Αφηρημένο

αναστολέας ιστού της μεταλλοπρωτεϊνάσης-4 (TIMP-4) είναι μέλος της εξωκυττάριας μήτρας αναστολέων (ECM) μεταλλοπρωτεϊνασών που έχει πλειοτροπικές λειτουργίες. Ωστόσο, ΤΙΜΡ-4 ρόλους στην καρκινογένεση δεν είναι καλά κατανοητοί. Η βιωσιμότητα των κυττάρων και κυτταρόμετρο ροής προσδιορισμοί χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των διαφορών του κυτταρικού θανάτου μεταξύ των κυτταρικών σειρών Η-ΤΙΜΡ-4 Η-διάνυσμα και. Ανοσοκηλίδωση και ημι-ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί η έκφραση των ρυθμιστικών απόπτωσης. Δείξαμε ότι TIMP-4 έχει απόπτωση-ευαισθητοποίηση αποτελέσματα προς την κατεύθυνση αρκετές ερεθίσματα θάνατο. Σε συμφωνία με τα ευρήματα αυτά, ρυθμιστές της απόπτωσης από Αναστολείς της Απόπτωσης Πρωτεΐνες (ΙΑΡ), FLICE πρωτεϊνών που ομοιάζουν με αναστολέα (FLIP) και Bcl-2 μέλη της οικογένειας που διαμορφώνονται από ΤΙΜΡ-4. Επιπλέον, ΤΙΜΡ-4 knockdown είχε σαν αποτέλεσμα την αύξηση της επιβίωσης των κυττάρων μετά τη στέρηση ορού, όπως εκτιμάται με αναλύσεις κλωνογόνων κυττάρων. Η έκθεση αυτή δείχνει ότι TIMP-4 ρυθμίζει την καρκινογένεση μέσω της ενεργοποίησης της απόπτωσης σε τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. Κατανόηση TIMP-4 αποτελέσματα στην ογκογένεση μπορεί να παρέχει ενδείξεις για τις μελλοντικές θεραπείες

Παράθεση:. Lizarraga F, Ceballos-Cancino G, Espinosa Μ, Vazquez-Santillan K, Maldonado V, Melendez-Zajgla J (2015) Αναστολέας ιστού της μεταλλοπρωτεϊνάσης-4 εναύσματα απόπτωση σε καρκίνο του τραχήλου κύτταρα. PLoS ONE 10 (8): e0135929. doi: 10.1371 /journal.pone.0135929

Επιμέλεια: Qing-Xiang Amy Sang, Florida State University, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 5 του Φλεβάρη 2015? Αποδεκτές: 28, Ιούλη του 2015? Δημοσιεύθηκε: 20 Αυγούστου του 2015

Copyright: © 2015 Lizarraga et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Consejo Nacional de Επιστήμης και Tecnologia, επιχορηγήσεις 1616519, 87855, conacyt.mx. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η απόπτωση αποτελεί ένα διατηρημένο τύπος κυτταρικού θανάτου που απορυθμισμένη στον καρκίνο. Δύο κύριες οδούς σηματοδότησης ενεργοποιούν την απόπτωση σε κύτταρα θηλαστικών [1]. Η εξωγενής οδός συνδέει τα εξωτερικά ερεθίσματα θάνατο μέσα στο ενδοκυττάριο αποπτωτικών μηχανημάτων. Η διέγερση των υποδοχέων κυτταρικού θανάτου με συνδετήρες θάνατος ενεργοποιεί σχηματισμό του θανάτου που επάγει σύμπλεγμα σηματοδότησης (ΔΙΣΚΟΣ) [2]. Πρώτον, στην κυτταροπλασματική πλευρά της TNFR1, ο σχηματισμός ενός συμπλόκου πρωτεΐνης που αποτελείται από TRADD, TRAF2, CIAP-1 και RIP κινάσης λαμβάνει χώρα, που ονομάζεται Σύμπλεγμα I. Το σύμπλοκο αυτό στη συνέχεια προσλαμβάνει και ενεργοποιεί κινάσες ΙΚΚ που με τη σειρά της φωσφορυλιώνει αναστολείς ΙκΒ και επιτρέπουν NFκB που προκαλείται από την επιβίωση των κυττάρων. Ακολούθως, TRADD μπορεί διίστανται από TNFR1, η οποία οδηγεί στο σχηματισμό συγκρότημα ΙΙ μέσω της σύνδεσης του FADD και κασπάσης-8 τελικά προκαλώντας κυτταρικό θάνατο. Σε αυτό το μοντέλο, Συγκρότημα Ι ή Complex ενεργοποίηση II εξαρτάται από FLIP (ΡΕΙΟΕ-σαν αναστολέας πρωτεΐνες) [3]. Από την άλλη πλευρά, υπάρχει η ενδογενής οδός, όπου αποπτωτικά ερεθίσματα προκαλούν την απελευθέρωση των μιτοχονδριακών πρωτεϊνών χώρου μεταξύ της μεμβράνης (όπως κυτόχρωμα c) στο κυτταρόπλασμα. Το κυτόχρωμα c προωθεί ενεργοποίηση κασπασών με σχηματισμό ενός συμπλόκου πρωτεΐνης που αποτελείται από κυτόχρωμα c, Apaf-1, και της κασπάσης-9, που οδηγεί στην ενεργοποίηση του καταρράκτη κασπάσης. Η απόπτωση ελέγχεται στενά από έναν αριθμό ρυθμιστών σε διαφορετικά επίπεδα. Ανάμεσα στις κύριες ρυθμιστικές αρχές του είναι ο αναστολέας της οδού του υποδοχέα θανάτου cFLIP (κυτταρική FLIP), ο αναστολέας της απόπτωσης πρωτεΐνης (ΙΑΡ) της οικογένειας, και Bcl 2-μελών της οικογένειας [4].

Η οικογένεια ΤΙΜΡ αποτελείται από τέσσερις πλειοτροπική πρωτεΐνες που ρυθμίζουν τη δραστικότητα των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs) [5]. Ως εκ τούτου, έχουν TIMPs έχουν συσχετισθεί με την ανάπτυξη του καρκίνου? Ωστόσο, αυτές οι πρωτεΐνες εμφανίζουν διαφορετικούς και μερικές φορές αντίθετους ρόλους σε κυτταρικές διαδικασίες όπως η ενεργοποίηση ΜΜΡ, απόπτωση, κυτταρικό πολλαπλασιασμό και εισβολή [6]. ΤΙΜΡ-4 αυξημένη έκφραση σχετίζεται με καρκίνωμα ανθρώπινου μαστού [7], καρκίνωμα του ενδομητρίου [8], και γαστρικού καρκίνου [9], ενώ η έκφραση του μειώνεται σε ανθρώπινα γλοιώματα [10] και σε όγκους Wilms’ [11]. προηγούμενη εργασία μας έδειξε ότι το ΤΙΜΡ-4 εκφράζεται

de novo

σε καρκίνο του τραχήλου με αυξημένα επίπεδα σε πιο προχωρημένα στάδια [12]. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν μια σύνθετη συμμετοχή του ΤΙΜΡ-4 στην ανάπτυξη του καρκίνου.

αντίσταση κυτταρικός θάνατος επέρχεται ως συνέπεια της ανισορροπίας μεταξύ προ- και αντι-αποπτωτικών παραγόντων που τελικά ανταποκρίνονται στην συσσώρευση μεταλλάξεων του DNA και τον προσδιορισμό της απόκρισης καρκινικών κυττάρων στη θεραπεία [13]. TIMPs είναι γνωστοί ρυθμιστές της απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα [6]. ΤΙΜΡ-3 δρα ως ισχυρός επαγωγέας κυτταρικού θανάτου σε καρκινικά κύτταρα, κυρίως με την προώθηση της σταθεροποίησης των υποδοχέων θανάτου [14]. Σε αντίθεση, ΤΙΜΡ-1 και ΤΙΜΡ-2 έχουν ένα προστατευτικό αποτέλεσμα έναντι απόπτωσης που επάγεται από διάφορους διεγέρτες [15]. Επιπλέον, ΤΙΜΡ-4 μπορεί να διεγείρει απόπτωση σε αγγειακά κύτταρα λείου [16] και μετασχηματίστηκε καρδιακή ινοβλάστες [17], αν και, παραδόξως, αυτός ο παράγοντας έχει επίσης δειχθεί να προστατεύουν κύτταρα καρκίνου του μαστού από την απόπτωση [7], πράγμα που συνεπάγεται μια ιστο-ειδική επίδραση . Ωστόσο, κανένας μηχανισμός για τις επιπτώσεις της TIMP-4 στο θάνατο των κυττάρων έχει περιγραφεί.

Στην παρούσα έκθεση, παρατηρήσαμε ότι TIMP-4 πάνω ρύθμιση ευαισθητοποιεί του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα σε απόπτωση μέσω της διαφοροποίησης των αποπτωτικών πρωτεϊνών από το ΙΑΡ, FLIP και τις οικογένειές Bcl-2. Τα ευρήματα αποκαλύπτουν νέων θεραπευτικών στόχων για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας που λαμβάνουν υπόψη τον πολυλειτουργικό ιδιότητες των TIMPs.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και αντισώματα

hrTIMP-4 (Νο 974 -tsf) και TNF-α (210-TA) ήταν από την R &? D Systems (Minneapolis, ΜΝ, USA). Caspase-8 (Νο 9746), Κασπάση-3 (Νο 9661) και Caspase-9 (Νο 9501) αντισώματα ήταν από κυτταρική σηματοδότηση (USA). FLIP αντίσωμα ήταν από την Upstate (Νο 06 έως 697, η Merck Millipore KGaA, Darmstadt, Γερμανία). Mcl-1 αντίσωμα ήταν από την Millipore (Νο AB9260). Bcl-2 (Νο PC-6820UG), Bax (No.AM-04-20UG), Bak (Αρ AM03-20UG), PARP (Αρ PC-100-100UG) αντισώματα ήταν από την Calbiochem (Merck KGaA, Darmstadt , Γερμανία). Προσφοράς (Νο sc-6538), β-ακτίνη (Νο sc-130656), TNF-RI (Νο sc-1070), TNF-RII (Νο sc-1074), TRAF2 (Νο sc-876) και TRADD (Νο sc-1163) αντισώματα ήταν από την Santa Cruz Biotechnologies (Ντάλας, Τέξας, ΗΠΑ).

Κλωνοποίηση έκφρασης, καλλιέργεια κυττάρων και σταθερή επιμόλυνση

Ανθρώπινο TIMP-4 ανοικτής ανάγνωσης πλαισίου λήφθηκε από κυτταρική σειρά Caski. Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν? αίσθηση: 5 ‘GCGGAAGCTTCCCAGCATGCCTGGGAGCCCTCGGCCC 3 »και αντίθετης φοράς: 5’ CTCCCGAATTCGGCTGAACGATGTCAACAAACTCTTTCC 3 ‘. Αυτό αμπλικόνιο κλωνοποιήθηκε εντός του φορέα pLXSN (Clontech, Mountain View, CA, USA). Ο νέος φορέας που εκφράζονται pLXSN-TIMP-4.

Ο καρκίνος του τραχήλου κυτταρική σειρά HeLa ήταν επιμολυσμένα με pLXSN και pLXSN-TIMP-4 και επιλέγονται με 800 μg /mL G418 για 4 εβδομάδες για τη δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών. Οι κυτταρικές σειρές οι κατωτέρω ονομαζόμενα H-Vector (pLXSN) και Η-ΤΙΜΡ-4 (pLXSN-ΤΙΜΡ-4) και αναπτύχθηκαν σε DMEM. Ο καρκίνος του τραχήλου κυτταρική σειρά CaSki αναπτύχθηκε σε ϋΜΕΜ.

ευαισθησία φαρμάκου

2×10

4 H-διάνυσμα και Η-ΤΙΜΡ-4 κύτταρα σπάρθηκαν σε 24 φρεατίων θαλάμου. Μετά από 24 ώρες τα κύτταρα πλύθηκαν με μέσο χωρίς FBS (Βόειο Εμβρυϊκό Ορό) και επωάστηκαν με TNF-α (10 ng /mL, Sigma-Aldrich, αρ T6674) ή TRAIL (20 ng /mL, Κ &? D Systems, αρ 375-TL-010) για καθορισμένα χρονικά διαστήματα. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με ΜΤΤ (Promega, Νο G1111) επί 3 ώρες και η κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογήθηκε ως προηγουμένως περιγράφεται [18].

Serum δοκιμασίες λιμοκτονία

2×10

4 Η -φορέα και η-ΤΙΜΡ-4 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 24-φρεατίων και αναπτύχθηκαν κατά τη δεικνυόμενη συγκέντρωση FBS για 5 ημέρες. Ανεξάρτητα, 1×10

4 κύτταρα CaSki σπάρθηκαν σε πλάκα 24 φρεατίων και αναπτύχθηκαν με ή χωρίς hrTIMP-4 (10 ηΜ) για 48 ώρες σε DMEM με 8% FBS. Στη συνέχεια, τα κύτταρα CaSki αναπτύχθηκαν με 3% FBS για 6 ημέρες με ή χωρίς hrTIMP-4. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 70% αιθανόλη και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Ο λεκές διαλυτοποιήθηκε με 33% οξικό οξύ και η απορρόφηση μετρήθηκε σε αναγνώστη ELISA στα 570 nm. Βιολογική τριπλότυπα αναλύθηκαν για κάθε σειρά πειραμάτων.

TIMP-4 Νοκ ντάουν

Δύο Τα siRNAs (GAATCACAGCCCTCAGTTT, CCATCACATCCCTTCAAGA) σχεδιάστηκαν με την RNAi Target Ακολουθία Selector (Clontech, Mountain View, CA, USA ). Δίκλωνα ολιγονουκλεοτίδια που αντιστοιχούν σε αυτές Τα siRNAs κλωνοποιήθηκαν εντός του φορέα pSIREN-RetroQ σύμφωνα με τη διαδικασία του κατασκευαστή (RNAi-Ready pSIREN-RetroQ Vector, Cat. Νο 631526, Clontech). Ένα shRNA έναντι λουσιφεράσης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν με pSiren-Luc (έλεγχος shRNA), η κάθε μία πλασμίδια pSiren-TIMP4 χωριστά ή pSiren-ΤΙΜΡ-4 πλασμίδια μαζί και επιλέγονται με 1 μg /mL πουρομυκίνη για 2 εβδομάδες. Σταθερές κυτταρικές γραμμές οι εξής καλείται H-Luc (pSiren-Luc) και Η-pS-ΤΙΜΡ-4 (pSiren-ΤΙΜΡ-4). TIMP4 knockdown επαληθεύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR.

δοκιμασίες επιβίωσης

5×10

3 H-Luc και τα κύτταρα H-pS-ΤΙΜΡ-4 σπάρθηκαν σε 24 φρεατίων πλάκα και ορό υποβλήθηκαν σε έλλειψη για 7 ημέρες. Οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αιθανόλη 70%, χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες, και ποσοτικά σύμφωνα με Guzman και συνεργάτες [19]. Βιολογικά τριπλούν αναλύθηκαν για κάθε ομάδα πειραμάτων.

Η κυτταρομετρία ροής

H-διάνυσμα και Η-ΤΙΜΡ-4 κύτταρα αναλύθηκαν για χρώση Annexin V-FITC σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (BD Pharmingen) .

εκχύλιση πρωτεϊνών και ανοσοκηλίδωση

μιτοχονδριακού και διαλυτά εκχυλίσματα πρωτεΐνης ελήφθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20, 21]. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Amersham) μπλοκαριστεί, επωάστηκαν με ειδικά αντισώματα, πλύθηκαν, και επωάστηκαν με αντι-IgG-HRP δεύτερα αντισώματα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Για διαλυτά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα ίση φόρτωση επιβεβαιώθηκε με την εκτέλεση πυκνομετρική ανάλυση των παράλληλων τζελ βάφονται με Coomasie λαμπρό μπλε.

Η στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν με Statistica και Intercooled Stata Έκδοση 7.0 (TX, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής ) λογισμικά. Οι δοκιμές που αναφέρονται για κάθε πείραμα. Η στατιστική σημαντικότητα θεωρήθηκε όταν

σ

αξία ήταν & lt? 0.05.

Αποτελέσματα

ΤΙΜΡ-4 ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο

Προηγούμενη εργασία έχει δείξει ότι το ΤΙΜΡ-4 ρυθμίζει αρνητικά την ανάπτυξη των διαφόρων κυττάρων όγκου [11 , 16, 17]. Για να αναλυθεί αν ΤΙΜΡ-4 ρυθμίζει επίσης τον κυτταρικό θάνατο σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα, δημιουργήσαμε μία κυτταρική γραμμή HeLa που υπερεκφράζει σταθερώς ΤΙΜΡ-4 (Σχήμα 1Α, αποκαλούμενο στο εξής H-ΤΙΜΡ-4) και κυτταρικής γραμμής ελέγχου (στο εξής καλείται H-Vector) . Μελετήσαμε την επίδραση της στέρησης ορού σε κυτταρικές σειρές Η-ΤΙΜΡ-4 Η-διάνυσμα και. Παρά το γεγονός ότι δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στον αριθμό των κυττάρων που αναπτύσσονται σε 8% ορού μέσο συμπληρωμένο, λιγότερα κύτταρα Η-ΤΙΜΡ-4 παρατηρήθηκαν όταν ορού ήταν απούσα από το μέσο (Σχήμα 1Β). Στη συνέχεια, για να ελεγχθεί αν αυτές οι επιδράσεις αυτές περιορίζονται σε παράγοντα ανάπτυξης πείνα, αξιολογήσαμε παράγοντες κυτταρικού θανάτου από την οικογένεια TNF, καθώς και. Κατά την έκθεση στο θάνατο συνδετήρες TNF-α και TRAIL, υπήρχαν λιγότερα βιώσιμα κύτταρα H-ΤΙΜΡ-4 από τα κύτταρα H-διάνυσμα (Σχήμα 1 C). Για την περαιτέρω επιβεβαίωση αυτών των αποτελεσμάτων, HeLa κύτταρα άγριου τύπου υποβλήθηκαν σε θεραπεία με hrTIMP-4 παρουσία ή απουσία του ΤΝΡ-α και TRAIL. Βρήκαμε ότι η έκθεση σε hrTIMP-4 μόνη μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων HeLa και ενίσχυσε τις επιδράσεις του TRAIL και TNF-α (Σχήμα 1D και 1Ε, αντίστοιχα).

Α, ΤΙΜΡ-4 ανάλυση έκφρασης με RT-PCR σε H-διάνυσμα και Η-ΤΙΜΡ-4 κύτταρα. Β, Το γράφημα δείχνει τα H-διάνυσμα και Η-ΤΙΜΡ-4 ποσοστά κυτταρικής βιωσιμότητας μετά την ανάπτυξη με FBS (8%) ή χωρίς FBS (0%) για 5 ημέρες. C, Το γράφημα απεικονίζει τα ποσοστά κυτταρικής βιωσιμότητας Η-διάνυσμα και Η-ΤΙΜΡ-4 μετά ΤΝΡ-α (20 ng /mL, 48 ώρες) και TRAIL (20 ng /mL, 7 Η) θεραπεία. D, Το γράφημα εμφανίζει HeLa βιωσιμότητα των κυττάρων αναλύθηκε μετά hrTIMP-4 (10 ηΜ, 48 ώρες) και TRAIL (20 ng /mL, 7 ώρες) έκθεσης. Ε, Η γραφική παράσταση δείχνει τον HeLa κύτταρα βιωσιμότητα μετά από μια περίοδο προ-επώασης 48 ώρες με hrTIMP-4 (10 ηΜ) που ακολουθείται από ΤΝΡ-α (20 ng /mL, 48 ώρες) διέγερση. Οι αστερίσκοι δεικνύουν σημαντικές διαφορές με τιμές ρ = 0.03 σε Α, ρ = 0.006 σε C και ρ = 0,003 σε D και Ε

Η

Η-4 Η-ΤΙΜΡ κυτταρική γραμμή παρουσίασε επίσης ένα μεγαλύτερο αριθμό αποπτωτικών σωμάτων (Σχήμα 2Α). Για να διερευνηθεί αυτό το είδος του κυτταρικού θανάτου σε λεπτομέρεια, αναλύσαμε την μετατόπιση φωσφατιδυλοσερίνης από την εσωτερική προς την εξωτερική πλευρά της μεμβράνης πλάσματος (πρώιμος δείκτης απόπτωσης) με κυτταρομετρία ροής μετά ασιτία ορού και TNF-α θεραπεία. Διαπιστώσαμε ένα μεγαλύτερο ποσοστό του H-ΤΙΜΡ-4 κύτταρα που ήταν θετικά για τις εξωτερικές φωσφατιδυλοσερίνη μεμβράνη πλάσματος σε σύγκριση με κύτταρα Η-διάνυσμα (Πίνακας 1).

Α, Η-διάνυσμα και Η-ΤΙΜΡ-4 κυτταρικές γραμμές επωάστηκαν με ή χωρίς TRAIL (20 ng /mL, 7 h). Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν με φωτεινή μικροσκοπία πεδίου. θραύσματα Β, κασπάση-9 ενεργοποίηση και διάσπαση PARP εξετάστηκαν με Western blots του H-διάνυσμα και Η-ΤΙΜΡ-4 πρωτεϊνικά εκχυλίσματα κυττάρου κατά FBS λιμοκτονία. β-ακτίνης ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. C, κασπάση-8 και κασπάσης-3 διάσπαση αναλύθηκε με στύπωμα Western σε H-διάνυσμα και Η-ΤΙΜΡ-4 κυττάρων κατά ΤΝΡ-α θεραπεία. χρώση ζελέ Coomassie χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Α, Η γραφική παράσταση δείχνει τα ποσοστά βιωσιμότητας των κυττάρων CaSki αναπτύσσονται με FBS 3% για 6 ημέρες μαζί με ή χωρίς hrTIMP-4 (10 ηΜ) (αστερίσκοι δεικνύουν σημαντικές διαφορές με τιμές ρ = 0,0114, un-paired t-test με διόρθωση του Welch ).

Η

TIMP-4 νοκ ντάουν αυξάνει την επιβίωση των HeLa κύτταρα

για να επικυρώσετε τα προηγούμενα δεδομένα μας, δύο TIMP-4-συγκεκριμένες τα siRNAs χρησιμοποιήθηκαν για να αναστέλλουν την έκφραση της σε κύτταρα HeLa. Η καλύτερη knockdown ΤΙΜΡ-4 σε κύτταρα HeLa επετεύχθη με μια πισίνα των δύο ΤΙΜΡ-4 ειδικές Τα siRNAs (42% αναστολή σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου H-Luc, όπως αξιολογείται με qPCR). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η επιβίωση των κυττάρων αυξήθηκε σε H pS ΤΙΜΡ–4-κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου H-Luc μετά από 7 ημέρες από FBS ασιτία (S1 Σχήμα).

ΤΙΜΡ-4 ρυθμίζει κασπάσης

ενεργοποίηση

Επειδή μια αλληλουχία κασπασών είναι υπεύθυνο για την εκτέλεση αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, αξιολογήσαμε την ενεργοποίηση της κασπάσης με κηλίδωση Western. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, βρήκαμε ότι επάγεται ασιτία ορού διάσπαση της κασπάσης-9 σε H-Control και Η-ΤΙΜΡ-4 κύτταρα. Επιπλέον, παρατηρήσαμε διάσπαση PARP, μια ευρέως χρησιμοποιούμενη δείκτη ενεργοποίησης κασπάσης. Υψηλότερες ποσότητες του διασπασμένης κασπάσης-3 και κασπάσης-8, τα οποία είναι υπεύθυνα για την οδό μεταγωγής μετά την σύνδεση του υποδοχέα θανάτου, βρέθηκαν σε H-ΤΙΜΡ-4 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με TNF-α (Σχήμα 2C). Επιπλέον, τα αποτελέσματα της ΤΙΜΡ-4 δεν περιορίζεται στην κυτταρική σειρά HeLa, δεδομένου ότι η έκθεση των κυττάρων CaSki προς hrTIMP-4 ενίσχυσε επίσης την κυτταροτοξική δράση του ασιτία ορού (Σχήμα 2D). Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν την ιδέα ότι TIMP-4 έχει επιπτώσεις απόπτωση-ευαισθητοποίηση του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα.

TIMP-4 ρυθμίζει αναστολείς της απόπτωσης από το IAP, cFLIP και Bcl 2-οικογένειες

Πολλοί μεταγωγής σήματος οι οδοί που απαιτούνται για απόπτωση κυτταρικού θανάτου. Στο επίπεδο των υποδοχέων θανάτου κυττάρου, πρωτεΐνες FLIP ρυθμίζουν την απόπτωση. Είναι ενδιαφέρον ότι, η έκφραση του mRNA για το FLIP ισομορφή S ήταν χαμηλότερη σε κύτταρα HeLa μετά hrTIMP-4 θεραπεία. Συνεπής με αυτή τη διαπίστωση, TIMP-4 υπερέκφραση ανέστειλε την ισομορφή FLIP

έκφραση πρωτεΐνης S σε μη ανιχνεύσιμα επίπεδα (Σχήμα 3Α). Σε αντίθεση, Η-TIMP-4 κύτταρα έδειξαν υψηλότερα επίπεδα CIAP-1 και CIAP 2-mRNA, ενώ survivin έκφρασης δεν τροποποιήθηκε (Σχήμα 3Β).

Ένα, η συσσώρευση του mRNA ισομορφών FLIP »αναλύθηκε με RT -PCR σε κύτταρα HeLa σε επεξεργασία με hrTIMP-4 (10 ηΜ, το άνω πάνελ) κατά τη διάρκεια της υποδεικνυόμενο χρόνο. έκφραση FLIP πρωτεΐνης προσδιορίσθηκε με ανοσοστύπωση σε κυτταρικές σειρές Η-ΤΙΜΡ-4 (κάτω πάνελ) H-διάνυσμα και. Β, CIAP-1, CIAP-2, και του mRNA της survivin παρουσία εξετάστηκαν με ημι-ποσοτική RT-PCR σε κυτταρικές σειρές Η-ΤΙΜΡ-4 Η-διάνυσμα και.

Η

Μετά την ενεργοποίηση της ανάντη κασπάσες έναρξης, τα μιτοχόνδρια απελευθερώνουν διάφορους αποπτωτικών παραγόντων σε μια διαδικασία που ελέγχεται από την οικογένεια πρωτεϊνών Bcl-2 [23]. Όπως φαίνεται στο Σχ 4Α, Η-ΤΙΜΡ-4 κύτταρα απέδειξαν χαμηλότερα επίπεδα του Bcl-2 και Mcl-1, που είναι και οι δύο αντιαποπτωτική μέλη της οικογένειας Bcl-2. Επιπλέον, υψηλότερη έκφραση των αποπτωτικών πρωτεϊνών Bid και Bax παρατηρήθηκε επίσης σε H-ΤΙΜΡ-4 κύτταρα. Αυτές οι διαφορές αυτές αντανακλούν απομονωμένα μιτοχόνδρια, όπου παρατηρήθηκε ΤΙΜΡ-4 μία μείωση στην έκφραση Bcl-2 σε κύτταρα που υπερεκφράζουν, καθώς και μια αύξηση στο μιτοχονδριακό σχετιζόμενη Bak (Εικόνα 4Β).

οικογένειας Bcl-2 μελών αξιολογήθηκαν με ανοσοκηλίδωση σε κυτοσολική (Α) και μιτοχονδριακή (Β) η-φορέα και λύματα κυττάρων H-ΤΙΜΡ-4. Ακτίνης και αντι-Mit αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν αντιστοίχως ως έλεγχοι φόρτωση.

Η

Πρόσφατα, έχει δειχθεί ότι ο ΤΙΜΡ-3, ένας ισχυρός επαγωγέας απόπτωσης, προάγει θάνατο σε κύτταρα μελανώματος μέσω της σταθεροποίησης των υποδοχέων θανάτου και την επακόλουθη ενεργοποίηση των αποπτωτικών καταρράκτη σηματοδότησης μέσω κασπάσης-8 [14]. Επειδή παρατηρήσαμε κασπάσης-8 προϊόντα διάσπασης σε H-ΤΙΜΡ-4 κυττάρων κατά ΤΝΡ-α διέγερση (Σχήμα 2C), αξιολογήσαμε τα επίπεδα πρωτεΐνης του TNFRI, RII, και την TRAF2 συστατικά DISC και TRADD. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, παρατηρήσαμε μια μείωση στην TNFRI, TRADD, και τα επίπεδα της πρωτεΐνης TRAF2 σε H-ΤΙΜΡ-4 κύτταρα, ενώ τα επίπεδα TNFRII παρέμειναν αμετάβλητες. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι TIMP-4 ευαισθητοποιεί τα κύτταρα HeLa σε απόπτωση

in vitro

μεταβάλλοντας την ισορροπία των βασικών αποπτωτικών παίκτες για τη στήριξη του κυτταρικού θανάτου.

Α, TIMP-4 ρυθμίζει TNFRI, TNFRII και εξαρτήματα DISC TRAF2 και TRADD. Πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με ανοσοστύπωμα σε H-διάνυσμα και Η-ΤΙΜΡ-4 εκχυλισμάτων κυττάρων πρωτεΐνη.

Η

Συζήτηση

TIMPs είναι πλειοτροπικές πρωτεΐνες που ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση, ΜΜΡ δραστικότητα, κυτταρική εισβολή και αγγειογένεση κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των όγκων [6]. Ωστόσο, η συμμετοχή των TIMP-4 στην καρκινογένεση έχει εξεταστεί μόνο σε λίγους τύπους ιστών.

Η περιπλοκή αυτό το σενάριο, TIMP-4 δείχνει επίσης δραστηριότητες απόπτωση ρύθμισης που είναι κυτταρικό τύπο. Ενώ ΤΙΜΡ-4 αναστέλλει την αυθόρμητη απόπτωση [7], αυτό ενισχύει επίσης την απόπτωση σε καρδιακά ινοβλάστες και αγγειακά κύτταρα λείου μυός [16, 17]. Παρόμοια με τα προηγούμενα αποτελέσματα, στην παρούσα έρευνα έδειξε ότι TIMP-4 ευαισθητοποιεί του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα σε θάνατο

in vitro

.

Παρατηρήσαμε την εντυπωσιακή ικανότητα των TIMP-4 για την ενίσχυση της απόπτωσης σε τραχήλου της μήτρας καρκινικές κυτταρικές γραμμές μετά πρόσδεμα υποδοχέα θανάτου (TNF-α και TRAIL) επεξεργασία και ασιτία ορού. Σύμφωνα, δείξαμε ότι ΤΙΜΡ-4 knockdown ενισχύει HeLa κύτταρα επιβίωση μετά από στέρηση ορού. Tummalapalli

κ.ά.

., Ανέφεραν ότι ΤΙΜΡ-4 επαγόμενη απόπτωση σε μετασχηματισμένα καρδιακή ινοβλάστες [17], υποδηλώνοντας έναν πιθανό προστατευτικό ρόλο έναντι της καρκινογένεσης σε όργανα που εκφράζουν αυτό το μόριο. Επειδή ΤΙΜΡ-4 προστατεύει παραδόξως άλλων τύπων κυττάρων από απόπτωση [7, 24] (Πίνακας 2), ένα ιστο-ειδικό και ένας υποπληθυσμός αποτέλεσμα μπορεί να συναχθεί, η οποία μπορεί να προκληθεί από τις πολύπλοκες σχέσεις αυτού του αναστολέα με άλλες πρωτεΐνες, όπως φαίνεται στο

in vitro

μελέτες [25].

η

προηγούμενη έκθεσή μας απέδειξε ότι, σε ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, TIMP-4 αυξάνει την έκφραση σε πιο προχωρημένα στάδια των κλινικών [12]. Επειδή TIMP-4 μπορεί να επηρεάσει την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων στη χημειοθεραπεία, όπως προτείνεται από την παρούσα εργασία μας, θα ήταν ελκυστική για να εκτελέσει συμπληρωματικές μελέτες για να διερευνηθεί κατά πόσο οι ασθενείς εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα αυτού του αναστολέα έχουν μια καλύτερη ή χειρότερη πρόγνωση.

Για να αποκτήσετε περισσότερες πληροφορίες για τη TIMP-4 ασκεί τις δραστηριότητες που επάγει θάνατο των κυττάρων, ερευνήσαμε αν TIMP-4 διαμορφωμένα την έκφραση αρκετών ρυθμιστές της απόπτωσης. Πράγματι, παρατηρήσαμε ότι TIMP-4 μείωσε τα επίπεδα του FLIP

S, CIAP-1, CIAP-2, Bcl-2, Mcl-1, προσφορά, και Bak. Οι αλλαγές στην έκφραση cIAPs μπορεί να είναι συνέπεια της αύξησης των TNF-α και η ενεργοποίηση ΝΡκΒ, καθώς έχουμε βρει ότι ΤΙΜΡ-4 αυξάνει τα επίπεδα διαλυτού αυτής προσδέματος υποδοχέα θανάτου (Lizarraga

κ.ά.

.,

αδημοσίευτα

δεδομένα).

σε συμφωνία με τα αποτελέσματα μας, η προηγούμενη εργασία έχει δείξει ότι ΤΙΜΡ-4 ρυθμίζει de έκφραση των πρωτεϊνών Bcl-2 σε ένα μοντέλο ποντικού καρκίνου του μαστού [7]. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε επίσης ότι ΤΙΜΡ-4-κύτταρα που υπερεκφράζουν ενεργοποιημένη κασπάση-8 κατά την κατεργασία του ΤΝΡ-α. Αυτό θα μπορούσε να έχει προκληθεί από τη σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση των FLIP

S, μια ισομορφή της οικογένειας FLIP. FLIP

S, μία πρωτεΐνη αντιαποπτωτικών με παρόμοια δομή προς κασπάσης-8, στερείται καταλυτική δραστηριότητα και έτσι έχει τη δυνατότητα να μπλοκάρει την μεταγωγή σήματος από διάφορους υποδοχείς θανάτου [26]. Στην περίπτωση του ΤΝΡ-α, η αναλογία μεταξύ FLIP και κασπάσης-8 στο δίσκος καθορίζει κύτταρο μοίρα [3]. Από αυτή την άποψη, παρατηρήσαμε ότι H-ΤΙΜΡ-4 κύτταρα εξέφρασαν χαμηλότερα επίπεδα των πρωτεϊνών TRAF2 και TRADD. Συνολικά τα δεδομένα μας δείχνουν ότι TIMP-4 ρυθμίζει πρωτεΐνες DISC και έκφραση flip, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε αύξηση της κασπάσης 8-ενεργοποίηση και κυτταρικό θάνατο [27].

Εν κατακλείδι, η παρούσα εργασία αποδεικνύει ότι TIMP-4 παρουσιάζει μια αντι-ογκογόνο ρόλο απόπτωση ευαισθητοποιήσεως του τραχήλου της μήτρας καρκινικά κύτταρα. Περαιτέρω μελέτες απαιτούνται για τον προσδιορισμό του παράγοντα (ες) που καθορίζουν την ισορροπία μεταξύ TIMP-4 πλειοτροπικές δραστηριότητες. Ωστόσο, τα ευρήματά μας μπορούν να επηρεάσουν το σχεδιασμό των μελλοντικών θεραπευτικών προσεγγίσεων που να λαμβάνουν υπόψη τους πολλαπλούς ρόλους των TIMPs στον καρκίνο.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. TIMP-4 αναστολή αυξάνει την επιβίωση των κυττάρων

Το γράφημα δείχνει τα suvival ποσοστά H-Luc και H-pS-TIMP-4 κυττάρων μετά από ανάπτυξη χωρίς FBS για 7 ημέρες σε τρία ανεξάρτητα πειράματα

doi:.. 10.1371 /περιοδικό. pone.0135929.s001

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Julio Pérez-Carreón (INMEGEN) για τη βοήθειά του στην απόκτηση εικόνας και Μοριακός Βιολόγος Paulina Sanchez για την αναθεώρηση ευγενικά η χειρόγραφο. Η εργασία αυτή υποστηρίχθηκε από επιχορήγηση 161.619 από CONACYT να JM-Z.