Αφηρημένο

Σε προηγούμενες μελέτες, parasporin-2Aa1, αρχικά απομονώθηκε από

Bacillus thuringiensis

στέλεχος A1547, φάνηκε να είναι κυτταροτοξική έναντι συγκεκριμένων ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων, αλλά οι μηχανισμοί δράσης δεν μελετήθηκαν . Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι πρωτεϊνάση Κ ενεργοποιηθεί parasporin-2Aa1 πρωτεΐνη που απομονώνεται από ένα μυθιστόρημα

Β

.

thuringiensis

στέλεχος, 4R2, ήταν κυτταροτοξική ειδικά για να του ενδομητρίου, του παχέος εντέρου, του ήπατος, του τραχήλου, του μαστού και του καρκίνου του προστάτη. Έδειξε καθόλου τοξικότητα έναντι των φυσιολογικών κυττάρων. Κατά την επεξεργασία με πρωτεϊνάση Κ-ενεργοποιημένα parasporin-2Aa1, παρατηρήθηκαν μορφολογικές αλλαγές και ανάλυση κηλίδας Western απεκάλυψε την διάσπαση πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράση, κασπάσης-3 και κασπάσης-9 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές αποκλειστικά, ενδεικτικό του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, απόπτωση. Η κυτταρομετρία ροής αναλύσεις, χρησιμοποιώντας ιωδιούχο προπίδιο και αννεξίνης V, όπως επίσης και ένα κασπάσες 3/7 δοκιμασία επιβεβαίωσε επαγωγή απόπτωσης. Περαιτέρω αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν για τη μελέτη οδών επιβίωσης, συμπεριλαμβανομένου του ΑΚΤ, ΧΙΑΡ, ERK1 /2 και PAR-4, ενός γνωστού επαγωγέα απόπτωσης. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι parasporin-2Aa1 είναι ένας εκλεκτικός κυτταροτοξική πρωτεΐνη που επάγει την απόπτωση σε διάφορες ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές από διαφορετικούς ιστούς

Παράθεση:. Brasseur K, Auger P, Asselin Ε, η Μητρική εταιρεία S, Ακτή JC, Sirois Μ (2015) Parasporin-2 από τη Νέα

Bacillus thuringiensis

4R2 στέλεχος Προκαλεί κασπάσες ενεργοποίηση και την απόπτωση στα ανθρώπινα κύτταρα του καρκίνου. PLoS ONE 10 (8): e0135106. doi: 10.1371 /journal.pone.0135106

Επιμέλεια: Ferenc Gallyas, Jr., Πανεπιστήμιο του Πετς Ιατρική Σχολή, ΟΥΓΓΑΡΙΑ

Ελήφθη: 9η Απριλίου, 2015? Αποδεκτές: 16 Ιουλ 2015? Δημοσιεύθηκε: 11 Αυγούστου 2015

Copyright: © 2015 Brasseur et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από την εσωτερική ομάδα έρευνας UQTR. Kevin Brasseur ήταν ο κάτοχος του διδακτορικού υποτροφία από τις καναδικές Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας (CIHR). Eric Asselin είναι κάτοχος του προέδρου της έρευνας του Καναδά στη μοριακή gyneco-ογκολογίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Bacillus thuringiensis

είναι ένα Gram-θετικό βακτήριο που παράγει κρυσταλλικά παρασποριακά εγκλείσματα κατά τη διάρκεια της σποροπαραγωγής. Αυτά τα εγκλείσματα είναι κατασκευασμένα από πρωτεΐνες, οι δ-ενδοτοξίνες. Αυτά ταξινομούνται σε δύο οικογένειες, ο κρύσταλλος (Cry) και πρωτεϊνών (Cyt) κυτταρολυτική που κωδικοποιείται από το

κλαίνε

και

καθίσει

γονίδια, αντίστοιχα [1,2]. Οι πρωτεΐνες Cry έχουν μελετηθεί εκτενώς από το 1970, λόγω ειδική εντομοκτόνο δράση τους έναντι των λεπιδοπτέρων, διπτέρων και κολεοπτέρων [3]. Κατόπιν κατάποσης από ευπαθή έντομο, οι παρασποριακούς εγκλείσματα διαλυτοποιούνται σε αλκαλικό μέσο έντερο εντόμου, οι προτοξίνες Cry απελευθερώνονται και στη συνέχεια σε επεξεργασία από πρωτεάσες μέσου εντέρου για να αποδώσει ενεργοποιημένες πρωτεΐνες τοξίνης. Αυτά προσδένονται σε ειδικούς υποδοχείς που βρίσκονται επί της μεμβράνης των επιθηλιακών κυττάρων του εντέρου, οδηγώντας σε σχηματισμό πόρων και τελικά σε θάνατο των εντόμων [1,4].

Η επιτυχής ανάπτυξη και τη χρήση των

B

.

thuringiensis

έδρα σκευάσματα για τον έλεγχο των επιβλαβών εντόμων έχει οδηγήσει στην απομόνωση των χιλιάδων νέων στελεχών και εκατοντάδες πρωτεΐνες Cry έχουν πλέον χαρακτηριζόμενη σε διάφορους βαθμούς [5]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η μη εντομοκτόνες πρωτεΐνες Cry είναι ευρύτερα διανέμονται από τις εντομοκτόνες πρωτεΐνες Cry [6]. Αυτό οδήγησε στην έρευνα της εν δυνάμει νέων βιολογικών δραστηριοτήτων από τις μη εντομοκτόνες πρωτεΐνες Cry. Μετά από μια μεγάλη προβολή, ορισμένες μη εντομοκτόνο και μη αιμολυτικές πρωτεΐνες Cry έδειξε κυτταροτοξική δράση έναντι ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα και αυτά τα νέα

Β

.

thuringiensis

τοξίνες κλήθηκαν parasporins [7,8]. Μέχρι τώρα, έξι οικογένειες parasporins, PS1 -PS6, έχουν ταυτοποιηθεί [9]. Κάθε parasporin οικογένεια παρουσιάζει ειδικά το φάσμα και τον μηχανισμό δράσης ενάντια ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων.

Parasporin-2Aa1 (PS2Aa1, κατατάσσονται επίσης Cry46Aa1) που παράγεται από

Β

.

thuringiensis

οροποικιλίας

στέλεχος Ντακότα

A1547 έχει εντατικά μελετηθεί για τοξική δράση του σε καρκινικά κύτταρα [9-11]. Όταν ενεργοποιείται από πρωτεϊνάση Κ, PS2Aa1 είναι τουλάχιστον 400- φορές πιο τοξική για τον καρκίνο ανθρώπινη κυτταρική σειρά HepG2 (ανθρώπινο καρκίνο των ηπατοκυττάρων) από ό, τι για την κανονική ανθρώπινη κυτταρική σειρά HC (ανθρώπινη φυσιολογική ηπατοκυττάρων) και ανθρώπινη καρκινική κυτταρική σειρά HeLa (ανθρώπινου τραχηλικού μήτρας καρκίνος) [12]. Σε κύτταρα HepG2, η μονομερής τοξίνη φαίνεται να δεσμεύεται σε ένα άγνωστο πρωτεΐνη υποδοχέα που βρίσκεται στη λιπιδική σχεδία [13]. Μόλις που συνδέονται με τον υποδοχέα, PS2Aa1 oligomerizes να διαπερατά τη μεμβράνη που οδηγεί σε σχηματισμό πόρων [11,12]. Μια γλυκοσυλοφωσφατιδυλοϊνοσιτόλης (GPI) -anchored πρωτεΐνη φαίνεται να εμπλέκεται για την αποτελεσματική κυτταροκτόνο δράση του PS2Aa1 [13]. Pore ​​αποτελέσματα σχηματισμός σε μεταβολές των κυτταροσκελετικών δομών, ο κατακερματισμός του οργανιδίων, οι μεταβολές της μορφολογίας των κυττάρων, όπως η κυτταρική διόγκωση και τελικά κυτταρική λύση [11]. Ο τρόπος κυτταρικού θανάτου φαίνεται να είναι μη-αποπτωτικά αλλά αυτή η υπόθεση δεν επιβεβαιώθηκε [11-13]. Έτσι, επιπλέον χαρακτηρισμός των ενδοκυτταρικών γεγονότων που εμπλέκονται κατά τη διάρκεια induced- PS2Aa1 κυτταρικού θανάτου ήταν υποχρεωτικό να επιβεβαιώσει κατά πόσον ή όχι η απόπτωση εμπλέκονται.

Στην παρούσα μελέτη, ένα επιπλέον

Β

.

thuringiensis

στέλεχος που ονομάζεται

Bt

4R2 που περιέχει το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη Cry46Aa1 (PS2Aa1) έχει μελετηθεί για τον εντοπισμό των μηχανισμών που εμπλέκονται στην επαγωγή κυτταρικού θανάτου κυτοκτονικό-εξαρτώμενη. Βρήκαμε ότι PS2Aa1 ήταν πολύ κυτταροτοξική σε πολλά καρκινικά κύτταρα

in vitro

. Για την περαιτέρω διερεύνηση του μηχανισμού με τη χρήση επιλεγμένων καρκινικών κυττάρων από διαφορετικά ιστού (HepG2-ηπατοκυττάρων καρκίνο, καρκίνο PC-3-προστάτη και του καρκίνου του MCF-7-μαστού) βρήκαμε ότι η απόπτωση κυτταρικού θανάτου συνέβαινε μέσω κασπάσες και πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) διάσπαση. Βρήκαμε επίσης ότι PS2Aa1 εμφανίζει πολύ χαμηλή τοξικότητα σε φυσιολογικές κυτταρικές σειρές (IOSE-144, HIESC, HIEEC και MCF-10Α).

Έχουμε στηρίξει περαιτέρω την υπόθεση της επαγωγής απόπτωσης με την αναγνώριση των διαφόρων αναστολή της οδού επιβίωσης συμπεριλαμβανομένων των AKT , ΧΙΑΡ, ERK1 /2 και επαγωγή της καταστολής του όγκου PAR-4 μετά από θεραπεία με PS2Aa1. Μπορούμε επίσης ανακάλυψε ότι αναστολή της /ΑΚΤ οδού ΡΙ3Κ σε συνδυασμό με την τοξίνη αυξάνει, σε μία συνεργική τρόπο, η αποτελεσματικότητα της PS2Aa1 να διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα. Έτσι, PS2Aa1 φαίνεται να είναι ένα κύτταρο-δολοφονία διακρίσεις τοξίνη που ρυθμίζουν την απόπτωση σε διαφορετικά ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Βακτηριακό στέλεχος και τον πολιτισμό μέσα ενημέρωσης

Β

.

thuringiensis

οροποικιλίας

Ντακότα

στέλεχος 4R2 χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη. Έχει ληφθεί από το

Bacillus

Genetic Stock Center (Ohio State University, Columbus, OH, USA). Τα βακτηριακά κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 30 ° C σε θρεπτικό άγαρ από τη Sigma-Aldrich (St-Louis, ΜΟ, USA) σε ρΗ 7.1.

Κύτταρα και συνθήκες καλλιέργειας

Ανθρώπινο ηπατοκυττάρου κυτταρική γραμμή καρκίνου HepG2 (ΗΒ-8065), ανθρώπινου προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή PC-3 (CRL-1435), ανθρώπινα επιθηλιακά κυτταρική σειρά ορθοκολικού αδενοκαρκινώματος Caco-2 (ΗΤΒ-37), ανθρώπινα επιθηλιακά τραχήλου κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος HeLa (CCL-2), ανθρώπινη μήτρα ενδομήτριο κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος Hec-1Α (ΗΤΒ-112), ανθρώπινη μήτρα ενδομητρίου κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος KLE (CRL-1622), την ανθρώπινη κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος μαστού ΜΟΑ-ΜΒ231 (ΗΤΒ-26), ανθρώπινου μαστού καρκινική κυτταρική γραμμή MCF-7 (ΗΤΒ -22), ανθρώπινο μη ογκογόνα επιθηλιακά κύτταρα ΜΟΡ-10Α (CRL-10317), ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα ωοθηκών κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος OVCAR-3 (ΗΤΒ-161) και ανθρώπινων επιθηλιακών ωοθήκης κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος SKOV-3 (ελήφθησαν ΗΤΒ-77) από την American Type Culture Collection (ATCC). Ανθρώπινη αθάνατος μη ογκογόνα επιφάνεια των ωοθηκών επιθηλιακής κυτταρικής γραμμής IOSE-144 παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. David Hunstman (British Columbia Cancer Research Center, Vancouver, BC, Canada). Ανθρώπινα αθάνατα ενδομητρίου στρωματικά κύτταρα HIESC και Ανθρωπίνων αθάνατα ενδομητρίου επιθηλιακά κύτταρα HIEEC ήταν ένα δώρο είδος και παράγεται από τον Δρ Μισέλ Fortier (νοσοκομειακό κέντρο de l’Université Laval, Quebec City, QC, Καναδάς) [14]. Ανθρώπινα κύτταρα καρκινώματος ωοθηκών Α2780 ευγενικά από τον Dr. G. Peter Raaphorst (Οττάβας Περιφερειακό Κέντρο Καρκίνου, Ottawa, ON, Καναδάς). Ανθρώπινα ενδομητρίου κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος Ishikawa ευγενώς από τον Dr. Samuel Chogran (Université de Montréal, Montreal, QC, Καναδάς). HepG2, PC-3, κύτταρα HIEEC και HIESC γραμμές διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου και 50 μg /ml γενταμυκίνη. κυτταρικές σειρές OVCAR-3 MCF-7 και διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει 10% ορό βοείου αυξητικής και 50 μg /ml γενταμυκίνη. κυτταρική σειρά MDA-MB-231 διατηρήθηκε σε RPMI 1640 μέσο που περιέχει 5% ορό βοείου αυξητικής και 50 μg /ml γενταμυκίνη. Hec-1Α κυτταρική γραμμή διατηρήθηκε σε μέσο McCoy που περιέχει 5% ορό βοείου αυξητικής και 50 μg /ml γενταμυκίνη. SKOV-3 κυτταρική γραμμή διατηρήθηκε σε μέσο McCoy που περιέχει 10% ορό βοείου αυξητικής και 50 μg /ml γενταμυκίνη. HeLa, Ishikawa και Α2780 κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε μέσο DMEM-F12 που περιείχε 2% ορό βοείου αυξητικής και 50 μg /ml γενταμυκίνη. κυτταρική σειρά MCF-10Α διατηρήθηκε σε μέσο DMEM-F12 που περιείχε 5% ορό εμβρύου ανάπτυξη, 20 ng /ml EGF, 0,5 mg /ml υδροκορτιζόνη, 100 ng /ml τοξίνης χολέρας, 10 μg /ml ινσουλίνη και 1Χ Πενικιλλίνη-Στρεπτομυκίνη. KLE κυτταρική γραμμή διατηρήθηκε σε μέσο DMEM-F12 χωρίς HEPES που περιείχε 10% ορό βοείου αυξητικής και 50 μg /ml γενταμυκίνη. Caco-2 κυτταρική γραμμή διατηρήθηκε σε μέσο DMEM-F12 που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου και 50 μg /ml γενταμυκίνη. IOSE-144 κυτταρική γραμμή διατηρήθηκε σε μέσο MCDB105 που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός και 50 μg /ml γενταμυκίνη. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2.

Σύνολο απομόνωση DNA

Σύνολο DNA από

Β

.

thuringiensis

4R2 απομονώθηκε από μια ολονύκτια καλλιέργεια 5 ml χρησιμοποιώντας QIAmp DNA kit mini αίμα (Qiagen, Τορόντο, ΟΝ, Καναδάς), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή για την εκχύλιση του βακτηριακού DNA.

ενίσχυση PCR

Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη σχεδιάστηκαν στο εργαστήριο μας από το

αλληλουχία κλαίνε

νουκλεοτιδίων 46Aa1 γονιδίου. Εναρκτήρες για PCR ενίσχυση ήταν ως εξής:

Bt

4R2-2F: 5′- TAACCGGAGGGCTTCAAG -3 ‘(με νόημα) και

Bt

4R2-1R: 5′- TAATTCCCCCATTTTGGG -3′ (αντινοηματικό ). PCR διεξήχθησαν σε έναν Applied Biosystems 2720 θερμικό κυκλοποιητή (Life Technologies, Οτάβα, ΟΝ, Canada). Οι αντιδράσεις PCR διεξήχθησαν σε ένα όγκο 50 μι που περιείχε 200μΜ κάθε ένα από τριφωσφορικούς νουκλεοζίτες (dNTP), ρυθμιστικό 1Χ PCR, 0,5μM κάθε εκκινητές, 100 ng DNA και 1,25 μονάδες Taq DNA πολυμεράσης. Όλα τα PCR αντιδραστήρια ήταν από την New England Biolabs (Ottawa, ΟΝ, Canada). PCR διεξήχθη με ένα αρχικό στάδιο αποδιάταξης στους 94 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενη από 30 κύκλους στους 94 ° C για 45 s, 50 ° C για 30 s, 72 ° C για 2 λεπτά και μία τελική επέκταση στους 72 ° C για 7 λεπτά. Τα προϊόντα της PCR ήταν μεγέθους διαχωρίζεται σε ένα πήκτωμα 1% αγαρόζης και οπτικοποιούνται χρησιμοποιώντας SYBR-Safe (Invitrogen, Burlington, ΟΝ, Canada) χρώση κατά υπεριώδη ακτινοβολία.

DNA αλληλούχιση

αμπλικόνια καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας το Καθαρισμός Kit Mini Εκλούστε PCR από την Qiagen. Οι καθαρισμένες αντιδράσεις PCR διαχωρίστηκαν σε 3130XL Γενετικής Analyser (Applied Biosystems) σε IBIS Plate-forme d’αναλύσεις Génomiques (ΠΣΟ) de l’Université Laval (Κεμπέκ, QC, Καναδάς). Και τα δύο σκέλη της ακολουθίας του DNA η αλληλουχία: Η αλληλουχία 940pb συγκρίθηκε χρησιμοποιώντας το εργαλείο Blast-N (National Center for Biotechnology Information? Www.ncbi.nim.nih.gov)

Παρασκευή ενεργοποιημένου παρασπορικών πρωτεΐνες

Bacillus thuringiensis

στέλεχος 4R2 καλλιεργήθηκε επί πλακών θρεπτικού άγαρ, επωάστηκαν για 4 ημέρες στους 30 ° C μέχρι κυτταρική λύση. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν από τα τρυβλία και πλένεται δύο φορές με αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό. Το σφαιρίδιο που περιείχε τα σπόρια κρυστάλλων Πρωτεΐνες διαλυτοποιήθηκε σε 500 μι του ρυθμιστικού διαλύματος διαλυτοποίησης που περιέχει 56mm Na

2CO

3 (pH: 11,4) και 11mM διθειοθρεϊτόλης (DTT) για 1 ώρα στους 37 ° C. Αδιάλυτο υλικό σφαιροποιήθηκε με φυγοκέντρηση στις 13 200 rpm για 2 λεπτά και το υπερκείμενο πέρασε μέσω ενός φίλτρου μεμβράνης 0, 22μm. 250 μΐ του διηθήματος μεταφέρθηκε σε ένα αποστειρωμένο σωλήνα φυγοκέντρησης 1,5ml και το ρΗ ρυθμίστηκε στο 8 με 1Μ Tris-HCl (ρΗ 4,98).

Τα διαλυτοποιημένα πρωτεΐνες υπέστησαν πέψη με είτε πρωτεϊνάση Κ (τελική συγκέντρωση σε 185μg /ml) ή θρυψίνη (τελική συγκέντρωση στο 300μg /mL) για 1 ώρα στους 37 ° C. φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο (PMSF) προστέθηκε (τελική συγκέντρωση 1 mM) για να σταματήσει πρωτεολυτική επεξεργασία. Για να επιβεβαιωθεί η παρουσία των παρασπορικών πρωτεϊνών, ανάλυση SDS-PAGE πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται αλλού [15] χρησιμοποιώντας 4% πηκτή στοιβασίας και 12% διαχωριστική γέλη. Μετά την ηλεκτροφόρηση, η πηκτή χρωματίστηκε με 0, 1% Coomassie blue R-250 (Sigma-Aldrich). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με την Bio-Rad DC Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ΟΝ, Canada).

Δοκιμασία κυτταροτοξικότητας

Η αντιπολλαπλασιαστική δραστικότητα

B

.

thuringiensis

4R2 πρωτεΐνες τοξίνης εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ [16,17]. Εν συντομία, πλάκες σπάρθηκαν με 180μL των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων σε αιώρηση (για HIESC, 14 000? IOSE-144, 12 000? HIEEC, 15 000? Ishikawa, 16 000? HeLa, 16 000? KLE, 14 000? Hec- 1Α, 12 000? Caco-2, 20 000? PC-3, 16 000? HepG2, 20 000? Α2780, 16 000? OVCAR-3, 20 000? SKOV-3, 14 000? MCF-7, 16, 000? MDA-ΜΒ231, 12 000 και MCF-10Α, 8000) σε μέσο χρησιμοποιώντας 96 φρεατίων. Οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C, 5% CO

2 για 24 ώρες. Φρέσκο ​​διαλύονται και ενεργοποιείται

Β

.

thuringiensis

4R2 πρωτεΐνες τοξίνης (με πρωτεϊνάση Κ ή θρυψίνη) σε ρυθμιστικό διαλυτοποίησης αραιώθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο και δείγματα 100μL που περιέχουν κλιμάκωση συγκεντρώσεις των πρωτεϊνών τοξίνης (0μg /mL έως 20 μg /mL) προστέθηκαν και οι πλάκες επωάστηκαν για 24 ακόμη ώρες. Η τελική συγκέντρωση του ρυθμιστικού διαλυτοποίησης (56mm Na2CO3, 11mM DTT, 100 μg /ml πρωτεϊνάση Κ (ή 30mg /mL θρυψίνης) και 1 mM PMSF) στο μέσο καλλιέργειας ήταν 8% και διατηρήθηκε σταθερή σε όλα τα πειράματα. Μετά από 24 ώρες, 10 μί 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) (5 mg /ml σε PBS) προστέθηκαν στα φρεάτια. Τέσσερις ώρες αργότερα, 100 μl διαλύματος διαλυτοποίησης (10% δωδεκυλ θειικό νάτριο (SDS) σε 0,01 Μ HCl) προστέθηκαν και οι πλάκες επωάζονται όλη τη νύκτα (37 ° C, 5% CO

2). Η οπτική πυκνότητα διαβάστηκε χρησιμοποιώντας ένα Fluostar βέλτιστα BMG (BMG Labtech Inc., Durham, NC, USA) σε 565 nm. Αναγνώσεις που λαμβάνονται από επεξεργασμένα κύτταρα συγκρίθηκαν με τις μετρήσεις από πλάκες κυτταρικής έλεγχος κατά την ημέρα θεραπεία? και το ποσοστό της αναστολής της ανάπτυξης των κυττάρων υπολογίστηκε για κάθε πρωτεΐνη τοξίνης (πρωτεϊνάση Κ ή θρυψίνη ενεργοποιημένη ενεργοποιημένη). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Οι δοκιμασίες θεωρείται έγκυρο όταν ο συντελεστής διακύμανσης για ένα δεδομένο σύνολο συνθηκών και μέσα στο ίδιο πείραμα ήταν & lt? 10%.

Φως μικροσκοπία παρατήρηση

Για παρατήρηση των μορφολογικών αλλαγών, η κανονική (HIESC) και καρκινικά κύτταρα (PC-3, MCF-7 και HepG2) παρατηρήθηκαν μετά από θεραπεία 24 ώρες με πρωτεϊνάση K ενεργοποιημένες πρωτεΐνες τοξίνης σε 1 μg /mL (MCF-7) ή 2 μg /mL (HIESC, PC-3 και HepG2). 10Χ και 20Χ μεγεθύνσεις χρησιμοποιήθηκαν με την Olympus (μοντέλο ΒΧ60) οπτικό μικροσκόπιο (Carsen Group, Markham, ON, Καναδάς).

Αντισώματα και αντιδραστήρια

Το Na

2CO

3, DTT, 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου, HCl, SDS, PMSF, Tris-HCl και πρωτεϊνάση Κ ελήφθησαν όλα από την Sigma-Aldrich. Όλα τα πρωτογενή αντισώματα ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Bervely, MA, USA) εκτός από β-ακτίνης (Sigma-Aldrich). Δευτερογενής αντίσωμα, ΗΡΡ-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού ήταν αγορά από την Bio-Rad Laboratories. Αννεξίνη V /PI κιτ απόπτωση αγοράστηκε από την Invitrogen. ΜΕΚ ½ αναστολέα, U0126, ελήφθη από την Cell Signaling Technology και του αναστολέα της ΡΙ3Κ, βορτμαννίνη, ελήφθη από την Sigma-Aldrich.

κηλίδος Western

PS2Aa1 επεξεργασμένα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και υποβλήθηκαν σε λύση σε ψυχρό ρυθμιστικό που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης RIPA (Complete από την Roche Applied Science, Laval, QC, Canada) και αναστολέα φωσφατάσης (PhosSTOP από τη Roche Applied Science) ακολουθούμενη από τρεις κύκλους ψύξης-απόψυξης. Ίσες ποσότητες των προϊόντων λύσης κυττάρου, προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία πρωτεΐνης Bio-Rad DC, διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου (10-14%) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 5% γάλα, PBS 1Χ, 0,06% Tween 20 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, ανιχνεύθηκαν με πρωτογενές αντίσωμα, πλύθηκαν σε PBS 1Χ, 0,06% Tween 20, και επωάστηκαν με συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου δευτερεύον αντίσωμα (Bio-Rad ). Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση SuperSignal West Femto υπόστρωμα (Thermo Fisher Scientific, Nepean, ΟΝ, Canada), όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή χρησιμοποιώντας συστήματα UVP bioimaging.

Μέτρηση αννεξίνης κυττάρων V /PI

FITC Annexin V /Dead κυτταρικής απόπτωσης Kit (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα επεξεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS και αραιώνονται σε 1Χ δέσμευσης αννεξίνης ρυθμιστικό (100 μΙ). Για κάθε δείγμα, 5 μL αννεξίνης V και 2 μΙ ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) προστέθηκαν στο κυτταρικό εναιώρημα και επωάζεται για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ένας επιπρόσθετος όγκος 100 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης αννεξίνης προστέθηκε σε κάθε δείγμα για ένα σύνολο 200 μλ. Τα δείγματα αναλύθηκαν (10 000 καταχωρήσεις) χρησιμοποιώντας μια ροή Beckman Coulter κυτταρομετρητή Cytomics FC500. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού CXP Ανάλυση (Beckman Coulter, Mississauga, ON, Καναδάς).

κασπάσης 3-7 δοκιμασία

Για να μετρηθεί η ειδική δραστικότητα της κασπάσης 3 και 7, ένα κιτ δοκιμασίας φωταύγειας χρησιμοποιήθηκε ονομάστηκε κασπάση-Glo 3/7 δοκιμασία (Promega, Madison, WI, USA)). Η δοκιμασία αυτή παρέχει μια proluminescent κασπάσης-3/7 υπόστρωμα που περιέχει μια αλληλουχία (DEVD) ειδικά για κασπάση 3 και 7. Εάν κασπάσες 3 ή /και 7 είναι ενεργά, το υπόστρωμα διασπάται και aminoluciferin θα εκπέμπεται. Εν συντομία, πλάκες σπάρθηκαν με 180μL των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων σε εναιώρημα (για HIESC, 14 000? PC-3, 16 000? HepG2, 20 000 και MCF-7, 16 000) σε μέσο. Οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C, 5% CO

2 για 24 ώρες. Φρέσκο ​​διαλύονται και ενεργοποιείται

Β

.

thuringiensis

4R2 πρωτεΐνες τοξίνης (με πρωτεϊνάση Κ) σε ρυθμιστικό διάλυμα διαλυτοποίησης αραιώνονται σε φρέσκο ​​μέσο. Στη συνέχεια, δείγματα 100μL που περιέχουν την τοξίνη, με ή χωρίς αναστολείς, προστέθηκαν και οι πλάκες επωάστηκαν για 24 ακόμη ώρες. Η τελική συγκέντρωση του ρυθμιστικού διαλυτοποίησης (56mm Na2CO3, 11mM DTT, 100 μg /ml πρωτεϊνάση Κ και 1 mM PMSF) στο μέσο καλλιέργειας ήταν 8% και διατηρήθηκε σταθερή σε όλα τα πειράματα. Μετά από 24 ώρες, 100 μl της κασπάσης-Glo αντιδραστήριο 3/7 προστέθηκε στα φρεάτια. Μία ώρα αργότερα, η οπτική πυκνότητα αναγνώστηκε χρησιμοποιώντας ένα Fluostar βέλτιστα BMG (BMG Labtech Inc., Durham, NC, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Αναγνώσεις που λαμβάνονται από επεξεργασμένα κύτταρα συγκρίθηκαν με τις μετρήσεις από τα κύτταρα ελέγχου χρησιμοποιώντας αυξήσεις φορές. . Κάθε πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν

Στατιστικές αναλύσεις

Τα δεδομένα υποβλήθηκαν σε είτε μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης ή έλεγχος τ (PRISM έκδοση λογισμικού 5.00? GraphPad, San Diego, CA ). Οι διαφορές μεταξύ των πειραματικών ομάδων, όταν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης, προσδιορίστηκαν με δοκιμή του Tukey για. Η στατιστική σημαντικότητα έγινε δεκτή όταν p & lt? 0.05.

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός του Β thuringiensis 4R2 πρωτεΐνη κυτταροτοξική κρύσταλλο

ανάλυση SDS-PAGE των διαλυτοποιημένων κρυσταλλικών πρωτεϊνών απεκάλυψε μία κύρια ζώνη που εκτιμάται σε 37 kDa, που αντιστοιχεί στο η φυσική μορφή της Cry46Aa1 πρωτεΐνης (Εικόνα 1). Σε πειράματα PCR με ειδικούς εκκινητές Cry46Aa1, ένα προϊόν ενίσχυσης 940bp ελήφθη. Αναλύσεις της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων χρησιμοποιώντας εργαλεία BLAST αποκάλυψε ότι η αλληλουχία νουκλεοτιδίων ήταν 100% ομόλογη με την πρωτεϊνάση Κ ενεργοποιημένου Cry46Aa1 αλληλουχία νουκλεοτιδίων (NCBI αριθμό πρόσβασης AB099515.1). Λόγω αυτού του νουκλεοτιδίου ταυτότητα ακολουθίας, οι 37 kDa κρύσταλλο πρωτεΐνες από

Β

.

thuringiensis

4R2 ονομάστηκε PS2Aa1

(Α) Διαδρομή 1:. Μοριακό βάρος σήμανση? λωρίδα 2: διαλυτοποιημένα pro-PS2Aa1. αλληλουχία (Β) νουκλεοτίδια του

κλαίνε

46Aa1 θραύσμα γονιδίου που λαμβάνεται μετά από ενίσχυση με το ζεύγος εκκινητών Bt4R2-2F και Bt4R2-1R.

Η

κυτταροτοξικότητα του PS2Aa1 σε καρκινικά και φυσιολογικά κύτταρα

η θρυψίνη (που χρησιμοποιείται ως θεραπεία ελέγχου) και πρωτεΐνες ενεργοποιούνται κρύσταλλο πρωτεϊνάση Κ από

Β

.

thuringiensis

4R2 (PS2Aa1) εξετάστηκαν για κυτταροτοξικότητα εναντίον φυσιολογικών και καρκινικών ανθρώπινα κύτταρα χρησιμοποιώντας Δοκιμασία ΜΤΤ για 24 ώρες θεραπείας (Σχήμα 2). Δεν κυτταροκτόνο δραστικότητα παρατηρήθηκε μετά από επεξεργασία με θρυψίνη των διαλυτοποιημένων κρυσταλλικών πρωτεϊνών για οποιαδήποτε από τις γραμμές κυττάρων. Μεταξύ των κυττάρων που δοκιμάστηκαν, πρωτεϊνάση Κ πρωτεΐνες ενεργοποιούνται κρύσταλλο ήταν ιδιαίτερα κυτταροτοξική σε HepG2, MCF-7, KLE, Hec-1A, MDA-ΜΒ231 και PC-3 κύτταρα ενώ είναι μετρίως κυτταροτοξικά σε κύτταρα Caco-2. Καμία σημαντική κυτταροτοξική δράση παρατηρήθηκε στην Α2780, OVCAR-3, SKOV-3 και καρκινικές κυτταρικές σειρές HeLa. Καμία από τις φυσιολογικές κυτταρικές σειρές (IOSE-144, HIEEC, HIESC και MCF-10Α) έδειξε κυτταροτοξικά αποτελέσματα. Η κυτταροτοξικότητα των κρυσταλλικών πρωτεϊνών ήταν δοσο-εξαρτώμενη και εξετάστηκε χρησιμοποιώντας σειριακές αραιώσεις πρωτεϊνών. Με βάση την υψηλή ευαισθησία τους σε PS2Aa1, HepG2, επιλέχθηκαν κυτταρικές σειρές PC-3 και MCF-7 καρκίνου για περαιτέρω πειραματισμούς. κύτταρα HIESC χρησιμοποιήθηκαν ως ένα κανονικό μοντέλο κυτταρική γραμμή για την περαιτέρω διερεύνηση των επιπτώσεων της PS2Aa1 σε μη καρκινικά κύτταρα.

Κανονικό καλλιεργημένα ανθρώπινα κύτταρα (Α) και του καρκίνου καλλιεργημένα ανθρώπινα κύτταρα (Β) (2 Χ 10

4 κύτταρα) προεπωάστηκαν στους 37 ° C για 20 ώρες? Προστέθηκε η τοξίνη σε αγωγή με θρυψίνη (○) ή πρωτεϊνάση Κ (●) (τελικές συγκεντρώσεις, 0,3 μ§ /mL έως 20 μg /mL) επωάζονται περαιτέρω για 24 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ΜΤΤ.

Η

Μορφολογικές αλλαγές στα καρκινικά κύτταρα που προκαλείται από PS2Aa1

Για να μελετηθεί περαιτέρω το αποτέλεσμα της PS2Aa1, συγκεντρώσεις από 1 μg /mL έως 2 μg /mL χρησιμοποιήθηκαν βασίζονται σχετικά με το προηγούμενο πείραμα κυτταρικής βιωσιμότητας. Μετά τη θεραπεία με ενεργοποιημένες πρωτεΐνες PS2Aa1 πρωτεϊνάσης Κ σε HepG2 (2 μg /mL), PC-3 (2 μg /mL) και MCF-7 κύτταρα (1 μg /mL), μορφολογικά χαρακτηριστικά των κατεργασμένων κυττάρων παρατηρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός (Σχήμα 3) . Κυττάρων συρρίκνωση, χαρακτηριστικό του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου [18], παρατηρήθηκε μόνο σε HepG2, MCF-7 και PC-3 καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, δεν μορφολογικές αλλαγές παρατηρήθηκαν σε HIESC? επιβεβαιώνοντας τη μη κυτταροτοξικότητα της PS2Aa1 σε φυσιολογικά κύτταρα, όπως προηγουμένως παρατηρήθηκε με το πείραμα ΜΤΤ. Δεν παρατηρήθηκαν νέκρωση μορφολογικές αλλαγές όπως κυτταρική διόγκωση ή διόγκωση [18].

PC-3 (Α), κύτταρα MCF-7 (Β), HepG2 (C) και HIESC (D) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 μg /mL ή 2 μg /mL

Β

.

thuringiensis

4R2 πρωτεΐνες τοξίνης για 24 ώρες. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα παρατηρήθηκαν με μικροσκόπιο φωτός σε μεγέθυνση 10Χ και 20Χ. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

PS2Aa1 προκαλεί κυτταρικό θάνατο μέσω αποπτωτικών μηχανισμών

Για να επιβεβαιώσετε τις προηγούμενες παρατηρήσεις μας σχετικά με τις μορφολογικές αλλαγές που σχετίζονται με την απόπτωση που συμβαίνουν σε καρκινικά κύτταρα, πραγματοποιήσαμε αννεξίνη V /ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) χρώση ανάλυση επί των κατεργασμένων κυττάρων. Annexin V έχει την ικανότητα να βάφει φωσφατιδυλοσερίνη στην εξωτερική φύλλο της μεμβράνης πλάσματος και την παρουσία της στο εξωτερικό φύλλο αντί του εσωτερικού φυλλάδιο είναι ένα μοναδικό χαρακτηριστικό της απόπτωσης [19]. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι 6 ώρες και 24 ώρες μετά τη θεραπεία, PS2Aa1 επαγόμενη υψηλό επίπεδο απόπτωσης σε όλες τις τρεις καρκινικές κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4A-4C) και πολύ λίγο στην κανονική του ενδομητρίου κυτταρική σειρά καρκίνου HIESC (Εικ 4D) Αυτή είναι σε άμεση συσχέτιση με την ΜΤΤ αποτελέσματα της ανάλυσης (Σχήμα 2). Τα περισσότερα καρκινικά κύτταρα έδειξαν υψηλό επίπεδο απόπτωσης μετά 6 ώρες θεραπείας υποδεικνύει την υψηλή απόδοση της PS2Aa1 στην επαγωγή της απόπτωσης.

PC-3 (Α), MCF-7 (Β), HepG2 (C) και HIESC (D κύτταρα) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με

Β

.

thuringiensis

4R2 πρωτεΐνες τοξίνης (1 μg /mL (Β) ή 2 μg /mL (A, C, D)) για 24 ώρες. Annexin V και χρώση ΡΙ ανιχνεύτηκε με ανάλυση FACS. Τα αποτελέσματα είναι μέσες ± S.E.M. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt?. 0.05 σε σύγκριση με την αντίστοιχη ψευδο-κατεργασμένα κύτταρα

Η

Επειδή PS2Aa1 προκαλεί υψηλή τοξικότητα και πολλά κύτταρα είναι PI θετική μόνο μετά από 24 ώρες, αποφασίσαμε να εκτελέσει μια δοκιμασία της κασπάσης-3/7 για να ελέγξετε αν PS2Aa1 ενεργοποιεί ειδικά κασπάσες -3 και -7 να επάγει απόπτωση (Σχήμα 5). Μετά τη θεραπεία 24 ώρες, PS2Aa1 αύξησε σημαντικά τη δραστικότητα των δύο κασπασών -3 και -7 σε PC-3 και κυτταρικές γραμμές καρκίνου HEPG2 (Σχήμα 5Α και 5C). MCF-7 κυτταρική σειρά καρκίνου είναι κασπάσης-3 με ανεπάρκεια και λαμβάνοντας υπόψη αυτής της ανεπάρκειας, μόνο κασπάσης-7 μπορεί να μετρηθεί με την δοκιμασία αυτή σε αυτή την κυτταρική γραμμή [20]. Μια σημαντική αύξηση της δραστηριότητας κασπάσης μπορεί να παρατηρηθεί σε MCF-7 κυτταρική σειρά καρκίνου του που δείχνει ότι η απόπτωση που επάγεται αντισταθμίζεται από κασπάση-7, εμπλέκονται στο μηχανισμό δράσης του PS2Aa1 (Σχήμα 5Β). Χαμηλό επίπεδο κυτταρικού θανάτου ήταν προηγουμένως παρατηρήθηκαν σε φυσιολογικά HIESC κυτταρική γραμμή με Annexin V /PI κυτταρομετρία ροής και κατά συνέπεια, καμία σημαντική αύξηση της κασπάσης-3/7 Δράση θα μπορούσε να μετρηθεί με την δοκιμασία της κασπάσης σε HIESC (Σχήμα 5D).

PC-3 (Α), MCF-7 (Β), κύτταρα HepG2 (C) και HIESC (D) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με

B

.

thuringiensis

4R2 πρωτεΐνες τοξίνης (2 μg /mL) για 24 ώρες. Το επίπεδο των κασπασών-3/7 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κασπάση-Glo 3/7 δοκιμασίας. Τα κύτταρα MCF-7 (Β) είναι Caspase-3 με ανεπάρκεια και μόνο κασπάση-7 μπορεί να μετρηθεί. * Ρ & lt? 0.05 και ** Ρ & lt?. 0.01 σε σύγκριση με το αντίστοιχο ψευδο-κατεργασμένα κύτταρα

Η

Για να διερευνηθεί περαιτέρω επαγωγή απόπτωσης, μπορούμε επίσης να μετρηθεί διαφορετικούς δείκτες απόπτωσης με ανάλυση κηλίδος Western όπως διασπασμένη κασπάση 3, 8, -9 και διασπασμένη PARP. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι, ήδη από 6 ώρες της θεραπείας με PS2Aa1, η διάσπαση της κασπάσης-3 /ενεργοποίησης παρατηρήθηκε και στα δύο PC-3 και HepG2 καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 6Α και 6C? MCF-7 είναι κασπάσης-3 αρνητικό). Μόλις ενεργοποιηθεί, κασπάσης-3 είναι ένας κασπάση ενέργειας και μπορεί να κάνει πρωτεολυτική διάσπαση σε διάφορες πρωτεΐνες, όπως η πρωτεΐνη επισκευή PARP, τότε οδηγούν σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Ωστόσο, κασπάσης-3 απαιτεί κασπάσες έναρξης είτε από το ενδογενούς ή εξωγενούς μονοπατιού για να διασπαστεί /ενεργοποιηθεί [21,22]. Με ανάλυση κηλίδος western, μετρήσαμε διασπασμένη κασπάση-8 (εξωγενής οδός) και διασπασμένη κασπάση-9 (εγγενής οδός) και ανακάλυψαν ότι μόνο κασπάσης-9 διάσπασης /ενεργοποίησης ήταν παρούσα και στις τρεις κυτταρικές γραμμές καρκίνου (Σχήμα 6Α-6C), ενώ κασπάσης-8 διάσπασης /ενεργοποίησης δεν παρατηρήθηκε (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε συσχέτιση με διάσπαση κασπάσες, PS2Aa1 επίσης επαγόμενη διάσπαση PARP /αποδόμησης και στις τρεις κυτταρικές γραμμές καρκίνου (Σχήμα 6Α-6C). Διασπασμένη PARP και διασπάστηκε επίπεδα πρωτεΐνης κασπάσης-3 είναι χαμηλά μετά τη θεραπεία 24 ώρες της τοξίνης στο HEPG2 καρκινική κυτταρική σειρά (Σχήμα 6C). Αυτό είναι πιθανώς επειδή τα περισσότερα κύτταρα ήταν νεκρά μετά 6 ώρες (& gt? 75%). Μετά από 24 ώρες θεραπείας, σχεδόν όλα τα κύτταρα HepG2 ήσαν νεκρά επιπλέουν και (& gt? 92%). Πρωτεΐνες ήταν πιθανώς όλοι υποβαθμισμένη λόγω των πρωτεασών δράση στα τέλη της απόπτωσης οδηγεί σε μαζική πρωτεΐνη και κυτταρική καταστροφή [23]. Αυτό υποστηρίζεται περαιτέρω από τα δεδομένα ΜΤΤ (Σχήμα 2Β) και αννεξίνης V /PI κυτταρομετρία ροής (σχήμα 4Γ και 4Η) τα οποία δείχνουν ότι σχεδόν το 100% των κυττάρων είναι νεκρά σε αυτή τη συγκέντρωση μετά από 24 ώρες θεραπείας εξηγώντας την κατάσταση που παρατηρείται. Είναι επίσης αξιοσημείωτο ότι κανένα από αυτούς τους δείκτες απόπτωσης παρατηρήθηκαν στην κανονική κυτταρική σειρά HIESC (Σχήμα 6D) που δείχνει ότι δεν απόπτωση που συμβαίνουν χρησιμοποιώντας την μέγιστη δόση των PS2Aa1 (2 μg /ml) που χρησιμοποιήθηκε προηγουμένως επί καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Οι ζώνες στυπώματος Western ορατά στο φυσιολογικό HIESC κυτταρική γραμμή είναι το βασικό επίπεδο των διαφόρων δεικτών, παρατηρήσιμη μόνο μετά από υψηλές έκθεση για να αποκαλύψει τις κατάλληλες ζώνες πρωτεΐνης (Εικ 6D). Αυτό είναι σε συμφωνία με την απουσία της απόπτωσης και τη δραστηριότητα των κασπασών-3/7 που παρατηρήθηκε στα προηγούμενα πειράματα για την κανονική κυτταρική γραμμή HIESC (Σχήματα 4 και 5).

PC-3 (Α), MCF-7 ( Β), κύτταρα HepG2 (C) και HIESC (D) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με

B

.

thuringiensis

4R2 πρωτεΐνες τοξίνης (1-2μg /ml) για 6 ώρες και 24 ώρες. Τα επίπεδα της απόπτωσης-ειδική σχάση πρωτεϊνών κασπάσης-3, κασπάσης-9 και PARP προσδιορίστηκαν σε κύτταρα επεξεργασμένα με τη χρήση ανάλυσης στυπώματος Western. Τα κύτταρα MCF-7 (Β) είναι κασπάση-3 ανεπάρκεια. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Κανονισμός διαφορετικών οδών επιβίωσης και θανάτου σε απάντηση PS2Aa1

Όλα τα προηγούμενα πειράματα δείχνουν ότι PS2Aa1 τοξίνη μπορεί να προκαλέσει θάνατο των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα μέσω της επαγωγής της απόπτωσης. Προκειμένου να διερευνηθεί η πιθανή συμμετοχή άλλων οδών επιβίωσης /θανάτου, είχαμε διενεργήσει επιπρόσθετες πειράματα σε καρκινικά κύτταρα προστάτη PC3 χρησιμοποιώντας ανάλυση Western blot. Ερευνήσαμε πρώτα την οδό επιβίωσης ΑΚΤ γνωστή για να είναι ένας σημαντικός μηχανισμός επιβίωσης για τα καρκινικά κύτταρα. Οι πρωτεΐνες από την οδό ΑΚΤ συχνά μεταβάλλεται σε καρκίνο και το υψηλό σήμα επιβίωσης από αυτές τις μεταλλάξεις είναι συχνά υπεύθυνη για την αντίσταση των καρκινικών κυττάρων να Therapeutics θεραπείες και την αδυναμία να επάγει απόπτωση [24-28]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ένα υψηλό μείωση του φωσφορυλιωμένη (την ενεργό μορφή) ΑΚΤ σε σερίνη 473. επίπεδο Σύνολο AKT ήταν, επίσης, μειώθηκε υποδηλώνοντας ότι είναι επίσης εν μέρει υπεύθυνη για τη μείωση του p-ΑΚΤ επίπεδο. ΧΙΑΡ, ένας αναστολέας της κασπάσης και ένα ubiquitin λιγάση για ΡΤΕΝ (ένας αρνητικός ρυθμιστής φωσφορυλίωσης ΑΚΤ) επίσης μειώθηκαν (Σχήμα 7Α) [29]. ERK1 /2, πρωτεΐνες της οδού ΜΑΡΚ, απαιτεί ενεργοποίηση /φωσφορυλίωση για να επάγει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα μετά από θεραπεία με σισπλατίνη ή άλλα ερεθίσματα απόπτωσης [30-32]. Όπως παρατηρήθηκε σε θεραπείες σισπλατίνη, PS2Aa1 προκάλεσε αύξηση της /2 φωσφορυλίωση ERK1 σε 24 ώρες μετά τη θεραπεία, ενώ το συνολικό επίπεδο ERK έμενε σταθερή (Σχήμα 7Β). Αυτό υποδηλώνει ότι η ενεργοποίηση ERK απαιτείται για την επαγωγή της απόπτωσης. Τέλος, ανακαλύψαμε πρόσφατα ένα νέο μηχανισμό που σχετίζονται με το ογκοκατασταλτικό PAR-4 το οποίο διασπάται από κασπάση-3 κατά ερεθίσματα απόπτωσης και είναι ικανό να επάγει απόπτωση άπαξ διασπάται [33,34]. Λόγω της PS2Aa1 ικανότητα να ενεργοποιούν τους μηχανισμούς απόπτωσης, έχουμε το ερώτημα κατά πόσον PAR-4 διάσπαση θα μπορούσε να συμμετέχει στην επαγωγή της απόπτωσης κατά την κατεργασία με την τοξίνη. Είναι ενδιαφέρον, ένα διασπασμένο θραύσμα περίπου 25 kDa εμφανίστηκε αμέσως μόλις 6 ώρες μετά την αγωγή με PS2Aa1 σε πλήρη συσχέτιση με την υπόθεση μας (Σχήμα 7C). Η παρουσία του διασπασμένου τεμαχίου PAR-4, που κανονικά υπάρχουν μόνο σε καρκινικά κύτταρα που υφίστανται απόπτωση, ενισχύει την ιδέα ότι PS2Aa1 είναι ένας επαγωγέας απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα.

PC-3 καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τοξίνη Bt 4R2 πρωτεΐνες (2 μg /mL) για 6 ώρες και 24 ώρες. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.