Abstract

θερμικού σοκ συγγενούς πρωτεΐνης 70 (Hsc70) δρα ως μοριακός συνοδός για τη συντήρηση των ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών, η οποία επιτρέπει στα καρκινικά κύτταρα να επιβιώσουν υπό proteotoxic στρες. Προσπαθήσαμε να χρησιμοποιήσετε Hsc70 να προσδιοριστούν τα βασικά μόρια στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων. Εδώ, εκτελέσαμε ανάλυση φασματομετρίας μάζας με βάση πρωτεϊνωματική χρησιμοποιώντας καθαρισμό συγγενείας με αντι-Hsc70 αντισώματα? ως αποτέλεσμα, 83 διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών ταυτοποιήθηκαν υπό συνθήκες στρες. Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι υπήρξε μια μεταβολή των πρωτεϊνών με τις οποίες αλληλεπιδρά Hsc70 σε απάντηση στο στρες. Μεταξύ των πρωτεϊνών που προσδιορίζονται υπό αμφότερες τις συνθήκες ορό εξαντλημένο και 5-φθοριοουρακίλη επεξεργασμένο, Rab1A ταυτοποιήθηκε ως ουσιαστικό μόριο για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων. Hsc70 αλληλεπίδρασε με Rab1A σε μια συνοδό-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, Hsc70 knockdown μείωσε το επίπεδο της Rab1A και αύξησε το επίπεδο της ουμπικουιτίνωση του κάτω από συνθήκες στρες, γεγονός που υποδηλώνει ότι Hsc70 εμπόδισε την αποικοδόμηση Rab1A μετουσιώθηκε με έκθεση στο στρες. Βρήκαμε επίσης ότι Rab1A νοκ ντάουν κυτταρικό θάνατο που επάγεται από την αναστολή του σχηματισμού autophagosome. Rab1A μπορεί επομένως να συμβάλει στην υπέρβαση proteotoxic προσβολές, η οποία επιτρέπει στα καρκινικά κύτταρα να επιβιώσουν κάτω από συνθήκες στρες. Ανάλυση της Hsc70 αλληλεπιδρούν παρέχονται διορατικότητα αλλαγές ενδοκυτταρικής κατάστασης. Αναμένουμε περαιτέρω μελέτη της interactome Hsc70 να παρέχει μια πιο ολοκληρωμένη κατανόηση των καρκινικών κυττάρων φυσιολογία

Παράθεση:. Tanaka Μ, Δ S, Harada Α, Ohkawa Υ, Ιναγάκι Α, Sano S, et al. (2014) Hsc70 Συμβάλλει στην Cancer Cell επιβίωση με την πρόληψη Rab1A Υποβάθμιση κάτω από ακραίες συνθήκες. PLoS ONE 9 (5): e96785. doi: 10.1371 /journal.pone.0096785

Επιμέλεια: Ram Nagaraj, Πανεπιστημίου Case Western Reserve, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8 Οκτωβρίου του 2013? Αποδεκτές: 11 Απρ 2014? Δημοσιεύθηκε: May 6, 2014

Copyright: © 2014 Tanaka et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε, εν όλω ή εν μέρει, από JSPs KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) Αριθμοί Επιχορήγηση 24.650.637 (Masayuki Σιότα) και 23650617 (Hiroshi Ιννβο), και Grant-in ενισχύσεις για JSPs Μέλη (24-2543 για Masako Tanaka). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο θερμικού σοκ πρωτεΐνη 70 οικογένεια (Hsp70s) είναι μια καλά γνωστή ομάδα μοριακών συνοδών που υποστηρίζουν την πρωτεϊνική σύνθεση

in vivo

, βοηθούν στην αναδίπλωση της εν τω γεννάσθαι πολυπεπτίδια, και την πρόληψη του σχηματισμού συσσωματώματα με την παύση μη ειδικές αλληλεπιδράσεις [1], [2]. Με την παρουσία του misfolded και μετουσιωμένες πρωτεΐνες, Hsp70s διευκολύνουν επίσης αναδίπλωση τους ή, στην περίπτωση των ανεπανόρθωτα εξασθενημένη πρωτεϊνών, η απομάκρυνσή τους από τον μηχανισμό αποικοδόμησης των πρωτεϊνών του κυττάρου [3] – [5]. Οι Hsp70s εκφράζεται σε υψηλό επίπεδο σε καρκινικά κύτταρα και παίζουν ένα ρόλο στη διατήρηση της ομοιόστασης πρωτεΐνης, η οποία προωθεί την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση [6], [7]. Hsp70s είναι επίσης γνωστό ότι εμπλέκεται στην ανάπτυξη του όγκου, συμπεριλαμβανομένης της μετάστασης, εισβολή, και αντοχή φαρμάκου [8] – [11]? ως τέτοιες, διάφορους αναστολείς στόχευσης Hsp70s έχουν αναπτυχθεί ως αντι-καρκινικοί παράγοντες [12] – [15]

Hsc70 είναι ένα συστατικώς εκφράζεται μοριακός συνοδός που ανήκει στην οικογένεια Hsp70.. Έχει κάποιες δομικές και λειτουργικές ομοιότητες με την Hsp72. Ωστόσο, Hsc70, η οποία δεν προκαλείται από θερμικό σοκ ή άλλες καταπονήσεις, διατηρεί την ομοιοστασία πρωτεΐνη τόσο σε κανονικές όσο και το άγχος συνθήκες, ενώ το στρες επαγόμενο Hsp72 είναι σημαντικό για να επιτρέπει στα κύτταρα να αντιμετωπίσουν οξύ στρες. Hsc70 έχει αναφερθεί ότι εμπλέκεται σε ένα πλήθος housekeeping συνοδείας λειτουργιών, συμπεριλαμβανομένης της αναδίπλωσης του εν τω γεννάσθαι πολυπεπτίδια, πρωτεΐνη μετατόπιση κατά μήκος των μεμβρανών, συνοδού μεσολάβηση αυτοφαγία, την πρόληψη της συσσώρευσης των πρωτεϊνών κάτω από συνθήκες στρες, και η αποσυναρμολόγηση του κλαθρίνη επικαλυμμένα κυστίδια [16 ]. Ως εκ τούτου, τα ποντίκια knockout Hsc70 δεν μπορεί να δημιουργηθεί λόγω της ουσιαστικό ρόλο αυτής της πρωτεΐνης στην κυτταρική επιβίωση [17].

Τα καρκινικά κύτταρα υφίστανται πολλαπλές μικροπεριβάλλον πιέσεις, όπως υποξία, θρεπτικών στέρηση, και η έκθεση σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [18 ] – [21]. Επιπλέον, κακοήθη κύτταρα υποφέρουν από εσωτερικές τάσεις, όπως η συσσώρευση των μεταλλαγμένων και λανθασμένα αναδιπλωμένες πρωτεΐνες και την ακατάλληλη δραστικότητα του απελευθερωμένης οδών σηματοδότησης, οι οποίες απειλούν επίσης την επιβίωσή τους [22]. Ως εκ τούτου, τα καρκινικά κύτταρα πρέπει να ξεπεραστούν proteotoxic στρες που προκύπτει από την ενδοκυτταρική συσσώρευση misfolded πρωτεϊνών. Παρόμοια με Hsp72, η έκφραση του Hsc70 είναι υψηλότερη σε ορισμένες καρκινικές κυτταρικές γραμμές από ότι στα φυσιολογικά αυτές [23]. Αν και Hsc70 υπερεκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα, λίγα είναι γνωστά σχετικά με το πώς Hsc70 συμβάλλει στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων σε σύγκριση με το Hsp72. Υπό κανονικές συνθήκες ανάπτυξης, κυτταροπλασματική Hsc70 μπορεί να κινηθεί μέσα και έξω από τον πυρήνα. Ωστόσο, είναι συγκεντρωμένη στον πυρήνα όταν τα κύτταρα εκτίθενται σε καταπονήσεις όπως θερμικό σοκ. Αυτή η πυρηνική Hsc70 στη συνέχεια μετακομίζει στο κυτταρόπλασμα κατά τη διάρκεια της αποκατάστασης [24], [25]. Heat δείχθηκε επίσης ότι επάγει την ταχεία Hsc70 πρόσδεση σε αδιάλυτες κυτταροπλασματικά δομές που είναι διακριτές από τον κυτταρικό σκελετό και μεμβράνη εσωτερικής κυττάρου [26]. Ως εκ τούτου, hsc70 ενεργεί γρήγορα σε απόκριση στο στρες, αλλά εκφράζεται συστατικά. Υπάρχει επίσης μια αλλαγή στις πρωτεΐνες με τις οποίες αλληλεπιδρά Hsc70 κατά την έκθεση στο στρες. Υπό proteotoxic συνθήκες, η λειτουργία του Hsc70 βοηθώντας συμμεταφραστική αναδίπλωση διακόπτεται και αυτό το μόριο αντί διευκολύνει την επισκευή του misfolded πρωτεϊνών [27]. Ως εκ τούτου, οι πρωτεΐνες πελάτη Hsc70 είναι σημαντική για την κυτταρική ομοιόσταση και είναι απαραίτητα μόρια στις απαντήσεις του στρες. Από Hsc70 απαιτείται για την αναδίπλωση των πρωτεϊνών πελάτη, πρωτεΐνες πελάτης του κάτω από συνθήκες στρες είναι δυνητικά κλειδί μόρια για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων.

Σε αυτή τη μελέτη, εκτελέσαμε φασματομετρία μάζας με βάση πρωτεομική ανάλυση χρησιμοποιώντας καθαρισμό συγγενείας με αντι-Hsc70 αντισωμάτων για Hsc70 interactome χαρακτηριστικών της κυτταρικής γραμμής ανθρώπινου καρκίνου κόλου ΗΤ29. Με τη σύγκριση των προφίλ των πρωτεϊνών του πελάτη Hsc70 μεταξύ της κανονικής και το άγχος συνθήκες, εντοπίσαμε τα μόρια που είναι δυνητικά κρίσιμες για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

πρωτογενή αντισώματα και Χημικών

τα αντισώματα εναντίον Rab1A, ουβικιτίνης, Hsp72, και ρ62 αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Αντισώματα έναντι όλων των μορφών πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης-1 (ΡΑΚΡ-1) και διασπασμένης μορφές της κασπάσης-3 αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Αντισώματα έναντι αντίσωμα β-ακτίνης και LC3B αγοράστηκαν από τη Sigma (St. Louis, ΜΟ). αντίσωμα αντι-Rab1B αγοράστηκε από Abgen (San Diego, CA). Συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα αγοράστηκαν από GE Healthcare Bio-Science (Μικρή Chalfont, Bucks, UK). Δύο διαφορετικά αντισώματα αντι-Hsc70 χρησιμοποιηθεί σε καθαρισμό συγγένειας παρήχθησαν στο εργαστήριο μας [25], και αντι-Hsc70 αντίσωμα που χρησιμοποιείται στα άλλα πειράματα αγοράστηκε από Enzo (Farmingdale, ΝΥ). MG132 αγοράστηκε από την Sigma (St. Louis, ΜΟ). 5-φθοριοουρακίλη (5-FU), και Brefeldin Α (BFA) ελήφθησαν από την Wako (Osaka, Japan), αραιωμένο σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), και αποθηκεύεται στους -20 ° C.

Κυτταροκαλλιέργεια και Πειραματικές θεραπείες

Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά αδενοκαρκινώματος κόλου ΗΤ29 αγοράστηκε από DS Pharma Biomedical (Osaka, Japan) και διατηρήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α (Invitrogen) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 100 U /ml πενικιλλίνη, και 100 U /ml στρεπτομυκίνη σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2 στους 37 ° C. Τα κύτταρα περάστηκαν κάθε επτά ημέρες, όταν πλησιάζει συρροή. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3,2 μΜ (IC

50 στις 48 ώρες) 5-FU ή χωρίς FBS (εξάντληση ορού) για έξι ώρες. Για πρωτεομική φασματομετρία μάζας με βάση, 10 μΜ 5-FU χρησιμοποιήθηκε. Όλες οι θεραπείες διεξήχθησαν σε μια τελική συγκέντρωση 0,1% DMSO.

Ανοσοκηλίδωση και Ανοσοκαταβύθιση

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA, και οι πρωτεΐνες απομονώθηκαν από κυτταρικά λύματα με ανοσοκαταβύθιση όπως περιγράφεται προηγουμένως [28] . Για ανοσοστύπωση, οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε SDS-πολυακρυλαμιδίου πηκτές κάτω από αναγωγικές συνθήκες, ακολουθούμενη από ηλεκτροφορητική μεταφορά σε μεμβράνες PVDF, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με ΣΕΝ-4000 σύστημα αναλυτή Lumino-εικόνα (GE Healthcare Bio-Science) χρησιμοποιώντας την ενισχυμένη τεχνική χημειοφωταύγειας (Immobilon Δυτική HRP υποστρώματος? Millipore).

Απομόνωση και Πρωτεϊνωματική Ανάλυση Hsc70 πελάτη Πρωτεΐνες

για την ανάλυση φασματομετρίας μάζας, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν με 1% παραφορμαλδεΰδη σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά, ακολουθούμενη από απόσβεση με 125 mM γλυκίνη. Σταθερή κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA που αποτελείται από 10 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton Χ-100, 10% γλυκερόλη, 100 mM NaF, 1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο, 0,2 mM DTT, και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης. Τα κυτταρικά λύματα (1 mg πρωτεΐνης) προκαθορίσθηκε με αδρανοποιημένο σφαιρίδια NHS-Sepharose (GE Healthcare Bio-Science) για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και ανοσοκαταβυθίστηκαν με δύο είδη αντισώματος in-house ειδικό για HSC70 ακινητοποιημένο επί NHS-ενεργοποιημένης Sepharose σε δωμάτιο θερμοκρασία για δύο ώρες. Τα ανοσοϊζήματα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό RIPA και υποβλήθηκαν σε αφαλάτωση και συμπύκνωση με SDS-PAGE σε ένα πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου διαβάθμισης 5-20% (Wako), ακολουθούμενη από χρώση με Quick-CBB (Wako). Η γέλη αποκόπηκε σε φέτες πάχους περίπου 1 mm ανά λωρίδα. Τα τεμάχια πηκτώματος αποχρωματίζονται σε 25 mM ΝΗ

4HCO

3 και 50% ακετονιτρίλιο, που ακολουθείται από επιπλέον αποχρωματισμού σε 25 mM ΝΗ

4HCO

3, 30% ακετονιτρίλιο, και μείωση σε 25 mM ΝΗ

4HCO

3 που περιέχει 10 mM DTT στους 56 ° C για μία ώρα. Τα μειωμένα κατάλοιπα κυστεΐνης είχαν στη συνέχεια αλκυλιώνεται σε 55 mM ιωδοακεταμιδίου εντός 25 mM ΝΗ

4HCO

3 και τα τεμάχια του πηκτώματος κατόπιν πλύθηκαν σε ακετονιτρίλιο και ξηραίνεται. Τα ξηρά τεμάχια πηκτής υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μg /ml θρυψίνη (θρυψίνη Gold? Promega, Madison, WI) σε 50 mM ΝΗ

4HCO

3 σε πάγο για 30 λεπτά, η περίσσεια αφαιρείται, και πλήρη πέψη αφέθηκε να συμβεί σε 37 ° C για 18 ώρες σε 50 mM ΝΗ

4HCO

3. Τα δείγματα αφαλατώθηκαν χρησιμοποιώντας Ταχυδρομικός Tip C18 (Millipore) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τριφθοροοξικό οξύ προστέθηκε στη συνέχεια σε τελική συγκέντρωση 0,1% και χρησιμοποιείται για χρωματογραφία ηλεκτροψεκασμού ιονισμού-διαδοχική φασματομετρία μάζας νανο-υγρού ανάλυση (LC-ESI-MS /MS).

νανοηλεκτροψεκασμού LC-MS /MS Ανάλυση και πρωτεΐνη Αναγνώριση

LC-MS /MS αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε ένα σύστημα νανο LC Ντίνα-AI (ΚΥΑ Τεχνολογίας, Τόκιο, Ιαπωνία) σε συνδυασμό με ένα φασματόμετρο μάζας υβριδικό QSTAR Elite (ΑΒ Sciex, Concord, Οντάριο, Καναδάς) μέσω μιας πηγής νανοψεκασμού ιόντων (ΑΒ Sciex). Οι λεπτομέρειες αυτής της ανάλυσης που περιγράφεται αλλού [30]. Η απόκτηση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση QS Αναλυτής Λογισμικού 2.0 (ΑΒ Sciex) στον τρόπο θετικού ιόντος. Και τα δύο σύνολα δεδομένων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ProteinPilot χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο αναζήτησης της Paragon ™ (ΑΒ Sciex). δεδομένων MS /MS χρησιμοποιήθηκαν ως ερώτημα αναζήτησης στη βάση δεδομένων NCBI (αφήστε REFSEQ 55, Σεπτεμβρίου 2012, ftp://ftp.hgc.jp/pub/mirror/ncbi/refseq/) χρησιμοποιώντας ένα

Homo sapiens

φίλτρο ταξινόμηση. Το ελάχιστο όριο για την αναγνώριση πρωτεΐνη ορίστηκε στο σκορ πρωτεΐνη 0,47, που αντιστοιχεί σε ένα επίπεδο εμπιστοσύνης μεγαλύτερο από 66% και ένα ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη του 1%.

iTRAQ Σήμανση και ποσοτικοποίηση της έκφρασης της πρωτεΐνης

Οι πρωτεΐνες από τον έλεγχο ή κύτταρα Rab1A-σιωπήσουν εξήχθησαν όπως περιγράφεται για ανοσοαποτύπωση. Τα κυτταρολύματα συμπυκνώθηκαν και το ρυθμιστικό διάλυμα διάλυσης (100 mM τριαιθυλο-αμμώνιο διττανθρακικό, ρΗ 8,0) αντικαταστάθηκε με Microcon φυγοκεντρικό φίλτρα με ονομαστικό μοριακό βάρος μεμβράνη όριο υπερδιήθησης 3 K, που ακολουθείται από πέψη και την επισήμανση με 4-plex αντιδραστήρια iTRAQ σύμφωνα με τυποποιημένες διαδικασίες [31]. Τα δείγματα επισημαίνονται ως εξής: 114, έλεγχος knockdown? και 115, Rab1A νοκ ντάουν. Κάθε δείγμα περιείχε 100 μα πρωτεΐνης. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μετρήθηκαν με προσδιορισμό πρωτεΐνης BCA.

παρεμβολή RNA

Όλα τα siRNA κατά της ανθρώπινης

Hsc70

(

HSPA8

),

Rab1A

και

Ran

, και τον αριθμό σιγαστήρας αρνητικού ελέγχου 1 siRNA (έλεγχος) ελήφθησαν από την Invitrogen. Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε για να αντιστρέψει-επιμόλυνση siRNAs στα κύτταρα (τελική συγκέντρωση, 30 ηΜ ή 10 ηΜ), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

MTS Δοκιμασίες

siRNA επιμολυσμένα κύτταρα ήταν σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

4 ή 1 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο. Μετά από 48 ώρες επιμόλυνσης, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με ορό μέσο απεμπλουτισμένο ή με 5-FU (3,2 μΜ) για 24 ώρες. Η βιωσιμότητα προσδιορίστηκε από την αντίδραση με το κινητό Μετρώντας Kit-8 (Dojindo, Κουμαμότο, Ιαπωνία). Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm με Microplate Reader.

Προσδιορισμός απόπτωσης

siRNA επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε πυκνότητα 5 χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο . Μετά από 48 ώρες επιμόλυνσης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε εξάντληση ορό ή θεραπεία 5-FU για 24 ώρες. Τα αποπτωτικά κύτταρα ταυτοποιήθηκαν με πυρηνική χρώση με Hoechst 33258 μετά από στερέωση με 0,5% γλουταραλδεΰδη για πέντε λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν με Fluorescence Τοποθέτηση Medium (Dako, Glostrup, Δανία). Βιτρώ κύτταρα έγιναν ορατά με μικροσκόπιο φθορισμού. (Biozero? Keyence, Osaka, Japan) με ένα στεγνό στόχος 20 ×

Παρασκευή RNA και σε πραγματικό χρόνο ανάλυση της αλυσίδας ανάστροφης μεταγραφάσης-αντίδρασης πολυμεράσης

Σύνολο RNA απομονώθηκε από Hsc70- ή Rab1A-knockdown, ή κύτταρα ελέγχου knockdown χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ISOGEN (Nippon Gene, Tokyo, Japan). Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε με τη χρήση, στη συνέχεια, 1 μg RNA και ένα ReverTra Ace qPCR RT Master Mix με gDNA Remover (ΤΟΥΟΒΟ, Osaka, Japan). Real-time PCR ανάλυση διεξήχθη με τη χρήση ενός 7500 Fast PCR Πραγματικού χρόνου System (Applied Biosystems, Foster City, CA) με το κιτ LightCycler-FastStart DNA κύριο SYBR Green Ι (Roche, Penzberg, Γερμανία). Το επίπεδο RNA ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το

GAPDH

. Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη συγκριτική C

T χρήση 7500 λογισμικού ver. 2.0.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA).

IncuCyte Cell Growth Δοκιμασία Μέτρηση

Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA, συνολικού ύψους 5 × 10

4 ΗΤ29 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων. Τα μη επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μg /ml BFA ή DMSO κατά την έναρξη της μέτρησης. Η πλάκα επωάστηκε σε ένα σύστημα IncuCyte κινητική απεικόνισης (Essen BioScience, Ann Arbor, ΜΙ) μέσα σε ένα επωαστήρα κυτταρικής καλλιέργειας. Εικόνες συνελήφθησαν σε τέσσερις τομείς ανά καθώς κάθε τρεις ώρες για να παρακολουθήσει τον πολλαπλασιασμό.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± Τ.Α. Οι συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων έγιναν με μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε

σ

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Hsc70 είναι κρίσιμης σημασίας για Cancer Cell Επιβίωση

Για να διερευνηθεί η συμβολή των Hsc70 να κυτταρικής επιβίωσης ΗΤ29, εκτελέσαμε την δοκιμασία MTS στα κύτταρα knockdown Hsc70 (Εικ. 1Α). Σε σύγκριση με τον μάρτυρα, Hsc70 knockdown μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων, η οποία ήταν ανεξάρτητη από την ένταση στρες. Παρά το γεγονός ότι τα κύτταρα ΗΤ29 ήταν ιδιαίτερα ανθεκτικά σε ορό πείνα, Hsc70 νοκ ντάουν αύξησε την ευαισθησία του ορού πείνα και οδήγησε στο θάνατο των κυττάρων (Εικ. 1Β και σχ. S1). Παρά την επακόλουθη επαγωγή της hsp72 ως προσαρμοστική αντίδραση στο στρες (Εικ. 1Γ), Hsp72 δεν εμπόδισε τον θάνατο των κυττάρων που προκαλείται από Hsc70 νοκ ντάουν. Ως εκ τούτου, Hsc70 είναι κρίσιμη για την επιβίωση των κυττάρων και Hsp72 δεν θα μπορούσε εντελώς αντισταθμίσει την απώλεια του.

(Α) Νοκ ντάουν της Hsc70 μειωμένη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων. κύτταρα ΗΤ29 επιμολύνονται με siRNA για

Hsc70

ή τον έλεγχο αγωνίζομαι. Στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση του siRNA, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ορό ασιτίας ή υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5-FU στην ένδειξη συγκέντρωσης για 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία MTS. Τα σημεία των δεδομένων αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± S.D. (N = 5). (Β) Επίδραση των Hsc70 νοκ ντάουν στην κυτταρική μορφολογία. Hsc70 ή κύτταρα ελέγχου νοκ ντάουν υποβλήθηκαν σε θεραπεία η ίδια όπως στο

A

. εικόνες αντίθεσης φάσης των κυττάρων υπό συνθήκες άνευ ορού τρέφονται ή χωρίς ορό 24 ώρες μετά τις θεραπείες. μπαρ κλίμακα, 200 μm. (C) Hsc70 νοκ ντάουν που προκαλείται από αντισταθμιστικά έκφραση της Hsp72. Στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση του siRNA, Hsc70 knockdown ή ελέγχου κύτταρα υποβλήθηκαν σε εξάντληση ορού για 6, 12, ή 24 ώρες. Μετά την λύση των κυττάρων, Hsc70 και Hsp72 ανιχνεύθηκαν με ανοσοκηλίδωση. SD, η εξάντληση του ορού.

Η

Αναλύσεις Hsc70 Ιντεράκτορες κατονομάζεται στις ορού εξαντληθεί και 5-FU θεραπεία ΗΤ29 κύτταρα

Σαν μια ποικιλία τάσεων επάγει την ενδοκυτταρική συσσώρευση misfolded και μετουσιώνεται πρωτεΐνες, Hsc70 συνδέεται με και αναδιπλώνεται αυτών κατεστραμμένο πρωτεΐνες. Αυτή η λειτουργία του Hsc70 επιτρέπει στα κύτταρα να επιβιώσουν κάτω από proteotoxic καταπονήσεις. Έτσι, προσπαθήσαμε να αναλύσουμε αλληλεπιδρούν Hsc70 υπό συνθήκες στρες, προκειμένου να προσδιοριστούν τα βασικά μόρια για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων. Ένα διάγραμμα ροής της αναγνώρισης του Hsc70 αλληλεπιδρούν φαίνεται στο Σχ. 2Α. ΗΤ29 κύτταρα εκτέθηκαν σε εξάντληση ορού ή 5-FU, και επίσης αντιμετωπίζονται με DMSO ως έλεγχος οχήματος για 6 ώρες. Ο χαρακτηρισμός του Hsc70 αλληλεπιδρούν σε καρκινικά κύτταρα πραγματοποιήθηκε με απομόνωση χρησιμοποιώντας σφαιρίδια συγγένειας Hsc70, που ακολουθείται από φασματομετρία μάζας με βάση ταυτοποίησης. Ένα σύνολο από 124 μοναδικές πρωτεΐνες εντοπίστηκαν σε & gt? Εμπιστοσύνης 95% (Εικ. 2Β και τον πίνακα S1). Από αυτούς, 41 πρωτεΐνες μοναδική για τον έλεγχο του οχήματος ενεπλάκησαν σε κανονική ομοιοστατική διαδικασίες. Gene Ontology (GO) ανάλυση έδειξε ότι αυτές οι πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην μιτοχονδριακή παραγωγή ενέργειας, τον κυτταρικό σκελετό, και την πρωτεϊνική σύνθεση. Μεταξύ των υπολοίπων πρωτεϊνών, 30 πρωτεΐνες μοναδικές σε εξάντληση του ορού ήταν ιδιαίτερα εμπλέκονται στην μεταφορά πρωτεϊνών, την πρωτεϊνική σύνθεση, και του κυτταρικού κύκλου, ενώ 29 πρωτεΐνες μοναδική για θεραπεία 5-FU ήταν συνήθως σχετίζονται με το μεταβολισμό της γλυκόζης. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι υπήρξε μια μεταβολή των πρωτεϊνών με τις οποίες αλληλεπιδρά Hsc70 σε απόκριση προς διάφορους τύπους στρες. Ως εκ τούτου, η interactome Hsc70 αντικατοπτρίζει ερέθισμα μεταβολές που εξαρτώνται από τις αποκρίσεις σε στρες και θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την παρακολούθηση των φυσιολογικών αλλαγών των κυττάρων. Η ανάλυσή μας εντόπισε επίσης έναν περιορισμένο αριθμό πρωτεϊνών που είναι κοινά και στις δύο συνθήκες στρες, οι οποίες συμμετείχαν στα μιτοχόνδρια, κυτταροσκελετού, και πρωτεΐνη μεταφοράς. Από αυτά, εστιάσαμε στην Rab1A στην υπεροικογένεια Ras, που εκφράζεται σε υψηλό επίπεδο σε καρκινικά κύτταρα. Αυτό το μόριο ρυθμίζει βασικές κυτταρικές διαδικασίες όπως μεταγωγής σήματος, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και κυστιδίων μεταφοράς (Εικ. 2Β και Πίνακας S2).

(Α) Μια σχηματική άποψη της αναγνώρισης της Hsc70 αλληλεπιδρούν. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε εξάντληση ορού (SD), 5-FU, ή DMSO για 6 ώρες. Hsc70 αλληλεπιδρούν απομονώθηκαν με αντι-hsc70 από το κυτταρικό εκχύλισμα, και ταυτοποιήθηκαν μέσω επακόλουθη ανάλυση με υγρή χρωματογραφία-διαδοχική φασματομετρία μάζας (LC-MS /MS). (Β) Προσδιορισμός και λειτουργική ταξινόμηση των Hsc70 αλληλεπιδρούν που σχετίζονται με τις αλλαγές στην αντίδραση στο στρες. Ένα διάγραμμα Venn απεικονίζουν Hsc70 αλληλεπιδρούν που εντοπίστηκαν σε & gt? 95% βαθμολογία εμπιστοσύνης (1.3 ProtScore) χρησιμοποιώντας το λογισμικό ProteinPilot 2.0. γραφήματα στήλη αναφέρει τον αριθμό και τη λειτουργικότητα των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών.

Η

Rab1A νοκ ντάουν Επιδεινώνεται στρες Ζημιές από ορού εξάντληση και 5-FU θεραπεία

Για να επεκτείνει πρωτεομική μας ευρήματα, αξιολογήσαμε την επόμενη της συμβολής της Rab1A για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων. Σε σύγκριση με την επιμόλυνση του ελέγχου, Hsc70 νοκ ντάουν μειωμένο μέγεθος αποικία, χωρίς καμία μεταβολή της κυτταρικής μορφολογίας (Εικ. 3Α). Ωστόσο, Rab1A knockdown προκαλείται εξασθένηση της προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου και σημαντικά μείωσε τον αριθμό των κυττάρων, η οποία ενισχύεται από εξάντληση ορού. Για την ποσοτικοποίηση των επιδράσεων των Rab1A knockdown, εκτελέσαμε την δοκιμασία MTS (Σχ. 3Β). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 1 × 10

5 ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων, προκειμένου να εξαλειφθεί η επίδραση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Τόσο εξάντληση ορού και θεραπεία 5-FU είχε μικρή επίδραση στην βιωσιμότητα των κυττάρων ελέγχου, υποδεικνύοντας ότι αυτές οι θεραπείες αποτελούσαν μόνο ήπιου στρες για τα κύτταρα. Σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, Hsc70 νοκ ντάουν μειώθηκε σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων (

σ

& lt? 0.01), παρά την ήπια έκθεση στο στρες. Αυτό δείχνει ότι Hsc70 knockdown κυτταρικό θάνατο που επάγεται υπό συνθήκες στρες, όπως υποδεικνύεται επίσης στο Σχ. 1Α και Β Ωστόσο, Rab1A knockdown μειώθηκαν σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων (

ρ

& lt? 0,05) χωρίς έκθεση στο στρες, υποδεικνύοντας περαιτέρω ότι Rab1A knockdown μόνος κυτταρικό θάνατο που επάγεται υπό κανονικές συνθήκες. Επιπλέον, παρά την ήπια φύση αυτών των τάσεων, η εξάντληση του ορού και θεραπεία 5-FU μειώθηκε περαιτέρω τη βιωσιμότητα των Rab1A νοκ ντάουν κυττάρων. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Rab1A συμβάλλει στην κυτταρική επιβίωση και είναι πολύ σημαντικό υπό συνθήκες στρες που είναι πέρα ​​από την ικανότητα των Hsc70 να εξασφαλίσει την επιβίωση των κυττάρων.

ΗΤ29 κύτταρα επιμολυσμένα με

Hsc70

,

Rab1A

, ή

έλεγχος

siRNA υποβλήθηκαν σε εξάντληση του ορού, 5-FU, ή θεραπεία οχήματος για 24 ώρες. (Α) Επίδραση της καταστολής της Hsc70 και αλληλεπιδρούν της στην κυτταρική μορφολογία. εικόνες Εκπρόσωπος αντίθεσης φάσης των κυττάρων. μπαρ κλίμακα, 100 μm. (Β) Rab1A knockdown μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία MTS. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν στατιστική σημαντικότητα. **

σ

& lt? 0,01, *,

σ

& lt? 0,05 έναντι του οχήματος?

†,

σ

& lt? 0,05 ενάντια στον έλεγχο νοκ ντάουν με αμφίδρομη ANOVA που ακολουθείται από Tukey-Kramer post hoc test? τιμές είναι οι μέσες ± S.D. (

n

= 7). Veh, όχημα. SD, η εξάντληση του ορού. FU, 5-φθοριοουρακίλη.

Η

Hsc70 προληφθεί Rab1A Υποβάθμιση

Για να διερευνήσει τις επιπτώσεις της Hsc70 για Rab1A υπό συνθήκες στρες, εστιάσαμε στην αλληλεπίδραση αυτών των δύο μορίων. Επαληθεύσαμε τη φυσική αλληλεπίδραση του ενδογενούς Hsc70 και Rab1A με δοκιμασίες συν-ανοσοκατακρήμνιση με αντισώματα του εμπορίου (Σχ. 4Α). Αυτό επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα της ανάλυσης φασματομετρίας μάζας που Hsc70 αλληλεπιδράσει με Rab1A υπό συνθήκες χωρίς ορό εξαντληθεί. Επιβεβαιώσαμε επίσης ότι Hsc70 αλληλεπιδρούν με Rab1A σε μια συνοδός-εξαρτώμενο τρόπο, επειδή Hsc70 και Rab1A είχαν διαχωριστεί το ένα από το άλλο από την ATP. Βρήκαμε επίσης ότι Hsc70 σχηματίζονται ομοδιμερή, αλλά Rab1A δεν το έκανε. Δευτερεύουσα έκλουση σε ρυθμιστικό δείγματος SDS για τις υπόλοιπες πρωτεΐνες που συνδέονται σε σφαιρίδια αγαρόζης διεξήχθη για την ανίχνευση των πρωτεϊνών δόλωμα, επειδή το ΑΤΡ δεν αλληλεπιδρά με την αλληλεπίδραση αντιγόνου-αντισώματος. Στη συνέχεια, θα αξιολογηθεί το επίπεδο Rab1A όταν Hsc70 κατεστάλη? έδειξε μια μείωση κάτω από συνθήκες στρες, παρά μια αντισταθμιστική αύξηση του επιπέδου Hsp72 (Εικ. 4Β). Ωστόσο, Hsc70 knockdown δεν είχε καμία επίδραση στο επίπεδο Rab1A κάτω από τις συνθήκες ελέγχου. Αυτή η ρύθμιση προς τα κάτω του Rab1A υπό συνθήκες στρες παρατηρήθηκε στο επίπεδο πρωτεΐνης, αλλά όχι στο επίπεδο mRNA (σχ. 4C). Ως εκ τούτου, hsc70 φάνηκε να μην ρυθμίζουν τη σύνθεση Rab1A, τουλάχιστον. Έχουμε επόμενη διαπίστωσε ότι η καταστολή Hsc70 αύξησε το επίπεδο των ουβικουιτινωμένης Rab1A υπό συνθήκες χωρίς ορό εξαντλημένο (Εικ. 4D). Επιπλέον, η υποβάθμιση Rab1A που προκλήθηκε με Hsc70 knockdown υπό συνθήκες στρες ανεστάλη από το MG132 πρωτεοσωμικού αναστολέα (Σχ. 4Ε). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Hsc70 εμποδίζει την υποβάθμιση της Rab1A που έχει misfolded κάτω από συνθήκες στρες.

(Α) αλληλεπίδραση Hsc70-Rab1A μέσω της συνοδευτικής δράσεως. ΗΤ29 κύτταρα υποβλήθηκαν σε εξάντληση του ορού για 24 ώρες, και στη συνέχεια υποβάλλονται σε λύση. Για να επαληθευτεί η αλληλεπίδραση μεταξύ Hsc70 και Rab1A σε μια συνοδό-εξαρτώμενο τρόπο, αντι-Hsc70 ή αντι-Rab1A ανοσοκαταβυθιστικό εκλούστηκε με ΑΤΡ, που ακολουθείται από έκλουση με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS και ανοσοκηλίδωση, προκειμένου να επιβεβαιώσει τις πρωτεΐνες δόλωμα. (Β) Hsc70 νοκ ντάουν μείωσε το επίπεδο της Rab1A πρωτεΐνη κάτω από συνθήκες στρες. ΗΤ29 κύτταρα επιμολυσμένα με

Hsc70

ή

έλεγχος

siRNA υποβλήθηκαν σε εξάντληση του ορού, 5-FU, ή θεραπεία οχήματος για 24 ώρες. Ανοσοαποτύπωση για ενδογενή Rab1A και πρωτεΐνες Hsc70. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (C) Hsc70 νοκ ντάουν δεν μειώνεται

Rab1A

επίπεδο του mRNA. Μετά knockdown του Hsc70 και στον έλεγχο,

Rab1A

mRNA επίπεδα προσδιορίστηκαν με qPCR στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. (D) Hsc70 νοκ ντάουν προώθησε την ουβικιτινίωση Rab1A. Μετά Hsc70 knockdown ή ελέγχου κύτταρα λύθηκαν, ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) με αντι-Rab1A ή αντι-ουβικιτίνης αντισωμάτων πραγματοποιήθηκε, ακολουθούμενη από ανοσοστύπωμα με αντι-ουβικιτίνης ή αντι-Rab1A αντισώματα. (Ε) MG132 θεραπεία ανέστειλε την υποβάθμιση Rab1A. κύτταρα knockdown Hsc70 υποβλήθηκαν σε εξάντληση ορό ή θεραπεία 5-FU, και στη συνέχεια, MG132 (10 μΜ) ή όχημα προστέθηκαν για την τελευταία 8 ώρες πριν από τη δειγματοληψία. SD, η εξάντληση του ορού. FU, 5-φθοριοουρακίλη. Ub, ουβικιτίνης, IgG LC, ελαφριά αλυσίδα ανοσοσφαιρίνης. Δεδομένων (εκτός C) είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον δύο ξεχωριστά πειράματα παράγουν παρόμοια αποτελέσματα.

Η

Rab1A νοκ ντάουν-κυτταρικό θάνατο που επάγεται δεν είναι από απόπτωση

Για να διερευνηθεί αν η απουσία Rab1A επάγει την απόπτωση, εξετάσαμε την παρουσία αποπτωτικών κυττάρων με πυρηνική χρώση με Hoechst 33258. Ραν, μέλος της Ras υπεροικογένειας, αλληλεπιδρούσαν με Hsc70 κάτω από όλες τις συνθήκες, σύμφωνα με πρωτεομική μας ανάλυση (Πίνακας S2). Ran knockdown διεξήχθη ως θετικός έλεγχος για απόπτωση. Ran νοκ ντάουν κύτταρα παρουσίασαν αποπτωτικών πυρηνική κατακερματισμό ανεξάρτητα από την εξάντληση του ορού, ενώ τα κύτταρα νοκ ντάουν Rab1A παρουσίασαν μόνο ελαφρά απόπτωση όταν εκτίθεται σε εξάντληση του ορού (Εικ. 5Α). Μετά την καταμέτρηση των Hoechst-χρωματισμένων κυττάρων και εκείνοι με την πυρηνική κατάτμηση, Rab1A knockdown βρέθηκε να μειώνει τον αριθμό των κυττάρων στον ίδιο βαθμό όπως Ran knockdown (Εικ. 5Β). Ωστόσο, η απόπτωση ήταν σημαντικά επάγεται από Ran knockdown αλλά όχι από Rab1A knockdown (Εικ. 5C). Επειδή εμείς επίσης δεν ανιχνεύει τυπικό PARP-1 και της κασπάσης-3 αποπτωτικών υπογραφές κατά Rab1A νοκ ντάουν (Εικ. 5D), κυτταρικό θάνατο επιδεινώνεται από Rab1A νοκ ντάουν φάνηκε να μην είναι υπεύθυνος για την απόπτωση. Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Rab1A νοκ ντάουν που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο δεν είναι από την απόπτωση.

ΗΤ29 κύτταρα επιμολυσμένα με

Hsc70

,

Rab1A

,

Ran

, ή

έλεγχος

siRNA υποβλήθηκαν σε εξάντληση του ορού, 5-FU, ή θεραπεία οχήματος για 24 ώρες. (Α) Rab1A knockdown είχε μικρή επίδραση στην επαγωγή της απόπτωσης. Η επαγωγή της απόπτωσης αναλύθηκε με χρώση με Hoechst 33258. Λευκή αιχμές βελών υποδεικνύουν αποπτωτικών πυρήνων με συμπυκνωμένη χρωματίνη. μπαρ κλίμακα, 50 μm. (B, C) Η μείωση του αριθμού των κυττάρων με Rab1A knockdown δεν οφειλόταν σε απόπτωση. Οι αριθμοί των συνολικών κυττάρων και αποπτωτικών κυττάρων προσδιορίστηκαν ποσοτικά μετρώντας Hoechst-χρωματισμένων κυττάρων και κυττάρων με πυρηνική συμπύκνωση στο (Α), αντιστοίχως. *,

σ

& lt? 0,05, **,

σ

& lt? 0,01 έναντι του ελέγχου /VEH?

†,

σ

& lt? 0,05,

††,

σ

& lt? 0,01 έναντι του ελέγχου /SD?

##,

σ

& lt? 0,01 έναντι Rab1A /SD με αμφίδρομη ANOVA που ακολουθείται από /Dunn post hoc δοκιμασία Bonferroni? τιμές είναι οι μέσες ± S.D. (

n

= 3). καταστολή (D) Rab1A δεν επάγουν απόπτωση. Η απόπτωση προσδιορίστηκε με τις διασπάσεις του ΡΑΚΡ-1 και κασπάσης-3, που ανιχνεύεται με ανοσοστύπωμα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Veh, όχημα. SD, η εξάντληση του ορού. FU, 5-φθοριοουρακίλη. δεδομένων ανοσοαποτύπωση είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τρία ξεχωριστά πειράματα παράγουν παρόμοια αποτελέσματα.

Η

Ποσοτική Διαφορικές Πρωτεομική στο Rab1A νοκ ντάουν κύτταρα

Για να εξετάσουμε γιατί η απουσία της επαγόμενης Rab1A κυτταρικό θάνατο μη συμπεριλαμβανομένης της απόπτωσης, πραγματοποιήσαμε ποσοτική διαφορική πρωτεομική ανάλυση των Rab1A νοκ ντάουν κυττάρων βασίζεται στην τεχνική iTRAQ. Οι iTRAQ-επισημασμένων πρωτεϊνών που είχαν εξαχθεί από Rab1A knockdown κύτταρα αναλύθηκαν και συγκρίθηκαν με την πρωτεώματος των κυττάρων ελέγχου. Ως αποτέλεσμα, 25 πρωτεΐνες με μια αλλαγή της έκφρασης του ≥1.2 φορές θεωρήθηκαν ότι ρυθμίζεται προς τα πάνω, ενώ 27 πρωτεΐνες με μια αλλαγή & lt? 0,8-φορές ρυθμίστηκαν προς τα κάτω (Πίνακας S3). Για την αξιολόγηση των λειτουργικές διαφορές μεταξύ των δύο αυτών υποσυνόλων των πρωτεϊνών, εκτελέσαμε ανάλυση GO (Σχ. 6Α και Β). Οι απορυθμίζεται πρωτεΐνες ταξινομήθηκαν σε κατηγορίες μεταφοράς πρωτεϊνών, τα μιτοχόνδρια, και πρωτεασώματος, ενώ την κατάταξη σύμφωνα με τους όρους ριβοσωμάτων και μεταγραφή /μετάφραση ήταν ιδιαίτερα συχνή μεταξύ των μειωτικά πρωτεΐνες. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Rab1A νοκ ντάουν αύξησε τα επίπεδα των άλλων πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) -Golgi εμπορίας, αλλά δεν οδηγεί στην αποζημίωση της λειτουργίας Rab1A. Η δυσλειτουργία του Rab1A διευκολύνεται αποικοδόμησης των πρωτεϊνών και σταμάτησε τη σύνθεση πρωτεϊνών, υποδεικνύοντας ότι Rab1A knockdown σε κύτταρα που προκαλείται από τη συσσώρευση του misfolded πρωτεϊνών. Ως εκ τούτου, Rab1A knockdown κύτταρα μπορούν να εκτεθούν σε proteotoxic στρες, το οποίο στη συνέχεια προκαλεί κυτταρικό θάνατο.

ΗΤ29 κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA για

Rab1A

ή τον έλεγχο αγωνίζομαι. ταυτοποίηση πρωτεϊνών σε Rab1A νοκ ντάουν κυττάρων πραγματοποιήθηκε μέσω ποσοτική πρωτεομική από σταθερό επισήμανση ισότοπο, χρησιμοποιώντας iTRAQ. (Α) Προς τα πάνω ρυθμισμένη πρωτεΐνες με iTRAQ λόγος ≥1.2. (Β) μειωτικά πρωτεϊνών με αναλογία iTRAQ & lt?. 0.8

Η

Rab1A-νοκ ντάουν που προκαλείται κυτταρικός θάνατος προκαλείται από την αναστολή της Autophagy αλλά όχι ER-Golgi Κυκλοφορίας

Από Rab1A εμπλέκεται στην κυκλοφορία ER-Golgi, είμαστε δίπλα εξέτασε κατά πόσον η διακοπή αυτής της κυκλοφορίας προκαλεί κυτταρικό θάνατο. Αν και η θεραπεία με BFA, έναν αναστολέα της κυκλοφορίας ER-Golgi, που προκαλείται από κυτταρικό θάνατο, η μορφολογία του θανάτου κυττάρων ήταν πολύ διαφορετική από ότι κατά Rab1A knockdown (Σχ. 7Α και Β). Επειδή BFA είναι επίσης γνωστή ως ένας επαγωγέας στρες ER, η θεραπεία με ΒΡΑ προβλέπεται να προκαλέσει την ενδοκυτταρική συσσώρευση misfolded και μετουσιωμένες πρωτεΐνες. Ως εκ τούτου, έχουμε την επόμενη διερευνήθηκε η επαγωγή της αυτοφαγία. Όπως ήταν αναμενόμενο, η θεραπεία με ΒΡΑ που προκαλείται LC3B-II, ενώ Rab1A νοκ ντάουν δεν το έκανε. Rab1A knockdown επιπλέον οδήγησε στη συσσώρευση ρ62, η οποία μπορεί να δεσμεύσει LC3, εξυπηρετώντας έτσι ως ένα επιλεκτικό υπόστρωμα του αυτοφαγία (Εικ. 7C). Όταν Rab1A κατεστάλη, το επίπεδο του mRNA της Rab1B αυξήθηκαν δύο φορές, ενώ το επίπεδο της πρωτεΐνης του έτεινε να αυξηθεί ελαφρά (Εικ. S2A και Β). Rab1A, ως εκ τούτου, μπορεί να έχει μια μοναδική άγνωστης λειτουργίας που στερείται Rab1B ή τα συνολικά επίπεδα Rab1A και Rab1B μπορεί να μειωθεί κάτω από το όριο που είναι απαραίτητο για την επιβίωση των κυττάρων όταν Rab1A καταστάλθηκε. Επιπλέον, δεδομένου ότι Hsc70 knockdown επάγεται LC3B-ΙΙ που επέτρεψε LC3B να συνδεθούν με αυτοφαγικά κυστίδια, δεν επηρεάζει το σχηματισμό των αυτοφαγοσώματα, σε αντίθεση με Rab1A knockdown (Σχ. 7D). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. 2Β.