Αφηρημένο

Fhit πρωτεΐνη χάνεται ή μειώνεται σε ένα μεγάλο μέρος των ανθρώπινων όγκων, και την αποκατάσταση της προκαλεί απόπτωση και καταστέλλει το σχηματισμό όγκων ή εξέλιξη σε προκλινικά μοντέλα. Εδώ, περιγράφουμε την ταυτοποίηση των υποψήφιων Fhit-πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με τον εντοπισμό κυτοσολικά και πλάσματος μεμβράνης. Μεταξύ αυτών, αννεξίνη 4 (ANXA4) ελέγχθηκε με συν-ανοσοκατακρήμνιση και συνεστιακή μικροσκοπία ως εταίρος αυτού του μυθιστορήματος συμπλόκου πρωτεΐνης Fhit. Εδώ αναφέρουμε ότι η υπερέκφραση του Fhit αποτρέπει αννεξίνης A4 μετατόπιση από το κυτοσόλιο στη μεμβράνη του πλάσματος σε Α549 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα που έλαβαν θεραπεία με πακλιταξέλη. Επιπλέον, η χορήγηση paclitaxel σε συνδυασμό με Ad

FHIT

δρα συνεργικά για να αυξήσουν το αποπτωτικό ποσοστό των καρκινικών κυττάρων και

in vitro

και

in vivo πειράματα

.

Παράθεση: Gaudio Ε, Paduano F, Spizzo R, Ngankeu Α, Zanesi Ν, Gaspari M, et al. (2013) Fhit Delocalizes Annexin A4 από μεμβράνη του πλάσματος σε κυτοσόλιο και ευαισθητοποιεί κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα με πακλιταξέλη. PLoS ONE 8 (11): e78610. doi: 10.1371 /journal.pone.0078610

Επιμέλεια: Srikumar Π Chellappan, πανεπιστήμιο του Catanzaro, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26 του Μαρτίου 2013? Αποδεκτές: 14η, Σεπτεμβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 6 Νοεμβρίου του 2013

Copyright: © 2013 Gaudio et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το παρόν έργο υποστηρίχθηκε από AIRC (Associazione Italiana Ricerca Cancro) και το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) CA152758 επιχορήγησης (CMC). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το

FHIT

γονίδιο, που περιλαμβάνει

FRA3B

, το πιο ενεργό κοινή εύθραυστη θέση στο χρωμόσωμα 3p14.2 [1], [2] είναι μέλος της τριάδας ιστιδίνης (ΙΜΕΤ) οικογένεια πρωτεϊνών, που περιλαμβάνει μια ομάδα νουκλεοτιδίων δεσμευτική και υδρόλυση πρωτεϊνών με τριάδας ιστιδίνης μοτίβα, εκπροσωπείται σε όλους τους οργανισμούς [3].

FHIT

κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη καταστολέας των όγκων των οποίων η απώλεια εμπλέκεται σε ένα μεγάλο κλάσμα των καρκίνων? Στην πραγματικότητα, η διαγραφή ή η απώλεια της έκφρασης της έχει αναφερθεί στο κεφάλι και το λαιμό [4], [5], γαστρεντερικές [6], του τραχήλου της μήτρας [7], του πνεύμονα [8], του μαστού [9], [10], και αιμοποιητικών όγκους [11]. Ο ρόλος των Fhit στην ογκογένεση επιβεβαιώθηκε σε ποντίκια, όπου

Fhit

γενετική εκτομή ως αποτέλεσμα την αυξημένη ευαισθησία σε ένα ευρύ φάσμα των αυθόρμητων όγκων [12], [13]. Επιπλέον, η διαγραφή είτε από ένα είτε και τα δύο

Fhit

αλληλόμορφα σε ποντικούς αυξημένη ευαισθησία προς την καρκινογόνο Ν-nitrosomethylbenzylamine (ΝΜΒΑ), με τα περισσότερα

Fhit

– /-

και

Fhit

+/- ποντίκια ανάπτυξη όγκων προστόμαχο (αδενώματα, θηλώματα, και διηθητικά καρκινώματα) μετά από μία δόση ΝΜΒΑ σε σύγκριση με ελέγχους άγριου τύπου [12], [14], η οποία αναπτύχθηκε πολύ λίγα. Είναι ενδιαφέρον ότι,

FHIT

χρησιμοποιήθηκε επίσης με επιτυχία ως θεραπευτικό γονίδιο σε κυτταρικές σειρές καρκίνου, όπου ενεργοποιεί την απόπτωση, και πολλά προκλινικά μοντέλα

FHIT

-null καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα, του οισοφάγου, του παγκρέατος, του μαστού και λευχαιμία [15] – [20]. Ωστόσο, οι εκθέσεις σχετικά με τους μηχανισμούς της Fhit λειτουργίας καταστολής ήταν πιο αραιά και πιο πρόσφατα. Fhit κωδικοποιεί μια πολυφωσφορικά diadenosine (Apna) υδρολάσης που διασπά υποστρώματα όπως diadenosine

P

1,

P

3 τριφωσφορική (ApppA) και diadenosine 5 ‘, 5’ ‘ «-

P

1,

P

4-τετραφωσφορικό (AppppA) για AMP συν το άλλο νουκλεοτίδιο [21], [22]. Μέσω αδενοϊική έκφραση του

FHIT

μεταλλαγμένα αλληλόμορφα, αποδείξαμε ότι η δέσμευση Fhit-υποστρώματος είναι περιοριστική για την καταστολή του όγκου, ενώ η καταλυτική του δράση δεν απαιτείται για την ικανότητα να ενεργοποιεί Fhit απόπτωση [23]? Επιπλέον, δείξαμε ότι η εξαιρετικά διατηρημένη Fhit τυροσίνη 114 (Y114), που μπορεί να φωσφορυλιωθεί από Src [24], είναι απαραίτητη για να προκαλέσει την κασπάση-εξαρτώμενη Fhit απόπτωση [25]. Πιο πρόσφατα, με τη χρήση ενός πρωτεομική προσέγγιση, ταυτοποιήσαμε ένα σύμπλοκο πρωτεΐνης Fhit συμπεριλαμβανομένων Hsp60 και Ηδρ10, η οποία μπορεί να μεσολαβήσει τόσο σταθερότητα Fhit και μιτοχονδριακή εντοπισμός του? μια φορά στα μιτοχόνδρια, Fhit δεσμεύει και σταθεροποιεί φερρεδοξίνη αναγωγάση (Fdxr), που οδηγεί στην ρύθμιση της παραγωγής δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS), ένα πρώιμο στάδιο στην Fhit επαγόμενη απόπτωση [26]. Τα στοιχεία του Fhit μιτοχονδριακού εντοπισμού οδήγησε επίσης στην ανακάλυψη ότι αυξάνει την συσσώρευση του Ca2 + μέσα στο οργανίδιο, σε συμφωνία με το ρόλο της στην απόπτωση υπό κατάλληλες συνθήκες [27].

Η ευρεία υποκυτταρική κατανομή της Fhit μας ενθάρρυνε να συνεχίσει την αναζήτηση εταίρων μυθιστόρημα Fhit πρωτεΐνης σε περαιτέρω ρίξει φως σχετικά με το ρόλο της στην καταστολή των όγκων. Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι Fhit αλληλεπιδρά με Annexin 4? Αυτή η αλληλεπίδραση μπορεί να εμποδίσει την μετατόπιση αννεξίνης 4 από το κυτοσόλιο στη μεμβράνη του πλάσματος κατά τη διάρκεια της θεραπείας του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων με πακλιταξέλη. Κατά συνέπεια, η εξωγενής

FHIT

αποκατάσταση σε

FHIT

-null καρκινικά κύτταρα δρα συνεργικά με πακλιταξέλη σε πυροδότηση της απόπτωσης

in vitro

και την υποχώρηση του όγκου

in vivo

. Λαμβανόμενα μαζί τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι η αποκατάσταση Fhit θα μπορούσε να έχει ένα ρόλο στην υπερνίκηση της αντίστασης στα φάρμακα και ότι συνδυασμό με paclitaxel μπορεί παριστάνει μια έγκυρη προσέγγιση για τη θεραπεία του καρκίνου.

Αποτελέσματα

Απομόνωση συμπλοκών πρωτεΐνης Fhit από κύτταρο μεμβράνες

Στην προηγούμενη πρωτεομική προσέγγιση μας, απομονώσαμε ένα διαλυτό σύμπλοκο πρωτεΐνης Fhit από καρκίνο του Α549 κύτταρα [26]. Με τη χρήση μιας ελαφρώς τροποποιημένη προσέγγιση, με στόχο τον προσδιορισμό Fhit-πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν στις κυτταρικές μεμβράνες, χρησιμοποιήσαμε ένα ανασυνδυασμένο αδενοϊό που φέρει ένα

FHIT

cDNA τροποποιηθεί στο 3 ‘άκρο με μια αλληλουχία που κωδικοποιεί μια ετικέτα ιστιδίνης-έξι επίτοπο ( διαφήμισης

FHIT-

His6), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Εν συντομία, Α549 πνεύμονα καρκινικά κύτταρα μολύνθηκαν είτε με διαφημίσεων

FHIT

(που χρησιμοποιείται ως μάρτυρας) ή διαφήμισης

FHIT-

His6 σε MOI50 και αντιμετωπίζονται με διθειοδις [σουκκινιμιδυλπροπιονικό] (DSP), ένας σταυρός -συνδετήρας που διασχίζει τις μεμβράνες και τις διορθώσεις των πρωτεϊνών σε σύνθετα στα ζωντανά κύτταρα. Τα κύτταρα λύθηκαν και μεμβράνη εμπλουτισμένο κλάσμα απομονώθηκε? Fhit-His6 ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη, μαζί με τους εταίρους της πρωτεΐνης υποψήφιος απομονώθηκε με χάντρες νικέλιο Avid για την ετικέτα επιτόπου His6. Καθαρισμένες πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διθειοθρεϊτόλη (DTT) για να διασπάσει DSP και διαχωριστεί το σύμπλεγμα, και υπέστη πέψη με θρυψίνη? πρωτεϊνικά συστατικά ταυτοποιήθηκαν με υγρή /χρωματογραφία διαδοχικής φασματομετρίας μάζας (LC-MS /MS). Μετά την ταυτοποίηση πρωτεϊνών από την αναζήτηση της βάσης δεδομένων, τον έλεγχο των δεδομένων LC-MS /MS είχε αναλάβει να εκτιμήσει την αποκλειστική παρουσία της μάζας κορυφές που ανήκουν σε πρωτεΐνες υποψήφιο εταίρο σε δείγματα από κύτταρα μολυσμένα με διαφημίσεων

FHIT-

His6. Οι πρωτεΐνες προσδιορίζονται παρατίθενται στον Πίνακα 1.

Η

Fhit πρωτεΐνη αλληλεπιδρά με Annexin 4

Έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι η απουσία Fhit πρωτεΐνης σε καρκινικά κύτταρα οδήγησε σε αντίσταση στην πακλιταξέλη [28] ? Αννεξίνη 4, μια πρωτεΐνη τόσο με πλασματική μεμβράνη και κυτταροπλασματική εντόπιση, έχει αναφερθεί ότι υπερεκφράζεται σε πολλά καρκινικά κύτταρα? Ειδικότερα, έχει αποδειχθεί ότι η αννεξίνη 4 υπερέκφραση συμβάλλει σε καρκινικά κύτταρα ανθεκτικά σε πακλιταξέλη [29]. Έτσι, για να ρίξει φως στους μηχανισμούς της ανθεκτικότητας στα φάρμακα σε

FHIT

-μείον καρκινικά κύτταρα, αποφασίσαμε να επικεντρωθεί σε αννεξίνη 4 από τα πρόσφατα εντοπίστηκαν υποψήφιων εταίρων Fhit. Annexin 4 ανήκει σε μια υπερ-οικογένεια στενά συνδεδεμένων ασβέστιο και μεμβράνη πρωτεΐνες δεσμεύσεως που συμμετέχουν σε μια ποικιλία κυτταρικών λειτουργιών, συμπεριλαμβανομένης της εμπορίας κυστίδιο, την κυτταρική διαίρεση, απόπτωση, σηματοδότηση ασβεστίου και ρύθμιση της ανάπτυξης. Έχει προταθεί ότι μερικές αλλαγές στην έκφραση αννεξίνης κατά την διάρκεια ογκογένεσης μπορεί να οδηγήσει σε αντίσταση στους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες και ότι οι μεμονωμένες αννεξίνες μπορούν να αποδειχθούν θεραπευτικοί στόχοι [30] – [35]. Το 4 (ANX4) γονίδιο αννεξίνης κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη (δηλαδή, ANX4 ή Α4) που εκφράζεται σχεδόν αποκλειστικά σε επιθηλιακά κύτταρα [31] και υπερεκφράζεται κατά την διάρκεια της θεραπείας πακλιταξέλη και σε πακλιταξέλη ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές? επιμόλυνση ANX4 cDNA σε κύτταρα 293 Τ οδήγησε σε τριπλάσια αύξηση στην αντίσταση paclitaxel [29], [36]. Συσχετισμός μεταξύ της παρουσίας αννεξίνης 1 (ANX1) και MDR (Multi αντίσταση στο φάρμακο) πρωτεϊνών σε καρκινικά κύτταρα του μαστού, εφόσον η πρώτη άμεση απόδειξη για ένα ρόλο ενός αννεξίνης αντοχή πολυφαρμάκου [37].

Για να αξιολογηθεί Fhit και Αννεξίνη 4 αλληλεπίδραση, πραγματοποιήσαμε ένα πείραμα συν-ανοσοκαθίζηση χρησιμοποιώντας προϊόντα λύσης πρωτεΐνης που παρασκευάζεται όπως περιγράφεται παραπάνω (σχήμα 1, Α και Β). Fhit και Αννεξίνη 4 colocalization ερευνήθηκε με συνεστιακή μικροσκόπηση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Ε, τόσο Fhit και Αννεξίνη 4 δείχνουν κυρίως κυτταροπλασματική υποκυτταρική colocalization.

A. καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549 μολύνθηκαν με διαφημίσεων

FHIT

-wild τύπου ή διαφημίσεων

FHIT-

His6 σε MOI50? 48 ώρες μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DSP και λύθηκαν με Mem-PER ευκαρυωτικοί Membrane Protein Kit Εκχύλιση να παρέχουν συνολική λύματα εμπλουτισμένο στο κλάσμα μεμβράνης. Σύνολο κυτταρολύματα ανοσοκαταβυθίστηκαν με σφαιρίδια νικελίου. Τα ανοσοϊζήματα αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση (ΙΒ) με αντι-Fhit και αντισώματα αντι-αννεξίνης Α4. Β κύτταρα Α549 διαμολύνθηκαν παροδικά με ένα πλασμίδιο έκφρασης που κωδικοποιεί θηλαστικών

Annexin4-

V5 (8 μg). 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DSP και συνολικό προϊόντα λύσης ανοσοκαταβυθίζονται (ΙΡ) με αντι-V5 αντισώματος. Τα ανοσοϊζήματα ανιχνεύθηκαν με ανοσοστύπωση (ΙΒ) με αντι-Fhit και αντι-αννεξίνης 4 αντισώματα. CD. κύτταρα ΗΕΚ293 υποβλήθηκαν ψευδο tretated ή υφισταται επεξεργασία με πακλιταξέλη για 24 ώρες (800 ηΜ) και λύθηκαν. Η συνολική πρωτεΐνη προϊόντα λύσης Immunoprecipited με IgG, Fhit και αννεξίνη 4 αντισώματα, όπως υποδεικνύεται. Η ανίχνευση της ενδογενούς αννεξίνης 4 και Fhit διεξήχθη χωρίς την χρήση του DSP σταυροειδών δεσμών.

Η

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α και 1Β, Fhit και αννεξίνη 4 αλληλεπίδραση κυρίως ανιχνεύθηκε σε εκχυλίσματα κυτταρολύματος. Έχουμε περαιτέρω διενεργούνται πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης στην ενδογενή Fhit και Annexin 4 πρωτεϊνών σε κύτταρα ΗΕΚ293 και αποδείξαμε την αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών των πρωτεϊνών και στην απουσία του DSP σταυροειδών δεσμών, είτε με ή χωρίς πακλιταξέλη (Σχήματα 1C και 1D). Η ανοσοκαθίζηση πραγματοποιήθηκε με αντίσωμα Fhit που ακολουθείται από μια ανοσοαποτύπωση πραγματοποιήθηκε με Annexin 4 αντιορό, ήταν σαφώς υποδηλώνουν μια Fhit-αννεξίνης 4 ενδογενές σύμπλεγμα σε άθικτα cells.The άμεσο τρόπο από τις ΠΕ μεταξύ ενδογενείς πρωτεΐνες ήταν σαφώς ενδεικτική της αλληλεπίδρασης (ΠΕ : Fhit, και ΙΒ: Annexin 4). Δυστυχώς, λόγω τεχνικών δυσχερειών που οφείλονται στην συν-μετανάστευση των IgG και πρωτεΐνη Fhit, την αντίστροφη προσέγγιση, που είναι η ανοσοκαθίζηση της ενδογενούς πρωτεΐνης αννεξίνης 4 ακολουθούμενη από ανίχνευση Fhit, ήταν unsuccessuful.

Fhit μπλοκ υπερέκφραση Αννεξίνη 4 μετατόπιση από το κυτοσόλιο στη μεμβράνη του πλάσματος

Fhit και η έκφραση πρωτεΐνης αννεξίνης 4 αξιολογήθηκε σε ένα πάνελ καρκινικών κυτταρικών γραμμών (σχήμα S1), η έκφραση Fhit χάνεται στις περισσότερες κυτταρικές γραμμές διερευνήθηκαν. Για να ρίξει τα φώτα για το νόημα του συγκροτήματος Fhit-αννεξίνης 4 πρωτεΐνη, πραγματοποιήσαμε πειράματα μας σε δύο από αυτούς, Α549 και Calu-2, τα οποία δείχνουν μικρή ή καθόλου έκφραση Fhit, αντίστοιχα. Για να καθοριστεί καλύτερα η υποκυτταρική εντόπιση του συγκροτήματος Fhit-αννεξίνης 4 πρωτεΐνη, πραγματοποιήσαμε κυτταρική πειράματα κλασματοποίησης. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 2Α και 2C, βασικοκυτταρικό Annexin 4 διανέμεται τόσο κυτοσόλιο και πλάσματος μεμβράνης. Θεραπεία της Α549 και Calu-2 καρκινικά κύτταρα πνεύμονα με επαγόμενη πακλιταξέλη εξάντληση κυτοσολικό αννεξίνης 4 που υποβλήθηκε σε μια φαινομενικά πλήρη μετάθεση στην εσωτερική πλευρά του μεμβράνης πλάσματος. Fhit υπερέκφραση μπλοκαριστεί Annexin 4 μετατόπιση από το κυτοσόλιο στη μεμβράνη του πλάσματος, που παρατηρούνται μετά τη χορήγηση paclitaxel. Για να δείξουμε ότι τα αποτελέσματα οδηγήθηκαν ειδικά από τον 4 αλληλεπίδραση Fhit-αννεξίνης, ένα παρόμοιο πείραμα πραγματοποιήθηκε λαμβάνοντας υπόψη την υποκυτταρική εντόπιση αννεξίνης 1 και MDR (πρωτεΐνη αντίστασης πολλών φαρμάκων), τα οποία εμπλέκονται αμφότερα στην αντίσταση στη χημειοθεραπεία [37] , [38]. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 2Β και 2D, ούτε Annexin εγώ ούτε MDR υποκυτταρικούς εντοπισμούς επηρεάστηκαν από Fhit υπερέκφραση. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι Fhit πρωτεΐνη παρεμβαίνει ειδικά με Annexin 4 μετατόπιση από το κυτοσόλιο στη μεμβράνη του πλάσματος, που παρατηρούνται σε πακλιταξέλη επεξεργασμένα Α549 και κύτταρα Calu-2.

A-C. Α549 και Calu-2 καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα μολύνθηκαν με διαφημίσεων

GFP

ή διαφήμισης

FHIT

σε MOI50? 48 ώρες αργότερα, τα κύτταρα ήταν ψευδο-κατεργασμένα ή κατεργασμένα με paclitaxel (800 ηΜ) για επιπλέον 24 ώρες. Πρωτεΐνες από κλάσματα κυτοσολίου και μεμβράνης διαχωρίστηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου, μεταφέρθηκαν σε φίλτρο νιτροκυτταρίνης, και ανιχνεύθηκαν με Annexin 4 αντίσωμα. GAPDH και Ε-καδερίνη χρησιμοποιήθηκαν για την κανονικοποίηση πρωτεΐνη φόρτωση των πρωτεϊνών κυτοσολίου και της μεμβράνης του πλάσματος, αντίστοιχα. B-D. Α549 και Calu-2 καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα μολύνθηκαν με διαφημίσεων

GFP

ή διαφήμισης

FHIT

-wild τύπου? 48 ώρες αργότερα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με πακλιταξέλη (800 ηΜ) για επιπλέον 24 ώρες. Πρωτεΐνες από κλάσματα κυτοσολίου και μεμβράνης διαχωρίστηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου, μεταφέρθηκαν σε φίλτρο νιτροκυτταρίνης, και ανιχνεύθηκαν με Αννεξίνη 1 και MDR (πρωτεΐνη αντοχής πολυ-φαρμάκου) αντισώματα. GAPDH και Ε-καδερίνη χρησιμοποιήθηκαν για την κανονικοποίηση πρωτεΐνη φόρτωση των πρωτεϊνών κυτοσολίου και της μεμβράνης του πλάσματος, αντίστοιχα.

Η

Annexin 4 εξάντληση συνδυασμό με Fhit υπερέκφραση και αγωγή με πακλιταξέλη επάγει συνεργικά αναστολή πολλαπλασιασμού και προκαλεί απόπτωση των κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα

για να ερευνηθεί ο ρόλος του Fhit μεσολάβηση μπλοκ αννεξίνης 4 μετατόπιση από το κυτοσόλιο στη μεμβράνη του πλάσματος στο μηχανισμό της ανθεκτικότητας στα φάρμακα, εκτελέσαμε καμπύλες ανάπτυξης των κυττάρων υπό διαφορετικές συνθήκες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α και 3Β για Α549 και Calu-2 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα, του αριθμού των κυττάρων μειώθηκε σε Ad

FHIT-

μολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με ελέγχους? ένα ελαφρώς ισχυρότερη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης παρατηρήθηκε σε κύτταρα επεξεργασμένα με πακλιταξέλη. Τέλος, σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές [26], παρατηρήσαμε μια συνεργιστική δράση επί της αναστολής ρυθμό πολλαπλασιασμού σε κύτταρα Α549 που έλαβαν θεραπεία με πακλιταξέλη συν διαφημίσεων

FHIT

. Σε ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα που απεικονίζεται στο Σχήμα 3C, κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε για να ερευνήσει τις διαταραχές του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα Α549 μολύνθηκαν με Ad

FHIT

, με (800 ηΜ για 24 ώρες) ή χωρίς αγωγή με πακλιταξέλη? Τα κύτταρα Α549 μολύνθηκαν με Ad

FHIT

έδειξε μία κορυφή υπο-G1 ήταν ανιχνεύσιμο (13%), σε συμφωνία με προηγούμενα ευρήματα μας [26]? ένα παρόμοιο αποτέλεσμα λήφθηκε μετά από 800 ηΜ χορήγηση paclitaxel. Μια συνεργική επίδραση ανιχνεύθηκε μετά από το συνδυασμό διαφήμισης

FHIT

και αγωγή με πακλιταξέλη (25% του κλάσματος υπο-G1).

Α-Β. Α549 και Calu-2 κύτταρα ψευδο-μολύνθηκαν, διαφημίσεων

GFP

ή διαφημίσεων

FHIT

μολυσμένων κυττάρων σε MOI10 για 24 ώρες, στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς 800 ηΜ πακλιταξέλη για επιπλέον 6 ώρες και μετρήθηκαν . ιστογράμματα δείχνουν μέση τιμή ± SEM για τιμές από τρία διαφορετικά πειράματα (* P & lt? 0,05). Η methos Chou-Talalay εφαρμόστηκε για τον υπολογισμό της φύσης των συνδυασμών (CI & lt? 1, συνέργεια). Γ κύτταρα Α549 ήταν είτε ψευδο-μολυσμένα ή μολυσμένα με διαφημίσεων

GFP

ή διαφήμισης

FHIT

, ή αφεθεί χωρίς θεραπεία ή θεραπεία με 800 nM πακλιταξέλη, και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η αποκατάσταση της λειτουργίας Fhit να Fhit αρνητικά κακοήθη κύτταρα, σε συνδυασμό με πακλιταξέλη, μπορεί να αντιπροσωπεύει μια πιθανή νέα προσέγγιση για τη θεραπεία των ασθενών που πάσχουν από καρκίνο του πνεύμονα. Στην πραγματικότητα, μειώνοντας το όριο ευαισθησίας από τη χορήγηση του φαρμάκου σε Annexin 4 μεσολάβηση στη χημειοθεραπεία όγκων, την αποκατάσταση Fhit μπορεί να αντιπροσωπεύουν μια ενδιαφέρουσα προσέγγιση για την απόκτηση μια καλύτερη έκβαση των ασθενών.

Για να διαπιστώσετε εάν η αλληλεπίδραση μεταξύ Fhit και Αννεξίνη 4 θα μπορούσε να έχει ένα ρόλο στην μεσολάβηση Fhit αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης και της απόπτωσης, αννεξίνη 4 σίγησε με μικρά RNAs παρεμβολής (siRNAs) που έχουν σχεδιαστεί για να εμποδίσει την έκφραση της πρωτεΐνης αννεξίνης 4. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4Α, τα επίπεδα Annexin 4 έκφρασης πρωτεΐνης μειώθηκαν σημαντικά μετά Annexin 4 siRNAs επιμόλυνση, σε απουσία ή παρουσία πακλιταξέλης. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες [36], ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα και κύτταρα επιμολυσμένα με περιπλεγμένο siRNAs έδειξε Annexin 4 πρωτεΐνη αναρρύθμιση μετά τη χορήγηση paclitaxel σε σύγκριση με τους μάρτυρες, ενώ δεν παρατηρήθηκαν αλλαγές στην Α549 Annexin 4-εξαντλημένο δειγμάτων είτε σε απουσία ή παρουσία του paclitaxel. Ο συνδυασμός της θεραπείας με paclitaxel Annexin 4 εξάντληση είχε συνεργιστική επίδραση στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, με τον αριθμό των κυττάρων που είναι σημαντικά χαμηλότερο σε σύγκριση με την θεραπεία με πακλιταξέλη ή αννεξίνη 4-ειδικά siRNA μόνο του (Σχήμα 4Β). Καμία επίδραση επί του πολλαπλασιασμού παρατηρήθηκε μετά από επιμόλυνση με κωδικοποιημένα τα siRNA. Δοκιμάσαμε επίσης ρυθμό πολλαπλασιασμού Α549 κυττάρων μετά Annexin 4 σιγαστήρα ή μόλυνση με Ad-

FHIT

σε MOI25 ή συνδυασμό θεραπειών (Σχήμα 4C). Αννεξίνη 4 εξάντληση και Fhit υπερέκφραση προκάλεσε σημαντική μείωση του αριθμού των κυττάρων σε σύγκριση με ελέγχους? Μια περαιτέρω δραματική μείωση του αριθμού των κυττάρων παρατηρήθηκε με την προσθήκη paclitaxel, υποδεικνύοντας μία συνεργική δράση.

A. Α549 κύτταρα ψευδο-επιμολυσμένα ή επιμολυσμένα με αννεξίνη 4 siRNAs (50 ηΜ) ή ως κωδικοποιημένο siRNAs (50 ηΜ) για 72 ώρες. Τα κύτταρα λύματα ανοσοστυπώθηκαν με Annexin 4 και αντισώματα GAPDH. B. Α549 κύτταρα ψευδο-επιμολυσμένα ή επιμολυσμένα με αννεξίνη 4 siRNAs (50 ηΜ) ή ως κωδικοποιημένο siRNA (50 ηΜ), μολυσμένα με Ad

FHIT

στο MOI25 για 72 ώρες, και στη συνέχεια αφεθεί χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με πακλιταξέλη ( 800 ηΜ). Τα κύτταρα πρώτα μετρήθηκαν στις 12 ώρες μετά την αγωγή με πακλιταξέλη. ιστογράμματα δείχνουν μέση τιμή ± SEM για τιμές από 3 πειράματα (* P & lt? 0,05). Η methos Chou-Talalay εφαρμόστηκε για τον υπολογισμό της φύσης των συνδυασμών (CI & lt? 1, συνέργεια). Γ Α549 κύτταρα ψευδο-επιμολυσμένα ή επιμολυσμένα με αννεξίνη 4 siRNA (50 ηΜ) ή ως κωδικοποιημένο siRNAs (50 ηΜ) για 72 ώρες, στη συνέχεια χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με πακλιταξέλη. Τα κύτταρα πρώτα μετρήθηκαν 12 ώρες μετά την αγωγή με πακλιταξέλη. ιστογράμματα δείχνουν μέση τιμή ± SEM για τιμές από 3 πειράματα (* P & lt? 0,05). Η methos Chou-Talalay εφαρμόστηκε για τον υπολογισμό της φύσης των συνδυασμών (CI & lt? 1, συνέργεια). D. κύτταρα Α549, επεξεργασία όπως περιγράφεται στο Β και C, αναλύθηκαν με δοκιμασία TUNEL.

Η

Μια δοκιμασία TUNEL επιβεβαίωσε ότι όλοι οι πληθυσμοί υπο-G1 περιγράφεται στην Εικόνα 3C ήταν κατά κύριο λόγο αποτελείται από αποπτωτικών κυττάρων (Σχήμα 4D). Επιπλέον, επίσης και οι επιδράσεις επί της αναστολής του πολλαπλασιασμού των κυττάρων παραλληλίζονται από αποτελέσματα προσδιορισμού TUNEL? Στην πραγματικότητα, η απόπτωση έφτασε στο υψηλότερο βαθμό της σε Annexin 4-εξαντλημένα κύτταρα μολυσμένα με διαφημίσεων

FHIT

και αντιμετωπίστηκαν με πακλιταξέλη (Σχήμα 4D).

Fhit /Αννεξίνη 4 αλληλεπίδραση συν επάγεται πακλιταξέλη υποστροφή του όγκου σε ένα προκλινικό μοντέλο καρκίνου του πνεύμονα

για να ερευνηθούν τα αποτελέσματα της αλληλεπίδρασης Fhit /Αννεξίνη A4

in vivo

με ή χωρίς πακλιταξέλη σε ένα προκλινικό μοντέλο καρκίνου του πνεύμονα, πραγματοποιήσαμε ένα πείραμα σε 11 ομάδες ποντίκια (η = 5 ποντικοί /ομάδα). Ιδρυματική φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση (IACUC) στο Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο ενέκρινε την εν λόγω μελέτη. Τρεις ομάδες υποδόρια ένεση με 1 × 10

κύτταρα 7 Α549. Όταν οι όγκοι έφθασαν διαμέτρου 15 mm, που τα ποντίκια ήταν ψευδο-κατεργασμένα, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DMSO ή επεξεργασμένα με ένα μόνο ενδοφλέβια χορήγηση 40 mg /kg πακλιταξέλης? ποντικοί παρακολουθούνται σε τακτική βάση. Τρεις ημέρες αργότερα, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και οι όγκοι αξιολογήθηκαν κατά βάρος. Οι όγκοι από ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με paclitaxel εμφάνισαν μείωση κατά 50% σε σύγκριση με τους ελέγχους. Αυτό το σύντομο χρονικό σημείο μας επέτρεψε να μεγεθύνει τα αποτελέσματα των δύο μονά tretaments και ο συνδυασμός τους, όπως συμβαίνει με πλέον χρονικά σημεία τα αποτελέσματα της θεραπείας Fhit θα καλύπτονταν από paclitaxel. Δύο ομάδες ποντικών έλαβαν ένεση με 1 × 10

7 κύτταρα Α549 προ-μολυνθεί με τον διαφήμισης

GFP

ή διαφήμισης

FHIT

σε MOI50, και δύο ακόμη ομάδες έλαβαν ένεση με 1 × 10 κύτταρα

7 Α549 προ-μολυνθεί με τον διαφήμισης

FHIT

σε χαμηλή πολλαπλότητα μόλυνσης (MOI5)? μία από τις τελευταίες ομάδες ήταν επίσης σε επεξεργασία με πακλιταξέλη, όπως περιγράφεται παραπάνω. βάρος του όγκου έδειξε 83% μείωση σε σύγκριση με τους ελέγχους σε ποντίκια με ένεση διαφήμισης

FHIT

προ-μολυσμένα κύτταρα MOI50 έναντι μείωσης 27% στα ποντίκια με ένεση διαφήμισης

FHIT

MOI5? Είναι ενδιαφέρον, διαφήμισης

FHIT

MOI5 ξενομοσχεύματα που έλαβαν θεραπεία με πακλιταξέλη έδειξε υποχώρηση του όγκου έως 7% των όγκων ελέγχου, υποδεικνύοντας μία συνεργική δράση Fhit και πακλιταξέλη.

Για την ολοκλήρωση του πίνακα, δύο ομάδες ποντικών ένεση με Annexin 4-εξαντλημένο κύτταρα (ένα από τα οποία υποβλήθηκε σε επεξεργασία με πακλιταξέλη, όπως περιγράφεται παραπάνω) και δύο περισσότερες ομάδες με Annexin 4-εξαντλημένο κύτταρα προ-μολύνονται με Ad

FHIT

MOI5 (μία αγωγή με πακλιταξέλη). Annexin 4-εξαντλημένο κύτταρα έδειξαν μία μικρή αλλά όχι σημαντική μείωση όγκου σε σύγκριση με τους μάρτυρες, ενώ μεγαλύτερη μείωση παρατηρήθηκε σε Annexin 4-εξαντλημένο ξενομοσχεύματα που έλαβαν θεραπεία με πακλιταξέλη έναντι ξενομοσχευμάτων σε επεξεργασία με πακλιταξέλη μόνο (70% και 50%, αντίστοιχα). Τέλος, σχεδόν καθόλου όγκοι ανιχνεύθηκαν σε ποντίκια που έφεραν ξενομοσχεύματα με νοκ-κάτω αννεξίνη 4 προ-μολυνθεί με τον διαφήμισης

FHIT

MOI5 συν πακλιταξέλη. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων αυτών αναφέρονται στο σχήμα 5Α και 5Β. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά υπογραμμίζουν τη σημασία της αλληλεπίδρασης Fhit /Αννεξίνη 4

in vivo

και την ανάδειξη της αξίας των συνδυασμένων γονιδιακή θεραπεία και χημειοθεραπεία Fhit σε προκλινικά μοντέλα καρκίνου.

Α. Γυμνοί ποντικοί εγχύθηκαν υποδορίως με 1 χ 10

κύτταρα Α549 7. Μερικές ομάδες (η = 5 ποντικοί /ομάδα) εγχύθηκαν με ψευδο επεξεργασμένα κύτταρα, άλλοι με κύτταρα επιμολυσμένα με Annexin 4 siRNA ή μολυσμένα με Ad

FHIT

(MOI5 ή MOI50) ή συνδυασμούς και των δύο. Όταν οι όγκοι έφθασαν διαμέτρου 15 mm, που τα ποντίκια ήταν ψευδο-κατεργασμένα, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DMSO ή επεξεργασμένα με ένα μόνο ενδοφλέβια χορήγηση 40 mg /kg πακλιταξέλης? ποντικοί παρακολουθούνται σε τακτική βάση. Τρεις ημέρες μετά την ΡΤΧ, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και οι όγκοι αξιολογήθηκαν κατά βάρος. ιστογράμματα δείχνουν μέση τιμή ± SEM για τιμές από 5 ποντίκια (* P & lt? 0,05). Η methos Chou-Talalay εφαρμόστηκε για τον υπολογισμό της φύσης των συνδυασμών (CI & lt? 1, συνέργεια). Οι όγκοι των όγκων B. ανέφερε την πάροδο του χρόνου.

Η

Συζήτηση

Η απώλεια της έκφρασης Fhit κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης έχει αναφερθεί για τους περισσότερους τύπους καρκίνου στον άνθρωπο. Ο ρόλος της στη κακοήθεις νόσους υπογραμμίζεται από το γεγονός ότι η απώλεια Fhit είναι ένα πρώιμο συμβάν σε όγκους, όπως αναφέρθηκε για πνεύμονα προκαρκινικές αλλοιώσεις. Επίσης, η επιτυχής

FHIT

γονιδιακή θεραπεία σε μια σειρά από προκλινικά μοντέλα καρκίνου στον άνθρωπο κάνει Fhit πρωτεΐνη ένας καλός υποψήφιος για την αναζήτηση καινοτόμων θεραπειών [1]. Παρά τις προσπάθειες να διευκρινίσει πώς λειτουργεί Fhit πρωτεΐνη, τον καθορισμό συγκεκριμένων μηχανισμών μέσω των οποίων Fhit διαμορφώνει αποπτωτικών και άλλες λειτουργίες ογκοκατασταλτικό ήταν προκλητική. Αυτό οφείλεται κυρίως στο γεγονός ότι, μέχρι πριν από λίγα χρόνια, Fhit είχε καμία επιβεβαιωμένη πρωτεΐνη εταίρους που προσδιορίζονται από συμβατικές μελέτες με στόχο την απομόνωση των συμπλοκών πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Έχουμε ανέφεραν την απομόνωση Fhit-πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με μια προσέγγιση πρωτεωμικής [26]? η έρευνα οδήγησε στην απομόνωση και τον χαρακτηρισμό ενός διαλυτού συμπλόκου πρωτεΐνης Fhit περιέχουν Ηδρ10 /Hsp60 και φερρεδοξίνη αναγωγάση (Fdxr) μεταξύ άλλων μιτοχονδριακών πρωτεϊνών. Στην εν λόγω μελέτη, αποδείξαμε ότι συμπλόκου Ηδρ10 /Hsp60 συμμετείχε στη μετατόπιση του Fhit πρωτεΐνης στα μιτοχόνδρια, όπου η αλληλεπίδρασή της με Fdxr συμμετείχε στην διαμόρφωση της παραγωγής δραστικών ειδών οξυγόνου, το νωρίτερο βήμα Fhit απόπτωση που διαμεσολαβείται. Αυτή η προσέγγιση, με στόχο την ταυτοποίηση των συμπλόκων πρωτεΐνης, πρότεινε μελέτες παρακολούθησης για τον εντοπισμό άλλων αλληλεπιδρούν Fhit και λειτουργικά μονοπάτια σήμα τους. Σε υποκυτταρική κλασματοποίηση μελέτες, Fhit πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε σε όλα τα διαμερίσματα κυττάρου αλλά πυρήνα [26]. Έτσι, απομονώθηκαν νέα σύμπλοκα πρωτεΐνης Fhit από προϊόντα λύσης πρωτεΐνη Α549 εμπλουτισμένο σε κυτταρικές μεμβράνες. Η προσέγγιση αυτή παρήγαγε μια λίστα των υποψήφιων Fhit εταίρων, μερικά από τα οποία είχαν επίσης εντοπιστεί σε προηγούμενες αναλύσεις μας [26]. Μεταξύ αυτών των νέων υποψηφίων, αννεξίνη A4 (ANXA4) είχε αναφερθεί ότι παίζει ένα ρόλο στην αντοχή σε φάρμακα, με την έκφραση της αυξήθηκε σε κλώνους ανθεκτικά στην πακλιταξέλη [36], ένα φάρμακο που χρησιμοποιείται ευρέως για τη θεραπεία των ασθενών με καρκίνο. Όπως δείξαμε και στο παρελθόν ότι η ίδια Fhit εμπλέκεται στην υπερνίκηση αντίσταση paclitaxel [26], [27], αποφασίσαμε να διερευνήσει τη δυνατότητα αυτή συσχέτιση με περισσότερες λεπτομέρειες.

Η αλληλεπίδραση μεταξύ Fhit και την ανταπόκριση στη χημειοθεραπεία έχει προηγουμένως μελετηθεί από Ανδριανή et al [41]. Ειδικότερα, η έκφραση Fhit οδήγησε σε μειωμένη ευαισθησία σε ετοποσίδη, ντοξορουμπικίνη, και τοποτεκάνη. Αυτό το χαρακτηριστικό σχετίζεται με Fhit επαγόμενη μειορύθμιση των τοποϊσομερασών DNA Ι και II. Αντίθετα, η έκφραση Fhit παρήγαγε μια μικρή αύξηση στην ευαισθησία στη σισπλατίνη, όπως φαίνεται από ανιχνεύσεις σχηματισμού αποικιών [41].

Αδρανοποίηση των δύο γονιδίων FHIT και ΤΡ53 συχνά παρατηρείται σε πρωτογενείς μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα ( NSCLC) και κυτταρικές σειρές και μπορούν να συμβάλλουν στην ανθεκτικότητα σε αποπτωτικά ερεθίσματα που προκαλείται από διάφορα φάρμακα κατά του όγκου [42]. Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι η χορήγηση paclitaxel προκαλεί τόσο Annexin Α4 πάνω ρύθμιση και τροποποίηση του ενδοκυτταρική κατανομή του? Στην πραγματικότητα, μετά από αγωγή με πακλιταξέλη, αννεξίνη A4 μετακινείται από το κυτοσόλιο στη μεμβράνη του κυττάρου. Είναι ενδιαφέρον, Fhit υπερέκφραση σε Fhit-αρνητικό καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων αποτρέπει την μετατόπιση αννεξίνη Α4 από το κυτοσόλιο στη μεμβράνη του κυττάρου? Επιπλέον, η ταυτόχρονη θεραπεία του καρκίνου Α549 κυττάρων με Ad

FHIT

και πακλιταξέλη είναι πολύ πιο αποτελεσματική στην πρόκληση απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων σε σύγκριση με ελέγχους? ελήφθησαν παρόμοια αποτελέσματα με τη χορήγηση του paclitaxel σε αννεξίνης Α4-εξαντλημένο κύτταρα Α549. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι και οι δύο αννεξίνης Α4 υπερέκφραση και μεμβράνης πλάσματος υποκυτταρική εντόπιση του στην πακλιταξέλη ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα δεν είναι ένα φαινόμενο γειτνιάσεως, αλλά μάλλον διαδραματίζει ενεργό ρόλο στους μηχανισμούς αντοχής φαρμάκου? περαιτέρω έρευνες της λειτουργίας της αννεξίνης Α4 στην κυτταρική μεμβράνη μπορεί να ρίξει φως σχετικά με τους πολύπλοκους μηχανισμούς της ανθεκτικότητας στα φάρμακα σε ασθενείς με καρκίνο. Αυτές

in vitro

βρέθηκαν αποτελέσματα περαιτέρω υποστήριξη σε προκλινικό μοντέλο του καρκίνου του πνεύμονα? Στην πραγματικότητα, και οι δύο

FHIT

γονιδιακή θεραπεία και αννεξίνης Α4 εξάντληση ενήργησε συνεργικά με paclitaxel στην επαγωγή υποχώρηση του όγκου σε ποντικούς σε σύγκριση με τους ελέγχους? Αυτός ο συνδυασμός θα μπορούσε να είναι χρήσιμες ενδιαφέρον για την θεραπεία των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα. Εν κατακλείδι, η προηγούμενη και πρόσφατη έρευνα υπογραμμίζει την απώλεια Fhit, ένα κοινό χαρακτηριστικό στον καρκίνο του ανθρώπου, ως δείκτης της κακής πρόγνωσης σε ασθενείς με καρκίνο, γεγονός που υποδηλώνει ότι Fhit-αρνητικούς όγκους είναι επιρρεπείς στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας στα φάρμακα.

Υλικά και μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

τα ποντίκια διατηρήθηκαν και τα πειράματα σε ζώα που διεξάγονται στο πλαίσιο του θεσμικού τις κατευθυντήριες γραμμές που καθορίστηκαν για τη διευκόλυνση των ζώων στο Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο. Η μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου του Κρατικού Πανεπιστημίου του Οχάιο. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Animal Care and Use (IACUC) στο Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο (IACUC αριθμό πρωτοκόλλου: 2010A00000146? Ημερομηνία έγκρισης 08.15.2011). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις πραγματοποιήθηκε υπό αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Κυτταρική καλλιέργεια και διαμόλυνση πειράματα

Α549 κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στο κατάλληλο μέσο ανάπτυξης με συμπληρώματα προστίθενται όπως συνιστάται. Τα κύτταρα ΗΕΚ-293 χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή και την ενίσχυση των ανασυνδυασμένων αδενοϊών [18]. Οι επιμολύνσεις αννεξίνης 4 μικρά παρεμβαλλόμενα RNA (Smart πισίνα, Dharmacon) εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Ανοσοκηλίδωση και κλασματοποίηση ανάλυση

Σύνολο πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν με Nonidet Ρ40 (ΝΡ-40 ) ρυθμιστικού διαλύματος λύσης? πρωτεΐνες κυτοσολίου και μεμβράνη πλάσματος εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα FractionPREP-κυττάρων κλασματοποίησης (Biovision). Σύνολο προϊόντων λύσης με εμπλουτισμένο πρωτεϊνών μεμβράνης πλάσματος, που χρησιμοποιούνται τόσο για μαζική φασματομετρία και ανοσοκαταβυθίσεις αναλύσεις, ελήφθησαν χρησιμοποιώντας Mem-PER ευκαρυωτικοί Membrane Protein Extraction Kit (Pierce).

Για ανοσοστύπωση, οι πρωτεΐνες (50 μg) διαχωρίστηκαν επί πολυακρυλαμιδίου πηκτώματα και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες ηθμού νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 5% άπαχο ξηρό γάλα, επωάστηκε με πρωτογενές αντι-αννεξίνης 4, GAPDH, και αντισώματα Ε-καδερίνης (Santa Cruz Biotechnology), που ανιχνεύεται με τα κατάλληλα δευτερεύοντα αντισώματα, και αποκάλυψε με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL? Amersham Inc .).

πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης Ανάλυση

πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης, με ή χωρίς διθειοδις- [ηλεκτριμιδυλοπροπιονικό] (DSP), ένας παράγοντας σταυρωτής σύνδεσης από την Pierce, πραγματοποιήθηκαν μέσω επώασης 1 mg ολικής προϊόντα λύσης πρωτεΐνης (που περιέχει κλάσμα μεμβράνης πλάσματος εμπλουτισμένο) είτε με ΝΙΝ-TA σφαιρίδια αγαρόζης μαγνητικό νικέλιο (Qiagen) ή με αντι-V5 αντίσωμα συζευγμένο με σφαιρίδια Sepharose, όλη τη νύκτα στους 4 ° C? Μετά την πλύση, τα σφαιρίδια έβρασαν σε 1 × ρυθμιστικό δείγματος SDS και οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου 4-20% (Bio-Rad).

ανοσοφθορισμού

Α549 κύτταρα, προ-μολύνονται με Ad

FHIT

, σταθεροποιήθηκαν σε 4% PFA (παραφορμαλδεϋδη) για 10 λεπτά, διαπερατά 4 λεπτά με Triton 0,05% και αναλύθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία. Η ενδογενής Annexin 4 ανιχνεύθηκε με ένα πρωτεύον αντίσωμα από το BD? δευτερογενές αντίσωμα (594 nm) ήταν από την Molecular Probes.

In vitro ρυθμός ανάπτυξης

αξιολόγηση

κύτταρα Α549 σπάρθηκαν σε 1 × 10

5 κύτταρα ανά δίσκο διαμέτρου 60 mm και ψευδο-μολυσμένα ή έχουν μολυνθεί με διαφημίσεων

GFP

ή διαφήμισης

FHIT

σε ΜΟΙ (πολλαπλότητα μόλυνσης) 50 και θεραπεία με 800 nM πακλιταξέλη. Τα κύτταρα παρακολουθούνται και μετρήθηκαν σε διαστήματα είκοσι τέσσερις ώρες μετά τη μόλυνση. Η πακλιταξέλη (LC-Laboratories) διαλύθηκε σε DMSO ως διάλυμα παρακαταθήκης 1 mm.

Δημιουργία ανασυνδυασμένων αδενοϊικών φορέων

Οι αδενοϊοί που μεταφέρουν

FHIT

ή

FHIT-

His6 cDNAs (Ad

FHIT

και διαφήμισης

FHIT-

His6, αντίστοιχα) υπό μεταγραφικό έλεγχο ενός υποκινητή του κυτταρομεγαλοϊού δημιουργήθηκαν με ομόλογο ανασυνδυασμό σε κύτταρα ΗΕΚ-293, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26] . Το Ad

GFP

φορέας χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

Protein Πέψη

Ανοσοκαταβυθισμένες σύμπλοκα πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε πέψη με θρυψίνη βαθμού αλληλούχισης από την Promega με τη χρήση των πλακών φίλτρου Multiscreen Solvinert από την Millipore (Bedford ).