Αφηρημένο

Ιστορικό

σύστημα τελομερούς /τελομεράσης έχει πρόσφατα αναγνωριστεί ως μια ελκυστική στόχευση για αντικαρκινική θεραπεία. Η τελομεράση αποτελέσματα αναστολή στην υποχώρηση του όγκου και αυξημένη ευαισθησία σε διάφορες κυτταροτοξικά φάρμακα. Ωστόσο, αυτό δεν έχει πλήρως καθοριστεί ακόμη αν ο μεσολαβητής των επιδράσεων αυτών είναι η αναστολή της τελομεράσης

per se

ή βράχυνση των τελομερών που προκύπτουν από την αναστολή της δραστηριότητας της τελομεράσης. Επιπλέον, τα χαρακτηριστικά και τους μηχανισμούς της ευαισθητοποίησης σε κυτταροτοξικά φάρμακα προκαλείται από την αναστολή της τελομεράσης δεν έχει διευκρινιστεί με συστηματικό τρόπο.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Στη μελέτη αυτή χαρακτηρίζεται η σχετική σημασία της αναστολή της τελομεράσης έναντι τελομερών σε καρκινικά κύτταρα. Ευαισθητοποίηση των καρκινικών κυττάρων σε κυτταροτοξικά φάρμακα επιτεύχθηκε με βράχυνση των τελομερών σε μήκος με τρόπο που εξαρτάται και όχι δι ‘αναστολής της τελομεράσης

per se

. Στο σύστημά μας αυτό ευαισθητοποίηση σχετιζόταν με το μηχανισμό δράσης του κυτταροτοξικού φαρμάκου. Επιπλέον, βράχυνσης των τελομερών επηρεάζονται επίσης και άλλες λειτουργίες καρκινικών κυττάρων όπως η μετανάστευση. Βράχυνσης των τελομερών που προκαλείται από βλάβη στο DNA του οποίου η επισκευή ήταν μειωμένη μετά τη χορήγηση της σισπλατίνη, ενώ δοξορουβικίνη ή βινκριστίνη δεν επηρέασε την επιδιόρθωση του DNA. Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώθηκαν και σε

in vivo

μοντέλο ποντικού. Η υποθετική εξήγηση στηρίζεται το φαινότυπο που προκαλείται από τελομερών μπορεί να σχετίζεται με αλλαγές στην έκφραση των διαφόρων microRNAs που προκλήθηκε από βράχυνσης των τελομερών.

Συμπεράσματα /Σημασία

Για καλύτερη γνώση μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που χαρακτηρίζουν η σχετική επίδραση της αναστολής τελομεράσης και βράχυνσης των τελομερών σε διάφορες πτυχές του φαινοτύπου καρκινικών κυττάρων, ιδίως σε σχέση με ευαισθησία σε κυτταροτοξικά φάρμακα και υποθετικό μηχανισμούς της. Οι αλλαγές microRNA σε καρκινικά κύτταρα κατά των τελομερών είναι νέες πληροφορίες. Τα ευρήματα αυτά μπορεί να διευκολύνει την ανάπτυξη των τελομερών προσεγγίσεις που βασίζονται στη θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Uziel O, με γεύση μπύρας Ε, Dronichev V, Samocha K, Gryaznov S, Weiss L, et al. (2010) βράχυνσης των τελομερών ευαισθητοποιεί καρκινικά κύτταρα να Επιλεγμένα Τα κυτταροτοξικά εκπρόσωποι:

In Vitro

και

In Vivo

Μελέτες και Υποθετικές μηχανισμοί. PLoS ONE 5 (2): e9132. doi: 10.1371 /journal.pone.0009132

Επιμέλεια: Μιχαήλ Β Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30, Σεπ, 2009? Αποδεκτές: 6 Δεκ του 2009? Δημοσιεύθηκε: 9 Φεβρουαρίου 2010

Copyright: © 2010 Uziel et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε μερικώς από ερευνητικές επιχορηγήσεις από Ράμπιν Ιατρικού Κέντρου Αρχή έρευνας και μια ερευνητική επιχορήγηση από Sackler School of Medicine, Τελ Αβίβ Πανεπιστήμιο, το Ισραήλ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή οι

Ανθρώπινο τελομερή αποτελούνται από κλώνου επαναλήψεις ενιαίας TTAGGG και τα αντίστοιχα δίπολα αυτής εξανουκλεοτιδίου βρίσκονται στα δύο άκρα του γραμμικού χρωμοσώματος. Μαζί με ειδικό σύμπλοκο πρωτεΐνης shelterin τους παρέχουν σταθερότητα στο σύνολο του γονιδιώματος, συγκαλύπτοντας το χρωμόσωμα τελειώνει από το να αντιμετωπίζεται από τους μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA όπως το διπλό διαλείμματα σκέλος [1]. Τα τελομερή σταδιακά διαβρώνουν στα περισσότερα σωματικά κύτταρα μετά από κάθε κύκλο αντιγραφής του DNA, μέχρις ότου επιτευχθεί η κρίσιμη μικρού μήκους το οποίο τελικά εκκινεί μία παύση της κυτταρικής ανάπτυξης που ονομάζεται κυτταρική γήρανση [2]. Τα καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιούν το ένζυμο τελομεράση να παρακάμψουν βράχυνσης των τελομερών, και ως εκ τούτου την επίτευξη ατελείωτες δυναμικό αντιγραφής. Η τελομεράση είναι ένα μοναδικό συγκρότημα ριβονουκλεοπρωτεΐνης ανάστροφης μεταγραφάσης που διατηρεί μια σταθερή κατάσταση του μήκους του τελομερούς συνθέτοντας επαναλήψεις TTAGGG στα άκρα των χρωμοσωμάτων. Είναι πολύ δραστικό σε περισσότερο από το 90% όλων των κακοηθειών, και ως εκ τούτου θεωρείται σήμα κατατεθέν του καρκίνου [3]. Η τελομεράση δεν εκφράζεται στα περισσότερα φυσιολογικά σωματικά κύτταρα αλλά διατηρεί μέτρια δραστικότητα σε πολλαπλασιαστική βλαστοκύτταρα και σε μεγαλύτερο βαθμό στα αρσενικά γεννητικά κύτταρα γραμμής. Λόγω αυτής της ιδιαιτερότητας και ουσιαστικότητα στην απεριόριστη διάρκεια ζωής των καρκινικών κυττάρων, τελομεράση θεωρείται έγκυρη και ελκυστική αντικαρκινικό στόχο [4].

Πράγματι, πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι τα αποτελέσματα της αναστολής της τελομεράσης στην απόπτωση των καρκινικών κυττάρων, συρρίκνωση όγκων σε πειραματικά ζωικά μοντέλα και αυξημένη ευαισθησία των κυττάρων του όγκου σε διάφορα αντικαρκινικά τρόπους [5]. Ωστόσο, δεν είναι σαφές αν αυτοί οι «ευεργετικές βιολογικά επιθυμητά αποτελέσματα» είναι η συνέπεια της βράχυνσης των τελομερών ή την αναστολή της τελομεράσης

per se

. Επιπλέον, δεν έχει προσδιοριστεί ακόμη αν η βελτίωση της ευαισθησίας σε κυτταροτοξικά φάρμακα μέσω αναστολής της τελομεράσης /βράχυνσης των τελομερών εξαρτάται από τον μηχανισμό ή την κατηγορία του χημειοθεραπευτικού παράγοντα.

Τα περισσότερα από τα στοιχεία υποδεικνύουν βράχυνση των τελομερών κάτω από ένα κρίσιμο όριο ως το πιο σημαντικό στόχο επιτυγχάνεται μέσω αναστολής της τελομεράσης [6], [7], υποστηρίζοντας την ιδέα με την οποία επίτευξη σημαντικών τελομερών θα οδηγήσει σε αντι καρκίνος κλινικά αποτελέσματα. Ωστόσο, αρκετές μελέτες εμπλέκουν επιπλέον «εξωσχολικές» δραστηριότητες της τελομεράσης που είναι ανεξάρτητες της ρύθμισης μήκους των τελομερών. Για παράδειγμα, η τελομεράση έχει δειχθεί ότι διαθέτει ιδιότητες αντιαποπτωτικών [8], [9]. Επιπλέον, η συμμετοχή της σε απάντηση της βλάβης του DNA [10] ή την προστασία του DNA από το «ανώτατο όριο» [11] προσδιορίστηκε επίσης. Η τελομεράση έχει επίσης εμπλακεί σε γονίδιο ελέγχου έκφρασης ανεξάρτητα από το μήκος των τελομερών και σε συμβολή στην ανάπτυξη των διαφόρων τύπων των καλοήθων [12] – [14]. Και κακοήθεις [15], [16] κύτταρα

Ο στόχος αυτός της μελέτης ήταν να διευκρινισθεί η σημασία της αναστολής της τελομεράσης

ανά

se έναντι της επίδρασης των τελομερών σε καρκινικά κύτταρα και να αξιολογηθεί η επίδραση αυτών των διαταραχών σχετικά με την ευαισθησία των κυττάρων σε διάφορα κυτταροτοξικά φάρμακα με διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης. Επιπλέον, με σκοπό την απεικόνιση των μηχανισμών με τους οποίους τα κύτταρα με κοντή μήκος των τελομερών έκθεμα διαφορετική ευαισθησία σε αυτά τα φάρμακα.

Έχουμε βρει ότι η αναστολή της τελομεράσης

per se

δεν μεταβάλλει την ευαισθησία πολλών κακοήθεις κυτταρικές σειρές σε οποιοδήποτε από τα φάρμακα που δοκιμάστηκαν. Μακροπρόθεσμη αναστολή της τελομεράσης, που είχε ως αποτέλεσμα βράχυνσης των τελομερών ευαισθητοποιηθεί τα κύτταρα να σισπλατίνη, ένα DNA προσαγωγές παράγοντας σχηματισμού και όχι στη δοξορουβικίνη, ένα διπλό διαλείμματα σκέλος πράκτορα ή βινκριστίνη, η οποία τρόπος δράσης δεν είναι μέσω της άμεσης βλάβης του DNA που παράγουν. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν σε ένα ζωικό μοντέλο που χρησιμοποιεί γυμνούς ποντικούς με ξενομοσχεύματα κυττάρων παγκρεατικού καρκινώματος που είχαν εκτεθεί σε αναστολέα τελομεράσης και κυτταροτοξικά φάρμακα. Κύτταρα με μικρότερη τελομερή αποκτήσει φαινότυπο βλάβη στο DNA των οποίων η επισκευή ήταν μειωμένη μετά από μόνο σισπλατίνη και εξέφρασε miRNA που σχετίζονται με διακοπή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων. Αυτά τα κύτταρα παρουσιάζονται επίσης βραδύτερη μετανάστευσης σε σχέση με την άγρια ​​τύπου (WT) των ομολόγων. Προτείνουμε τελομερών στα καρκινικά κύτταρα που σχετίζονται με αλλαγές στην έκφραση των miRNAs και οδηγεί σε μειωμένη επιδιόρθωση του DNA μετά από έκθεση σε σισπλατίνη συγκεκριμένα.

Υλικά και Μέθοδοι

τηλέφωνα Γραμμές

SK-N-MC (σάρκωμα Ewing) κυτταρική γραμμή παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr Gad Lavie (Sheba Medical Center, Ramat Gan-Ισραήλ). MCF-7 (καρκίνωμα του μαστού) και Κ562 (χρόνια μυελοειδή λευχαιμία) κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10-15% θερμο-απενεργοποιημένο ορρό εμβρύου μόσχου (FCS), γλουταμίνη (2 mM), πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη (Beit Haemek, Ισραήλ ). Αναλύσεις πολλαπλασιασμού, αναλύσεις απόπτωση και δοκιμασίες δραστικότητας τελομεράσης πραγματοποιήθηκαν σε όλες τις κυτταρικές σειρές. SK-N-MC γραμμή επελέγη για περαιτέρω λεπτομερή ανάλυση των διαφόρων μηχανισμών που σχετίζονται με την επίδραση της αναστολής της τελομεράσης στην ευαισθησία στην cisplatinum. Τα κύτταρα ελέγχου διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια χωρίς αναστολέα τελομεράσης, GRN163, παράλληλα με τις τελομεράσης ανέστειλε κύτταρα.

Η τελομεράση Αναστολή

Τα κύτταρα εκτέθηκαν δύο φορές την εβδομάδα για αναστολέα τελομεράσης GRN163, προορίζονται για την περιοχή προτύπου του RNA υπομονάδα της τελομεράσης (hTR). Τα κύτταρα ελέγχου διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια χωρίς αναστολέα τελομεράσης παράλληλα με τις ανέστειλε κύτταρα. Για το

in vivo

αναστολή της τελομεράσης, τα ποντίκια ενέθηκαν με GRN163L, μία παλμιτοϋλ (C16) λιπίδιο εγγεγραμμένων Ν3′-Ρ5 ‘φωσφοραμιδικού εκδοχή του GRN163. Και οι δύο ενώσεις ευγενώς από τον Γέροντα Corporation (Menlo Park, CA, USA)

Drug Θεραπεία και

In Vitro

Πειραματικό πρωτόκολλο

Όλες οι κυτταρικές σειρές εκτέθηκαν στα ακόλουθα φάρμακα για τρεις ημέρες πριν από την πολλαπλασιασμό, κυτταρικό κύκλο και την απόπτωση αναλύσεις: σισπλατίνη, ένα DNA προσαγωγές σχηματισμού φαρμάκου, δοξορουβικίνη, ένα διπλό έλικα παράγοντα ο οποίος και βινκριστίνη, η οποία παρεμβαίνει με τον σχηματισμό ατράκτου μικροσωληνίσκων, έτσι σταματά τον διαχωρισμό των διπλές χρωμοσωμάτων και αποτρέπει την κυτταρική διαίρεση. Η συγκέντρωση των φαρμάκων απεικονίζεται στο τμήμα αποτελέσματα

Για να εκτιμηθεί η επίδραση της αναστολής της τελομεράσης έναντι βράχυνσης των τελομερών από την ευαισθησία των κυττάρων των κυτταροτοξικών φαρμάκων επινοήσαμε τέσσερις πειραματικές συνθήκες:. 1. Η τελομεράση ανεστάλη στο τρεις κυτταρικές σειρές για τρεις ημέρες τη δημιουργία κύτταρα χωρίς δράση της τελομεράσης και με άθικτα (WT) τελομερή. 2. Μακροχρόνια αναστολή (από τρεις έως 16 μήνες), δημιουργώντας κύτταρα χωρίς δράση της τελομεράσης και να συντομευθούν τελομερή. 3. Απόσυρση του αναστολέα της τελομεράσης στα κύτταρα με κοντή τελομερή, δημιουργώντας κύτταρα με σύντομη τελομερή και να ανασυσταθεί δράση της τελομεράσης. 4. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκαν άθικτα κύτταρα άγριου τύπου. μήκους του τελομερούς και η IC50 των τριών κυτταροτοξικών φαρμάκων προσδιορίστηκαν μετά από 3 και 16 μήνες σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές.

Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού

Προσκολλητικά κύτταρα (1 χ 10

4 κύτταρα ml

-1 SK-N-MC και MCF-7) σπάρθηκαν εις τετραπλούν σε πλάκες 24 φρεατίων. Διάφορα φάρμακα προστέθηκαν στις ακόλουθες συγκεντρώσεις κυμαίνονται: βινκριστίνη: 0-100 ng /ml, δοξορουβικίνη: 0-1000 ng /ml και σισπλατίνη: 0-10 μg /ml. Μετά από 3 ημέρες, ο πολλαπλασιασμός προσδιορίστηκε με την δοκιμασία σουλφοροδαμίνης Β [17]. Ο πολλαπλασιασμός των μη-προσκολλημένα κύτταρα Κ562 προσδιορίστηκε με τη WST 1-δοκιμασία που ακολουθεί τη μετατροπή του άλατος τετραζολίου σε φορμαζάνη βαφής από μιτοχονδριακά ένζυμα σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Roche, Germany) και όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17].

TRAP Δοκιμασία

κύτταρα (5 × 10

4 /ml) τοποθετήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και επωάζονται σε παρουσία GRN163 για 1-3 ημέρες. Κάθε αγωγή διεξήχθη εις διπλούν. Στη συνέχεια, η μέτρηση της δραστικότητας της τελομεράσης εκτελέστηκε από τον ποσοτικό προσδιορισμό TRAP βασιζόμενη σε PCR, χρησιμοποιώντας το TRAP

EZE κιτ ανίχνευσης τελομεράσης (Δια-ηλικιακό, ΝΥ, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Εν συντομία, τα κύτταρα λύθηκαν με παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης CHAPS) για 30 λεπτά στους 4 ° C και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στις 13.000 rpm για 30 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο ακολούθως συλλέχθηκε και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία Bradford (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). Εκχυλίσματα πρωτεΐνης (0,2 μg) αναλύθηκαν για ανάλυση TRAP. Κάθε αντίδραση διεξήχθη σε ένα μίγμα αντίδρασης 50 μΙ που περιείχε 10 Χ ρυθμιστικού διαλύματος TRAP, μείγμα dNTP, TS εκκινητή, μείγμα εκκινητή TRAP και Taq πολυμεράση. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν στους 30 ° C για 30 λεπτά και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ενίσχυση PCR για 30 κύκλους των 94 ° C, 58 ° C και 72 ° C για 30 s το καθένα, και διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου 12,5% (Acryl /δις 19:01 λύση). Οι πηκτές χρωματίστηκαν με Syber Πράσινο λεκέ νουκλεϊκών γέλη οξέος (Amresco, Ohio, USA). Ποσοτικοποιήσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το Ποσότητα-ένα λογισμικό για συστήματα ανάλυσης εικόνας Bio-Rad του (Bio-Rad Laboratories, Ισραήλ). δραστικότητα τελομεράσης υπολογίστηκε σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: TPG = [(Χ-Χ

0) /C]: [(R-r

0) /Cr * 100], όπου TPG παράγεται το συνολικό προϊόν, Χ σημαίνει κάθε δείγμα, C αντιπροσωπεύει το 36 bp εσωτερικού ελέγχου PCR, r είναι ο έλεγχος ποσοτικοποίηση TSR8.

TRF μήκος

τερματικό τεμάχιο περιορισμού (TRF) μήκους, που αντιστοιχεί στο μήκος των τελομερών, μετρήθηκε με μία τεχνική μη-ραδιενεργό Southern blot. δείγματα DNA εκχυλίζονται από τα κύτταρα με το κιτ καθαρισμού Γονιδιωματικό DNA (Gentra, Minneapolis, ΜΝ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, σε πέψη για 16 ώρες από το

HinfIII

και

RSAI

και διαχωρίζεται σε πηκτώματα αγαρόζης 0 · 8%. Μετά τη μεταφορά σε θετικά φορτισμένη μεμβράνη νάιλον, τα δείγματα υβριδοποιήθηκαν με επισημασμένο με διγοξιγενίνη διερευνητή (TTAGGG)

4 (Roche Applied Science, Mannheim, Germany) για 16-18 ώρες. Οι μεμβράνες στη συνέχεια εκτίθενται σε χημική φωταύγεια ευαίσθητο φιλμ, και οι μέσες μήκη TRF υπολογίστηκαν από το σύστημα απεικόνισης Versa Doc, χρησιμοποιώντας Ποσότητα One λογισμικού (Bio-Rad Laboratories).

Αναλύσεις miR Υπογραφή

απομόνωση RNA.

RNA απομονώθηκε με τη χρήση του εμπορικού κιτ ΕΖ-RNA II (Biological Industries, Beit Haemek, Israel) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή που παρέχονται. Σε γενικές γραμμές, τα κύτταρα μετά από σχετικές θεραπείες λύθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης του κιτ και αποθηκεύτηκε στους -70 ° C πριν από την εκχύλιση RNA το οποίο έγινε σε όλα τα κύτταρα με τη μία, πριν από την υβριδοποίηση με συστοιχίες miRNA.

microRNA μικροσυστοιχιών.

έχουν

Προσαρμοσμένη microRNA μικροσυστοιχίες έχουν περιγραφεί στο παρελθόν [18]. Εν συντομία, περίπου 900 DNA Ολιγονουκλεοτιδικοί ανιχνευτές που εκπροσωπούν microRNA (Sanger έκδοση της βάσης δεδομένων 10 και πρόσθετα microRNAs προβλεφθεί και επικυρώνονται από Rosetta Genomics) εντοπίστηκαν στο τριπλούν σε επιχρισμένα slides μικροσυστοιχιών (Nexterion® Slide Ε Schott, Mainz, Γερμανία). Κάθε δείγμα RNA (15 μg ολικού RNA) σημάνθηκε με σύνδεση ενός RNA-συνδέτη, ρ-rCru-Cy /Dye (Dharmacon Lafayette, CO: Cy3 ή Cy5) προς το 3 ‘άκρο. Τα πλακίδια επωάστηκαν με το σημασμένο RNA για 12-16 ώρες στους 42 ° C και στη συνέχεια πλένονται δύο φορές. Συστοιχίες σαρώθηκαν σε ανάλυση 10 μm και οι εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό SpotReader (Niles Scientific Portola Valley, CA). Δύο τύποι θετικών μαρτύρων συμπεριλήφθηκαν στο πειραματικό σχεδιασμό: (i) συνθετικά μικρά RNAs εμπλουτίστηκαν σε κάθε δείγμα RNA πριν επισήμανσης για την επαλήθευση αποτελεσματικότητα επισήμανσης και (ii) ανιχνευτών για άφθονη μικρών RNAs κηλιδώθηκαν για την επικύρωση της ποιότητας RNA. κηλίδες μικροσυστοιχιών συνδυάστηκαν και σήματα εξομαλύνονται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]

Δεδομένα ανάλυσης

Τα στοιχεία που περιλαμβάνονται δύο δείγματα:.. τα κύτταρα SK-N-MC με άθικτα τα τελομερή και SK-N-MC κύτταρα με μικρότερη τελομερή. Ένα σύνολο 170 ανιχνευτές microRNA είχε ένα σήμα που πέρασαν το κατώφλι ελάχιστη 300 σε τουλάχιστον ένα από τα δείγματα. Για καθένα από αυτά τα μόρια microRNA υπολογίσαμε την αλλαγή φορές σήματος μεταξύ των δειγμάτων με σύντομη τελομερή και το δείγμα με άθικτα τα τελομερή.

κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης Αναλύσεις

Τα κύτταρα (0,7-1 × 10

4 ml

-1) καλλιεργήθηκαν για 3 ημέρες. Πλωτή και προσκολλημένα κύτταρα συνενώθηκαν, πλύθηκαν με PBS και οι πυρήνες που παρασκευάζονται από 5 × 10

5 έως 1 χ 10

6 κυττάρων για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής χρησιμοποιώντας ένα απορρυπαντικό-θρυψίνη μέθοδος που ακολουθείται από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο [19]. περιεχόμενο DNA αναλύθηκε με FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), χρησιμοποιώντας λογισμικό ανάλυσης κυτταρικού κύκλου ModFitLT (Verity Software House Inc., Topsham, ΜΕ, USA). Η απόπτωση εκτιμήθηκε με ανάλυση FACS, με την οποία τα κύτταρα στο στάδιο προ-G1 του κυτταρικού κύκλου ορίστηκαν ως αποπτωτικά.

Ανίχνευση γH2AX Εστίες

Τα κύτταρα απλώθηκαν σε πλάκες καλύμματος και εκτίθενται στο φάρμακα για 24 ώρες, σταθεροποιήθηκαν και υπέστησαν επεξεργασία όπως περιγράφεται προηγουμένως [20]. Εν συντομία, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% paraformaldehide, πλύθηκαν τρεις φορές με PBS, και κατέστησαν διαπερατά με 5% Triton Χ για 10 λεπτά. Μετά από τρεις πλύσεις με PBS, τα κύτταρα είχαν μπλοκαριστεί από 10% φυσιολογικό ορό γαϊδάρου και 1% BSA, πλύθηκε και πάλι με PBS και επωάστηκαν με διάλυμα γH2AX αντίσωμα (1:350, Upstate Biotechnology, ΝΥ, USA) για 16 ώρες στους 4 ° C. Το δεύτερο αντίσωμα CY2 συζευγμένο αντι-ποντικού (Jackson Immuno Research Laboratories, ΡΑ, USA) προστέθηκε μετά από τρεις πλένονται με PBS. Καλυπτρίδες χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ και διάλυμα στερέωσης. γH2AX εστίες έγιναν ορατές κάτω από το μικροσκόπιο φθορισμού (Applied Spectral Imaging, Migdal Haemek, Ισραήλ). 50 πυρήνες μετρήθηκαν για κάθε δείγμα.

Η Δοκιμασία Comet

επίπεδα βλάβη του DNA σε κύτταρα με διαφορετικά μήκη των τελομερών και τις ζημίες που πραγματοποιήθηκαν μετά την έκθεση σε φάρμακα αξιολογήθηκαν από τον κομήτη δοκιμασία, όπως περιγράφεται [21 ]. Αυτή η δοκιμασία ακολουθεί το επίπεδο ευθραυστότητα του DNA με την αξιολόγηση της μετανάστευσης θραυσμάτων DNA (προϊόντα εφάπαξ ή /και διπλά σπασίματα κλώνος) από πυρήνα πυρήνα για να σχηματίσει κομήτη σχήμα όταν εκτίθεται σε ηλεκτροφορητική πεδίο. Μετά από χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο, η έκταση του κομήτη μπορεί να παρακολουθείται και να ποσοτικοποιηθεί. Βασικά, κυτταρικό εναιώρημα αναμίχθηκε με 0,65% χαμηλής τήξης αγαρόζη και απλώνονται σε μία πλάκα μικροσκοπίου Star-παγετό, προ-επικαλυμμένο με 0.65% φυσιολογικό αγαρόζης τήξης. Μία τρίτη στοιβάδα που περιέχει 0.65% αγαρόζη χαμηλού σημείου τήξης τοποθετήθηκε στην κορυφή και τα κύτταρα στη συνέχεια λύθηκαν με εμβάπτιση των slides τη διάρκεια της νύχτας σε ένα πρόσφατα παρασκευασμένο διάλυμα λύσης (2.5 Μ NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton Χ-100 , 10% DMSO, ρΗ 10,0) στους 4 ° C. Μετά τη λύση, τα πλακίδια πλύθηκαν τρεις φορές με κρύο νερό και τοποθετείται σε οριζόντια συσκευή ηλεκτροφόρησης γέλης που περιέχει πρόσφατα παρασκευασμένο ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης (1 mM EDTA, 300 mM Ν & ΟΗ, ρΗ = 13,0) για 20 λεπτά για να επιτραπεί DNA ξετύλιγμα. Η ηλεκτροφόρηση στη συνέχεια διεξάγεται σε 20 V και με ρεύμα εκκίνησης 300 mA για 20 λεπτά στους 4 ° C. Στη συνέχεια, τα πλακίδια εξουδετερώθηκαν με τρεις πλύσεις 0.4 Μ Tris, ρΗ = 7.5, αφυδατώνεται με αιθανόλη και ξηραίνεται. Τα πλακίδια χρωματίστηκαν με αιθίδιο διάλυμα 20 μg /ml βρωμιούχο και παρατηρήθηκαν κάτω από φθορίζοντα φωτισμό χρησιμοποιώντας φίλτρο διέγερσης 530-550 nm και φίλτρο φραγής 590 nm (U-MNG κύβος, η Olympus, Germany). Όλα τα στάδια διεξήχθησαν στο σκοτάδι για να αποφευχθούν οι πρόσθετες βλάβη του DNA. Για την αξιολόγηση κομήτη παραμέτρους, διαφάνειες εξετάστηκαν παράλληλα με τη χρήση του λογισμικού ανάλυσης εικόνας Viscomet. Ένα σύνολο 150 τυχαία επιλεγμένα κύτταρα από πλάκες εις τριπλούν εξετάσθηκαν για κάθε δείγμα (50 κύτταρα ανά διαφάνεια). Η ανάλυση εικόνας έγινε σε 200 χ μεγέθυνση. Οι εικόνες των κυττάρων προβάλλονται σε υψηλή ανάλυση Heper-HAD ™ (Sony, Ιαπωνία) φωτογραφική μηχανή CCD (8 bits [APPLITEC, το Ισραήλ, LIS-700]) και αναλύθηκαν με λογισμικό ανάλυσης εικόνας Viscomet χρησιμοποιώντας το grabber πλαίσιο MV Δέλτα (Matrix Vision , Γερμανία). βλάβη στο DNA μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες παραμέτρους: κομήτη έκταση (την απόσταση από το μπροστινό άκρο της κεφαλής προς την οπίσθια ακμή της ουράς), ποσοστό ουρά DNA (ποσοστό του DNA σε ουρά), και η ουρά έκταση στιγμή (ουρά μήκος Χ ποσοστό ουρά DNA ). Διαφάνειες κωδικοποιήθηκαν και ένα ενιαίο ερευνητής ανέλυσε όλες τις διαφάνειες για να ελαχιστοποιηθεί διακύμανση σκορ

Μετανάστευση Αναλύσεις

Η μετανάστευση των κυττάρων εκτιμήθηκε από δύο δοκιμασίες:. Η επούλωση των πληγών δοκιμασία και μια τροποποιημένη δοκιμασία θαλάμου Boyden (transwell δοκιμασίας).

Η επουλωτική των πληγών δοκιμασία διεξήχθη σύμφωνα με ref [22]. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 0,2 × 10

6 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες καλλιέργειας των έξι φρεατίων και αφέθηκαν να σχηματίσουν ένα συρρέουσα μονοστιβάδα. Το στρώμα των κυττάρων στη συνέχεια ξύνεται με ένα ρύγχος πιπέτας Ρ200 να δημιουργήσει μια πληγή πλάτους περίπου 1 mm. Εικόνες των τραυμάτων συλλήφθηκαν σε

t

= 0 και 24 ώρες σε 40 χ μεγέθυνση και η περιοχή του τραύματος προσδιορίσθηκε με τη χρήση του Scion Image για τα παράθυρα άλφα 4.0.3.2 λογισμικού. Η ικανότητα των κυττάρων να κλείσει το τραύμα, δηλαδή, κινητικότητα τους, αξιολογήθηκε με προσδιορισμό της επουλωθεί περιοχή. Ποσοστό θεραπευμένη περιοχή υπολογίζεται με τον ακόλουθο τρόπο: (περιοχή του τραύματος σε

t =

περιοχή 0-πληγή στο

t

= 22) /περιοχή του τραύματος σε

t =

0) × 100. Οι πλάκες χαρακτηρίστηκαν να διασφαλιστεί η συνεπής φωτογραφία-τεκμηρίωση.

Το τροποποιημένο θάλαμο Boyden διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε τριπλούν σε φίλτρα πολυανθρακικού με 8 μm πόρους τοποθετείται στο άνω διαμέρισμα του 24 φρεατίων επικοινωνούντα δοχεία (Costar, Cambridge, Mass, USA). Η κάτω επιφάνεια των θαλάμων transwell επικαλύφθηκε με ινονεκτίνη (5 μg /φίλτρο). Μέσο καλλιέργειας προστέθηκε στο κάτω διαμέρισμα. Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 18 ώρες στους 37 ° C και τα φίλτρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και βάφτηκαν με χρώση Giemsa. Τα κύτταρα στην ανώτερη επιφάνεια του φίλτρου απομακρύνθηκαν με ένα βαμβάκι. Τέλος, τα κύτταρα που έχουν μεταναστεύσει στην κάτω πλευρά του φίλτρου φωτογραφήθηκαν και μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο.

Ζώα

αθυμικά θηλυκά ή αρσενικά BALB /c

ηυ /ηυ

ποντίκια, ηλικίας 5-6 εβδομάδων, αγοράστηκαν από την Harlan Ltd. (Jerusalem, Israel). Οι ποντικοί στεγάστηκαν κάτω από ειδικές συνθήκες άνευ παθογόνων στην κορυφαία διηθείται κλωβούς και τράφηκαν με κανονική διατροφή. Όλες οι διαδικασίες διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τις εγκαταστάσεις και τα πρωτόκολλα που έχουν εγκριθεί από την Επιτροπή Φροντίδας Ζώων και τη χρήση του Hadassah-Hebrew University School of Medicine.

ανθρώπινου ξενομοσχεύματος ποντικού Μοντέλο

CRL 1867 κύτταρα (καρκίνωμα ανθρώπινου παγκρέατος) συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση του συρρέουσες καλλιέργειες, πλύθηκαν, και επαναιωρήθηκαν σε 1.0 × 10

8 κύτταρα /ml σε μέσο ανάπτυξης. Οι ποντικοί εμβολιάσθηκαν με CRL 1687 κύτταρα σε 100 μΐ μέσου κάτω από το ραχιαίο δέρμα μία ημέρα μετά την ακτινοβόληση ολόκληρου του σώματος σε 400 cGy, παραδίδονται από ένα γραμμικό επιταχυντή (Varian Climac 6 ×) σε μια πηγή σε απόσταση δέρμα 80 cm, και ένα ρυθμό δόσης 170 cGy /min. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με 30 mg /kg ε.π. GRN 163L 3 φορές την εβδομάδα για αρκετές εβδομάδες, αρχίζοντας μία ημέρα μετά την ένεση του όγκου. Η ομάδα ελέγχου εγχύθηκε με PBS (0.2 ml ϊ.ρ.). Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε κάθε 6-8 ημέρες με μετρήσεις δαγκάνα δύο κάθετων διαμέτρων ξενομοσχευμάτων (D

1, τη μεγαλύτερη διάμετρο και D

2, η μικρότερη διάμετρος). Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε με τη χρήση του τύπου: π /6 (D

1 × D

2), και εκφράζεται ως μέση μάζα όγκου ± SE (σε mm

3). Σε 41-55 ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων, κατά τη στιγμή της θανάτωσης, οι όγκοι αποκόπηκαν ελεύθερα του συνδετικού ιστού, σταθμισμένη και οι μισοί από αυτούς καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο. Το άλλο μισό χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του μήκους του τελομερούς και παθολογικών παραμέτρων.

Ιστολογίας

Στο τέλος των πειραμάτων, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και ο όγκος, το πάγκρεας, και πνευμονικό ιστό αφαιρέθηκαν. Οι ιστοί μονιμοποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη, ενσωματωμένο σε παραφίνη, χρώση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη και αξιολογήθηκαν με οπτικό μικροσκόπιο.

Αποτελέσματα

In Vitro

Μελέτες

Η τελομεράση αναστολή με GRN163 μικραίνει τα τελομερή.

Διοίκηση της GRN163 οδήγησε σε 70-90% αναστολή της τελομεράσης (Εικ. 1α). Αυτή η αναστολή επέμεινε μέχρι και 72 ώρες και επανειλημμένες μετρήσεις σε όλα τα 16 μήνες πειράματος επαληθεύεται συνεχή αναστολή της τελομεράσης σε αυτό το εύρος (δεν φαίνεται). Σε όλες τις κυτταρικές σειρές τα τελομερή ήταν μειωθεί σε ένα εύρος από 20-30% και 40% μετά από 3 και 16 μήνες, αντιστοίχως (Εικ. 1 b).

α. SK-N-MC, MCF-7 και Κ562 εκτέθηκαν σε 5 μΜ του GRN163. δραστικότητα τελομεράσης εκτιμήθηκε με τον προσδιορισμό TRAP μετά 24 ώρες. C- ελέγχου μη επεξεργασμένα κύτταρα, Μ- αναντιστοιχία μη ειδικά κωδικοποιημένα ολιγο, I-τελομεράση αναστολέα GRN163. R8- έλεγχο πρότυπο TRAP, Ν αρνητικού ελέγχου χωρίς εκχυλίσματα κυττάρων, IC- εσωτερικού ελέγχου PCR. Η έκταση της αναστολής της τελομεράσης υποδηλώνεται σε ποσοστά κάτω από τις λωρίδες. σι. κύτταρα SK-Ν-ΜΟ εκτίθεται συνεχώς σε 5μΜ του GRN163. το μήκος των τελομερών μετρήθηκε με στύπωμα Southern. C- ελέγχου μη επεξεργασμένα κύτταρα, Ια- μήκος των τελομερών των κυττάρων που εκτίθενται σε αναστολέα τελομεράσης για τρεις μήνες, Ib- μήκος των τελομερών των κυττάρων που εκτίθενται σε αναστολέα τελομεράσης για 16 μήνες Μ- δείκτη μοριακού μεγέθους. Η μέση διάρκεια των τελομερών υποδηλώνεται κάτω από κάθε λωρίδα, και το ποσοστό των τελομερών δείχνεται επίσης. ντο. Γραφική παρουσίαση της έκτασης της βράχυνσης των τελομερών, μετά την έκθεση των κυττάρων SK-N-MC για να GRN163 για 1 χρόνο, όπως μετράται με κηλίδα Southern.

Η

βράχυνσης των τελομερών, αλλά δεν παρατηρήθηκε αναστολή της τελομεράσης

per se

ευαισθητοποιεί τα κύτταρα ειδικά για την σισπλατίνη.

Όπως φαίνεται στο Σχ. 2 και Πίνακας 1 βράχυνσης των τελομερών αύξησε την ευαισθησία των τριών κυτταρικών γραμμών να cisplatinum σε μήκος εξαρτώμενο τρόπο. αναστολή της τελομεράσης

per se

δεν είχε καμία ανεξάρτητη επίδραση στα κύτταρα ευαισθησία στην σισπλατίνη. Το IC

50 σισπλατίνη μειώθηκε από 0.13μg /ml έως 0.07μg /ml μετά από 16 μήνες. Η περικοπή τελομερούς δεν επηρέασε σημαντικά την ευαισθησία των κυττάρων να δοξορουβικίνη και βινκριστίνη. Ο Πίνακας 1 συνοψίζει αυτά τα αποτελέσματα και το Σχ. 2 δείχνει σε λεπτομέρειες των αλλαγών στην ευαισθησία των κυττάρων SK-N-MC για cisplatinum. Δεδομένου ότι όλες οι κυτταρικές γραμμές συμπεριφέρθηκαν παρομοίως σε αυτό το πλαίσιο, επιλεγμένα κύτταρα SK-N-MC ως πρότυπο για περαιτέρω χαρακτηρισμό των μηχανισμών που διέπουν τη βράχυνσης των τελομερών επαγόμενη ευαισθητοποίηση των καρκινικών κυττάρων στη χημειοθεραπεία και τη διαφορική ευαισθησία σε cisplatinum.

α. Πολλαπλασιασμό των κυττάρων με κοντή τελομερή εκτίθενται σε σισπλατίνη. κύτταρα SK-Ν-ΜΟ εκτίθεται συνεχώς σε GRN163. Η ευαισθησία των κυττάρων σε σισπλατίνη εκτιμήθηκε μετά από τρεις και 16 μήνες αναστολής της τελομεράσης. Οι αριθμοί δείχνουν το IC

50 του φαρμάκου σε αυτά τα χρονικά σημεία (μετά το 22% και μείωση κατά 40% του μήκους των τελομερών). τιμή P αναφέρεται σε διαφορά μεταξύ WT και σύντομη τηλ-16 μήνες. σι. κατάσταση κυτταρικού κύκλου των κυττάρων SK-N-MC με κοντή τελομερή εκτίθενται σε 0.13μg /ml cisplatinum. κύτταρα SK-N-MC με συντομευμένη τελομερή εκτέθηκαν σε σισπλατίνη και η κατάσταση του κυτταρικού κύκλου αξιολογήθηκε με FACS. + Ή – αναφέρεται στην έκθεση σε σισπλατίνη. C. Η αποπτωτική δείκτης των κυττάρων SK-N-MC με κοντή τελομερή εκτίθενται σε cisplatinum. Τα ίδια τα κύτταρα αναλύθηκαν με FACS για το δείκτη αποπτωτικών τους, όπως αντιπροσωπεύεται από το καθεστώς τους pREG1. Οι αριθμοί δείχνουν την LD

50 σισπλατίνη σε κύτταρα με άθικτο ή μικρότερη τελομερή.

Η

Η περικοπή τελομερούς δεν επηρεάζει την κατάσταση του κυτταρικού κύκλου μετά την έκθεση σε κυτταροτοξικά φάρμακα.

η περικοπή τελομερούς δεν επηρέασε την κατάσταση του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων (ράβδοι Α και Γ στο Σχ 2β.). Η έκθεση των κυττάρων σε cisplatinum οδήγησε σε μείωση του G0 /G1 και αύξηση του G2 /M φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Αυτές οι αλλαγές δεν επηρεάζονται από την βράχυνση των τελομερών (εικ. 2β). Επίσης, βράχυνσης των τελομερών αύξησαν τον αποπτωτικό ποσοστό των κυττάρων που οφείλεται σε χημειοθεραπεία (Εικ. 2γ).

τελομερών βραδύτερη τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων.

Από

in vitro

μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων θεωρείται έγκυρη αναπαράσταση του μεταστατικού δυναμικού τους, αξιολογήσαμε την επίδραση της βράχυνσης των τελομερών σε αυτό το χαρακτηριστικό, καθώς και. Η μετανάστευση εκτιμήθηκε με transwell μεμβράνη (Boyden θάλαμο) (Εικ. 3a, b) και την επούλωση πληγών (Εικ. 3c, d) προσδιορισμούς. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, σχετικά με τη δοκιμασία μεμβράνης transwell τα κύτταρα με κοντή τελομερή μετανάστευσε σημαντικά πιο αργή από ό, τι τα κύτταρα ελέγχου. Η επουλωτική των πληγών δοκιμασία κατέδειξε επίσης τάση προς βραδύτερη μετανάστευση, αλλά τα αποτελέσματα δεν ήταν στατιστικά σημαντική.

Η μετανάστευση των κυττάρων με συντομευμένη τελομερή αξιολογήθηκε από τη transwell και της επούλωσης τραύματος δοκιμασίες. ένα. Η δοκιμασία μεμβράνης φρεατίων. Κύτταρα αφέθηκαν με ακέραια ή συντομευθεί τελομερή να μεταναστεύσουν μέσω μιας μεμβράνης για 16 ώρες, Gimza χρωματίστηκαν και μετρήθηκαν. Μια αντιπροσωπευτική εικόνα εμφανίζεται. σι. Γραφική επίδειξη του μέσου όρου των κυττάρων μετρήσεις των τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων. ντο. Η πληγή δοκιμασία επούλωσης. Κύτταρα με συντομευμένη τελομερή απλώθηκαν σε τρυβλία Petri, και η καλλιέργεια «γδαρμένο» και παρακολουθήθηκαν για 24 ώρες. Μετρήσεις μέσου όρου των ελεύθερων κενών κυττάρων έγιναν. Ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα φαίνεται. ρε. Γραφική επίδειξη του μέσου όρου των κυττάρων μετρήσεις των τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Οι επόμενες μελέτες πραγματοποιήθηκαν με σκοπό να διαφωτίσει τους πιθανούς μηχανισμούς που διέπουν τις φαινοτυπικές μεταβολές που προκαλούνται από βράχυνσης των τελομερών.

Η περικοπή τελομερούς σχετίζεται με αυξημένη βλάβες στο DNA και μειωμένη ικανότητα επιδιόρθωσης του DNA, όπως αξιολογήθηκε από κομήτη δοκιμασία. Σισπλατίνη μειώνει περαιτέρω την επιδιόρθωση του DNA σε κύτταρα με μικρότερη τελομερή.

του μήκους των τελομερών μπορεί να ενισχύσει την απόκριση βλάβη του DNA λόγω της απώλειας της προστατευτικής λειτουργίας του. Για να αξιολογηθεί το επίπεδο της βλάβης του DNA σε κύτταρα με μικρότερη τελομερή, χρησιμοποιήσαμε τον κομήτη δοκιμασίας. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4a, b βράχυνσης των τελομερών συνδέθηκε με βλάβη του DNA στα κύτταρα. Ουρά παράμετρος στιγμή βαθμό (που αντικατοπτρίζει το μήκος της ουράς ποσοστό Χ ϋΝΑ ουράς, ενώ το μήκος της ουράς είναι η απόσταση σε μm από το κέντρο της κεφαλής προς το άκρο της ουράς) ήταν 30% υψηλότερη σε κύτταρα με μικρότερη τελομερή. Αξιολόγηση όλων των άλλων κομήτη παράμετροι προσδιορισμού αποκάλυψε παρόμοια αποτελέσματα, και η συνολική ένταση κομήτη αυξήθηκε κατά περίπου 16% σε αυτά τα κύτταρα.

α. Η αρχή του κομήτη δοκιμασίας. Τα κύτταρα πυρήνες εκτέθηκαν σε ηλεκτροφόρηση και βάφτηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο. Θραύσματα DNA μεταναστεύει έξω των πυρήνων και σχηματίζει το κομήτη. Τρεις βαθμοί της βλάβης του DNA που εμφανίζονται: πυρήνες έλεγχος με ανέπαφο DNA (που αντιπροσωπεύουν βλάβη του DNA σε κύτταρα με ανέπαφη τελομερή, # 1), ενδιάμεση κατάσταση σε κύτταρα με μερικώς σπασμένη DNA (που αντιπροσωπεύει τα κύτταρα με ήπια βράχυνσης των τελομερών, # 2) και κύτταρα με συντομευμένη τελομερή υπόθαλψη καταστραφεί σπασμένο DNA (που αντιπροσωπεύουν κύτταρα με κοντή τελομερή, # 3). σι. Η ποσοτικοποίηση της έκτασης της κατάστασης βλάβη του DNA των κυττάρων με συντομευμένη τελομερή, που εκτελούνται με διαλογή 50 εικόνες ανά δείγμα σε τετραπλασιάζεται. Στην αριστερή παράμετρο στιγμή Tail βαθμό, στη δεξιά συνολικό κομήτη εντάσεις. ντο. Η ποσοτικοποίηση της έκτασης της ικανότητας των κυττάρων για την επιδιόρθωση της βλάβης του DNA που εφαρμόζεται από δοξορουβικίνη (δεξιός πίνακας) ή σισπλατίνη (αριστερό πάνελ) 2 και 4 ώρες μετά το φάρμακο που προκαλείται από βλάβη. Η δοκιμασία διεξήχθη με διαλογή 50 εικόνες ανά δείγμα σε τετράκλινα. Η κατάσταση βλάβης του DNA προσδιορίστηκε με υπολογισμό του βαθμού ουρά στιγμή.

Η

Για να κατανοήσουμε γιατί τα κύτταρα με μικρότερα τελομερή είναι πιο ευαίσθητα σε σισπλατίνη, παρά να δοξορουβικίνη, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε αυτά τα φάρμακα για μία ώρα που ακολουθείται από αλλάζοντας το μέσο με μέσο χωρίς φάρμακο. επίπεδα βλάβη του DNA αξιολογήθηκαν 2 και 4 ώρες μετά την έκθεση στο φάρμακο με τη χρήση της δοκιμασίας κομήτη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4c, τα δύο φάρμακα προκαλούμενη βλάβη του DNA, αλλά τα κύτταρα με κοντή τελομερή απέτυχε να επισκευάσει τη βλάβη του DNA που προκαλείται από σισπλατίνη, ενώ η επαγόμενη δοξορουβικίνη βλάβη επισκευάστηκε με παρόμοιο τρόπο από κύτταρα τόσο με άθικτα και συντομεύεται τελομερή.

βράχυνσης των τελομερών σχετίζεται με το σχηματισμό της βλάβης που προκαλείται από τελομερών εστίες (ΔΕΘ), του οποίου επισκευής είναι μειωμένη σε κύτταρα με μικρότερη τελομερή. ένα. σι. ντο. Σύκο.