Αφηρημένο

Ισχυροί δραστηριότητες RNase βρέθηκαν στον ορό των θηλαστικών, αλλά η φυσιολογική λειτουργία των ΡΝάσες δεν ήταν ποτέ καλά απεικονίζεται, σε μεγάλο βαθμό λόγω των περιορισμών που σε μεθόδους μέτρησης δραστικότητα ριβονουκλεάσης. Καμία από τις υπάρχουσες μεθόδους μπορούν να διακρίνουν μεταξύ ΡΝάσες με διαφορετικές ειδικότητες στόχου. Μια συστηματική μελέτη πραγματοποιήθηκε πρόσφατα στο εργαστήριο μας για να ερευνήσει την περιοχή-ειδικότητα της ΡΝάσες ορού σε δίκλωνο υποστρώματα RNA, και διαπίστωσε ότι ΡΝάσες ορού διασπούν διπλής έλικας RNA που κατά κύριο λόγο στο 5′-U /A-3 ‘και 5’ -C /A-3 ‘θέσεις δινουκλεοτίδιο, με ένα τρόπο που μοιάζει στενά RNase α με βάση αυτό το εύρημα, μία δοκιμασία FRET αναπτύχθηκε στην παρούσα μελέτη για τη μέτρηση αυτής site-specific δραστικότητα ριβονουκλεάσης ορού σε ανθρώπινα δείγματα χρησιμοποιώντας ένα υπόστρωμα δίκλωνο RNA . Δείξαμε ότι η μέθοδος έχει μια δυναμική περιοχή από 10

-5 mg /ml-10

-1 mg /ml χρησιμοποιώντας σειριακή αραίωση του RNase Α Οι οροί από 303 ασθενείς με καρκίνο υποβλήθηκαν σε σύγκριση με 128 υγιείς μάρτυρες , και διαπιστώθηκε ότι οι δραστηριότητες ΚΝάση ορού οπτικοποιούνται με αυτό το site-specific κλώνου ανιχνευτή διπλής βρέθηκαν να μειώνονται σημαντικά σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου, καρκίνο του ήπατος, καρκίνο του παγκρέατος, καρκίνο του οισοφάγου, καρκίνο των ωοθηκών, τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, καρκίνο ουροδόχου κύστης, καρκίνο του νεφρού και ο καρκίνος του πνεύμονα, ενώ μόνο μικρές αλλαγές βρέθηκαν σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού και του παχέος εντέρου. Αυτή είναι η πρώτη αναφορά χρησιμοποιώντας δίκλωνο RNA ως ανιχνευτή για την ποσοτικοποίηση τοπο-ειδικές δραστηριότητες της RNase Α σε ένα ορό. Τα αποτελέσματα απεικονίζονται ότι RNase Α θα μπορούσε να αξιολογηθεί περαιτέρω για να διαπιστωθεί εάν μπορεί να χρησιμεύσει ως μια νέα κατηγορία των βιοδεικτών για ορισμένους τύπους καρκίνου

Παράθεση:. Huang W, Zhao Μ, Wei Ν, Wang Χ, Cao Η, du Q, et al. (2014) Ιστοσελίδα-Ειδικές RNase A δραστηριότητα μειώθηκε δραματικά σε ορό από πολλαπλούς τύπους Καρκινοπαθών. PLoS ONE 9 (5): e96490. doi: 10.1371 /journal.pone.0096490

Επιμέλεια: Chandravanu Dash, Meharry Medical College, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19 Νοέμβρη 2013? Αποδεκτές: 8, Απριλίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: May 7, 2014

Copyright: © 2014 Huang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα Πεκίνο Φυσικών Επιστημών (5132015), Εθνικό Πρόγραμμα βασικής Έρευνας της Κίνας (2011CBA01102), Εθνική υψηλής τεχνολογίας Ε & amp? Α Πρόγραμμα της Κίνας (2012AA022501), ταμείο από Guangdong Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας (2011B090400478) και το Υπουργείο Παιδείας της Κίνας (20090001110052 και 200.800.010.019). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

RNase Α είναι ενδοριβονουκλεάση με λειτουργίες στο μεταβολισμό RNA και ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Βρέθηκε να παίζουν ρόλους σε ασθένειες όπως αυτοάνοσες παθήσεις, νεφρικές ανεπάρκειες και διαταραχή του παγκρέατος [1], [2], [3], [4]. Πιο πρόσφατα, μια δραστηριότητα κατά του όγκου αναφέρθηκε επίσης για μία RNase Α με κυτταροτοξικά και κυτταροστατικά ιδιότητες [5], [6].

Τις τελευταίες δεκαετίες, βιοχημικές ιδιότητες RNase Α ήταν καλά διερευνηθεί [7]. Ως ένα μοναδικό εξελικτικό οικογένεια συντηρημένη πρωτεΐνη, τα μέλη της υπερ-οικογένειας RNase Α αποτελούνται κατά κανόνα από 124 αμινοξέα [8]. Τα μέλη της υπεροικογένειας RNase Α εκφράζονται ευρέως και υπάρχει στον ορό και στους ιστούς των θηλαστικών [9]. Πέντε RNases, δηλαδή RNase 1, RNase 2, RNase 3, 4 και RNase RNase 5, εντοπίστηκαν σε ανθρώπινο ορό ήδη από το 1976 [10], [11]. ΚΝάση 1 βρέθηκε αργότερα να είναι το ανθρώπινο ομόλογο του RNase Α και ως εκ τούτου είναι επίσης αναφέρεται ως ανθρώπινη ΡΝάση Α ΚΝάση Α είναι το κυρίαρχο συστατικό ενδοριβονουκλεάσης ανθρωπίνων οργάνων και ιστών [9]. RNase 2 και RNase 3 συμπεριφέρονται με παρόμοιο ριβονουκλεολυτική λειτουργία [2]. Επιπλέον για να λειτουργούν σε mRNA και 18S rRNA αποικοδόμηση, RNase 4 και 5 RNase αναφέρθηκαν επίσης να έχουν μια λειτουργία της αγγειογένεσης, ενώ RNase 5 ειδικότερα θα μπορούσε να προωθήσει την ανάπτυξη των αιμοφόρων αγγείων [1].

Ranpirnase είναι μια RNase A μέλος υπεροικογένειας προσδιορίζονται στο βάτραχο (Rana pipiens) ωάρια [12]. Καθώς το μικρότερο μέλος της RNase Α υπεροικογένεια, ranpirnase είναι ένα μόνο σκέλος πολυ-πεπτίδιο που αποτελείται από 104 αμινοξέα [12]. Επί του παρόντος, ranpirnase είναι σε μια κλινική δοκιμή Φάσης IIIb, στα οποία, ranpirnase ελέγχθηκε για τη θεραπεία ασθενών με ανεγχείρητο κακόηθες μεσοθηλίωμα, καρκίνο του πνεύμονα και τη λευχαιμία, και αποδείχθηκε να αυξήσει το χρόνο επιβίωσης σε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία [13], [14]. Η απρόσμενη ανακάλυψη του αντικαρκινική δράση του ranpirnase υπαινιχθεί ότι άλλες νέες λειτουργίες θα μπορούσαν να διερευνηθούν περαιτέρω για τα μέλη της υπεροικογένειας RNase Α.

Λίγες μέθοδοι έχουν δοκιμαστεί για τη μέτρηση των επιπέδων RNase ορού. Ραδιενεργά επισημασμένα t-RNA και το υπόστρωμα dsRNA χρησιμοποιήθηκαν από Saxena και Ben-Artzi για να προσδιοριστεί η δραστικότητα ριβονουκλεάσης της αγγειογενίνη και RNase III [15], [16]. Τα υβριδοποιημένα RNA αποτελείται από ένα 17-μερές αντιπληροφοριακό κλώνο RNA και RNA που από την κυτταρική σειρά Τ24 χρησιμοποιήθηκε σε μια μελέτη για τον χαρακτηρισμό διπλό-κλώνο ριβονουκλεολυτική δραστικότητα RNase [17]. Σε μια μελέτη αγγειογενίνη, μία μέθοδος FRET χρησιμοποιήθηκε από Kelemen

et al.

Να ερευνήσει την καταλυτική αποτελεσματικότητα του RNase. Η μέθοδος αυτή, ωστόσο, λειτουργεί μόνο κάτω από εξαιρετικά χαμηλά επίπεδα RNase [18]. Παραδόξως, αν και αυτές οι μέθοδοι είναι παρόμοιες κατ ‘αρχήν, τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από αυτές τις δοκιμασίες δεν ήταν συνεπής. Reddi

et al.

Μεταχειρισμένα πολυ-C σαν το υπόστρωμα για να καθοριστεί το επίπεδο RNase μετρώντας το υπόλοιπο υπόστρωμα μετά την επεξεργασία με RNase [19]. Η μέθοδος χρησιμοποιήθηκε από Funakoshi και άλλες ομάδες το 1976 και σημαντικές σχέσεις λήφθηκαν μεταξύ των επιπέδων RNase και ασθενειών του παγκρέατος, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του παγκρέατος και παγκρεατίτιδα [20], [21], [22]. Σε περίπου την ίδια ώρα, Marabella επέδειξε μια μέθοδο για την εκτέλεση δοκιμασίας RNase, χρησιμοποιώντας RNA ζύμης ως υπόστρωμα [23]. Αργότερα, μια μέθοδος ιωδίωσης χρησιμοποιήθηκε για σήμανση ριβοσωμικό RNA. Χρησιμοποιώντας ένα ραδιενεργό σημασμένο υπόστρωμα, το υπόλοιπο υπόστρωμα προσδιορίστηκε ποσοτικά, χρησιμοποιώντας ένα φασματόμετρο σπινθηρισμού γάμμα αυτόματη [24]. Μέσω αυτού του πρωτοκόλλου, Kurihara

et al.

Μετρήθηκε η δραστικότητα ριβονουκλεάσης στον ορό, και βρήκε ότι τα επίπεδα στον ορό ΚΝάσης δεν συσχετίστηκαν με ιστολογία του καρκίνου, αντί δείχνει μια συσχέτιση με κάποιο φυσιολογικό δείκτη [25]. Επιπλέον, τα χημικά συντεθεί πολυ-C, καθώς επίσης και t-RNA που εξάγεται από

E. coli

, χρησιμοποιήθηκαν ως υποστρώματα σε δοκιμασία ριβονουκλεάσης με Kemmer

et al.

[26]. Ακόμα κι αν οι μετρήσεις του επιπέδου RNase ορού επιτεύχθηκαν σε αυτές τις μελέτες, η ανεπαρκής ικανότητα να διαφοροποιούνται ατομική RNase σε ένα μείγμα μπορεί να ήταν το τεχνικό εμπόδιο που εμπόδισαν οι ερευνητές να καταλήξουν σε συναίνεση αποτελέσματα σε διαφορετικές μελέτες RNase ορού.

Το 2003 , Czauderna

et al.

διερευνηθεί η σταθερότητα των siRNA ορού και διαπίστωσε ότι η υποβάθμιση αυτή οφείλεται κυρίως ενδοριβονουκλεάσης διάσπαση. Βρήκαν επίσης ότι, όταν τροποποιήθηκαν ορισμένες κρίσιμες περιοχές, η σταθερότητα των siRNAs ορού βελτιώθηκε σημαντικά [27]. Αργότερα, Turner και μελέτες Haupenthal έδειξε ότι RNase A έπαιξε σημαντικό ρόλο στην υποβάθμιση του siRNA στον ορό σε θηλαστικά [28], [29]. Ακολούθως τοποειδική μοτίβα διάσπασης επί C-A, U-G και θέσεις U-Α ταυτοποιήθηκαν με Volkov [30]. Σε μια προηγούμενη μελέτη που διεξήχθη με125Ι siRNAs, μπορούμε επεξηγείται περαιτέρω ότι η διάσπαση του δίκλωνου RNA που προέκυψε κυρίως σε δύο θέσεις, 5′-C /A-3 ‘(5′-U /G-3’ για συμπληρωματική έλικα) και 5 ‘-U /A-3’ θέσεις δινουκλεοτίδιο [31].

στην παρούσα μελέτη, σχεδιάσαμε ένα διπλό σημασμένο με φθορισμό RNA duplex το οποίο περιείχε θέση κοπή ενός 5′-C /A-3 ‘ως το ειδικό υπόστρωμα για την RNase ορό A. Μπορούμε χρησιμοποιούμενη μέθοδος φθορισμού μεταφοράς ενέργειας συντονισμού (FRET), μια ιδιαίτερα ευαίσθητη οπτική τεχνολογία, για να μελετήσει τη δυναμική της αντίδρασης μεταξύ επισημανθεί με φθορισμό υποστρώματα και RNase Α, για να οικοδομήσουμε μια πρότυπη καμπύλη για να συσχετίσει τα επίπεδα RNase με το ποσό καταλυτικών προϊόντων, ώστε να συναχθεί η RNase ένα επίπεδο στον ορό. Χρησιμοποιώντας αυτή τη δοκιμασία, ήμασταν σε θέση να ελέγχει την RNase A δραστηριότητα στον ορό από ασθενείς με καρκίνο. Συγκρίναμε το RNase Α επίπεδο των ασθενών με 11 είδος των καρκίνων με εκείνη των υγιών μαρτύρων, και βρήκε ο ορός ΚΝάση Α επίπεδο σε ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, καρκίνο του οισοφάγου, καρκίνο του νεφρού, καρκίνο του πνεύμονα, καρκίνο ουροδόχου κύστης, καρκίνο του παγκρέατος, καρκίνο των ωοθηκών, καρκίνο του ήπατος και του γαστρικού καρκίνου είναι σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε σύγκριση με αυτή των υγιών μαρτύρων (Ρ & lt? 0.001), ενώ το επίπεδο RNase ορό του καρκίνου του μαστού και ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από εκείνη των υγιών ατόμων

Αποτελέσματα

Σχεδιασμός και Χαρακτηρισμός ενός FRET Probe για τη μέτρηση του ορού RNase

ένα πολύ γνωστό γεγονός της μοριακής βιολογίας είναι ότι μονόκλωνου RNA που είναι πολύ ασταθείς στις περισσότερες περιπτώσεις, ιδιαίτερα στην παρουσία ριβονουκλεάσες. Οι γρήγορες διαδικασίες υποβάθμισης καθιστούν πολύ δύσκολο να παρακολουθεί τη διαδικασία υποβάθμισης σε πραγματικό χρόνο. Η κατάσταση αυτή οδηγεί σε περαιτέρω τις δυσκολίες στον καθορισμό ποσοτικών μετρήσεων της δραστηριότητας RNase.

Διαφορετικό από μονόκλωνο RNA που, δίκλωνο RNA που είναι γενικά πολύ πιο σταθερό. Σε μια πρόσφατη μελέτη προφίλ της υποβάθμισης του δίκλωνου siRNAs ορού, βρήκαμε ότι και οι δύο μεγάλες και μικρές δίκλωνο RNA που αποικοδομούνται κατά κύριο λόγο σε δύο ευαίσθητα θέσεις, δηλαδή 5′-U /A-3 ‘και 5’-C /A -3 ‘sites δινουκλεοτίδιο [31]. Με βάση αυτό το εύρημα, μπορούμε υπέθεσαν ότι δίκλωνο RNA που θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως υπόστρωμα για τη μέτρηση της δραστικότητας ριβονουκλεάσης ορού. Για το σκοπό αυτό, ένα δίκλωνο RNA αλληλουχία σχεδιάστηκε για να μεταφέρει ένα μόνο 5’-C /A-3 ευπαθή ιστοσελίδα, η οποία επιβεβαιώθηκε σε δοκιμασία αποικοδόμησης (Σχήμα 1Α). ΚΝάση Α είναι το κυρίαρχο ΚΝάση σε ανθρώπινο ορό που διαμεσολαβεί τη διαδικασία αποδόμησης των εν λόγω dsRNAs (Σχήμα 1Β). Για να διευκολυνθεί η παρακολούθηση της διαδικασίας αποικοδόμησης αυτού του ανιχνευτή σε πραγματικό χρόνο, ένα σύστημα FRET σχεδιάστηκε από την ενσωμάτωση ενός FAM φθορισμού δότη και ένα δέκτη φθορισμού TAMRA στο 5 ‘άκρο του κάθε συστατικού κλώνους RNA. Όσο το διπλό RNA διατηρεί ανέπαφα, τα δύο ακραία επισημασμένο φθορίζουσες χρωστικές είναι αρκετά κοντά για να μεσολαβήσει μεταφορά ενέργειας από τον δότη στον δέκτη (Σχήμα 2Α), οδηγώντας σε μια κορυφή εκπομπής στα 575 nm όταν διεγείρεται στα 480 nm (Σχήμα 2Β ). Όταν το δίδυμο είναι υποβαθμισμένη, η μεταφορά ενέργειας από την FAM με TAMRA θα διακοπεί, και η μέγιστη εκπομπή θα μετατοπιστεί από 575 nm έως 515 nm, κάτω από τις ίδιες συνθήκες διέγερσης (Εικόνα 2Β). Ως εκ τούτου, μετρώντας την αλλαγή της κορυφής εκπομπής στα 515 nm μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παρακολούθηση της διαδικασίας αποδόμησης του διπλού RNA και αντανακλούν τη δραστικότητα του RNase στο σύστημα (Σχήμα 2C).

Α) αποδόμηση μιάς 1860 bp μακρύ RNA duplex διεξήχθη σε RNase Α θραύσματα Αποδόμηση εκχυλίστηκαν και αλληλουχήθηκαν. Με την ευθυγράμμιση των θραυσμάτων αποικοδόμηση με την αρχική αλληλουχία RNA, θέσεις διάσπασης προσδιορίστηκαν και παρουσιάζονται σε σχέση με την αναλογία για κάθε πιθανή θέση δινουκλεοτίδιο [31]. Β) δοκιμασία υποβάθμιση Duplex RNA. Dual-σημασμένο RNA duplex χωριστά επωάζεται με RNase Α, το μίγμα RNase Α και αναστολέα ΚΝάσης Α, ανθρώπινος ορός, το μείγμα ανθρώπινου ορού και του αναστολέα RNase Α. Τα δείγματα συλλέχθηκαν και να τρέξει σε μια μετουσιωμένη PAGE γέλη.

Η

Α) Σχηματική απεικόνιση της δοκιμασίας RNase βάση FRET. Το RNA duplex (13 bp) ήταν διπλής-σήμανσης με φλουορεσκεΐνη (FAM) ως δότης και τετραμεθυλροδαμίνη (TAMRA) σαν δέκτη σε κάθε άκρο. Β) Κανονικοποιημένη φάσμα φθορισμού του διπλού RNA (13 bp) επωάζονται με (πράσινη γραμμή) ή χωρίς (κόκκινη γραμμή) ΚΝάσης /ορού στους 25 ° C για 15 λεπτά. Γ) μέτρηση δοκιμασία υποβάθμιση Duplex RNA σε πραγματικό χρόνο. Duplex RNA ανοπτήθηκε και επωάστηκε σε ρυθμιστικό αναδιάταξης στους 25 ° C. ΚΝάση ή ορός προστέθηκε κατά το χρόνο που υποδεικνύεται. Φθορισμού του δότη (FAM) καταγράφηκε σε πραγματικό χρόνο (μαύρες τελείες). Δείγματα σε διαφορετικά χρονικά (από αριστερά προς τα δεξιά: 0 s, 10 s, 60 s, 180 s, 480 s) συλλέχθηκαν και τρέχουν σε μετουσιωμένη γέλη PAGE (Ένθετο). Φθορισμού σαρώθηκε σε Typhoon δείχνει το υπόλοιπο ποσό της πλήρους μήκους dsRNA.

Η

Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η αποτελεσματικότητα της μεταφοράς ενέργειας εξαρτάται κυρίως από την απόσταση και το σχετικό προσανατολισμό του δότη και του δέκτη φθορισμού στο καθετήρα [32]. Από τη μια πλευρά, μια σύντομη καθετήρας αυξάνει την απόδοση μεταφοράς ενέργειας στην FRET, ενώ από την άλλη πλευρά, ένας ανιχνευτής πλέον έχει υψηλότερη θερμοκρασία τήξης και είναι πιο σταθερό. Διπλά RNA του 8 και 13 bp μελετήθηκαν για τη βελτιστοποίηση του μήκους του υποστρώματος. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το 13-bp υπόστρωμα, με αλληλουχίες 5′-AUGAGCCUGAUUU-3 ‘/3′-UACUCGGACUAAA-5’, ήταν βέλτιστη για την ανίχνευση FRET. Αυτό διπλό RNA στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε ως το υπόστρωμα της αντίδρασης στη μελέτη.

Βελτιστοποίηση του συστήματος δοκιμής

Για να μετρηθεί η δραστικότητα ριβονουκλεάσης στο σύστημα, τέσσερα μικρόλιτρα από 5 μΜ υποστρώματος dual-επισημασμένου RNA ήταν προστίθενται σε 2 ml ρυθμιστικό FRET υπό συνεχή ανάδευση. Πριν από την προσθήκη της RNase ή δειγμάτων δοκιμής, βασική καμπύλη καταγράφηκε στα 480 nm διέγερση για περίπου 30 δευτερόλεπτα, χρησιμοποιώντας ένα QuantaMaster 30 φασματοφθορίμετρο (Photon Technology International, Birmingham). Στη συνέχεια, διάλυμα ή δοκιμή δείγματα ΚΝάσης προστέθηκαν στο σύστημα αντίδρασης, και ο φθορισμός καταγράφηκε στα 515 nm σε ένα διάστημα 3 δευτερολέπτων για 15 λεπτά. Για ανάλυση δεδομένων, ο φθορισμός υποβάθρου αφαιρέθηκε από τον φθορισμό του δείγματος για να ληφθεί μια καμπύλη σε πραγματικό χρόνο, έτσι ώστε να παρακολουθεί τη διαδικασία αποδόμησης σε πραγματικό χρόνο κατά τη διάρκεια της θεραπείας (Σχήμα 2C). Μια μέθοδος μη γραμμικής παλινδρόμησης (single-εκθετική εξίσωση) χρησιμοποιήθηκε για να χωρέσει τα δεδομένα και να ληφθεί η σταθερά Κ

obs της αντίδρασης αποικοδόμησης (Σχήμα 3Α).

Α) Ποσοτικοποίηση της αποδόμησης σε δοκιμασία FRET. Η ένταση φθορισμού FAM μετατρέπεται ως λόγος υποβάθμισης καθορίζοντας κάτω και άνω ένταση φθορισμού ως 0% και 100%. Κάτω είναι η ένταση φθορισμού του πλήρους μήκους διπλής-σήμανσης dsRNA? κορυφή είναι η ένταση φθορισμού του ΡΑΜ επισημασμένου απλού κλώνου RNA. Η ΔF

max ορίστηκε ως 100%. Η φθορίζουσα ανάγνωση των δειγμάτων προσαρμόζονται σε εξίσωση απλής εκθετικής (κόκκινη γραμμή) για να ληφθεί η σταθερά ρυθμού Κ

obs. Ποσοστό αποδόμησης σε μια δεδομένη στιγμή υπολογίστηκε ως 100 χ ΔF /ΔF

max. Β) Υποβάθμιση της διπλής επισημανθεί dsRNA σε διάφορες συγκεντρώσεις της RNase Α, παρακολουθείται από FRET ανάλυσης (από κάτω προς τα πάνω: 10

-7 mg /ml, 10

-6 mg /ml, 10

– 5 mg /ml, 0.001 mg /ml, 0.003 mg /ml, 0.006 mg /ml, 0,01 mg /ml). C) Πρότυπη καμπύλη της συγκέντρωσης RNase Α και Κ

obs. K

obs ελήφθησαν όπως περιγράφεται στο Σχήμα 3Α. Δ) Κ

obs μεταβαλλόμενες μοτίβο κάτω από επεξεργασία κατάψυξης-απόψυξης. K

obs προσδιορίζεται από δείγματα ανθρώπινου ορού καταψύχθηκαν σε -80 ° C, και αποψύχθηκε σε θερμοκρασία δωματίου από 0 έως 6 φορές.

Η

Με αυτό τον τρόπο, μια πρότυπη καμπύλη δημιουργήθηκε με μέτρηση RNase Α δραστικότητα σε σειριακά αραιωμένα διαλύματα RNase Α, σε μία περιοχή συγκέντρωσης between10

-7 να 10

-1 μg /μl (Σχήμα 3C). Για κάθε συγκέντρωση, μια κινητική καμπύλη καταγράφηκε (σχήμα 3Α), και μία καμπύλη έγινε αναφορά, σύμφωνα με την υπολογισμένη K

obs να περιγράψει τη σχέση μεταξύ της δραστηριότητας και της συγκέντρωσης ΚΝάσης Α Α προσομοιωμένη καμπύλη έδειξε ότι η αποικοδόμηση δραστηριότητα αυξήθηκε ταχέως όταν η συγκέντρωση RNase αυξήθηκε (Σχήμα 3C). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μια γραμμική σχέση σε ένα ευρύ φάσμα συγκεντρώσεων RNase Α από 10

-7 να 10

-3 μg /μl. Μετά την προσθήκη RNase A 10

-7 μg /μl, φθορισμού ένταση του σήματος αυξάνεται 1000 a.u., ο δείκτης θορύβου σήμα ήταν 2 φορές. Το όριο ανίχνευσης της δοκιμασίας FRET ήταν 10

-7 μg /μl. Όταν η δοκιμασία RNase πραγματοποιήθηκε με 1 × 10

-6 μg /μl RNase Α, η φθορίζουσα ένταση σήματος αυξάνεται από 41.000 Α.υ. για 58.000 a.u., και το θόρυβο σε αυτή τη δοκιμασία ήταν 500. Η αναλογία θορύβου του σήματος κάτω από 1 × 10

-6 μg /μl είναι 34 φορές. Σύμφωνα με αυτό το θόρυβο του σήματος, η ανιχνεύσιμη περιοχή ήταν τόσο χαμηλή AS1 × 10

-6 μg /μl. Η μη γραμμική παλινδρόμηση R

2 σε 1 × 10 μl συγκέντρωση

-6 μg /ήταν 0,9856. Σύμφωνα με την συγκέντρωση του 1 × 10

-5 μg /μl, η μη γραμμική παλινδρόμηση R

2 ήταν 0,9945. Από την άλλη πλευρά, η φθορίζουσα ένταση σήματος αυξάνεται από 43.000 Α.υ. σε 78000 a.u., και ο λόγος του θορύβου του σήματος ήταν 70 φορές. Σύμφωνα με την R

2 και ο δείκτης θορύβου σήμα, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η περιοχή συγκέντρωσης των ΡΝάσες που μπορεί να μετρηθεί εύκολα με τη μέθοδο αυτή θα πρέπει να είναι από 1 × 10

-5 έως 0,1 μg /μl.

για να επικυρώσετε την περαιτέρω αυτό το σύστημα προσδιορισμού, δραστηριότητες RNase μετρήθηκαν για δείγματα ανθρώπινου ορού που έχουν υποστεί επανειλημμένα θεραπεία κατάψυξη-απόψυξη. Με την κατάψυξη των δειγμάτων στους -80 ° C και απόψυξη σε πάγο για πολλές φορές, οι δραστηριότητες RNase των δειγμάτων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας την τρέχουσα μέθοδο FRET. Βρέθηκε ότι θα μπορούσε να επιβιώσει RNase πολλαπλούς κύκλους ψύξης-απόψυξης, χωρίς απώλεια της δραστικότητας, υποδεικνύοντας την τρέχουσα μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για το κατεψυγμένο κλινικά δείγματα (Σχήμα 3D).

Μέτρηση Serum RNase Δραστηριότητα σε καρκινοπαθείς

η χρήση αυτής της FRET με βάση τη μέτρηση της δραστηριότητας RNase, ένα σύνολο από δείγματα ανθρώπινου ορού μελετήθηκαν, συμπεριλαμβανομένων 55 υγιή άτομα και 34 ασθενείς με καρκίνο που καλύπτουν ορισμένες κοινές μορφές καρκίνου. Η πρότυπη καμπύλη που περιγράφηκε παραπάνω χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των σχετικών συγκεντρώσεων RNase ορού δειγμάτων ανθρώπινου ορού, και στη συνέχεια η σχετική συγκέντρωση RNase των ασθενών με καρκίνο συγκρίθηκαν με εκείνη των υγιών ατόμων (μέσος όρος των φυσιολογικών μαρτύρων αυθαίρετα ορίστηκε σε 100%). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα RNase στον ορό ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω για όλα τα 7 είδη των τύπων καρκίνου (Σχήμα 4).

δραστηριότητες ορού ΚΝάσης προσδιορίστηκαν για υγιή άτομα καθώς και 4 ασθενείς με γαστρικό καρκίνο, ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου 5 , 5 ασθενείς καρκίνο του πνεύμονα, 5 ασθενείς με καρκίνο του οισοφάγου, 5 ασθενείς με καρκίνο του νεφρού, 5 ασθενείς με καρκίνο της μήτρας και 5 ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος. Η συγκέντρωση RNase κάθε δείγματος ορού υπολογίστηκε με την πρότυπη καμπύλη και Κ

obs ελήφθη από μονό-εκθετική εξίσωση. Η σχετική δραστικότητα RNase ορού του κάθε ασθενούς με καρκίνο ποσοτικοποιήθηκε με κανονικοποίηση του καρκίνου συγκέντρωση του ορού του ασθενούς με τη μέση συγκέντρωση των δειγμάτων ορού υγιών ατόμων.

Η

Για την επιβεβαίωση αυτών των παρατηρήσεων, επιπλέον δείγματα ορού συλλέχθηκαν από ασθενείς με καρκίνο του μαστού, γαστρικό καρκίνο, καρκίνο κόλον, καρκίνο ήπατος, παγκρεατικό καρκίνο, καρκίνο του οισοφάγου, καρκίνο των ωοθηκών, ο καρκίνος του τραχήλου, καρκίνος της ουροδόχου κύστης, καρκίνο του νεφρού και του καρκίνου του πνεύμονα, σε ένα μέγεθος δείγματος 303 ασθενείς με καρκίνο στο σύνολο. Αξιολόγηση των δειγμάτων αυτών έδειξε μια ρύθμιση προς τα κάτω των επιπέδων RNase ορού σε καρκίνο του στομάχου, καρκίνο του ήπατος, καρκίνο του παγκρέατος, καρκίνο του οισοφάγου, καρκίνο των ωοθηκών, ο καρκίνος του τραχήλου, καρκίνος της ουροδόχου κύστης, καρκίνο του νεφρού και του καρκίνου του πνεύμονα (Πίνακας S1). Καμία εμφανής αλλαγή των επιπέδων RNase ορού παρατηρήθηκαν σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού και ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζονται σε μεγάλο βαθμό προηγούμενες παρατηρήσεις μας. Ο γαστρικός καρκίνος, καρκίνος του ήπατος, καρκίνο του παγκρέατος, καρκίνο του οισοφάγου, καρκίνο των ωοθηκών, ο καρκίνος του τραχήλου, καρκίνος της ουροδόχου κύστης, καρκίνο του νεφρού και του καρκίνου του πνεύμονα ομάδες ασθενών διέφεραν από υγιή ομάδα με μια τιμή Ρ μικρότερη από 0.001. Σε σύγκριση, η τιμή Ρ για την ομάδα του καρκίνου του μαστού ήταν μόνο 0,0619, που δεν εμφανίζει καμία εμφανής διαφορά από την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 5). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι τα κάτω ρύθμιση δραστικότητας ριβονουκλεάσης ορού είναι ένα γενικό φαινόμενο σε πολλούς κοινούς τύπους καρκίνου. Αυτή η παρατήρηση υπαινίχθηκε μια πιθανή για site-specific RNase ως κοινή βιοδεικτών του καρκίνου.

Τα επίπεδα ορού RNase ήταν ποσοτικά για υγιή άτομα, καθώς και 37 ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, 37 ασθενείς με καρκίνο του οισοφάγου, ασθενείς με καρκίνο του νεφρού 37, 24 πνευμόνων ασθενείς με καρκίνο, 10 ασθενείς κύστη καρκίνο, 21 ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος, 23 ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών, 32 ασθενείς με καρκίνο του ήπατος, 27 ασθενείς με γαστρικό καρκίνο, 31 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, και 24 ασθενείς με καρκίνο του μαστού (για περισσότερες λεπτομέρειες των δεδομένων βλέπε πίνακα S1).

Υπήρχαν 32 από καρκίνο του ήπατος εξετάστηκαν, η μέση σχετική δραστικότητα σε σύγκριση με το κανονικό έλεγχο ήταν 32,9%, με P & lt? 0,0001. Από τα 32 δείγματα, μόνο 1 δείγμα έπεσε σε εύρος δραστηριότητας ελέγχου. ορό Είκοσι επτά ασθενείς με γαστρικό καρκίνο »δοκιμάστηκαν, η μέση σχετική δραστικότητα ήταν 38,8%, με P & lt? 0.001. Υπήρχαν 24 πνεύμονα στον ορό ασθενών με καρκίνο «δοκιμάστηκαν, η μέση σχετική δραστικότητα ήταν 29,1%, P & lt? 0,0001. «Ορός και 35 ασθενείς καρκίνο του τραχήλου« Τριάντα επτά ασθενείς καρκίνο του οισοφάγου ορό, ορό ασθενών με καρκίνο 37 του νεφρού και 21 παγκρεατικού καρκίνου δοκιμάστηκαν και φαίνεται να έχει 21,1% με την P & lt? 0,0001, 20,2% με P & lt? 0,0001, 27,6% με την P & lt ? 0,0001, 29,4% με P & lt? 0.0001, αντίστοιχα. Υπήρχαν ορούς 23 ασθενών ωοθηκών καρκίνο »μετρήθηκαν, η σχετική δραστηριότητα του καρκίνου των ωοθηκών ήταν 28,6%, με P & lt? 0,0001, και μία περίπτωση είχε πέσει μέσα στο εύρος ελέγχου. Για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης παρατηρήθηκε επίσης μια εξαιρετική περίπτωση που έπεσε στην κανονική περιοχή, ενώ η μέση σχετική δραστηριότητα ήταν 29,5%, με P & lt? 0,0001. Ο καρκίνος του μαστού δεν μοιράζονται την παρόμοια κάτω-ρυθμίζονται μοτίβο ριβονουκλεάσης με όλα τα άλλα 10 είδη καρκίνων, η σχετική δραστικότητα του καρκίνου του μαστού ήταν 61,4%, ελαφρώς χαμηλότερα από τα φυσιολογικά άτομα, αλλά στατιστική ανάλυση έδειξε η διαφορά αυτή δεν θα μπορούσε να είναι σημαντική (Ρ = 0.0619). Μια παρόμοια κατάσταση που αντιμετωπίζουν ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου μελετηθεί με το μέσο όρο σε σχέση με RNase A δραστηριότητα σε 54,5% και η P & lt?. 0.05

Δεν Διαφορά Ορός RNase επίπεδα μεταξύ των ασθενών με πρωτοπαθή και μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου

επίπεδα RNase εξετάστηκαν περαιτέρω σε ασθενείς με πρωτοπαθή και μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου, προκειμένου να διερευνήσει αν οι τιμές ευρεία δραστηριοτήτων RNase στον ορό των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου ήταν λόγω της ανάμιξης των σταδίων, και αν RNase διαφορές δραστηριότητα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διάκριση διαφορετικά στάδια του καρκίνου αυτού. Συλλέχθηκαν δείγματα ορού από ασθενείς πρωτογενούς και μετάσταση καρκίνου του κόλου για τους οποίους τα στάδια της μετάστασης προσδιορίστηκαν με εξέταση της βιοψίας ιστού. Δείγματα ορού από δέκα ασθενείς με μεταστάσεις λεμφαδένων και 10 χωρίς μεταστάσεις συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν, χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία FRET ΚΝάσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν καμία διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων (εικόνα 6).

Αυτές οι δραστηριότητες ρούμι RNase 10 ασθενείς πρωτογενούς καρκίνου του παχέος εντέρου και 10 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου μετάσταση ποσοτικοποιήθηκαν με δοκιμασία FRET.

Η

Συζήτηση

μια συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων στον ορό RNase και τον καρκίνο του παγκρέατος για πρώτη φορά αναφέρθηκε από Reddi το 1976. Χρησιμοποιώντας μια οπτική μέθοδο, μέτρησαν το επίπεδο της RNase ορού με την ποσοτικοποίηση της δραστηριότητας σε πολυ-C RNA, ένα μη ειδικό υπόστρωμα RNase [19]. Στα τέλη της δεκαετίας του 1970 και στις αρχές της δεκαετίας του 1980, ραδιοανοσοδοκιμασία υλοποιήθηκε σε μέτρηση RNase [24], [25], και σε μερικές μελέτες E. coli tRNA χρησιμοποιήθηκε για να αντικαταστήσει το πολυ-C ως υπόστρωμα δοκιμασίας [26], οι βελτιώσεις αυτές ενισχύουν την ακρίβεια των μετρήσεων του RNase. Διάφορες μελέτες έχουν διεξαχθεί για τη διερεύνηση των επιπέδων στον ορό ΚΝάση σε ασθενείς με κακοήθη καρκίνωμα, καλοήθης όγκος, καπνιστής, νεφρική ανεπάρκεια και σε ιδιαιτέρως ασθενείς με παγκρεατίτιδα και καρκίνο του παγκρέατος. Αυτές οι μελέτες, ωστόσο, αποκάλυψε μια μικτή εικόνα [22], [24]. Αν και Funakushi και ομάδες Kemmer ανέφεραν αυξημένα επίπεδα RNase ορού σε ασθενείς τόσο με καρκίνο του παγκρέατος και παγκρεατίτιδα [21], [26], Reddi και Warshaw ομάδες ωστόσο βρεθεί ότι το επίπεδο ΚΝάση αυξήθηκε μόνο σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος [19], [22], ενώ τα επίπεδα RNase στον ορό των ασθενών παγκρεατίτιδα ήταν σε παρόμοιο επίπεδο με υγιείς μάρτυρες [19], [22]. Mitsuhashi και Kurihara ομάδες, από την άλλη πλευρά, βρέθηκε ότι τα επίπεδα στον ορό RNase σχετίζονται μόνο με την ηλικία, το κάπνισμα καθώς και ορισμένες άλλες φυσιολογικές δείκτη, συμπεριλαμβανομένου του αζώτου ουρίας αίματος και συστατικά αλβουμίνης [25]. Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε αυξημένα επίπεδα RNase του ορού σε ασθενείς με νεανική σακχαρώδη διαβήτη [33]. Ακόμα μια έκθεση δείξει ότι RNase 1 έχει αλλάξει επίπεδο έκφρασης του από μικροσυστοιχιών και κηλίδωση Western μέθοδο κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης γαστρικού καρκίνου [34].

Αυτές οι διαφορές μπορεί να προκαλούνται από την πολυπλοκότητα του προσδιορισμού Reddi, όπως για παράδειγμα ο τερματισμός της αντίδρασης βαθμίδα ή οι βαθμίδες καθαρισμού ουσία. Σε αυτές τις δοκιμασίες, τα συστήματα αντίδρασης αφέθηκαν σε πάγο για αρκετό διάστημα, πριν από την υψηλή δόση του ΗΟΙΟ

4 προστέθηκαν για να σταματήσει η πέψη. Ωστόσο, στη μελέτη μας, διαπιστώθηκε ότι η θεραπεία με λουτρό πάγου δεν θα μπορούσε να καταργήσει εντελώς RNase δραστηριότητας. Πρόσθετες, ο καθαρισμός των αχώνευτος πολυνουκλεοτιδίου μπορεί να είναι άλλο ένα βήμα περιπλοκής για δοκιμασία Reddi του. Σε αυτό το στάδιο μια απλή φυγοκέντρηση χρησιμοποιήθηκε για να αφαιρέσει δι-νουκλεοτιδίων και τρι-νουκλεοτίδιο προέκυψε από πέψη ΚΝάσης. Αυτή η διαδικασία όμως επίσης μπορεί επίσης να αφαιρέσει κάποιες πλέον πολυνουκλεοτίδια που δεν υποβλήθηκαν σε πέψη πλήρως, ως εκ τούτου οδηγεί σε υπερεκτιμήσει δραστικότητα RNase ορού.

Μια δοκιμασία FRET χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη μας για την καταγραφή της έντασης φθορισμού σε πραγματικό χρόνο, έτσι ώστε να αποφευχθεί η διαδικασία τερματισμού της αντίδρασης και το στάδιο καθαρισμού. Αναγνώριση των μεταβολών του σήματος φθορισμού σε πραγματικό χρόνο, και με τη χρήση ενός ανιχνευτή FRET που έχει μόνο μία RNase A σημείο διάσπασης, προφανώς επέτρεψε την ακριβή υπολογισμό του Κ

obs για την αντίδραση.

Στην παρούσα μελέτη, μία μέθοδος FRET που βασίζεται συστάθηκε για να μετρηθεί στον ορό επίπεδα RNase σταθερά με υψηλή ευαισθησία για την ανίχνευση τόσο χαμηλά όσο 1 × 10

-7 μg /μl RNase. Σε αυτή τη μελέτη, η απόδοση του φασματοφθοριόμετρο συστηματικά βελτιστοποιείται χρησιμοποιώντας Raman φάσμα του νερού. Αυτό βρέθηκε να βελτιωθεί η ποιότητα της μέτρησης και της αναπαραγωγιμότητας μεταξύ των δοκιμών. Με την εφαρμογή ενός όγκου αντίδρασης των 2 ml, θα ήταν πράγματι σε θέση να μετρήσουν το επίπεδο RNase ορό χωρίς σειριακή αραίωση, έτσι αποφεύγεται το δυναμικό απόκλισης που προκαλείται από αραίωση 1000 το χρόνο σε άλλα πρωτόκολλα.

Η εκ νέου ανακάλυψη του κόσμου του RNA έχει που όλο και περισσότερη προσοχή σε μια ποικιλία από ριβονουκλεάσες λειτουργούν τροποποίηση RNA και το μεταβολισμό. Έτσι, μια αξιόπιστη μέθοδος ΡΝάσες Ένα ανίχνευσης μπορεί να είναι εύλογο για τέτοιου είδους μελέτες. Η δοκιμασία FRET καθορίζονται στην παρούσα μελέτη δεν περιορίζεται μόνο σε μέτρηση RNase σε δείγματα ορού, αλλά μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί σε πολλές άλλες κλινικές δοκιμές και επιστημονικές αναλύσεις. Με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων, όπως παρατηρείται μείωση της ΡΝάσες Α στον ορό του συγκεκριμένου τύπου των ασθενών με καρκίνο, ένας κόκκος προσοχή πρέπει να ληφθούν, καθώς δεν έπαιρναν φαρμακευτική αγωγή διαφόρων ασθενών υπόψη, και υπάρχει ανάγκη να προσδιοριστεί εάν οποιοδήποτε φάρμακο μπορεί να αναστέλλει την RNase Α δραστηριότητα. Σταδιοποίηση των ασθενών υποβλήθηκαν σε μέτρηση της RNase ορού είναι προφανώς ένας από τους πιο σημαντικούς παράγοντες για να εξετάσει πριν από τη στρατολόγηση RNase ως πιθανή βιοδείκτη, και για το λόγο αυτό οι περισσότεροι ασθενείς με καρκίνους πρώιμο στάδιο θα πρέπει να ελέγχονται για τον εντοπισμό της αρχικής ανίχνευσης της μείωσης της RNase A δραστηριότητας .

Υλικά και Μέθοδοι

Ανθρώπινο Συλλογή δείγματος και δήλωση Δεοντολογίας

Αυτή η μελέτη έχει ακολουθήσει τη Διακήρυξη του Ελσίνκι, και διεξάγονται σύμφωνα με τις αρχές που έχουν εγκριθεί από τις δεοντολογικής εξέτασης Διοικητικά το νοσοκομείο του καρκίνου, κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών (Πεκίνο, Κίνα). Γραπτή συγκατάθεση δόθηκε για τη συλλογή δειγμάτων και την επακόλουθη ανάλυση. Συνολικά, 431 συλλέχθηκαν δείγματα ορού από υγιή άτομα και ασθενείς με καρκίνο και αναλύθηκαν στη μελέτη. Τα χαρακτηριστικά του ασθενή με καρκίνο περιγράφηκαν στον Πίνακα 1. Οι οροί αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μετά τη συλλογή.

Η

Oligonucleotide Synthesis and Παρασκευή

Δύο συμπληρωματικές και επισημασμένο με φθοροφόρο RNA ολιγονουκλεοτίδια με αλληλουχίες 5′-FAM-AUGAGCCUGAUUU και 5′-TAMRA-AAAUCAGGCUCAU συντέθηκαν και καθαρίστηκαν από την Takara (Dalian, Κίνα). Συγκεντρώσεις του ολιγονουκλεοτιδίου RNA προσδιορίστηκαν με μέτρηση της απορρόφησης στα 260 nm, χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο Nanodrop. Ο συντελεστής απόσβεσης μετρήθηκε επίσης στα 260 nm, με αποτέλεσμα 140.860 L /(mol * cm) για το FAM-επισημασμένο ολιγονουκλεοτίδιο RNA και 156.900 L /(mol * cm) για το TAMRA-επισημασμένο ολιγονουκλεοτίδιο RNA. Οι δύο συμπληρωματικές RNA ολιγονουκλεοτίδια αναμίχθηκαν σε ένα ρυθμιστικό ανόπτησης (5 mM Tris-HCl, ρΗ = 7.6, 10 mM NaCl) σε συγκέντρωση 5 μΜ. Το μίγμα επωάστηκε στους 95 ° C για 5 λεπτά σε ένα θερμικό ανακυκλωτή, και στη συνέχεια η θερμοκρασία μειώθηκε κατά 5 ° C για κάθε 5 λεπτά για να επιτραπεί ο σχηματισμός διπλής όψης. Τα προκύπτοντα δίπολα ελέγχθηκαν σε ένα πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 20% και οπτικοποιήθηκαν μέσω χρώσης SYBR Gold (Molecular Probes, Eugene, OR, USA).

FRET Δοκιμασία

Οι μετρήσεις φθορισμού διεξήχθησαν σε ρυθμιστικό FRET (0,01 Μ Tris-HCl, ρΗ 7.4, 0.002 MgCl

2), χρησιμοποιώντας ένα QuantaMaster 30 φασματοφθοριόμετρο (Photon Technology International, Birmingham).

Σε 2 ml FRET ρυθμιστικό διάλυμα, 10 ηΜ RNA duplex προστέθηκε υπό συνεχή ανάδευση. Το μήκος κύματος διέγερσης ορίστηκε στα 480 nm, και το σήμα φάσμα εκπομπής μετρήθηκε μεταξύ 500 ως 650 nm. Μία αύξηση στην εκπομπή φθορισμού στα 515 nm δείχνει την πρόοδο της διάσπασης RNA. Ένα παράδειγμα των δεδομένων που συλλέγονται παρουσιάζονται στο Σχήμα 2C.

Για την κανονικοποίηση των δεδομένων, ένα άθικτο 13 bp siRNA αναλύθηκε ως μάρτυρας διπλής όψης, και μια εντελώς διασπαστεί siRNA συμπεριλήφθηκε ως μάρτυρας υποβάθμιση. Οι εντάσεις φθορισμού FAM μετατράπηκαν ως αναλογία αποδόμησης καθορίζοντας κάτω και άνω εντάσεις φθορισμού ως 0% και 100%. Η μέθοδος ομαλοποίηση αναφέρθηκε στο Σχήμα 3. Το φθορίζον αναγνώσεις προσαρμόσθηκαν στην εξίσωση απλής εκθετικής (κόκκινη γραμμή) για να ληφθεί η σταθερά ρυθμού Κ

obs. Τοις εκατό υποβάθμιση σε μια δεδομένη στιγμή υπολογίστηκε ως 100 × ΔF /ΔF

max (Εικόνα 3Α).

Για να διασφαλιστεί η RNase-free κατάσταση, θέσαμε το μήκος κύματος διέγερσης στα 480 nm, και εξέτασε την εκπομπή μεταξύ 500 ως 650 nm του ακέραιου υποστρωμάτων. Ακέραια υπόστρωμα εμφανίζει χαμηλό σήμα στα 515 nm και υψηλό σήμα στα 575 nm, ενώ υποβαθμισμένη προϊόντα οδηγεί σε αυξημένα σήματα στα 515 nm.

Σύμφωνα με την παραπάνω περιγραφή, όταν η διπλή επισημασμένη 13-bp siRNA σε 2 ml FRET ρυθμιστικό διάλυμα αναμιγνύεται με διάλυμα ή ορό δείγματα RNase Α, ο φθορισμός του FAM θα ​​αυξηθεί. Η αλλαγή του φθορισμού παρακολουθήθηκε συναρτήσει του χρόνου με το μήκος κύματος διέγερσης ορίζεται σε 480 nm και εκπομπή στα 515 nm. Για κινητική μονού κύκλου εργασιών ανάλυσης, το ποσοστό σταθερά k

obs και το πλάτος της μέγιστης υποβάθμιση F

max προήλθε από την τοποθέτηση των πειραματικών δεδομένων με την ενιαία-εκθετική εξίσωση:.

Αναγνώριση της RNase διάσπαση τοποθεσίες

Για να εντοπίσουμε RNase θέσεις διάσπασης, προϊόντων αποδόμησης dsRNA εξήχθησαν και κλωνοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ως κιτ εκχύλισης πηκτής εμπορικό κέντρο RNA και κιτ κλωνοποίησης από TaKaRa (Κιότο, Ιαπωνία).