Αφηρημένο

Ο προσδιορισμός και η επικύρωση των βιοδεικτών για κλινικές εφαρμογές εξακολουθεί να αποτελεί σημαντικό ζήτημα για τη βελτίωση της διάγνωσης και της θεραπείας σε πολλές ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη. Τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης εφαρμόζεται συστηματικά για τον εντοπισμό διαγνωστική και προγνωστική βιολογικών δεικτών ή νέων στόχων για τον καρκίνο. Ωστόσο, λίγες μόνο προγνωστική δείκτες που προσδιορίζονται

in silico

έχουν επίσης εγκριθεί για κλινική, λειτουργική ή μηχανιστική ενδιαφέρον στην εξέλιξη της νόσου. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε χρησιμοποιήσει ένα ευρύ, βιοπληροφορική προσέγγιση για τον εντοπισμό αυτών των βιοδεικτών σε ένα φάσμα των σταδίων εξέλιξης, συμπεριλαμβανομένων των φυσιολογικών και καρκινικών-δίπλα, προκαρκινικές, πρωτοβάθμιας και όψιμο στάδιο βλάβες. Βιοπληροφορική εξόρυξης δεδομένων σε συνδυασμό με την κλινική επικύρωση των βιοδεικτών από ευαίσθητες, ποσοτική ανάστροφης μεταγραφής PCR (qRT-PCR), που ακολουθείται από λειτουργική αξιολόγηση των υποψηφίων γονιδίων σε διαδικασίες ασθενειών σχετικών με, όπως πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, την κινητικότητα και την εισβολή. Από 300 αρχική υποψηφίων, επελέγησαν οκτώ γονίδια για την επικύρωση από διάφορα στρώματα της εξόρυξης δεδομένων και το φιλτράρισμα. Για κλινική επικύρωση, η έκφραση του mRNA διαφορική επιλεγμένων γονιδίων μετρήθηκε με qRT-PCR σε 197 κλινικά δείγματα ιστού του προστάτη συμπεριλαμβανομένων φυσιολογικό προστάτη, σε σύγκριση εναντίον ιστολογικά καλοήθη και καρκινικούς ιστούς. Με βάση τα αποτελέσματα qRT-PCR, σημαντικά διαφορετική έκφραση mRNA επιβεβαιώθηκε σε φυσιολογικό προστάτη έναντι κακοήθους δείγματα προστάτη (για όλες τις οκτώ γονίδια), αλλά επίσης και σε καρκίνο γειτονικούς ιστούς, ακόμη και εν απουσία του ανιχνεύσιμου καρκινικά κύτταρα, δείχνοντας έτσι τη δυνατότητα από έντονες επιπτώσεις στον τομέα των βλαβών του προστάτη. Για την επικύρωση των λειτουργικών ιδιοτήτων αυτών των γονιδίων, και να αποδείξουν υποτιθέμενο ενδιαφέρον τους για τις διαδικασίες ασθένειες σχετικές, siRNA knock-down μελέτες διεξήχθησαν σε 2D και μοντέλα οργανοτυπικής κυτταρικής καλλιέργειας 3D. Αποσιώπηση τριών γονιδίων (

DLX1

,

PLA2G7

και

RHOU)

στον καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές PC3 και vCap με siRNA οδήγησε σε αξιοσημείωτη αναστολή της ανάπτυξης και της κυτταροτοξικότητας, ιδιαίτερα σε 3D οργανοτυπικής συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων. Επιπλέον, σίγηση του

PLA2G7

,

RHOU

,

ACSM1

,

LAMB1

και

CACNA1D

επίσης ως αποτέλεσμα μειωμένη καρκινικών κυττάρων εισβολή στο PC3 οργανοειδή πολιτισμούς. Για

PLA2G7

και

RHOU

, τα αποτελέσματα των siRNA αποσιώπηση επί του πολλαπλασιασμού και της κυτταρικής κινητικότητας θα μπορούσε επίσης να επιβεβαιωθεί σε καλλιέργειες μονοστοιβάδας 2D. Εν κατακλείδι, DLX1 και RHOU έδειξε το ισχυρότερο δυναμικό ως χρήσιμο κλινικό βιοδείκτες για την PCA διάγνωση, ακόμη επικυρωθεί από λειτουργικές τους ρόλους τους στην εξέλιξη της ΣΕΣΣ. Αυτές οι υποψήφιοι μπορεί να είναι χρήσιμη για την πιο αξιόπιστη αναγνώριση των υποτροπών ή αποτυχίες της θεραπείας πριν από την επανάληψη τοπικές ή απομακρυσμένες μεταστάσεις

Παράθεση:. Alinezhad S, Väänänen RM, Mattsson J, Li Υ, Tallgrén Τ, Tong Ochoa Ν, et al. (2016) Επικύρωση των νέων βιολογικών δεικτών για τον καρκίνο του προστάτη Η εξέλιξη από το συνδυασμό της Βιοπληροφορικής, Κλινικές και λειτουργικές μελέτες. PLoS ONE 11 (5): e0155901. doi: 10.1371 /journal.pone.0155901

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 14η Οκτωβρίου, 2015? Αποδεκτές: 5 Μάη 2016? Δημοσιεύθηκε: May 19, 2016

Copyright: © 2016 Alinezhad et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή υποστηρίχθηκε από την Marie Curie (FP-7) του προστάτη Έρευνα Οργανισμοί-Δίκτυο Έγκαιρης Κατάρτισης Στάδιο (PRO-NEST, η αναφορά του έργου 238278) , και η Ακαδημία της Φινλανδίας (στο μικροπεριβάλλον του όγκου & amp? μετάσταση σε Ευνουχισμός-Resistant τον καρκίνο του προστάτη, οι αριθμοί του έργου 267.326 στον Matthias Νέες και 267.326 σε Malin Åkerfelt). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη (PCA) παραμένει ένα μείζον πρόβλημα δημόσιας υγείας σε όλες τις δυτικές χώρες. PCa αντιπροσωπεύει την πιο συχνά διαγιγνώσκεται οντότητα όγκου μετά τον καρκίνο του δέρματος στους άνδρες, και είναι η δεύτερη πιο συχνή αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται στις Ηνωμένες Πολιτείες. Στις ΗΠΑ, 233.000 νέες περιπτώσεις προστάτη διαγνώστηκε, και 29.480 άνδρες έχασαν τη ζωή τους από την ασθένεια το 2014 [1]. Ένας στους επτά άνδρες μπορούν να αναπτύξουν διηθητικό καρκίνο του προστάτη κατά τη διάρκεια της ζωής τους [1]. Μετρήσεις των επιπέδων (PSA) ορό ειδικού προστατικού αντιγόνου, που ακολουθείται από δακτυλική εξέταση (DRE) και ιστολογική εξέταση βιοψιών του προστάτη, εξακολουθούν να είναι τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα ρουτίνας διαγνωστικές μέθοδοι για την PCA. Το 1986, η PSA εγκρίθηκε ως βιοδείκτη για την παρακολούθηση και την παρακολούθηση των ασθενών προστάτη από τον Αμερικανικό Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων [2]. Οι πρώτες μελέτες έχουν αναφέρει σημαντική μείωση του ποσοστού θνησιμότητας των ασθενών με προστάτη [3] μετά την ευρεία εισαγωγή του τεστ PSA για μεγάλης κλίμακας ελέγχου του πληθυσμού. Ωστόσο, πιο πρόσφατες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι διαλογής PSA μπορεί να οδηγήσει σε εκτεταμένη υπερ-διάγνωση και δαπανηρή υπερβολική θεραπεία ασθενών με βραδείας εξέλιξης καρκίνους [4]. Όπως PSA είναι μια ιστοειδική, αλλά όχι καρκινικού δείκτη ειδικό για τον προστάτη, τα αυξημένα επίπεδα του PSA κατά τη διάρκεια και μετά τη χημειοθεραπεία ή ριζική προστατεκτομή υποδεικνύουν αποτυχία της θεραπείας, και την προφανή υποτροπής της νόσου. Παρά το γεγονός ότι ένα αναμφισβήτητο δείκτη κλινική παρακολούθηση, τα επίπεδα του PSA αυξάνεται μόνο μετά προστάτη ύφεση και όταν έχει ήδη συμβεί εξέλιξη. Κατά συνέπεια, η PSA έχει μικρή διαγνωστική και πρακτικά δεν προγνωστική αξία για την εξέλιξη της νόσου σε τοπικά προχωρημένο καρκίνο (& lt? 10% των ασθενών), ή ακόμη και μεταστατικό PCa. Πρόσφατα, ωστόσο, μια ομάδα τεσσάρων καλλικρεϊνών, σε συνδυασμό με PSA-aided διαστρωμάτωση κινδύνου, δείχθηκε ότι είναι χρήσιμες για τον προσδιορισμό άνδρες σε ηλικία πενήντα ετών με μια ιδιαίτερα αυξημένο κίνδυνο για εξέλιξη και την ανάπτυξη των μακρινών μετάστασης της νόσου. Αυτό παρέχει επίσης ένα μέσο για τη μείωση της υπερ-διάγνωση της νόσου βραδείας [5]. Πιο ευαίσθητοι, κατατοπιστική, ασθένειες και καρκίνο ειδικών βιοδεικτών θα ήταν αναγκαίο, για να διακρίνει τους ασθενείς με υψηλό κίνδυνο από εκείνους με νωχελικός καρκίνους ή ακόμα και προκαρκινικές προκαρκινικές αλλοιώσεις. Αυτό μπορεί επίσης να περιλαμβάνουν δείκτες που δείχνουν σχετίζονται με τον καρκίνο «αποτελέσματα πεδίο», οι οποίες περιγράφονται μόλις πρόσφατα στον καρκίνο του προστάτη [6], αλλά έχουν γίνει πλέον ένα επαναλαμβανόμενο παρατήρηση ότι είναι πιθανό να γίνουν σημαντικές για διαγνωστικούς σκοπούς. Tissue πετασμάτων δείκτης μπορεί να έχει τη δυνατότητα να βελτιώσει σημαντικά την διαγνωστική, οδηγώντας σε μεγαλύτερη ακρίβεια και έγκαιρη ανίχνευση, ή μπορεί να υποδεικνύουν την συχνά παρατηρούμενη πολυεστιακή φύση της ασθένειας [7]. Αναδυόμενες εφαρμογές των τεχνολογιών διαφορετικές «-ωματικής», όπως η γονιδιωματική, πρωτεομική transcriptomics και μεταβολισμική έχουν προωθήσει το πεδίο της ανακάλυψης βιοδεικτών σημαντικά. Δείκτες που είναι λειτουργικά εμπλέκονται σε διάφορα στάδια της εξέλιξης της νόσου ή μεταστατική εξάπλωση θα μπορούσε να έχει το υψηλότερο δυναμικό για να προβλέψει με επιτυχία τις αδυναμίες της ακτινοβολίας και αντι-ορμόνη θεραπείες, οι οποίες οδηγούν σε εξαιρετικά επιθετική και μεταστατική, ο ευνουχισμός ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (CRPC). Τέτοια μηχανιστικά συμμετέχουν οι δείκτες δεν μπορεί να βελτιώσει σημαντικά μόνο τη διαχείριση του προστάτη στην κλινική πράξη? μπορούν επίσης να αντιπροσωπεύουν νέους στόχους για θεραπευτική παρέμβαση. Στην κλινική πράξη, η εφαρμογή της πιο έξυπνη, δείκτες με βάση το χαρτί θα μπορούσε να με νόημα σε συνδυασμό με άλλες παραμέτρους υψηλού κινδύνου, όπως η θετική extracapsular ή σπερματικό εισβολή κύστη, προχωρημένα στάδια όγκων (& gt? T2c, Τ3 ή Τ4), υψηλή βαθμολογία Gleason ( & gt? 8), ή υψηλή σε πολύ υψηλό επίπεδο PSA (& gt? 20 ng /ml)? και θα υποστηρίζεται περαιτέρω από προηγμένες τεχνολογίες απεικόνισης όπως MRI.

Τα τελευταία χρόνια, μοριακές τεχνικές όπως η δημιουργία προφίλ γονιδιακής έκφρασης μικροσυστοιχιών και αλληλουχίας επόμενης γενιάς (NGS) έχουν διευκολύνει σημαντικά γονιδίωμα-ευρεία μελέτες της γονιδιακής έκφρασης όγκου προφίλ. Κατά συνέπεια, μικροσυστοιχιών και NGS-based προφίλ γονιδιακής έκφρασης έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για την ταυτοποίηση πάνελ των προγνωστικών [8] και προγνωστική βιολογικών δεικτών, συμπεριλαμβανομένων τέτοιων που μπορεί να είναι ενδεικτική για την PCA επανάληψη [9,10], πρώιμο και όψιμο στάδια της εξέλιξης του καρκίνου, ή επιδράσεις τομέα. Ταυτοποίηση νέων, ενημερωτικά βιοδείκτες για πνεύμονα και του παχέος εντέρου με τη συστηματική εξόρυξη των συνόλων δεδομένων έκφραση δημόσιας γονιδίων όπως το The Cancer Genome Atlas (TCGA) έχει αναφερθεί [11,12] και αλλού. Η βάση δεδομένων TCGA περιέχει πολλές μελέτες γονιδιακής έκφρασης σε μεγάλη κλίμακα με βάση την κλινική βιοψίες προστάτη [13,14,15], που προέρχεται από δημόσια χρηματοδότηση της έρευνας και ανοιχτά διαθέσιμα σύνολα δεδομένων. Η cBio Καρκίνος Genomics Πύλη [16] (https://www.cbioportal.org) είναι η κύρια πηγή ανοικτής πρόσβασης για την εξόρυξη των συνόλων καρκίνο γονιδιωματική δεδομένων TCGA, και φιλοξενεί σήμερα περισσότερα από 21.000 δείγματα όγκων από & gt? 20 διαφορετικές οντότητες καρκίνο και 91 μελέτες. Έχουμε επιλέξει ένα από τα μεγαλύτερα και πιο ολοκληρωμένη από αυτές τις μελέτες έκφρασης μικροσυστοιχιών στην ΣΕΣΣ, η οποία εκτελείται κυρίως σε κλινικές βιοψίες, διεξήχθη από Taylor et al. στο Memorial Sloan-Kettering, (MSKCC) [13] το 2010. Η μελέτη αυτή περιλαμβάνει 181 βασικά δείγματα προστάτη, 37 μεταστατικό δείγματα προστάτη, 12 κυτταρικές σειρές προστάτη και ξενομοσχεύματα, και 29 φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη ως υγιείς μάρτυρες. Ένας μεγάλος αριθμός παθολογικών και κλινικές παραμέτρους όπως Gleason βαθμούς, στάδια ΤΝΜ, θετική χειρουργικά όρια, το καθεστώς της τοπικής εισβολής των καρκινικών κυττάρων στους λεμφαδένες, σπερματοδόχων κύστεων, ή εξωκαψική χώρο, ή μακρινή μετάσταση επισημειώνονται. Αυτές οι παράμετροι θεωρούνται πιο σημαντικά για την αξιολόγηση του προστάτη επιθετικότητα και αξιόπιστα να προβλέψει κακή έκβαση της νόσου. συγκεκριμένο στόχο μας για την εξόρυξη δεδομένων ήταν να χρησιμοποιήσει μια ανοικτή, αμερόληπτη προσέγγιση, αντιμετωπίζοντας ένα ευρύ φάσμα των φυσιολογικών ιστών, πρωτογενείς καρκίνους, και προχωρημένου σταδίου, προχωρημένων βλαβών. Δεδομένου ότι ο στόχος δεν ήταν να προβλέψει την κλινική έκβαση ή την αξιολόγηση του ατομικού κινδύνου για τους ασθενείς ή υποομάδες ασθενών με βάση τα δεδομένα της έκφρασης mRNA, τα δεδομένα δεν χωρίστηκαν σε εκπαίδευση και δοκιμασία σύνολα για cross-επικύρωσης. Επίσης, δεν στοχεύουν για την αξιολόγηση ενός «προγνωστική υπογραφή δείκτη» που πρέπει να χρησιμοποιούνται σε άλλους, ανεξάρτητες μελέτες γονιδιακής έκφρασης του mRNA. Ως εκ τούτου, Σταυρός επικύρωση δεν ήταν απαραίτητη για να επιβεβαιώσει πόσο στατιστικά ακριβή ένα σύνολο πρόβλεψης βιοδεικτών θα εκτελέσει πρόσθετα σύνολα δεδομένων. Αντίθετα, στόχος μας ήταν να προσδιορίσει προηγουμένως λαθραία βιοδεικτών και την επικύρωσή τους σε όλο το φάσμα των κλινικών βιοψίες που διατίθενται από ΣΕΣΣ. Η προσέγγισή μας βασίστηκε σε ανάλυση της διαφορικής έκφρασης mRNA για τον προσδιορισμό των υποψηφίων βιοδεικτών, που ακολουθείται από την πειραματική συσχέτιση τους με τις πιο κρίσιμες κλινικές παραμέτρους σε ανεξάρτητες συλλογές δειγμάτων, τα οποία ήταν συχνά πολύ διαφορετικής προέλευσης σε σχέση με τα δεδομένα μικροσυστοιχίας. Η κύρια έμφαση ήταν στη λειτουργική επικύρωση των βιοδεικτών σε σχέση με την έναρξη και την εξέλιξη της ΣΕΣ, ιδανικά σε συνδυασμό με την αξιολόγηση των πιθανών διαγνωστική αξία τους.

Για ανεξάρτητη επικύρωση των αρχικών ευρημάτων, θα εξορύσσεται πρόσθετους πόρους, όπως το

in silico

transcriptomics (IST) της βάσης δεδομένων [17] (https://ist.medisapiens.com). Αυτή η βάση δεδομένων περιλαμβάνει δεδομένα γονιδιακής έκφρασης mRNA από πάνω από 20.000 μικροσυστοιχίες Affymetrix, που καλύπτουν 60 υγιείς ιστούς, 104 κακοήθεις και 64 άλλα είδη ασθενειών. Για την εξόρυξη δεδομένων, έχουμε χρησιμοποιηθεί Ingenuity Διαδρομή Ανάλυση (ΜΠΒ), το οποίο παρέχει πληροφορίες σύνδεσης γονιδίων και οντολογία, και επιτρέπει το φιλτράρισμα των γονιδίων που βασίζονται σε λειτουργικά ζητήματα. Διαρκέσει όχι λιγότερο σημαντικό, χρησιμοποιήσαμε το Pubmed σύστημα πληροφοριών της βιβλιογραφίας για να φιλτράρετε βιοδείκτες που έχουν επανειλημμένα περιγραφεί πριν ως συνδεδεμένες με προστάτη. Ένα εργαλείο εξόρυξης κειμένου λειτουργία δέσμης (https://pmid.us) χρησιμοποιήθηκε, η οποία επέτρεψε sca1nning καθ ‘όλη τη βιβλιογραφία για τον τίτλο «καρκίνο του προστάτη» των ματιών, κατά συνύπαρξη των εκατοντάδων υποψηφίων γονιδίων τέθηκε ως «σύμβολα γονίδιο». Με αυτή τη στρατηγική, ένα σύνολο 300 υποθετικών υποψηφίων βιοδεικτών ως προτεραιότητα βήμα προς βήμα, χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό των διαφορετικών δεδομένων και κειμένων ή φιλτράρισμα προσεγγίσεις, τονίζοντας δείκτες που είχαν πιο στενά με τις γενικές πτυχές του προστάτη εξέλιξη, η αποτυχία της θεραπείας, ή εξέλιξη σε μεταστατικό CRPC, αλλά δεν καλύπτονταν προηγουμένως από ένα μεγάλο σώμα των επιστημονικών εκθέσεων. Οκτώ γονίδια επιλέχθηκαν για κλινικές και λειτουργικές επικύρωσης. Για το σκοπό αυτό, ποσοτικές, εσωτερικώς τυποποιηθεί σε πραγματικό χρόνο αντίστροφης μεταγραφής PCR (RT-PCR) εφαρμόστηκε, χρησιμοποιώντας τέσσερις ανεξάρτητες συλλογές δειγμάτων ιστού από ριζική προστατεκτομή και cystoprostatectomy. Αυτά περιείχαν φυσιολογικά δείγματα cystoprostatectomy, ιστολογικά καλοήθη ιστό από cystoprostatectomy δείγματα με παρεπόμενες καρκίνο του προστάτη, εκτός από ιστολογικά καλοήθη ιστούς, και κακοήθη καρκίνο από ριζική προστατεκτομή δείγματα.

Πρόσφατες πρόοδοι στην κυτταρική βιολογία έχουν διευκολύνει συστηματικές μελέτες λειτουργικής επικύρωσης ( λειτουργική γενετική) των υποψηφίων βιοδεικτών, που βασίζεται σε αποτελεσματικές προσεγγίσεις, όπως η μικρή παρεμβολή RNA (siRNA ή RNAi), CRISPR /Cas9 και τεχνολογίες talen. Από αυτούς, οι μελέτες siRNA παραμένουν οι πιο προσβάσιμες, προσιτές και ταχύτερη τεχνολογίες στην πειραματική πρακτική, και αντιπροσωπεύουν την κύρια προσέγγιση στη λειτουργική επικύρωση στόχο. Για να διερευνήσουν λειτουργικές επιδράσεις των επιλεγμένων γονιδίων στην ανάπτυξη, τον πολλαπλασιασμό και επεμβατική ιδιότητες των κυττάρων καρκίνου του προστάτη, siRNA knock-down μελέτες για επιλεγμένα γονίδια διεξήχθησαν σε 2D και οργανοτυπικά μοντέλων 3D (καλλιέργειες οργανοτυπικές κυττάρων) χρησιμοποιώντας το κακώς επεμβατική VCAP και ο άκρως επιθετική PC3 κυτταρικές σειρές.

Υλικά και μέθοδοι

ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης για τον εντοπισμό υποψήφιων βιοδεικτών

Μια ομάδα από διαφορετικές μεθόδους βιοπληροφορικής ανάλυσης και φιλτραρίσματος εφαρμόστηκε σε ορυχείο μεγάλες -scale γονιδιακής έκφρασης προφίλ σύνολα δεδομένων και να επιλέξετε τα πιο κατατοπιστική, θεωρούμενων βιοδεικτών για την πρόγνωση ή /και την παρακολούθηση της εξέλιξης της νόσου (που συνοψίζονται στο Σχήμα 1). Χρησιμοποιήσαμε Bioconductor /R με βάση την κανονικοποίηση των δεδομένων και την RMA (Στιβαρή πολλαπλών ψηφίδων Μέση) πακέτο για την επεξεργασία και την ομαλοποίηση της Affymetrix σύνολα πειράματος που εξάγεται από την πύλη TCGA /cBio. Στη συνέχεια, τα γονίδια κατατάχθηκαν σύμφωνα με διαφορική γονιδιακή έκφραση σε όλες τις κύριες ομάδες του δείγματος (Ν, φυσιολογικό? T, πρωτοβάθμια προστάτη? Και Μ, μεταστατικό PCA). Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε αρκετές στατιστικές δοκιμές σημαντικότητας (ANOVA, T-test ή Ζ-βαθμολογίας και το Mann-Whitney U Test?. Και στη συνέχεια διηθείται υποψηφίων από πολλαπλές διορθώσεις δοκιμών (Bonferroni) Παράλληλα, χρησιμοποιήσαμε το SAM ή » αναλύσεις σημασία για μικροσυστοιχίες «πρόγραμμα, χρησιμοποιώντας False Discovery Rate (FDR) τα κριτήρια για την επιλογή των γονιδίων. η προσέγγιση αυτή οδήγησε σε επικαλυπτόμενες, παρόμοια σύνολα γονιδίων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Περιορίσαμε την ανάλυσή μας στη μεγάλη MSKCC σύνολο δεδομένων (218 προφίλ των όγκων, συμπεριλαμβανομένων των 37 μεταστάσεις, 12 κυτταρικές γραμμές PCa, και 29 φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη). η διαφορική έκφραση του κάθε γονιδίου σε ολόκληρη 181 πρωτογενή δείγματα καρκίνου σε σύγκριση με τα 29 κανονικά δείγματα (

T έναντι Ν σύγκριση

). Ομοίως, η έκφραση της 37 μεταστατικό δειγμάτων σε σύγκριση με τα 181 στοιχειώδη δείγματα προστάτη (

M έναντι Τ

). Η μέση μεταβολή φορές της έκφρασης του mRNA και η στατιστική σημαντικότητα σε όλα τα δείγματα υπολογίζεται, και τα γονίδια κατατάχθηκαν σύμφωνα με τις ισχυρότερες διαφορές στη γονιδιακή mRNA έκφρασης (fold αλλαγή, δείτε S1 και S2 Files). Τα κορυφαία 300 χτυπήματα σε κάθε ομάδα (Τ έναντι Ν και Μ εναντίον Τ) ήταν τότε υπόκεινται σε επιπλέον φιλτράρισμα των δεδομένων: επιλέχθηκαν μόνο εκείνα τα γονίδια για τη συνέχεια που έδειξαν τα στατιστικά πιο σημαντική, ισχυρή και επαναλήψιμη διαφορές μεταξύ της κανονικής, πρωτοβάθμια προστάτη και μεταστατικές δείγματα προστάτη (με βάση εκτιμήσεις FDR ή Bonferroni-φίλτρο). Χρησιμοποιήσαμε επίσης το εργαλείο λογισμικού Ingenuity Διαδρομή Ανάλυση (IPA) για πρόσθετες επιλογές φιλτραρίσματος από τις αρχικές λίστες του γονιδίου, με βάση δύο στατιστικών παραμέτρων καθώς και τη λειτουργική «γονίδιο οντολογία» και μηχανιστική σχολιασμούς μονοπάτι. Αξιοποιήσαμε την ιεραρχημένο κατάλογο των υποψηφίων που παράγεται από το IPA για επιπλέον συσχέτιση με κλινικές παραμέτρους (Kaplan-Meier οικόπεδα), αξιολόγηση των ιστο-ειδική έκφραση, και την εξόρυξη λογοτεχνία κειμένου (επόμενες παραγράφους). Για τον καρκίνο-ειδικά γονίδια αναγνωρίζονται ως διαφορικά εκφρασμένων μεταξύ του Ν και Τ-ομάδες, η κατάταξη ήταν υψηλότερη αν παρατηρήθηκε επίσης γονιδιακή έκφραση διαφορική mRNA μεταξύ των υποκατηγοριών Τ και Μ.

Η

Για κάθε επιλεγμένο γονίδιο, κουτί -Αγροτεμάχιο γραφήματα έκφρασης παράχθηκαν χρησιμοποιώντας HTML-based εργαλείο οπτικοποίησης δεδομένων in-house (R-εκτελέσιμο (REX)). Αυτό επιτρέπει τη συστηματική, χρήστη με γνώμονα την εξόρυξη δεδομένων των συνόλων δεδομένων σύμφωνα με τις κλινικές παραμέτρους (π.χ. υποομάδες όγκου όπως πρωτοβάθμια εναντίον μεταστατικούς καρκίνους, λεμφαδένων και extracapsular εισβολή, η διείσδυση των χειρουργικών περιθωρίων, και μακρινή μετάσταση). Επιπλέον, η διαφορική έκφραση μεταξύ χαμηλών (4-6), το ενδιάμεσο (7) και υψηλή (8-10) Gleason σκορ ή μεταξύ διαφόρων σταδίων της νόσου (& gt? Τ2, Τ3 ή Τ4), και κατηγορίες ασθενειών όπως πρωτογενείς εναντίον μετάσταση στους λεμφαδένες, συστηματικά αξιολογήθηκαν (Εικόνα 2Α). Στη συνέχεια, θα δοθεί προτεραιότητα γονίδια που ήταν ειδικά, κατά προτίμηση ή εκφράζεται ισχυρά στον προστάτη σε σύγκριση με όλους τους άλλους ανθρώπινους ιστούς, συμπεριλαμβανομένων και άλλων οντοτήτων του όγκου. Για το σκοπό αυτό, οι βαθμολογίες ιστο-ειδική έκφραση που παρέχεται από το IST ηλεκτρονική βάση δεδομένων που χρησιμοποιείται (Σχ 2C). Η ιστοειδική έκφραση βαθμολογίες και γραφήματα έκφραση box-πλοκή για άλλα επιλεγμένα γονίδια συνοψίζονται στο S3 File.

Α) Dot διάγραμμα οικόπεδο που απεικονίζει τη σύνδεση των γονιδίων mRNA έκφραση του CACNA1D σε φυσιολογικά και καρκινικά δείγματα με ένα πάνελ από τα πιο κατατοπιστική κλινικο-παθολογική παραμέτρους. Β) Kaplan-Meier ανάλυση, που δείχνει την συσχέτιση των υψηλών επιπέδων έκφρασης mRNA για CACNA1D με μειωμένη συνολική ανάλυση επιβίωσης για τους ασθενείς PCa. Γ) σχετική έκφραση CACNA1D σε ένα πάνελ 60 + κανονικής και σχετίζονται με τον καρκίνο τύπους ανθρώπινων ιστών και νόσων.

Η

Στη συνέχεια, θα απευθύνεται κλινική έκβαση, αλλά χρησιμοποιούνται άλλα σύνολα δεδομένων εκτός από μικροσυστοιχία MSKCC δεδομένα. Για κάθε επιλεγμένου γονιδίου, ένα Kaplan-Meier οικόπεδο έκβαση των ασθενών βασίζεται σε ανεξάρτητη, μεγάλης κλίμακας κλινική μελέτη με δημόσια διαθέσιμα στοιχεία [15] δημιουργήθηκε. Για το σκοπό αυτό, επικεντρωθήκαμε στην συνολική επιβίωση και χρονικά διαστήματα απαλλαγμένα από ασθένειες, χρησιμοποιώντας μη παραμετρικές στατιστικές που διακρίνουν τις λειτουργίες της επιβίωσης των ασθενών από τα δεδομένα κλινικών ζωής (Σχήμα 2Β). Δεδομένου ότι περίπου το 85-90% των ασθενών ακόμη και με τοπικά προχωρημένο προστάτη δείχνουν μακροχρόνια επιβίωση (& gt? 5 ή 10 έτη) και ως επί το πλείστον καλό κλινικό αποτέλεσμα, και μόνο το 10-15% των ασθενών αυτών να εξελιχθεί σε CRPC, έχουμε επιλέξει ισοδύναμους αριθμούς επίσης, για τις αναλύσεις Kaplan-Meier. Κατά συνέπεια, το 85% των ασθενών που ομαδοποιήθηκαν στο «χαμηλού κινδύνου /καλό κλινικό αποτέλεσμα» κατηγορία, σε σύγκριση με το 15% των ασθενών υψηλού κινδύνου ότι η πρόοδος σε προχωρημένο προστάτη.

Τέλος, να δοθεί προτεραιότητα μυθιστόρημα υποψήφιο βιοδεικτών για επακόλουθη λειτουργική και κλινική επικύρωση, τη λίστα των υποψηφίων βιοδεικτών διηθείται εναντίον ολόκληρης της βάσης δεδομένων βιβλιογραφίας PubMed. Συνύπαρξη των ονομάτων υποψήφιο γονίδιο και τα σύμβολα της HUGO με τον όρο «καρκίνος του προστάτη» στις PubMed εγγραφές της βάσης δεδομένων προβλήθηκε συστηματικά, χρησιμοποιώντας το εργαλείο Pubmed παρτίδα-αναζήτησης (https://pmid.us). Γονίδια που αναφέρθηκαν περισσότερες από πέντε φορές στο ευρετήριο επιστημονικών δημοσιεύσεων αποκλείστηκαν αυτόματα ως «περιγράφηκε προηγουμένως με λεπτομέρεια» (Κατάσταση της αναζήτησης βιβλιογραφίας: Σεπτέμβριος 2012). Αυτά τα τελευταία στάδια φιλτραρίσματος οδήγησε σε οκτώ γονίδια για πειραματική επαλήθευση. Τα οικόπεδα γονιδιακής έκφρασης από τη βάση δεδομένων και dot IST οικόπεδα από το σύνολο δεδομένων MSKCC συνοψίζονται στο S3 αρχείου. Έχουμε ως στόχο να προσδιορίσει και να επιβεβαιώσει γενική PCA-ειδικών βιοδεικτών (διαγνωστικοί δείκτες), συμπεριλαμβανομένων των βιολογικών δεικτών που μπορεί να υποδεικνύει νωρίς και πολυεστιακή στάδια της νόσου ή «αποτελέσματα στον τομέα». Επιπλέον, θα θέλαμε να επικυρώσει πιθανούς δείκτες εξέλιξης του προστάτη (προγνωστικοί δείκτες) που μπορεί να υποδεικνύουν την ανάπτυξη της υποτροπής, CRPC και μεταστατικές βλάβες μετά από αποτυχία της θεραπείας.

δείγματα ιστών για κλινικές βιοδείκτη επικύρωση

Η Επιτροπή ηθικής και Δεοντολογίας του Νοσοκομείου Περιφέρειας της Νοτιοδυτικής Φινλανδίας ενέκρινε το πρωτόκολλο της μελέτης. Ήταν, σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι το 1975, όπως αναθεωρήθηκε το 1996, με τη γραπτή συγκατάθεση που λαμβάνεται από κάθε συμμετέχοντα. Δύο ανεξάρτητα σύνολα δειγμάτων προστατικού ιστού που σχετίζονται χρησιμοποιήθηκαν για κλινική επικύρωση. Η πρώτη ομάδα αποτελούνταν από 180 δείγματα ιστού του προστάτη που λαμβάνεται από ένα σύνολο 90 πρωτοβάθμια ασθενείς ΣΕΣ, λειτουργεί από ριζική προστατεκτομή (RP) στο Turku University Hospital (TYKS). Από 90 ασθενείς, μόνο 2 ασθενείς είχαν λάβει HRH-αναλόγων πριν από τη χειρουργική επέμβαση ως προεγχειρητική θεραπεία. Από κάθε προστάτη, ελήφθησαν δύο δείγματα ιστών. Ένα προήλθε από το ύποπτο καρκινική περιοχή, από την άλλη από την παρακείμενη περιοχή, υπάρχουν υπόνοιες ότι είναι καλοήθης. Η ιστο-παθολογία του ήμισυ εκάστου δείγματος ιστού εξετάστηκε από παθολόγους TYKS, ενώ το άλλο μισό αποθηκεύτηκε αμέσως σε ισοθειοκυανική γουανιδίνη ρυθμιστικό (GITC) για εξαγωγή RNA. Η εξέταση αποκάλυψε ότι 30 από τους ασθενείς, και τα δύο δείγματα ελήφθησαν από την καλοήθη περιοχή? για 15 ασθενείς, και τα δύο δείγματα ελήφθησαν από τον καρκινικό περιοχή? και για 45 ασθενείς, ένα δείγμα λήφθηκε από καλοήθεις και το άλλο από το καρκινικό περιοχή (όπως προβλεπόταν αρχικά). Μόνο δύο δείγματα έπρεπε να αποκλειστεί λόγω τεχνικών προβλημάτων με εξαγωγή RNA. Τέλος, 178 δείγματα (104 δείγματα καλοηθών και 74 καρκινικά δείγματα) αφέθηκαν για ανάλυση γονιδιακής έκφρασης με qRT-PCR. Τα κλινικά και παθολογικά χαρακτηριστικά του συνόλου των 90 περιπτώσεων προστάτη παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.

Η

Η δεύτερη ομάδα περιελάμβανε 19 δείγματα ιστού του προστάτη, που λαμβάνεται από ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης, χωρίς κλινικά συμπτώματα του προστάτη. Αυτά λειτουργούν από cystoprostatectomy (CP) στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Skåne στο Malmö της Σουηδίας. Οι έμπειροι παθολόγους, χρησιμοποιώντας το ίδιο πρωτόκολλο όπως περιγράφηκε προηγουμένως για τα δείγματα RP, εξετάστηκαν όλα τα δείγματα προστάτη. 12 από τα 19 δείγματα προστάτη σε αυτή τη συλλογή είχε τυχαίες προστάτη (IPCA), ενώ επτά ήταν απαλλαγμένα από οποιοδήποτε ανιχνεύσιμο εστίες καρκίνωμα. Στην περίπτωση της IPCA, δείγματα ιστών για ανάλυση γονιδιακής έκφρασης ελήφθησαν από την καλοήθη περιοχή.

Εκχύλιση και αντίστροφη μεταγραφή του RNA

Εκχύλιση RNA από δείγματα ιστού έχει περιγραφεί προηγουμένως [18] . Εν συντομία, το RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κατά τη διάρκεια της εκχύλισης του RNA, και μετά το αρχικό στάδιο λύσης κυττάρου, μία γνωστή ποσότητα του RNA ενός τεχνητά μεταλλαγμένο

KLK3

γονίδιο, που ονομάζεται mmPSA, προστέθηκε στο δείγμα ως εσωτερικό έλεγχο και για την απόλυτη ποσοτικοποίηση των επιπέδων έκφρασης. Η ποιότητα του mRNA που λαμβάνεται επαληθεύτηκε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης, και η τελική συγκέντρωση του RNA μετρήθηκε με NanoDrop N2000 φασματοφωτόμετρο (NanoDrop Technology, LTD Lab). Αντίστροφη μεταγραφή cDNA παρήχθη χρησιμοποιώντας το High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, USA), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR

προηγουμένως περιγραφέν πρωτόκολλο μας [19] για υδρόλυση ενισχυμένη χημεία χηλικού φωταύγειας, με βάση το χρόνο φθωρομετρία, χρησιμοποιήθηκε επίσης εδώ για ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR. Για κάθε γονίδιο, ένα ζεύγος ειδικών εκκινητών, και ταιριάζουν ρεπόρτερ και αποσβέστη ανιχνευτές σχεδιάστηκαν και αγοράστηκαν από την Thermo Fisher (Γερμανία) (S1 πίνακα). Για την επισήμανση του ανιχνευτές ανταποκριτές αποτελεσματικά με ένα χηλικό ευρώπιο nonadentate, χρησιμοποιήθηκε μία διαδικασία που περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα συνολικό όγκο 25 μL, που περιέχει 2.5 μί cDNA εκμαγείου με Hotmaster

™ Taq DNA πολυμεράση (5 Prime, Γερμανία) ή AmpliTaq

® Gold ϋΝΑ πολυμεράση (Applied Biosystems, USA) . Τα δείγματα έτρεξαν εις τριπλούν. Για να διορθωθεί για πιθανή αποικοδόμηση του RNA και η ποσότητα του RNA χάνονται κατά την εκχύλιση και αντίστροφη μεταγραφή, το ληφθέν μεταγραφή πρέπει επίπεδο δεδομένων που πρέπει να ομαλοποιηθούν. γονίδια καθαριότητας (π.χ.

GAPDH

) υποτίθεται να μεταγραφεί σε σταθερό επίπεδο σε διαφορετικούς ιστούς και σε όλες τις συνθήκες, και χρησιμοποιούνται ευρέως για την ομαλοποίηση των αποτελεσμάτων RT-PCR σε σχετική μεθόδους ποσοτικοποίησης [21]. Ωστόσο, η αξιοπιστία των γονιδίων καθαριότητας για την εξομάλυνση έχει συχνά αμφισβητηθεί λόγω της αστάθειας τους κατά τη διάρκεια αλλαγών αποθήκευσης και ασυνεπή έκφραση σε διαφορετικές συνθήκες ασθένειας [22,23]. Η προσθήκη ενός καθορισμένου ποσού σε ένα τεχνητό RNA, το οποίο δεν εκφράζεται στα δείγματα εγγενώς ως εσωτερικά RNA αναφορά σε δείγματα (πριν από την εκχύλιση) θεωρείται πιο αξιόπιστη εναλλακτική λύση για την εξομάλυνση [24,25]. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε λάβει τα πλεονεκτήματα της χρήσης τεχνητών RNA (mmPSA) για εξομάλυνση και τα οφέλη από τη χρήση ιχνηλατών επισημασμένου με χηλικά λανθανιδίου αντί του Taqman ανιχνευτές, οι οποίες επιτρέπουν την ώρα φθωρομετρία για δοκιμασίες qRT-PCR.

Στατιστικές αναλύσεις

Για τις αναλύσεις qRT-PCR, τα δείγματα θεωρήθηκαν θετικά αν και τα τρία αντίγραφα ήταν πάνω από το χαμηλότερο όριο ανίχνευσης της ανάλυσης (LDL). Η απόλυτη, αριθμητική ποσότητα της γονιδιακής έκφρασης για κάθε γονίδιο ενδιαφέροντος υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας εσωτερικό πρότυπο αξίες, κανονικοποιούνται από την ποσότητα του συνολικού RNA που χρησιμοποιείται σε αυτές τις δοκιμασίες. Για τον έλεγχο των διαφορών των επιπέδων μεταγραφής των υποψήφιων γονιδίων μεταξύ υπόθεση και δείγματα ελέγχου, καθώς και μεταξύ των διαφόρων κατηγοριών του δείγματος, η μη-παραμετρική δοκιμή Mann-Whitney

εφαρμόστηκε U

δοκιμής. Για να αξιολογηθεί η απόδοση του κάθε υποψήφιου γονιδίου σε μιά διαγνωστική περιοχή, ένα χαρακτηριστικό δέκτης-λειτουργίας (ROC) καμπύλη ανάλυση διεξήχθη και η περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) που χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση της ευαισθησίας και της ειδικότητας των προσδιορισμών. Για τον προσδιορισμό της συσχέτισης των επιπέδων μεταγραφής mRNA ενός συγκεκριμένου υποψήφιου γονιδίου με την εξέλιξη του όγκου (που μετράται ως PSA υποτροπή στις κλινικές), τα δείγματα RP χωρίστηκαν σε δύο ομάδες, αντανακλώντας υποτροπή PSA και αριθ υποτροπή, αντίστοιχα? σύμφωνα με τα κλινικά δεδομένα παρακολούθησης. Κάθε συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης υποψηφίου γονιδίου και κλινική ή παθολογική παραμέτρους όπως Gleason βαθμό, το σκορ Gleason, το ποσοστό του καρκίνου σε σχέση με στρωματικά κύτταρα σε βιοψίες ιστού και κλινική κατηγορία T (T-στάδιο) αντιμετωπίστηκε από το μη-παραμετρικό Mann-Whitney

U

δοκιμή, προκειμένου να προσδιοριστούν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p & lt? 0,05). Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό SPSS, έκδοση 22 (IBM, USA).

Λειτουργική γονίδιο knock-down μελέτες με siRNAs

PC-3 ανεξάρτητο από ανδρογόνο ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη από προθέσεις οστών μετάσταση αδενοκαρκινώματος του προστάτη αγοράσθηκαν από την ATCC (USA) [18] και αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI-1640 στους 37 ° C σε πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων (95% υγρασία και 5% CO2). Για τις μελέτες knock-down siRNA, συνολικά 31 διαφορετικά siRNAs παραγγέλθηκαν από Qiagen (Γερμανία) (τρία διαφορετικά siRNAs για

ACSM1

και τέσσερα διαφορετικά siRNAs για κάθε ένα από τα άλλα επτά γονίδια). Χρησιμοποιήσαμε αρκετές κυτταρικές σειρές προστάτη, συμπεριλαμβανομένων των PC-3, vcap και LNCaP κύτταρα, για αυτά τα λειτουργικά πειράματα επικύρωσης. Για να επιτευχθεί η κατά το δυνατόν αποτελεσματικότερη knock-down για κάθε γονίδιο, αρκετές siRNAs ελέγχθηκαν τόσο μεμονωμένα όσο και σε συγκεντρωμένα μίγματα που περιέχουν και τις τρεις ή τέσσερις siRNAs σε ίσες συγκεντρώσεις. Allstars Hs ελέγχου κυτταρικού θανάτου siRNA (Qiagen, Germany) χρησιμοποιήθηκε ως ένας θετικός έλεγχος για την εκτίμηση της αποτελεσματικότητας της διαμόλυνσης σε κάθε πείραμα. Τα siRNAs ήταν προ-φορτώθηκαν σε φρεάτια, προστέθηκε Hiperfect διαμόλυνση παράγοντα (Qiagen, Germany) σε μέσο Opti-ΜΕΜ (Invitrogen, USA), και επωάστηκαν για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, 2000 έως 5000 PC-3, LNCaP ή Vcap κύτταρα προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Οι τελικές συγκεντρώσεις των siRNA και Hiperfect σε κάθε αντίδραση ήταν 4 ηΜ και 8 ηΜ, αντιστοίχως. Για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα της RNA παρεμβολής για κάθε γονίδιο με τις διάφορες siRNAs, ολικό RNA εκχυλίστηκε από τα επιμολυσμένα κύτταρα πέντε ημέρες μετά την επιμόλυνση και siRNA ειδική έκφραση του mRNA των γονιδίων-στόχων μετρήθηκε με qRT-PCR. Για να επιλεγούν εκείνα τα μόρια siRNA που έχει ως αποτέλεσμα την πιο αποτελεσματική knock-down, κανονικοποιημένες τιμές έκφρασης για κάθε δείγμα κατεργάζεται διαιρέθηκαν με το επίπεδο έκφρασης του υποψήφιου γονιδίου σε μη κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου ( «κωδικοποιημένο έλεγχος»). Για να εξαιρέσετε τυχόν συνέπειες αυτής της διαδικασίας για την έκφραση του γονιδίου στόχου, ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα (χρησιμοποιώντας μόνο παράγοντα επιμόλυνσης) συμπεριλήφθηκαν ως ένα δεύτερο έλεγχο.

φθορισμού δοκιμασίες για τη μέτρηση της απόπτωσης και της ανάπτυξης αναστολή της vcap organoids μετά siRNA επιμόλυνση

κύτταρα vcap απέτυχαν να αναπτυχθούν σε 3D συνθήκες, αν ενσωματωθεί απευθείας σε Matrigel ή καλλιέργειες κολλαγόνου. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα vCap επιμολύνθηκαν με τα siRNA όπως περιγράφεται για PC3. Στη συνέχεια, τα επιμολυσμένα κύτταρα Vcap αναπτύχθηκαν σε στρογγυλού πυθμένα πλάκες. Τα κύτταρα αφέθηκαν να συσσωματώνονται και σχηματίζουν σφαιροειδή για επτά ημέρες μετά την επιμόλυνση. Ένας μικρός αριθμός σφαιριδίων (1-6) μεταφέρθηκαν σε φρεάτια πλάκας καλλιέργειας 3D. Τέτοια organoids vcap έδειξε μερικά φαινοτυπικά αποτελέσματα, αλλά εμφάνισε αλλάξει οργανοειδή ανάπτυξης και τα διαφορετικά επίπεδα των αποπτωτικών, νεκρά ή πεθαίνουν τα κύτταρα σε 3D πολιτισμό ως απάντηση στην siRNAs, έτσι θεωρήθηκαν κατατοπιστική. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία CellTiter-Glo σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Promega, USA). Εν συντομία, ρυθμιστικό CellTiter-Glo και λυοφιλοποιήθηκε υπόστρωμα συνδυάστηκε, 100 μΐ του εν λόγω διαλύματος προστίθενται σε κάθε φρεάτιο δείγματος και η πλάκα ανακινείται για 30 λεπτά. Η φωταύγεια που προκύπτει από την λύση των κυττάρων και οι οποίες είναι σε αναλογία με την ποσότητα του τριφωσφορική αδενοσίνη (ΑΤΡ), μετρήθηκε με μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας EnVision multilabel (Wallac, Φινλανδία). Επιπλέον, η κασπάσης 3/7 δοκιμασία NucView έχει χρησιμοποιηθεί η οποία ανιχνεύει κύτταρα που υφίστανται ενεργά προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (περιγράφεται λεπτομερώς στο [26,27,28].

μετανάστευση 2D κυττάρων και δοκιμασία εισβολής

Η επεμβατική ή μεταναστευτικών δυναμικό των κυττάρων του προστάτη ερευνήθηκε με μια «πληγή μηδέν» ή δοκιμασία επούλωση της πληγής, που εκτελούνται σε πλάκες ImageLock 96 φρεατίων (Έσσεν Bioscience, USA). και τα δύο κύτταρα vcap και LNCaP έλειπε επεμβατικές ή κινητικά ιδιότητες σε 2D ή 3D συνθήκες. Αυτές οι κυτταρικές σειρές δεν παρουσίασαν ιδιότητες κλείσιμο της πληγής, και δεν ήταν χρήσιμα σε δοκιμασίες μηδέν πληγή. για το λόγο αυτό, χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα PC3, που εξέφραζαν επίσης επτά από τις οκτώ υποψήφια γονίδια σε σημαντικά επίπεδα, ήταν εύκολο να επιμολύνει με