο σταθερά) μεθυλιώνεται, ενώ άλλοι δεν θα πρέπει να διερευνηθεί, καθώς μπορεί να σχηματίσουν νέες γνώσεις σχετικά με την καρκινογένεση και πώς μεθυλίωση μπορεί να συμβάλει στην ανάπτυξη του καρκίνου. Περαιτέρω, μπορεί να είναι ότι τα γονίδια και ανιχνευτές (όπως

RUNX3

και

IGF2

) θα πρέπει να χρησιμοποιείται μαζί με άλλα ή παρόμοια με συνέπεια μεθυλιωμένα γονίδια σε πάνελ για να σχηματιστεί απόφαση για το καθεστώς CIMP, προκειμένου για να αποφευχθεί η υπερεκτίμηση ή υποτίμηση των CIMP θετικά ή αρνητικά δείγματα.

Η παρουσίασε μελέτη διεξήχθη με σκοπό να αξιολογηθεί η καταλληλότητα της χρήσης εναλλακτικών κριτηρίων βαθμολόγησης για CIMP, με τη χρήση μεθυλίωσης ειδική ενίσχυση πολλαπλής ανιχνευτή απολίνωση-εξαρτώμενη (MS -MLPA). Στην βιβλιογραφία υπάρχουν αρκετές μελέτες που αξιολογούν πάνελ γονιδίων και τις θέσεις CpG που πρέπει να χρησιμοποιούνται για CIMP βαθμολόγησης, αλλά οι υποκείμενες cut-off για την εκάστοτε θέση και το γονίδιο δεν είναι καλά συζητηθεί [11], [20], [24].

σε αυτή τη μελέτη, η διαφορά στο αριθμό των θετικών δειγμάτων χρησιμοποιώντας την πιο αυστηρή σύγκριση με τα λιγότερο αυστηρά κριτήρια ήταν στατιστικά σημαντική, και δείχνει ότι τα επιλεγμένα αποκοπές που χρησιμοποιούνται για τη βαθμολόγηση του καθεστώτος CIMP είναι σημαντική. Επιπλέον, οι στατιστικές αναλύσεις έδειξαν επίσης ότι οι συνδυασμοί των τριών επιπέδων των εναλλακτικών βαθμολόγησης έδωσε στατιστικά διαφορετικό αριθμό των θετικών δειγμάτων, γεγονός που υποδηλώνει ότι και τα τρία επίπεδα θα πρέπει να αξιολογηθεί προσεκτικά. Ωστόσο, μέσα σε τρεις πίνακες, αλλαγή των κριτηρίων επίπεδο γονίδιο είχε μεγαλύτερη επίδραση στον αριθμό των δειγμάτων που σημείωσε ως θετική από την αλλαγή των κριτηρίων επίπεδο ανιχνευτή. Ακόμα και αν αρκετές διαφορετικές μέθοδοι θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση του φαινοτύπου CIMP, όλες αυτές οι μέθοδοι θα πρέπει να εξετάσει τα κριτήρια βαθμολόγησης που περιέχονται στον ορισμό CIMP. Ανεξάρτητα από τη μεθοδολογία που χρησιμοποιείται, κάποιος θα πρέπει να εξετάσει ποιες περιοχές CpG να μελετήσει και να καθορίσει ένα cut-off για μεθυλίωσης του συγκεκριμένου χώρου CpG, καθορίζουν πόσες CpG θέσεις εντός του γονιδίου το οποίο θα πρέπει να μεθυλιωμένο να καθορίσει το γονίδιο ως μεθυλιωμένο, και, τέλος, το οποίο τα γονίδια, και πόσοι από αυτούς θα πρέπει να μεθυλιώνεται για να στείλει τελικά το δείγμα ως μεθυλιωμένο.

οι διαφορές στην CIMP βαθμολόγησης μεταξύ των πινακίων γονίδιο έχουν αξιολογηθεί [20], και βρέθηκε να είναι αρκετά μικρή (& lt? 3,2%), ακόμη και μεταξύ των πινάκων που χρησιμοποιούν διαφορετικά γονίδια. Επίσης, η σύγκριση των αποκοπής για τον πίνακα Ogino (5 από 8 και 6 από 8) συγκρίθηκε, και 3% των δειγμάτων έδειξε διαφορετικές βαθμολογίας (18% και 15%, αντίστοιχα) [20].

σε γενικές γραμμές, ανεξάρτητα από τα κριτήρια και μέθοδος που χρησιμοποιείται για τη βαθμολόγηση του CIMP, ο βαθμός μεθυλίωσης μετρήθηκε για μια δεδομένη θέση θα εξαρτηθεί από την ομοιογένεια των κυττάρων, και διήθηση των φυσιολογικών κυττάρων στο δείγμα που μελετήθηκαν.

Επίσης, η επιλογή του κανονικού δείγματος αναφοράς για κάθε μελέτη πρέπει να αξιολογηθεί προσεκτικά, καθώς η μεθυλίωση του δείγματος είναι σε σχέση με την επιλεγείσα αναφορά. Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκε δείγμα από φυσιολογικό επιθήλιο από έναν ασθενή με καρκίνο του παχέος εντέρου. Θεωρητικά, αυτό το δείγμα είναι δυνατό να παραμείνουν κάποιες επιγενετικές χαρακτηριστικά που επηρεάζουν τα αποτελέσματα του προτύπου μεθυλίωσης στα δείγματα καρκίνου. Ωστόσο, αυτό θα επηρεάσει όλα τα δείγματα εξίσου, και είναι, επομένως, της ελάχιστης σημασίας σε σχέση με την αξιολόγηση των κριτηρίων βαθμολόγησης. Με δεδομένη την ευκαιρία, η καλύτερη επιλογή θα ήταν να δοκιμάσουν φυσιολογικό βλεννογόνο ιστό από τον ασθενή, όπου ο όγκος δοκιμαστεί προέρχεται από παράλληλα με τον ίδιο τον όγκο. Δεδομένης της περιορισμένης υλικό που είχαμε στη διάθεση, καλύτερη επιλογή μας ήταν να χρησιμοποιήσετε το πριν αναφερόμενο έλεγχο και ως εκ τούτου παρουσιάζουν τα δεδομένα αναλόγως.

Οι περισσότερες εκθέσεις της κατάστασης CIMP έχουν χρησιμοποιηθεί όξινου θειώδους επεξεργασίας του DNA πριν από την επιλεγείσα μέθοδο ανάκριση του προτύπου μεθυλίωσης. Αυτός ο χειρισμός του DNA μετατρέπει μη μεθυλιωμένα κυτοσίνες σε ουρακίλες, ενώ το μεθυλιωμένο αφήνονται μη μετατραπείσες. Υπάρχουν διάφορα πρωτόκολλα για όξινου θειώδους θεραπεία, που διαφέρει ως προς το όξινο θειώδες συγκέντρωση που χρησιμοποιείται και ο χρόνος επώασης /μετατροπής, και να προσθέσετε ένα άλλο επίπεδο πολυπλοκότητας στην οριστική κατάσταση CIMP. Στη μελέτη που παρουσιάζεται εδώ, καμία θεραπεία DNA έχει γίνει πριν από την μέθοδο MLPA, περιορίζοντας έτσι την πηγή σφαλμάτων.

Περαιτέρω, το γεγονός ότι η μεθυλίωση του γονιδίου κυμαινόμενες φυσικά, προκειμένου να ρυθμίσει την γονιδιακή έκφραση, και ότι η φύση του επιγονιδίωμα, σε αντίθεση με το γονιδίωμα, είναι να είναι σε συνεχή μετασχηματισμό, είναι μια άλλη πτυχή που περιπλέκει ένα σαφή ορισμό του CIMP [25]. Για να παρακάμψουν αυτή την πρόκληση που θα πρέπει να βασίζονται σε υλικό που έχουν συλλεχθεί κατά το ίδιο χρονικό διάστημα και το στάδιο στη θεραπεία ασθενών, ως εκ τούτου την αποφυγή πιθανών αποκλίσεων time-lapse.

Συμπεράσματα

Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη φωτίζει το πώς διαφορετικά κριτήρια βαθμολόγησης οδηγήσει σε στατιστικά σημαντικό διαφορετικό αριθμό CIMP θετικών δειγμάτων. Ο ορισμός της CIMP στον καρκίνο του παχέος εντέρου δεν έχει ακόμη συμφωνηθεί, ούτε σε ποιοτικό επίπεδο (που νησίδες CpG /γονίδια που πρέπει να ελέγχεται), σε ποσοτικό επίπεδο (πόσες θέσεις πρέπει να είναι μεθυλιωμένα), ούτε σε τεχνικό επίπεδο ( ποια μεθοδολογία θα χρησιμοποιηθεί). Ωστόσο, ανεξάρτητα από τη μεθοδολογία που χρησιμοποιήθηκε κάποιος θα πρέπει να αποφασίσει σχετικά με cut-offs για τη θετική βαθμολόγηση, η οποία θα πρέπει να αξιολογούνται προσεκτικά, καθώς η προκύπτουσα συχνότητα CIMP θα επηρεαστεί σημαντικά από την παρούσα απόφαση. Περαιτέρω έρευνα σε αυτόν τον σημαντικό τομέα είναι αναγκαία για να βελτιώσει την κλινική μετάφραση του ρόλου των CIMP στον καρκίνο.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

Ακολουθίες, χρωμοσωμική θέση, και το θραύσμα μήκους για τις θέσεις διερευνήθηκαν /ανιχνευτές στη μέθοδο MLPA

doi:. 10.1371 /journal.pone.0086657.s001

(DOCX)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Oddmund Nordgaard για την ευγενική παροχή DNA από καρκίνους του παχέος εντέρου και φυσιολογικό ιστό του παχέως εντέρου.