Αφηρημένο

Ιστορικό

Πρόκειται για μια σημαντική κλινική πρόκληση να προβλέψουν ποιοι ασθενείς με προχωρημένο στάδιο της κεφαλής και του τραχήλου ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα, δεν θα εμφανίζουν μείωση στο μέγεθος του όγκου μετά από χημειοθεραπεία εφόδου σε Προκειμένου να αποφευχθεί η τοξική δράση της αναποτελεσματικά χημειοθεραπείας και τις καθυστερήσεις για την άσκηση άλλες θεραπευτικές επιλογές. Περαιτέρω, είναι ενδιαφέρον να γνωρίζουμε σε ποιο βαθμό ένα γονίδιο υπογραφή, το οποίο προσδιορίζει τους ασθενείς με όγκους που δεν θα ανταποκριθεί σε μια συγκεκριμένη χημειοθεραπεία εφόδου, εφαρμόζεται όταν οι επιπλέον χημειοθεραπευτικούς παράγοντες προστίθεται στο σχήμα.

Μεθοδολογία /κύρια Ευρήματα

για την αναγνώριση γονιδίων που προβλέπουν την αντίσταση του όγκου σε επαγωγή με σισπλατίνη /5-φθοριοουρακίλη (PF) ή PF και μια ταξάνη, αναλύσαμε βιοψίες των όγκων των ασθενών με όλη μικροσυστοιχίες γονιδίωμα και ποσοτική ανάστροφης μεταγραφάσης-PCR (TLDA) καρτέλλες. Μια μοναδική άδεια από τη διαδικασία διασταυρωμένης επικύρωσης επιτρέπεται αξιολόγηση του εργαλείου πρόβλεψης. Μια δέκα γονίδιο μικροσυστοιχιών υπογραφή ταξινομούνται σωστά 12/13 ανταποκρίθηκαν και 7/10 δεν ανταποκρίθηκαν στο PF (92% ειδικότητα, 82,6% ακρίβεια). Ανάλυση TLDA (χρησιμοποιώντας τον ίδιο ταξινομητή) των ασθενών που έχουν ταξινομηθεί σωστά 12/12 ανταποκρίθηκαν και 8/10 δεν ανταποκρίθηκαν (100% ειδικότητα, 90,9% ακρίβεια). Περαιτέρω, η ανάλυση TLDA προέβλεψε σωστά την απόκριση 5 νέων ασθενών και, συνολικά, 12/12 ανταποκρίθηκαν και 13/15 μη αποκρινόμενους (100% ειδικότητα, 92,6% ακρίβεια). Τα προϊόντα πρωτεΐνης των γονιδίων που αποτελούν την υπογραφή φυσικώς συνδέουν με 27 άλλες πρωτεΐνες, που εμπλέκονται στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, που αποτελεί δίκτυο αλληλεπίδραση. Σε αντίθεση, TLDA με βάση την πρόβλεψη (με το ίδιο γονίδιο υπογραφή) των απαντήσεων σε επαγωγή με PF και είτε δύο ταξάνες ήταν φτωχή (0% ειδικότητα, 25% ακρίβεια και 33,3% ειδικότητα, 25% ακρίβεια).

Συμπεράσματα /Σημασία

η επιτυχής μεταφορά των μικροσυστοιχιών με βάση το γονίδιο υπογραφή σε ένα ανεξάρτητο, PCR-based τεχνολογία υποδηλώνει ότι οι υπογραφές TLDA με βάση θα μπορούσε να είναι ένα χρήσιμο νοσοκομείο με βάση την τεχνολογία για τον καθορισμό θεραπευτικών επιλογών. Αν και πολύ ειδική για αποκρίσεις όγκου σε επαγωγή PF, το γονίδιο υπογραφή είναι ανεπιτυχής όταν προστίθενται ταξάνες. Τα αποτελέσματα απεικονίζουν την λεπτότητα στην ανάπτυξη «εξατομικευμένη ιατρική»

Παράθεση:. Tomkiewicz C, Hans S, Mucchielli ΜΗ, Agier Ν, Ντελακρουά Η Marisa L, et al. (2012) Ένα καρκίνου κεφαλής και τραχήλου όγκου Response-Ειδικό Γονίδιο Υπογραφή για σισπλατίνη, 5-φθοριοουρακίλη χημειοθεραπεία εφόδου αποτυγχάνει με Προστέθηκε ταξάνες. PLoS ONE 7 (10): e47170. doi: 10.1371 /journal.pone.0047170

Συντάκτης: Andrew Yeudall, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 12, 2012? Αποδεκτές: 10 Σεπ 2012? Δημοσιεύθηκε: 9 Οκτωβρίου, 2012

Copyright: © Tomkiewicz et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το CNRS (το Εθνικό Κέντρο Επιστημονικής Έρευνας της Γαλλίας), INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale), assitance Publique-hôpitaux de Paris (CRC03017), ο Καρτέσιος Πανεπιστήμιο Paris. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

πλακώδες καρκίνωμα κεφαλής και τραχήλου (HNSCC) είναι η έκτη συχνότερη μορφή καρκίνου παγκοσμίως [1]. Στη Γαλλία, πάνω από 20.000 νέες περιπτώσεις και περίπου 6.000 θάνατοι αναφέρθηκαν το 2003 και το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης εξακολουθεί να είναι χαμηλό (50%). στρατηγικές θεραπείας για προχωρημένο καρκίνο κεφαλής και λαιμού έχουν αλλάξει τα τελευταία 30 χρόνια. Στρατηγικές σήμερα, ιδιαίτερα για λάρυγγα, oro- και τον καρκίνο υποφάρυγγα, εστιάζονται σε χειρουργικές και μη χειρουργικές διαδικασίες που διατηρούν ένα λειτουργικό όργανο. [2].

Ιστορικά, δύο κλινικές μελέτες, από το Τμήμα Υποθέσεων Βετεράνων (DVA) λάρυγγα Καρκίνος Ομάδα Μελέτης [3] και η Therapy Oncology Group Ακτινοβολία (RTOG) 91 – 11 [4], έχουν επηρεάσει η διαχείριση του προχωρημένου καρκίνου του λάρυγγα. Η μελέτη DVA [3] ήταν ο πρώτος για να προωθήσει τη στρατηγική διατήρησης οργάνων και να αποδείξει ότι η επιβίωση των ασθενών μετά την εισαγωγική ή χημειοθεραπεία εφόδου (σισπλατίνη και 5-φθοριοουρακίλη) ακολουθούμενη από ακτινοθεραπεία ήταν σχεδόν πανομοιότυπη με εκείνη μετά από ολική λαρυγγεκτομή και μετεγχειρητική ακτινοθεραπεία.

Ωστόσο, η χρήση και όφελος της χημειοθεραπείας παραμένει το θέμα της συζήτησης μετά από μια μετα-ανάλυση, το 2000, από 63 δίκες μεταξύ του 1965 και του 1993, η οποία έδειξε ότι η χημειοθεραπεία για μη μεταστατικό καρκίνωμα κεφαλής και λαιμού πλακωδών κυττάρων σε 10.741 ασθενείς με καρκίνο του στοματοφάρυγγα, στοματικής κοιλότητας, του λάρυγγα ή του υποφάρυγγα έδωσε μόνο ένα μικρό σημαντικό όφελος επιβίωσης για ταυτόχρονη θεραπεία chemoradiation [5].

το 2007, μια πολυκεντρική μελέτη Eastern Cooperative Oncology Group φάσης II [6] ανέφεραν υψηλό ποσοστό όργανο-συντήρηση με ταξάνη που βασίζεται σε χημειοθεραπεία για τον καρκίνο στοματοφαρυγγική αλλά όχι για τον καρκίνο του λάρυγγα. Δύο κλινικές μελέτες [7], [8] δημοσιεύθηκαν το 2007, το οποίο σε σύγκριση με μια πιο εντατική αγωγή χημειοθεραπεία εφόδου? docetaxel προστέθηκε στη συμβατική αγωγή σισπλατίνης /5-φθοροουρακίλη. Διαδοχική θεραπεία με επαγωγή docetaxel, cisplatin και 5-φθοριοουρακίλη (ΧΑΤ) βελτίωσε σημαντικά την επιβίωση και την επιβίωση χωρίς εξέλιξη σε σχέση με σισπλατίνη και 5-φθοριοουρακίλη (PF) με τοπικά προχωρημένο λάρυγγα, oro- και υποφάρυγγα καρκίνου [7] προτείνοντας τη χρήση των διαδοχικών TPF ακολουθούμενη από καρβοπλατίνη χημειο-ακτινοθεραπεία ως θεραπευτική επιλογή για τη συντήρηση οργάνων και να βελτιώσει την επιβίωση στον τοπικά προχωρημένο λάρυγγα, oro- και τον καρκίνο υποφάρυγγα. Η ευρωπαϊκή ομάδα μελέτης ΦΟΡΟΥ 323 [8] σε σύγκριση TPF με PF, όπως χημειοθεραπεία εφόδου σε ασθενείς με locoregionally προχωρημένο, ανεγχείρητο νόσο και έδειξε ότι η διάμεση ελεύθερη προόδου επιβίωση ήταν 11,0 μήνες στην ομάδα TPF σε σύγκριση με 8,2 μήνες στην ομάδα PF. Αν και η προσθήκη του δοκεταξόλη ταξανίου στη σισπλατίνη /5-φθοριοουρακίλη χημειοθεραπεία εφόδου βελτιώνει την κλινική ανταπόκριση και την επιβίωση σε σύγκριση με την cisplatin /μόνη 5-φθοριοουρακίλη ή σισπλατίνη /5-φθοριοουρακίλη σε συνδυασμό με ακτινοθεραπεία, μπορεί να έχει μια υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης ανεπιθύμητων αιματολογικών συμβάντων (ουδετεροπενία και σχετικών επιπλοκών) [9]. Παρ ‘όλα αυτά, περίπου το 30% των ασθενών που εμφανίζουν είτε καμία βελτίωση ή επιδείνωση της κατάστασής τους μετά την επαγωγή. Είναι, ως εκ τούτου, μια σημαντική κλινική πρόκληση να προβλεφθεί ποιοι ασθενείς δεν θα ωφεληθούν από την επαγωγή χημειοθεραπεία i) για την αποφυγή τοξικών αποτελεσμάτων της χημειοθεραπείας αναποτελεσματική? ii) για την αποφυγή καθυστερήσεων για άλλες θεραπευτικές επιλογές και iii) να ελαχιστοποιηθεί το κόστος της θεραπείας.

Προηγούμενες έρευνες της ανταπόκρισης στην αρχική χημειοθεραπεία σε HNSCC έδειξε ότι οι διαφορές στις γονότυπους των διαφόρων ενζύμων που σχετίζονται με μεταβολές στο ανταπόκριση στη σισπλατίνη που βασίζεται επαγωγή χημειοθεραπεία [10]. Κυκλίνης Α έκφρασης σε HNSCC προέβλεψε μια καλύτερη ανταπόκριση στη σισπλατίνη /5-φθοριοουρακίλη χημειοθεραπεία [11]. Επίσης, καλύτερα δείκτες επιβίωσης για ασθενείς βρέθηκαν όταν η έκφραση λαμινίνης και syndecan-1 τροποποιηθεί σε ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία [12]. Ωστόσο, όλες αυτές οι μελέτες επικεντρώνονται σε μόνο μία ή λίγες γονίδια. Μικροσυστοιχιών που βασίζεται προφίλ γονιδιακής έκφρασης των καρκίνων της κεφαλής και του λαιμού έχει χρησιμοποιηθεί κυρίως για την ταξινόμηση των όγκων ή για την πρόβλεψη μακρινή μετάσταση ή έκβαση [13] – [15]. Αν και έκφρασης των γονιδίων αναλύσεις έχουν αξιολογήσει την απόκριση σε προεγχειρητική χημειοθεραπεία ακτινοβολία [16] ή επαγωγή χημειοθεραπεία με 5-φθοριοουρακίλη, σισπλατίνη και αντριαμυκίνη [17] σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου, καμία μελέτη μικροσυστοιχίας γονιδιώματος σε επίπεδο ασχολήθηκε σισπλατίνης /5-φθοριοουρακίλη επαγωγή της θεραπείας. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιώντας γονιδιώματος-ευρεία ανάλυση μικροσυστοιχιών, επιδιώξαμε να εντοπίσει γονίδια που ήταν προγνωστική της ανταπόκρισης του όγκου σε αρχική χημειοθεραπεία με σισπλατίνη /5-φθοριοουρακίλη. Εμείς επιπλέον προσπάθησε να καθορίσει σε ποιο βαθμό αυτό το γονίδιο υπογραφή ίσχυε όταν επιπλέον χημειοθεραπευτικούς παράγοντες (σισπλατίνη /5-φθοριοουρακίλη και μια ταξάνη ντοσεταξέλη ή πακλιταξέλη) προστέθηκαν στη θεραπευτική αγωγή.

Απλή αναζήτηση

Μέθοδοι

ασθενείς και χημειοθεραπεία εφόδου

Μεταξύ του 2002 και του 2007, οι ασθενείς με ιστολογικά αποδεδειγμένο καρκίνο του στοματοφάρυγγα, χωρίς προηγούμενο ιστορικό καρκίνου ή πολλαπλές όγκου θέσεις και χωρίς αντένδειξη για σισπλατίνη χημειοθεραπεία βασισμένη ήταν συμμετείχαν στη μελέτη στο Georges Pompidou Ευρωπαϊκό Νοσοκομείο (HEGP), στο Παρίσι. Οι ασθενείς, οι οποίοι είχαν προχωρήσει (στάδιο 3 ή 4) καρκίνους, έλαβαν είτε PF (100 mg /m

2 Ημέρα σισπλατίνη (D) 1 και 1 g /m

2 5-FU D1-D5) ή TPF (είτε καρβοπλατίνη (paraplatine) -AUC5 Δ1 (όπου AUC είναι η περιοχή κάτω από την καμπύλη, μια φόρμουλα που επιτρέπει τον υπολογισμό της δόσης από την προσαρμογή της αξίας της κάθαρσης κρεατινίνης) και 175 mg /m

2 πακλιταξέλη D1 (T1PF) ή PF και ντοσεταξέλη: 75 mg /m

2 σισπλατίνη D1, 75 mg /m

2 docetaxel D1, και 750 mg /m

2 5-FU ως μία συνεχής έγχυση D1-D5 ( T2PF) χημειοθεραπεία εφόδου. κατά μέσο όρο 3 μαθήματα (εύρος 2-5) δόθηκε με διαστήματα 14-21 ημερών μεταξύ των μαθημάτων και τις δόσεις προσαρμόστηκαν για να ληφθούν υπόψη οι ατομικές ανοχή και την απάντηση. Οι ασθενείς αξιολογήθηκαν από τον Κεφαλής και Τραχήλου Διοικητικό συμβούλιο του όγκου του HEGP (που αποτελείται από το κεφάλι και το λαιμό τους ειδικούς, ακτινολόγους και παθολόγους). Μελετήσαμε τους ασθενείς σε δύο από τις τέσσερις ομάδες στην κατάταξη ECOG [18], ώστε να έχει δύο ομάδες που ήταν η πιο «κλινικά» διαφορετικά . Η απόκριση ορίστηκε τόσο από την κλινική και ακτινολογική εξέταση? πλήρη κλινική ανταπόκριση (CCR) έδειξε περισσότερο από 90% μείωση του μεγέθους του όγκου, ενώ η ομάδα μη αποκρινόμενων (NR) έδειξε λιγότερο από 50% μείωση στο μέγεθος του όγκου ή την εξέλιξη της νόσου.

Η

HES-NR και HES CCR αντιστοιχούν σε αιματοξυλίνη-ηωσίνη-Safran χρώση των αντιπροσωπευτικών μη ανταπόκρισης και πλήρη κλινική άτομα ανταπόκρισης, αντίστοιχα, και IHC-p16 και HIS-ογκογόνο HPV αντιστοιχούν σε αντιπροσωπευτικό θετική ανοσοϊστοχημεία για το αντιγόνο p16 (καφέ χρώση ) και υβριδισμός

in situ

για ογκογόνο DNA του HPV (πυρηνική χρώση μπλε στικτή), αντίστοιχα. Η γραμμή αντιπροσωπεύει 40 microns στα άνω πάνελ και 20 μικρά στα κάτω πάνελ.

Η

Ηθική

Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας (CCPPRB Παρίσι-Broussais-HEGP N ° 2002-035) και υπάκουσε γαλλική βιοϊατρική έρευνα νομοθεσίας. Ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες.

Συλλογή Δείγματος, Ιστολογίας και Ιολογίας

Για διαγνωστικούς σκοπούς, τα δείγματα όγκων ελήφθησαν κατά τη διάρκεια της ενδοσκόπησης υπό γενική αναισθησία πριν από οποιαδήποτε θεραπεία. Κάθε βιοψία του όγκου αμέσως τέθηκε σε RNAlater (Ambion) για να αποφευχθεί η υποβάθμιση του RNA. Η βιοψία κόπηκε σε 2 κομμάτια, ένα για παθολογική εξέταση και ο άλλος αμέσως καταψύχθηκε στους -80 ° C μέχρι την περαιτέρω επεξεργασία για εξαγωγή RNA. Σταθεροποιημένα με φορμαλίνη, τμήματα ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή διαφάνειες για 1) αιματοξυλίνη-ηωσίνη-Safran (HES) χρώση για την αξιολόγηση της κατάστασης του όγκου και το ποσοστό των κυττάρων του όγκου στη βιοψία, 2) ανοσοϊστοχημική χρώση για το αντιγόνο ρ16 και 3)

in situ υβριδισμό χρησιμοποιώντας

ο HPV (Human Papilloma Virus) III Οικογένεια 16 Probe (Β) κιτ για την ανίχνευση των κύριων ογκογόνους τύπους HPV DNA INFORM 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 (Roche Diagnostics, Γαλλία). Χρώση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το σημείο αναφοράς Clyde ULTRA συσκευή Ventana Roche. Χρησιμοποιήθηκαν τα πρωτόκολλα των κατασκευαστών. Η κατάσταση του HPV δεν θα μπορούσε να εξακριβωθεί για ένα CCR ατομική της ομάδας αντιμετωπίζονται PF. αναλύσεις ιστολογική διαπιστώθηκε ότι όλοι οι όγκοι ήταν καρκινώματα πλακωδών κυττάρων (Σχήμα 1 δείχνει αντιπροσωπευτικά χρώση HES βιοψιών από NR και CCR άτομα). Οι ομάδες NR και CCR παρουσίασαν παρόμοια συνολική έκταση της διαφοροποίησης του όγκου και το ποσοστό της κυτταροβρίθειας όγκου.

Το 10 γονίδιο ταξινομητής διαχωρίζει σαφώς τα μέλη της NR (μπλε σφαίρες) και CCR (κόκκινες σφαίρες) ομάδες. 82-83 τοις εκατό της μεταβλητότητας περιέχεται σε αυτές τις πρώτες τρεις διαστάσεις.

Η

Προετοιμασία και Αξιολόγησης της Ποιότητας RNA

«TriPure αντιδραστήριο απομόνωση» (Roche) χρησιμοποιήθηκε για την εξαγωγή RNA από τη βιοψία. Εν συντομία, η βιοψία (λιγότερο από 100 mg) ομογενοποιήθηκε σε 1 mL TriPure με 3 αποστειρωμένα σφαιρίδια βολφραμίου σε ένα Retsch MM20 Mixer Μύλος (3 λεπτά άλεσης σε ταχύτητα 29, 3 φορές). Μετά την προσθήκη διακόσια μί χλωροφορμίου, ο σωλήνας ανακινήθηκε έντονα σε θερμοκρασία δωματίου για τουλάχιστον 5 λεπτά και αφέθηκε να παραμείνει για άλλα 5 λεπτά πριν από τη φυγοκέντρηση (15 λεπτά, 12,500 rpm, 4 ° C). Η υδατική άνω στιβάδα, που περιείχε το RNA συλλέχθηκε. Μετά την προσθήκη 500 μL ισοπροπανόλης και επώαση στους -20 ° C για 10 λεπτά, το RNA ιζηματοποιήθηκε με φυγοκέντρηση (15 λεπτά, 12,500 rpm, 4 ° C). Το σφαιρίδιο πλύθηκε με 1 κ.εκ. 75% αιθανόλης, φυγοκεντρήθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω και ξηραίνεται σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Ολικό RNA επαναιωρήθηκαν σε 40 μι RNase-free νερό. RNA καθαρίστηκε περαιτέρω με την RNase-free DNase Set (Qiagen) και RNeasy minielute καθαρισμού (Qiagen), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα RNA ποσοτικά με τη χρήση ενός Nanodrop ND-1000 φασματοφωτόμετρο και αξιολογήθηκε η ποιότητά τους με ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιώντας ένα BioAnalyzer (Agilent).

Σήμανση και καθαρισμός Probes

Για τις μελέτες των μικροσυστοιχιών, συνολικά 23 δείγματα και μια καθολική αναφορά RNA, που περιλαμβάνουν RNA από 10 διαφορετικούς ανθρώπινους ιστούς (Clontech), χρησιμοποιήθηκαν για να συνθέσουν σημασμένο cRNA. Εν συντομία, 200-300 ng ολικού RNA εκχυλίζεται από τα βιοψίες ή από την αναφορά RNA σημάνθηκαν χρησιμοποιώντας cyanine3-CTP ή cyanine5-CTP και το «Low Input RNA Kit Fluorescent γραμμική ενίσχυση» (Agilent), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι φθορίζοντες ανιχνευτές καθαρίστηκαν (Καθαρισμός RNeasy Mini Kit, Qiagen) και η συγκέντρωση των ανιχνευτών και το επίπεδο ενσωμάτωσης των χρωστικών εντός των ανιχνευτών μετρήθηκε (Nanodrop D-1000 φασματοφωτόμετρο). Agarose ηλεκτροφόρηση των σημασμένων ανιχνευτών (1,2% γέλη αγαρόζης σε 0,5 χ ΤΒΕ) εκτελείται επί ενός πλακιδίου μικροσκοπίου μαζί με ιχνηθέτες DNA (100 bp, Biolabs) πραγματοποιήθηκε και ο φθορισμός της γέλης αξιολογήθηκε σε ένα σαρωτή Genetac IV (Perkin-Elmer ). Τόσο η ένταση του σήματος και το προφίλ των δειγμάτων έδειξε την ποιότητα της επισήμανσης.

υβριδοποίηση και η πλύση των μικροσυστοιχιών

Οι ανιχνευτές (1 μg κάθε ενός δείγματος βιοψίας και της αναφοράς , απευθείας σχέδιο) στη συνέχεια υβριδοποιήθηκαν σε ένα τηγάνι-γονιδιωματικής μικροσυστοιχιών ανθρώπινο 44K (Agilent) που περιέχει 41.000 ανιχνευτών, που αντιστοιχούν σε γονίδια που εκφράζονται ή ετικέτες αλληλουχίας, χρησιμοποιώντας το 60-μερές πρωτόκολλο επεξεργασίας ολιγο μικροσυστοιχιών Agilent (Agilent). Ο υβριδισμός διεξήχθη για 17 ώρες στους 60 ° C με περιστροφή σε ένα φούρνο υβριδοποίησης (Agilent) όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή. Οι μικροσυστοιχίες πλύθηκαν όπως περιγράφεται στο πρωτόκολλο του κατασκευαστή και στεγνώνονται αμέσως σε φυγόκεντρο speed-vac για 2 λεπτά.

Array Σάρωση και Επεξεργασία Εικόνας

Οι μικροσυστοιχίες σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σαρωτή Axon 4000B ( Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) στους 5 μm ανάλυση. PMT τάσεις αυτές προσαρμόζονται αυτόματα για να εξισορροπήσει τις κατανομές των κόκκινο και πράσινο εντάσεις και να βελτιστοποιήσει τη δυναμική της ποσοτικοποίησης της εικόνας. Το ποσοστό των κορεσμένων pixels περιορίστηκε στο 0,01%. Οι προκύπτουσες 16 εικόνες bit αναλύθηκαν και η ποσοτικοποίηση των σημάτων στις συστοιχίες έγινε χρησιμοποιώντας GenePix Pro 6.0 λογισμικό (Αχοη Instruments, Union City, CA). Κατάτμηση υπολογίστηκε με τη μέθοδο της «προσαρμοστική κύκλο» της επεξεργασίας. Φόντα δεν αφαιρείται και δεν βρέθηκε, κορεσμένα και κακά σημεία απορρίφθηκαν. Ενδο-array κανονικοποίηση (εκτός από τα σημεία ελέγχου, 2.615 ανιχνευτές) πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο της loess με μια παράμετρο 0,5 έκταση.

Στατιστική Ανάλυση

Τα γονίδια που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ CCR και NR στη μελέτη των μικροσυστοιχιών ήταν που προσδιορίζονται από μια mutivariable δοκιμασία μετάθεσης που ελέγχει το ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (ένα μετριάστηκε t-test με προσαρμογή του p-τιμές [19] χρησιμοποιώντας το λογισμικό μάνγκο επιλέχθηκαν [20]. γονίδια και σημαντικά εκφράζεται όταν η τιμή p ήταν κάτω από 0.025 διαφορετικά , η μέση μεταβολή φορές (η πτυχή της αλλαγής μεταξύ των μέσων για την εξομάλυνση των σημάτων από τα 13 πλήρη κλινική ανταποκρίθηκαν και των 10 μη ανταποκρινόμενοι) μεγαλύτερο από 1,3 σε απόλυτη τιμή και η μέση ένταση (log

2 (Cy5 * Cy3) /2) μεγαλύτερο από 7. Κάθε γονίδιο έχει τουλάχιστον μία τιμή μεταξύ των δύο μέσων όρων των log

2 (NR /ref) και log

2 (CCR /ref) μεγαλύτερο από 0,4 σε απόλυτη τιμή και τουλάχιστον μία τιμή μεταξύ των δύο τυπικών αποκλίσεων της καταγραφής

2 (NR /ref) και log

2 (CCR /ref) μικρότερη από 0,5. Επιπλέον, υπάρχει ελάχιστη ανάκαμψη μεταξύ CCR και NR (