Αφηρημένο

Στόχος

Αλδεΰδη αφυδρογονάση (ALDH) έχουν κυττάρων που εκφράζουν χαρακτηριστεί ως έχοντα ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν. Αξιολογήσαμε ΑΙ_ϋΗ + ιδιότητες των ωοθηκών καρκίνο βλαστικών κυττάρων, όπως και ο ρόλος τους στην αντίσταση λευκόχρυσου.

Μέθοδοι

Ισογενή κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών για την ευαισθησία της πλατίνας (Α2780) και ανθεκτικά πλατίνα (Α2780 /CP70) ως καθώς και ασκίτη από ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών αναλύθηκαν για ΑΙ_ϋΗ + με κυτταρομετρία ροής για τον προσδιορισμό της σύνδεσης με την αντίσταση λευκόχρυσου, υποτροπής και επιβίωσης. Ένα σταθερό shRNA νοκ ντάουν μοντέλο για ALDH1A1 χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστούν οι επιπτώσεις της στην κυτταρική-όπως ιδιότητες καρκινικά βλαστικά, τα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, και οι μεσολαβητές επιδιόρθωση του DNA.

Αποτελέσματα

Κατάσταση ΑΙ_ϋΗ συσχετίζεται άμεσα με την αντίσταση λευκόχρυσου στην πρωτογενή δείγματα καρκίνου των ωοθηκών που λαμβάνονται από ασκίτη. Ασθενείς με ΑΙ_ϋΗ

HIGH εμφανίζεται σημαντικά χαμηλότερη επιβίωση χωρίς εξέλιξη από τους ασθενείς με ALDH

ΧΑΜΗΛΗ κύτταρα (9 έναντι 3 μήνες, αντίστοιχα, p & lt? 0,01). ALDH1A1-νοκ ντάουν εξασθενεί σημαντικά κλωνογόνο δυναμικό, PARP-1 τα επίπεδα της πρωτεΐνης, και να αντιστραφεί εγγενή αντίσταση λευκόχρυσου. ALDH1A1-νοκ ντάουν οδήγησε σε δραματική μείωση των KLF4 και τα επίπεδα της πρωτεΐνης p21 οδηγώντας έτσι σε S και τη συσσώρευση G2 φάση των κυττάρων. Αυξήσεις σε S και G2 κύτταρα έδειξαν αυξημένη έκφραση του στρες αντιγραφής που σχετίζονται πρωτεΐνες επισκευής Αναιμία Fanconi DNA (FANCD2, FANCJ) και το σημείο ελέγχου αναπαραγωγής (pS317 Chk1) επηρεάστηκαν. ALDH1A1-νοκ ντάουν που προκαλείται από βλάβες του DNA, αποδεικνύεται από την ισχυρή επαγωγή της γ-H2AX και ΒΑΧ απόπτωση, με σημαντικές αυξήσεις στην έκφραση γονιδίων BRCA1, προτείνοντας ALDH1A1-εξαρτώμενη ρύθμιση των σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και τα δίκτυα επιδιόρθωση του DNA στα ωοθηκών καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν.

Συμπέρασμα

Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ωοθηκών καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν ALDH1A1 μπορεί να διατηρήσει αντίσταση από λευκόχρυσο με αλλαγμένη ρύθμιση του σημείου ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και τη σηματοδότηση του δικτύου επιδιόρθωση του DNA

Παράθεση:. Meng Ε, Mitra Α , Tripathi Κ, Finan ΜΑ, Scalici J, McClellan S, et al. (2014) ALDH1A1 Διατηρεί καρκίνου των ωοθηκών Stem Cell-Like Properties από Altered κανονισμό του κυτταρικού κύκλου Checkpoint και επιδιόρθωση του DNA δίκτυο. PLoS ONE 9 (9): e107142. doi: 10.1371 /journal.pone.0107142

Επιμέλεια: Robertus AM. de Bruin, University College London, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: May 13, 2014? Δεκτές: 7 του Αυγούστου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 12, Σεπτεμβρίου, 2014

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή υποστηρίχθηκε από το Γυναικολογικής Ίδρυμα Καρκίνου Sherri από έναν ψίθυρο σε μια Roar, Βραβείο Μοτοσικλέτα Ίδρυμα ωοθηκών Cancer Research της Γυναίκας και της Eleanor Ruth Frenkel Ταμείο για καρκίνο των ωοθηκών Ερευνών (RPR)? NIH επιχορήγησης R01GM098956, και επιχορήγηση Αβραάμ Μίτσελ Endowment (Κ.Ρ.). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η πιο θανατηφόρα όλων των γυναικολογικών κακοηθειών, που επηρεάζει πάνω από 22.000 ζωές των γυναικών κάθε χρόνο στις Ηνωμένες Πολιτείες μόνο. Αν και η πλειοψηφία των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών επιτευχθεί μια πλήρης αρχική κλινική ανταπόκριση σε κυτταρομειωτική χειρουργική επέμβαση που ακολουθείται από χημειοθεραπεία συνδυασμού, οι περισσότεροι θα βιώσουν μια υποτροπή και δυστυχώς υποκύπτουν σε προοδευτική ασθένεια [1]. Ζωτικής σημασίας για την πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών είναι ποικίλες ευαισθησία της νόσου σε παράγοντες πλατίνας. Παρά το γεγονός ότι ένα συνεχές, οι ασθενείς στρωματοποιήθηκαν με την αρχική απόκριση της νόσου τους στη χημειοθεραπεία πλατίνα είτε ως «λευκόχρυσος-ευαίσθητα» ή «πλατίνα ανθεκτικά» ορίζεται από το μήκος του ελεύθερου υποτροπών διαστήματος. Αυτό το φάσμα είναι ιδιαίτερα προβλεπτική της κλινικής τελικά σημεία, όταν ένας καρκίνος υποτροπιάζει, η επιτυχία της χειρουργικής επέμβασης και /ή χημειοθεραπεία σε υποτροπή και η συνολική επιβίωση του ασθενούς.

Λαμβάνοντας υπόψη την ετερογένεια του καρκίνου, δεν είναι όλα τα κύτταρα εντός κακοήθεια θα να αναμένεται να είναι ανθεκτικά στη χημειοθεραπεία. Το καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) θεωρία προτείνει ότι αυτά τα ανθεκτικά κύτταρα περιλαμβάνουν μόνο μια μειοψηφία των κυττάρων εντός του καρκίνου, αλλά είναι αποκλειστικά υπεύθυνος για τη μακροπρόθεσμη υποτροπή [2]. Με αυτόν τον τρόπο, ανεξάρτητα από τα αρχικά ποσοστά ανταπόκρισης, αν η χημειοθεραπεία δεν εξάλειψη ανθεκτικά αυτά τα ΚΕΠ, τότε ο καρκίνος θα αναγεννηθεί και θα παρουσιαστεί υποτροπή ή εξέλιξη της νόσου. Η ταυτοποίηση αυτών των ανθεκτικών κυττάρων και για τον καθορισμό έμφυτη μοριακών οδών τους είναι υψίστης σημασίας για την εξεύρεση πιο αποτελεσματικών στοχευμένες θεραπείες [3]. Ως εκ τούτου, ένας στρατηγική για τη βελτίωση της επιτυχίας της θεραπείας του καρκίνου των ωοθηκών είναι η ενίσχυση ΚΕΠ ευαισθησία σε παράγοντες πλατίνας. Υπέρβαση αντίστασης πλατίνας θα είναι ζωτικής σημασίας για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών με τα δυνητικά οφέλη της ενισχυμένης ποσοστά ανταπόκρισης, μεγαλύτερης διάρκειας επιβίωση, και περισσότερο θεραπείες.

Πρόσφατα, αφυδρογονάση αλδεΰδης (ΑΙ_ϋΗ) δραστηριότητα έχει αποδειχθεί ότι είναι μια πολύ ελκυστική δείκτης CSCs σε πολλούς καρκίνους όπως του πνεύμονα [4], του μαστού [5], του προστάτη [6], του θυρεοειδούς [7], καρκίνο κεφαλής και λαιμού [8], και τον καρκίνο των ωοθηκών [9] – [12]. οικογένεια ΑΙ_ϋΗ περιλαμβάνει ισοενζύμων κυτοσολικό υπεύθυνη για την οξείδωση ενδοκυτταρική αλδεΰδες, συμβάλλοντας έτσι στην οξείδωση της ρετινόλης στο ρετινοϊκό οξύ στις αρχές διαφοροποίηση των βλαστικών κυττάρων [4]. Το ανθρώπινο ΑΙ_ϋΗ υπεροικογένεια αποτελείται σήμερα από 19 γνωστά πιθανώς λειτουργικά γονίδια σε 11 οικογένειες και 4 υπο-οικογένειες με ξεχωριστές χρωμοσωμικές θέσεις. Τις τεράστιες οικογένειες ALDH και υποοικογένειες, ALDH1A1 έχει έγκυρη δείκτη μεταξύ πολλών κακοηθών ιστών. Κατέχει την ελκυστική διάκριση του όχι μόνο να είναι ένας πιθανός δείκτης βλαστική ικανότητα αλλά δυνητικά να παίζει ένα ρόλο στην βιολογία του ογκογενή κύτταρα καθώς επίσης [13]. Επιπλέον, ο υποπληθυσμός ALDH1A1 είχε αποδείξει ότι σχετίζονται με χημειοαντίσταση σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών [9], [14].

Πρόσφατες μελέτες σε μοντέλα καρκίνου του μαστού έδειξαν μία ενδιαφέρουσα σχέση μεταξύ BRCA1 και βλαστικών κυτταρική διαφοροποίηση [15], [16]. BRCA1 έχει αποδειχθεί επίσης ότι παίζει σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση των ιστών του μαστού με τη ρύθμιση Notch σηματοδότηση και ανταπόκριση του όγκου σε αντι-ορμονική θεραπεία [14]. Ιδιαιτέρως, μια αντίστροφη σχέση μεταξύ της έκφρασης ALDH1A1 και BRCA1 είναι αξιοσημείωτη στο πλαίσιο της μελέτης καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν και χημειοαντίσταση. BRCA1 παίζει σημαντικό ρόλο στην προστασία του γονιδιώματος από παρεκκλίνουσα βλάβες του DNA, και οι μεταλλάξεις ή διαγραφή στο γονίδιο αυτό να οδηγήσει σε αστάθεια γονιδιώματος και αυξημένη συχνότητα εμφάνισης καρκίνου του μαστού, των ωοθηκών και άλλους καρκίνους [17]. Σε απάντηση σε βλάβη του DNA που εντοπίζεται ταχέως στις περιοχές της διπλής διαλείμματα σκέλος (DSB) και μεσολαβεί αρκετές απαντήσεις σηματοδότησης συμπεριλαμβανομένων των σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και την επιλογή της οδού επιδιόρθωσης του DNA για να διορθώσετε αυτά τα τραύματα [17] – [19]. Ωστόσο, το καθεστώς BRCA1 και ΑΙ_ϋΗ + καρκίνο των ωοθηκών βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με τη συντήρηση και την αντοχή τους στη χημειοθεραπεία δεν έχει μελετηθεί.

Έχουμε αποδείξει ότι ΑΙ_ϋΗ + φαινότυπος έχει CSC χαρακτηριστικά ενισχυμένης εισβολής, σχηματισμό αποικιών, και βλαστικών κυττάρων δεικτών. Η ειδική ισότυπος ALDH1A1 φαίνεται να είναι υπεύθυνη για ALDH μεσολάβηση αντίστασης πλατίνας τόσο κλινικά όσο και

στο in-vitro

μοντέλα. Τα δεδομένα μας υποστηρίζει ένα μηχανισμό αντίστασης πλατίνας ALDH1A1 μεσολάβηση στον καρκίνο των ωοθηκών, μέσω μια αλλαγμένη ρύθμιση του σημείου ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και τη σηματοδότηση του δικτύου επιδιόρθωση του DNA.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων και Πολιτισμών

Α2780 και ένα ισογονιδιακό σισπλατίνη ανθεκτικά Α2780 /CP70 κυτταρική γραμμή δημιουργήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20].

Δοκιμασία ALDEFLUOR και ενεργοποιούμενη με φθορισμό ταξινόμηση κυττάρων

Για την απομόνωση του κυτταρικού πληθυσμού με ένα υψηλό ΑΙ_ϋΗ ενζυματική δραστηριότητα, ALDEFLUOR κιτ δοκιμασίας (StemCell Technologies Inc.) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά θρυψινοποίηση, τα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό δοκιμασίας που περιέχει ALDEFLUOR ALDH υπόστρωμα ενζύμου ΒΟϋΙΡΥ-αμινοακεταλδεΰδης (ΒΑΑΑ) και επωάστηκαν στους 37 ° C για περίπου 40 λεπτά. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας τις ταυτόσημες συνθήκες με τον ειδικό αναστολέα ΑΙ_ϋΗ, diethylaminobenzaldehyde (ϋΕΑΒ), για να χρησιμεύσει ως αρνητικός μάρτυρας. Κυτταρομετρία ροής διαλογή διεξήχθη με τη χρήση ενός διαλογέα κυττάρων BD Bioscience Aria II Sorp.

καρκινογόνες ιδιότητες

Μετά τη διαλογή για φαινοτύπων ΑΙ_ϋΗ (ΑΙ_ϋΗ + εναντίον ALDH-), Matrigel εισβολής και μαλακό δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας agar διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Για να αξιολογηθεί η επίδραση της χημειοθεραπείας σε σχηματισμό αποικιών, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με φρέσκο ​​μέσο με 20 μΜ καρβοπλατίνη προστίθενται κάθε 3-4 ημέρες. Ορατές αποικίες (& gt? 50 κύτταρα). Μετρήθηκαν σε πέντε τυχαία επιλεγμένο 40Χ μικροσκοπικά πεδία σε κάθε φρεάτιο

CellTiter-Glo φθορισμού κυττάρων Βιωσιμότητας Δοκιμασία

κύτταρα Κατάταξη σύμφωνα Α2780 /CP70 απλώθηκαν σε πυκνότητα 4000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε 96 φρεατίων μαύρη πλάκα με διαυγή πυθμένα (Corning, ΝΥ, USA). Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις καρβοπλατίνης έως 72 ώρες. Μετά από 24, 48 και 72 ώρες, προστέθηκαν 100 μΐ αντιδραστηρίου CellTiter-Glo (Promega) ανά φρεάτιο, επωάστηκαν για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και η φωταύγεια καταγράφηκε σε ένα Synergy H4 Hybrid Reader (BioTek).

πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR

πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Εκκινητές και ανιχνευτές για το σύστημα TaqMan επιλέχθηκαν από την ιστοσελίδα Applied Biosystems [BMI1 ID δοκιμασίας: Hs00180411_m1, c-myc ID δοκιμασία: Hs00905030_m1, Kruppel-σαν παράγοντας 4 (KLF4) ID δοκιμασία: Hs00358836_m1, oct3 /4 ID προσδιορισμού: Hs01009568_m1, S100 ασβέστιο πρωτεΐνη δέσμευσης Α1 (S100A1) ID δοκιμασία: Hs00984741_m1, ALDH1A1 ID δοκιμασία: Hs00946916_m1, CDKN1A (p21) ID δοκιμασία: Hs00355782_m1, εσωτερικού ελέγχου αφυδρογονάση της 3-φωσφορικής ID δοκιμασία αφυδρογονάσης: Hs99999905_m1]. Τα σχετικά επίπεδα mRNA έκφραση BMI1, c-myc, Oct3 /4, KLF4, S100A1, ALDH1A1, p21, υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCt και την ομαλοποίηση να GAPDH.

λεντοϊών shRNA φορέα επιμόλυνσης

Έξι διαφορετικά αποθέματα pGIPZ λεντοϊών shRNA γλυκερόλης κατά ALDH1A1 και ένας αρνητικός μάρτυρας shRNA (Thermo Scientific) επιμολύνθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. κύτταρα Α2780 /CP70 απλώθηκαν σε μια πυκνότητα 2 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο ενός 6-φρεατίων για 18-24 ώρες. Για κάθε φρεάτιο, 2 μg DNA πλασμιδίου shRNA (pGIPZ) επιμολύνθηκαν σε Α2780 /CP70 χρησιμοποιώντας Σύλληψη-In αντιδραστήριο (Thermo Scientific, USA). Πουρομυκίνης (0,8 μg /ml) χρησιμοποιήθηκε για την επιλογή των επιμολυσμένων κυττάρων. Μετά τη βελτιστοποίηση, ALDH1A1-knockdown αποτελεσματικότητας των μεμονωμένων Τα siRNAs αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR και Western Blot. Vector 398.453 απέδειξε την πιο αποδοτική διαμόλυνση με πάνω από 95% αποτελεσματικότητα knockdown του ALDH1A1 και χρησιμοποιήθηκε για όλα τα πειράματα knockdown shRNA.

Ανάλυση Western Blot

Τα καλλιεργημένα κύτταρα συλλέχθηκαν σε ΝΡ-40 ρυθμιστικό διάλυμα λύσης με 10 μΐ κοκτέιλ αναστολέα /ml πρωτεάσης (Sigma) και υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοκηλίδωσης με πρότυπες τεχνικές χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι ALDH1A1, FANCJ, KLF4 (Sigma-Aldrich), FANCD2, PARP-1, ΧΚΧΧ1, β-ακτίνη, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), και ρ21, αντισώματα BRCA1 φωσφο-Chk1 (Ser317), (Cell Signaling Technology)

RT

2 Profiler PCR Array

Το ανθρώπινο Cancer Drug Resistance & amp.? Κυτταρικού Κύκλου RT

2 Profiler PCR Array (Qiagen, USA) χρησιμοποιήθηκε για να προφίλ της έκφρασης των 84 γονιδίων που εμπλέκονται στην αντοχή φάρμακο κατά του καρκίνου και του κυτταρικού κύκλου με πέντε γονίδια οικοκυρική σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Έλεγχοι για γονιδιωματικό DNA μόλυνση και για την αποτελεσματικότητα των αντιδράσεων RT-PCR και PCR προσδιορίστηκαν επίσης. Οι συστοιχίες PCR διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανίχνευσης σε πραγματικό χρόνο Bio-Rad iQ5 (Bio-Rad).

κυτταρικού κύκλου Ανάλυση με κυτταρομετρία ροής

κύτταρα Α2780 /CP70 επιμολύνονται με έλεγχο ή Τα siRNAs στόχευση σε ALDH1A1 χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Life Technologies) και τα κύτταρα συλλέχθηκαν και βάφτηκαν για ανάλυση κύκλου κυττάρου σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (BD Biosciences). Κύτταρα σε 10

6 επανεναιωρήθηκαν με 300 μΙ PBS, και 700 μΙ παγωμένης μεθανόλης για να καθορίσει τα κύτταρα για όλη τη νύχτα στους -20 ° C. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με 500 μΙ ιωδιούχου προπιδίου (BD Bioscience) σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά στο σκοτάδι. προφίλ του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Α2780 /κύτταρα CP70 επιμολυσμένα με αρνητικό μάρτυρα ή shRNA-ALDH1A1 προκλήθηκαν για απόπτωση με κατεργασία με 1,0 μΜ σταυροσπορίνη για 6 ώρες [22 ], [23]. APC-αννεξίνης V και χρώση 7-AAD διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κάθε ομάδα περιέχει τρία στοιχεία ελέγχου ισοτόπου: μη χρωματισμένα κύτταρα? κύτταρα χρωματίστηκαν με μόνη APC αννεξίνης V? κύτταρα βάφονται με μόνη 7-AAD. Τα δείγματα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

PARP Δραστηριότητα Δοκιμασία

δραστηριότητα ΡΑΚΡ μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ΗΤ PARP in vivo κιτ Φαρμακοδυναμικές Δοκιμασία II (Trevigen). Μετά την επεξεργασία με 100 μΜ καρβοπλατίνη για 45 λεπτά, Α2780 CP70 κύτταρα /επιμολυσμένα με αρνητικό μάρτυρα ή shRNA-ALDH1A1 πλύθηκαν δύο φορές με 5 ml θερμού (37 ° C) PBS. Τα κύτταρα ξύστηκαν σε 300 μΙ ψυχρού ρυθμιστικού διαλύματος λύσης κυττάρου και επωάστηκαν σε πάγο για 15 λεπτά. SDS προστέθηκε σε δείγματα σε τελική συγκέντρωση SDS 1% και επωάστηκαν στους 100 ° C για 5 λεπτά. Όταν τα δείγματα ψύχονται σε θερμοκρασία δωματίου, 0,01 όγκος του 100Χ μαγνησίου κατιόντος και 2 μΙ ϋΝάσης Ι (2 μονάδες /μΙ) προστέθηκαν στα δείγματα και επωάστηκαν για επιπλέον 90 λεπτά στους 37 ° C. Μετά από μια σύντομη φυγοκέντρηση, τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και πολυριβοζυλίωσης-ριβόζη (PAR) τα επίπεδα των κυττάρων εκχυλίσματα ποσοτικά χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ELISA.

Κλινική Συσχέτιση

Όλοι οι συμμετέχοντες παρείχαν έγγραφη συγκατάθεση τους να συμμετάσχουν σε αυτή τη μελέτη και την επιτροπή δεοντολογίας στο Πανεπιστήμιο της Νότιας Αλαμπάμα Σύστημα Υγείας ενέκρινε την εν λόγω μελέτη, καθώς και τη διαδικασία συναίνεσης. Ασκίτης από 15 διαδοχικούς ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση για προχωρημένο στάδιο IIIC /IV θηλώδους ορώδες καρκίνο των ωοθηκών καθώς και 2 ασθενείς με καλοήθη ασκίτες συλλέγονται και αμέσως σε επεξεργασία για την εκτέλεση δοκιμασίας ALDEFLUOR μετά το πλύσιμο τους με PBS και αφαίρεση των ερυθροκυττάρων χρησιμοποιώντας ACK ρυθμιστικού λύσεως (Lonza , Walkersville, MD, USA). Κλινικοπαθολογικοί δεδομένα συλλέχθηκαν για τις αντίστοιχες τους ασθενείς και συσχετίζεται με το ποσοστό των κυττάρων που επέδειξαν ΑΙ_ϋΗ + φαινότυπο σε ασκίτη τους.

Στατιστική Ανάλυση

Συγκρίσεις μεταξύ δύο ομάδων διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας t-test και ANOVA όπου Φοιτητών κατάλληλος. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε στο

σ

& lt? 0,05. Καμπύλη Kaplan-Meier διεξήχθη για την επιβίωση με log-rank για στατιστική σύγκριση.

Αποτελέσματα

Κατάσταση ΑΙ_ϋΗ συσχετίζεται με την αντίσταση του καρκίνου των ωοθηκών σε παράγοντες πλατίνας

Ισογενή κυτταρικές σειρές της πλατίνας ευαίσθητα (Α2780) και ανθεκτικά (Α2780 /CP70) ωοθηκών καρκινικά κύτταρα αξιολογήθηκαν για ρυθμούς επιβίωσης τους με την παρουσία και απουσία διαφόρων δόσεων της καρβοπλατίνης. Συνεπής με την προηγουμένως αναφερθέντα αποτελέσματα [24], που απαιτούνται [25], Α2780 /κυττάρων CP70 μέχρι 10 φορές υψηλότερη δόση καρβοπλατίνης για την επίτευξη του IC

50 συγκέντρωση σε σύγκριση με τα ευαίσθητα πλατίνα ομόλογό του, Α2780 (Σχήμα 1Α) . Πρόσφατα, σε διάφορα μοντέλα καρκίνου, κατάσταση ALDH έχει ενοχοποιηθεί στην αντοχή των όγκων στη χημειοθεραπεία με διατήρηση χαρακτηριστικά καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με «όπως επιθετική ανάπτυξη, αυξημένη επιβίωση και την εκ νέου διαφοροποίηση δυναμικό [9]. Προκειμένου να ελεγχθεί η συσχέτιση μεταξύ της κατάστασης ALDH και αντίσταση λευκόχρυσου σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, δοκιμασίες ALDEFLOUR πραγματοποιήθηκαν σε αυτά τα ισογονικών κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον ανθεκτικά πλατίνα καρκινική κυτταρική ωοθηκών γραμμή Α2780 /CP70 εμφάνισαν τουλάχιστον 110-φορές υψηλότερο ποσοστό των ΑΙ_ϋΗ + κυττάρων (με ένα εύρος από 22-40%) σε σύγκριση με τα πλατίνα ευαίσθητα κύτταρα Α2780, το οποίο είχε μόνο 0,2% ΑΙ_ϋΗ + κύτταρα (Σχήμα 1 Β) . Παρομοίως, ανάλυση Western blot των επιπέδων της πρωτεΐνης ALDH1A1 σε αυτά τα κύτταρα αποκάλυψε παρόμοια αποτελέσματα, γεγονός που υποδηλώνει συσχέτιση της κατάστασης ΑΙ_ϋΗ με αντίσταση από λευκόχρυσο (Σχήμα 1C)

Ισογενή κυτταρικές σειρές (A2780- πλατίνα ευαίσθητα & amp?. Πλατίνα Α2780 /CP70- ανθεκτικά) αξιολογήθηκαν για απόκριση πλατίνα με χρήση του προσδιορισμού της ευαισθησίας φαρμάκου όπως περιγράφεται στο Μ & amp? τμήμα Μ (Α). Για να εκτιμηθεί η επί τοις εκατό των ΑΙ_ϋΗ + κυττάρων, Α2780 και Α2780 /κυττάρων CP70 δοκιμασία ALDEFLUOR διεξήχθη με χρήση ΒΟϋΙΡΥ-αμινοακεταλδεΰδης (ΒΑΑΑ) ως υπόστρωμα για το ένζυμο ΑΙ_ϋΗ, μετά από 40 λεπτά επώασης στους 37 ° ροής C κυτταρομετρίας ανάλυση διεξήχθη (Β) και δυτικό δείχνει κηλίδα δεδομένα που αντιπροσωπεύουν τα επίπεδα της ALDH1A1 ισοενζύμου σε αυτά τα κύτταρα (C).

Η

Για να εκτιμηθεί κατά πόσον ΑΙ_ϋΗ + καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν είναι επίσης παρούσα σε πρωτογενείς όγκους και η σύνδεσή της με την επιβίωση χωρίς εξέλιξη των ασθενών , έχουμε συλλέξει ασκίτη από 15 ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών με προχωρημένη νόσο και 2 καλοήθης ασκίτη από ασθενείς με σύνδρομο Meigs και αναλύθηκαν για το ποσοστό των κυττάρων με την έκφραση ΑΙ_ϋΗ χρησιμοποιώντας δοκιμασία ALDEFLOUR. Σε συμφωνία με βλαστικά κύτταρα του καρκίνου υπόθεση, ΑΙ_ϋΗ + κυττάρων ήταν παρούσα σε πολύ μεγαλύτερο ποσοστό σε κακοήθη ασκίτη σε σύγκριση με καλοήθη ομολόγους τους. Το ποσοστό των ΑΙ_ϋΗ + κυττάρων σε κακοήθη ασκίτη κυμαίνονταν από 1,3 έως 25,4% (ασθενείς 3-17) σε σύγκριση με 2 καλοήθη ασκίτη (ασθενείς 1 &? 2) (Σχήμα 2Α). Το πιο σημαντικό, το ποσοστό των ΑΙ_ϋΗ + κυττάρων σε ασκίτη ασθενή αντιστρόφως συσχετίζεται με την επιβίωση χωρίς εξέλιξη. Οι ασθενείς που εμφάνισαν ΑΙ_ϋΗ

HIGH (& gt? 15% ΑΙ_ϋΗ) σε ασκίτη τους έδειξαν σημαντικά μικρότερη επιβίωση χωρίς εξέλιξη σε σύγκριση με τους ασθενείς με ALDH

LOW (& lt? 15% ΑΙ_ϋΗ) (3 έναντι 9 μηνών, αντίστοιχα?

σ

= 0,003) (Σχήμα 2Β). Αν και είναι δύσκολο να εξαχθεί μια ουσιαστική συμπέρασμα λόγω του περιορισμένου αριθμού των ασκίτη που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη, τα στοιχεία αυτά δείχνουν μια άμεση κλινική συσχέτιση μεταξύ της κατάστασης ΑΙ_ϋΗ με ανταπόκριση του όγκου σε παράγοντες πλατίνας και ελεύθερη εξέλιξης επιβίωση των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών.

λήφθηκε ασκίτης από 15 διαδοχικούς ασθενείς με πρωτοπαθή προχωρημένο στάδιο III /IV καρκίνο των ωοθηκών και 2 από καλοήθεις (σύνδρομο Miegs) και αναλύθηκαν για το ποσοστό των ΑΙ_ϋΗ + κυττάρων μέσω της δοκιμασίας ALDEFLUOR. Το ιστόγραμμα στο ένθετο δείχνει το ποσοστό των ΑΙ_ϋΗ + κυττάρων σε καλοήθη και κακοήθη ασκίτη (Α). Η κλινικοπαθολογικοί πληροφορίες από τις ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών συσχετίστηκαν με το ποσοστό των ΑΙ_ϋΗ + κυττάρων σε ασκίτες τους και αξιολογήθηκαν επιβίωση χωρίς εξέλιξη με ALDH

HIGH (& gt? 15% ALDH) για ALDH

LOW (& lt? 15% ΑΙ_ϋΗ) ασθενείς (3 έναντι 9 μηνών, αντίστοιχα?

σ

& lt? 0,01). (Β)

κυττάρων-όπως ιδιότητες

ΑΙ_ϋΗ + ωοθηκών καρκινικά κύτταρα εκθέματα προέρχονται

Αυτά τα αποτελέσματα μας οδήγησαν να χαρακτηριστεί περαιτέρω ALDH ως πιθανή δείκτης βλαστικών κυττάρων στον καρκίνο των ωοθηκών. Η πρόοδος του όγκου μπορεί να συσχετιστεί με την παρουσία ενός υποσυνόλου των κυττάρων που εκφράζουν βλαστικών κυττάρων δείκτες και επιδεικνύουν επιθετικές ιδιότητες συμπεριφοράς συμπεριλαμβανομένων διεισδυτικών και αυξημένο δυναμικό σχηματισμού αποικίας. Για να διερευνήσουν επεμβατική ιδιότητές τους, ταξινομημένα κύτταρα (ΑΙ_ϋΗ + εναντίον ALDH-) αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία εισβολής Matrigel. Όπως φαίνεται στα σχήματα 3Α & amp? 3Β, ΑΙ_ϋΗ + κύτταρα απέδειξαν πάνω από 1,7 φορές αύξηση (

σ

& lt? 0,01). Στην εισβολή μέσω Matrigel σε σύγκριση με ALDH- κύτταρα

Α2780 /κύτταρα CP70 ταξινομήθηκαν σε ALDH- και ΑΙ_ϋΗ + φαινοτύπων και αξιολογήθηκαν για τις ικανότητές τους για εισβολή χρησιμοποιώντας θαλάμους Matrigel εισβολής (Α), τα ποσοτικά δεδομένα όπως αντιπροσωπεύονται (Β) και το δυναμικό σχηματισμού αποικιών με την παρουσία και απουσία της καρβοπλατίνης (20 μΜ) αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς μαλακού άγαρ σχηματισμού αποικίας (C). Προκειμένου να προσδιοριστεί πιθανό μηχανισμό για τα χαρακτηριστικά των κυττάρων του καρκίνου του στελέχους σε ΑΙ_ϋΗ + κύτταρα, αξιολογήσαμε πολλαπλές δείκτες του «βλαστική ικανότητα». κύτταρα Α2780 /CP70 ταξινομήθηκαν σε φαινοτύπους ALDH- και ΑΙ_ϋΗ +, ολικό RNA απομονώθηκε, το cDNA παρασκευάζεται και πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε (D). ** Υποδεικνύει στατιστική σημαντικότητα (

ρ

& lt? 0,01).

Η

Ένα άλλο υποκατάστατο μέτρο για τον χαρακτηρισμό καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν είναι η ικανότητα να σχηματίσουν αποικίες, ιδιαίτερα παρουσία χημειοθεραπευτικών [26]. Σύμφωνα με το διηθητικό τους δυναμικό, ΑΙ_ϋΗ + κύτταρα επέδειξαν ενισχυμένη ικανότητα σχηματισμού αποικιών σε σύγκριση με ALDH- φαινοτύπους (2-φορές αύξηση,

ρ

& lt? 0,01). Σημαντικά, ΑΙ_ϋΗ + φαινότυποι επέδειξε αυξημένη ικανότητα σχηματισμού αποικιών παρουσία καρβοπλατίνη (5,4-φορές αύξηση,

ρ

& lt? 0,01) (Σχήμα 3C). Προκειμένου να αποκτήσουν εικόνα για τους πιθανούς μηχανισμούς στέλεχος-όπως αυτών των κυττάρων, αξιολογήσαμε δυνητικές οδούς βλαστικών κυττάρων που μας ενδιαφέρει σε αυτά τα κύτταρα. Τα δεδομένα RT-PCR έδειξε σχεδόν 3-φορές υψηλότερο επίπεδο έκφρασης του Krüppel-Like Παράγοντα 4 (KLF4) σε ΑΙ_ϋΗ + κυττάρων σε σύγκριση με ALDH- αντίστοιχά τους. KLF4 ανήκει στην οικογένεια ψευδάργυρο δάκτυλο των παραγόντων μεταγραφής, η οποία έχει αναφερθεί ότι είναι κρίσιμης σημασίας για τη διατήρηση του καρκίνου του μαστού βλαστοκυττάρων και επιθετική συμπεριφορά τους, όπως η μετανάστευση και εισβολή αντίσταση διαφήμιση στη σισπλατίνη [27] [28]. Ωστόσο, άλλοι μεσολαβητές βλαστικών κυττάρων όπως BMI1, c-myc, Oct3 /4 και S100A1 δεν έδειξαν αξιοσημείωτες αλλαγές στην έκφραση τους σε σύγκριση με ALDH- φαινοτύπους (

ρ

& lt? 0,01). (Σχήμα 3D)

ALDH1A1 ισότυπο προωθεί ιδιότητες καρκίνο των ωοθηκών βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με «

Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία CSC, τα δεδομένα μας αποκάλυψαν αυξημένη έκφραση του ALDH1A1 ισοενζύμου στην πλατίνα ανθεκτικά Α2780 κύτταρα /CP70. Για την περαιτέρω αξιολόγηση του ρόλου της ALDH1A1 στη συντήρηση του καρκίνου βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν ιδιότητες ανθεκτικών πλατίνα καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, έχουμε μειωτικά ALDH1A1 ειδικές ισοζύμης χρησιμοποιώντας Τα siRNAs (Σχήμα S1). Αντίθετα με υψηλή έκφραση του, προς τα κάτω ρύθμιση ALDH1A1 δεν έχει παρουσιάσει σημαντικές διαφορές στις επεμβατικές ιδιότητες αυτών των κυττάρων (Σχήμα 4Α & amp? 4Β). Ωστόσο, ALDH1A1 knockdown επηρέαζε την ικανότητά τους να σχηματίζουν αποικίες σε μαλακό άγαρ, επιδεικνύοντας μια 2.5-φορές μείωση στις αποικίες (

ρ

& lt? 0,01) (Σχήμα 4C). Παρομοίως, προς τα κάτω ρύθμιση ALDH1A1 μόνη ευαισθητοποιηθεί σημαντικά τη φύση της πλατίνας ανθεκτικά Α2780 κύτταρα /CP70 στην καρβοπλατίνη. Λαμβάνοντας υπόψη IC

50 δόσεις που απαιτούνται (82,9 μΜ και 43,8 μΜ για αρνητικό μάρτυρα και τα κύτταρα shALDH1A1 αντίστοιχα) για αυτά τα κύτταρα, μείωση περίπου 50% της δόσης καρβοπλατίνη είναι εμφανής για ALDH1A1 νοκ ντάουν κύτταρα (

σ

& lt? 0.001 ) (Σχήμα 4D). Μαζί, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι το καθεστώς ALDH1A1 είναι ένας από τους κρίσιμους παράγοντες για τη διατήρηση ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων, όπως και η αντίσταση λευκόχρυσου στον καρκίνο των ωοθηκών.

Οι φορείς λεντοϊών που εκφράζουν ALDH1A1 συγκεκριμένες Τα siRNAs ή nontargeting Τα siRNAs επιμολύνθηκαν σε Α2780 κύτταρα /CP70 και η επίδρασή της στις ιδιότητες των βλαστικών όπως κυττάρων αξιολογήθηκαν για επεμβατική δυναμικό, χρησιμοποιώντας θαλάμους Matrigel εισβολής (Α), τα ποσοτικά στοιχεία όπως αντιπροσωπεύεται (Β), κλωνογόνο δυναμικό χρησιμοποιώντας μαλακό σχηματισμό αποικιών άγαρ (C, και εξαρτάται από καρβοπλατίνη αναστολή της ανάπτυξης από CellTiter-Glo Luminescent Βιωσιμότητα δοκιμασία κυττάρων (D). η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το

έλεγχος τ.

η

ALDH1A1 ελέγχει τα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου με τον κανονισμό της KLF4 και των πρωτεϊνών p21

Αυξημένη έκφραση του KLF4 σε ΑΙ_ϋΗ + κύτταρα (Σχήμα 3D) μας οδήγησε να αξιολογεί κάθε λειτουργική σχέση μεταξύ ALDH1A1 και KLF4. Αν ALDH1A1 knockdown δεν επηρέασε το επίπεδο της KLF4 mRNA, μια σημαντική μείωση στα επίπεδα πρωτεΐνης KLF4 αποδείχθηκε σε αυτά τα κύτταρα (Σχήμα 5Α ). Λαμβάνοντας υπόψη ότι η λειτουργική κατάσταση του ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου p21 είναι άρρηκτα συνδεδεμένα με τη λειτουργία KLF4 του, αξιολογήθηκαν επίσης τα επίπεδα του mRNA και της πρωτεΐνης του p21. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα δύο μεταγράφημα και πρωτεΐνη επίπεδα ALDH1A1 του ρ21 μειώθηκαν δραματικά σε ανεπαρκή ALDH1A1 Α2780 /κύτταρα CP70 (Σχήμα 5Α). Από την κατάσταση ALDH1A1 επηρέασε την έκφραση του κυτταρικού κύκλου πρωτεϊνών checkpoint p21 /CDK4, αναλύσαμε περαιτέρω τα προφίλ κυτταρικού κύκλου των κυττάρων αυτών. Τα δεδομένα κυτταρομετρίας ροής υποδεικνύουν σαφώς μειωμένο πληθυσμό G1 κυττάρων (50,25% σε 42,10%) και μια αντισταθμιστική αύξηση της συσσώρευσης των κυττάρων σε S και G2 φάσεις (Σχήμα 5Β). Λόγω του γεγονότος ότι τα κύτταρα σε ενεργή αναδιπλασιασμού (S και G2 φάσεις) είναι πιο ευάλωτα σε γενοτοξικό στρες σε σύγκριση με μη-διαχωριστική τους ή άλλων ανήσυχο φάσεις (G0 και G1), η εκ νέου ευαισθητοποίηση των ελαττωματικών κυττάρων ALDH1A1 μπορεί εν μέρει να αποδοθεί στις μεταβολές στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου. Επιπλέον, έχουμε επίσης επιβεβαίωσε ότι το καθεστώς KLF4 επηρεάζει τα επίπεδα έκφρασης p21 σε Α2780 /κύτταρα CP70 (Σχήμα S2A & amp? S2B). Εντούτοις, η αξιολόγηση της δραστικότητας ALDH και έκφραση ALDH1A1 σε κύτταρα δεν παρουσίασαν αξιοσημείωτες αλλαγές, υποδηλώνοντας KLF4 πιθανόν χρησιμεύει κατάντη προς ALDH1A1 (Σχήμα S2C).

ALDH1A1 καλά και με ανεπάρκεια Α2780 /κύτταρα CP70 αξιολογήθηκαν για έκφραση των βλαστικών -όπως δείκτη κυττάρου KLF4 και του κυτταρικού κύκλου πρωτεΐνη ρ21 σημείο ελέγχου με RT-PCR και ανάλυση Western blot (Α). κατανομές κυτταρικού κύκλου των κυττάρων αναλύθηκαν μετά από σταθεροποίηση των κυττάρων σε 70% χρώσης μεθανόλη και ιωδιούχο προπίδιο που ακολουθείται από κυτταρομετρία ροής (Β). Τα αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν μετά από χρώση των κυττάρων με APC-αννεξίνης V και 7-AAD σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (C).

Η

Για να αξιολογεί περαιτέρω τα γονίδια που είναι υπεύθυνα για χημειοαντίσταση και κυτταρικές ρύθμιση του κύκλου με βάση την κατάσταση της ALDH1A1, έχουμε χρησιμοποιήσει RT

2 Profiler PCR γεννήτριας για την ανθρώπινη Αντίσταση Cancer Drug & amp? Του κυτταρικού κύκλου (Ambion). Οι συγκριτικές προφίλ έκφρασης των γονιδίων σε ALDH1A1 knockdown vs. κύτταρα ελέγχου αποκάλυψε μία σημαντική μείωση στην έκφραση του ρυθμιστών κυτταρικού κύκλου CDKN1A (p21) (0,27 φορές) και CDK4 (0,26 φορές), το οποίο επιβεβαιώνει το ρόλο της, σε συνδυασμό με KLF4 ( Πίνακας 1).

η

Αξίζει να σημειωθεί ότι, με την αποκατάσταση της ευαισθησίας της πλατίνας από ALDH1A1 νοκ ντάουν, έκφραση της προ-αποπτωτικό παράγοντα ΒΑΧ ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω περίπου 3,95 φορές. ALDH1A1 knockdown απέδειξε αυξημένο αριθμό κυττάρων σε πρώιμη αποπτωτική φάση σε σύγκριση με τον έλεγχο. Μετά από έκθεση των κυττάρων σε 1,0 μΜ σταυροσπορίνη για 6 ώρες, μια δραματική αύξηση των πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων παρατηρήθηκε σε κύτταρα με ανεπαρκές ALDH1A1 σύγκριση με ALDH1A1 ικανός αντίθετα μέρη τους (35,3% έναντι 20,3%) (Σχήμα 5C). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι ALDH1A1 knockdown κύτταρα είναι πιο ευαίσθητα σε ΒΑΧ επαγόμενη απόπτωση, η οποία έχει περιγραφεί καλά στην αναστολή του οδοφράγματος ρ21 του κυτταρικού κύκλου [29].

ALDH1A1 μεσολάβηση αντίστασης πλατίνας συσχετίζεται με δίκτυα επισκευή αλλαγμένο DNA

άθικτη σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και την αντιμετώπιση βλαβών του DNA (DDR) μηχανισμοί σηματοδότησης είναι σημαντικά για την ικανότητα του κυττάρου να αντιμετωπίσει με διαφορετικά είδη γονιδιωματικής ύβρεις και ομαλή εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Ωστόσο, ένα κοινό χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων μεταβάλλεται ρύθμιση αυτών των καταρρακτών σηματοδότησης να αποκτήσει πρόσθετες γενετικές αλλαγές που απαιτούνται για την εκ νέου διαφοροποίηση και την επιβίωση εμφανίζει ως εκ τούτου θεραπευτικό αντίσταση. Ομοίως, τα κύτταρα ALDH1A1 εμφανίζεται αλλαγμένη ρύθμιση μεσολάβηση /p21 μηχανισμό σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου KFL4, η οποία κατευθύνει κυρίως την αναστολή της G1 στην S και G2 σε εξέλιξη Μ ως απάντηση στην καταστροφή του DNA ώστε να υπάρχει περισσότερος χρόνος για το κύτταρο για την επισκευή. Λαμβάνοντας υπόψη τη σύνδεση της PARP-1 επισκευής που προκαλείται καρβοπλατίνη βλάβες στο DNA, αξιολογήσαμε τη συμμετοχή της στα κύτταρα ALDH1A1. PARP-1 επίπεδα προοδευτικά αυξήθηκαν μέχρι και 45 λεπτά μετά την καρβοπλατίνη αγωγή (Σχήμα 6Α και 6Β). Ωστόσο, προς τα κάτω ρύθμιση των ALDH1A1 οδήγησε σε σημαντική μείωση (1,8 φορές) συνολικά επίπεδα PAR (δραστηριότητα PARP) (Σχήμα 6C) σε σύγκριση με καλά κύτταρα ALDH1A1 (

σ

= 0,012).

ALDH1A1 καλά (έλεγχος) και ανεπάρκεια (shALDH1A1) Α2780 κύτταρα /CP70 αξιολογήθηκαν για τις ικανότητές τους να επισκευάσει επάγεται καρβοπλατίνη ενιαίο διαλείμματα κλώνου κοιτάζοντας εξαρτάται από το χρόνο επαγωγής των επιπέδων της πρωτεΐνης ΡΑΚΡ-1 με κηλίδες Western (Α), πυκνομετρία των στυπωμάτων με Image J ( Β) και τη συνολική δραστηριότητα ΡΑΚΡ προσδιορίστηκε με μέτρηση των επιπέδων PAR (C). Για την αξιολόγηση των εξαρτώμενων πρωτεϊνών DDR έκφραση και επιδιόρθωση ALDH1A1, λύματα ολόκληρων κυττάρων κανονικοποιήθηκαν για ολική πρωτεϊνών και ανάλυση κηλιδώσεως Western πραγματοποιήθηκαν με την χρησιμοποίηση αντισωμάτων όπως παριστάνεται (D).

Η

Αρκετές πρόσφατες μελέτες σχετικά με τον καρκίνο του μαστού STEM- κύτταρα δείχνουν μεταβληθεί ρύθμιση των δικτύων επιδιόρθωσης του DNA, ιδιαίτερα μια αντίστροφη σχέση μεταξύ της κατάστασης ALDH1A1 και γονιδιακή έκφραση BRCA1 [15], [16]. Επιπλέον, σε απόκριση σε βλάβη του DNA, BRCA1 είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και την επιλογή των μονοπατιών επιδιόρθωσης του DNA για την έγκαιρη επισκευή αυτών των βλαβών του DNA [16]. Σε συμφωνία με τα δεδομένα των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου του μαστού, ανάλυση κηλίδος Western αποκάλυψε μια αντίστροφη σχέση μεταξύ ALDH1A1 και έκφραση BRCA1 σε Α2780 /κύτταρα CP70, υποδηλώνοντας ALDH1A1 εκφράζουν ωοθηκών καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν πιο πιθανό να χάσουν ή να εκφράζουν χαμηλά επίπεδα του BRCA1. Περαιτέρω ανάλυση αποκάλυψε κάτω ρύθμιση των ALDH1A1 που προκαλείται απόκριση βλάβης αυθόρμητη DNA με την έκφραση της πρωτεΐνης γ-H2AX (ένας δείκτης της διπλής διαλείμματα σκέλος). Αυτό είναι επίσης συνέπεσε με τα μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης επιδιόρθωσης εκτομής (ΧΚΧΧ1), αντιγραφή οδοφράγματος πρωτεϊνική κινάση 1 (Chk1) και άλλες αντιγραφή άγχος που συνδέεται Fanconi αναιμία (FA) -BRCA γονιδιακών προϊόντων FANCD2 και FANCJ [30] – [32]. Μαζί αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ωοθηκών καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν μπορούν να διατηρούν θεραπευτική αντίσταση εκφράζοντας ALDH1A1 και εξάντληση της οποίας, καταργεί G1 και τα σημεία ελέγχου φάσης S (Σχήματα 5Α και 6C) που οδηγεί σε αντιγραφή στρες (Σχήμα 5Β). Αν και ALDH1A1 εξαντληθεί κύτταρα συσσωρεύονται στο S και G2 φάσεων, η κατάσταση φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης αναδιπλασιασμού οδοφράγματος Chk1 (Ser317) και έκφραση του αναδιπλασιασμού που σχετίζεται πιρούνι πρωτεΐνες μονοπάτι FA FANCD2 και FANCJ επηρεάστηκαν. Αυτό είναι επίσης παρέχεται από την επαγωγή της γ-H2AX, ένα δείκτη για ΟΕΔ και μειωμένη επιβίωση των κυττάρων. Δεδομένου ότι οι πρωτεΐνες Chk1 και FA είναι σημαντικές για την οδοφράγματος αντιγραφή και τη σταθερότητα του αδιέξοδο πιρούνια αντιγραφής, η αυθόρμητη απόκριση βλάβη του DNA σε αυτά τα κύτταρα μπορεί να αποδοθεί σε ελάττωμα αυτών των πρωτεϊνών (Σχήμα 6D). Για τον εντοπισμό των σημάτων μοριακό δίκτυο που εκφράζονται διαφορικά σε ALDH1A1 κύτταρα που εκφράζουν, μπορούμε αρχικά αξιολόγησε την έκφραση του Fanconi αναιμία οδού και η αντίσταση του όγκου σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Συνέπεια, τα αποτελέσματά μας έδειξαν μια άμεση συσχέτιση μεταξύ της κατάστασης ALDH1A1 και της έκφρασης FANCD2. Μαζί τα δεδομένα μας δείχνουν μια σύνδεση μεταξύ της κατάστασης ALDH1A1 να βλαστική ικανότητα και πλατίνα αντίσταση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών με αλλαγμένη ρύθμιση των εργασιών επιδιόρθωσης του DNA.

Συζήτηση

Πολλά δυναμικό των ωοθηκών ΚΕΠ ειδικούς δείκτες επιφάνειας έχουν περιγραφεί όπως όπως CD44 + /CD117 + [33], CD44 + /MyD88 + [34], CD133 + [35], CD44 + /CD24- [21], [36] και ΑΙ_ϋΗ /CD133 + [37]. Ανίχνευση ALDH1A1 μέσω της δοκιμασίας ALDEFLUOR είναι μια απλή και αποτελεσματική προσέγγιση για τον εντοπισμό και την απομόνωση ΚΕΠ ωοθηκών από κυτταρικές γραμμές και πρωτογενείς ιστούς.