έχουν

Αφηρημένο

Τα microRNAs (miRNAs) έχουν αναφερθεί να διαδραματίσει κρίσιμο ρόλο στην εισβολή καρκίνου και μετάσταση. προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι miR-375 συχνά μειωτικά σε γαστρικό καρκίνο καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με τη στόχευση Janus κινάση 2 (JAK2). Εδώ, βρήκαμε περαιτέρω ότι το επίπεδο έκφρασης της miR-375 μειώνεται σημαντικά σε μεταστατικό γαστρικό καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τους μάρτυρες που δεν μετάσταση. Η έκτοπη έκφραση του miR-375 αναστέλλει τη μετανάστευση και την εισβολή των γαστρικών καρκινικών κυττάρων εν μέρει με τη στόχευση JAK2. Επιπλέον, miR-375 έκφραση ρυθμίζεται αρνητικά από το συσχετισμένο μετάσταση παράγοντα μεταγραφής σαλιγκάρι, το οποίο δεσμεύεται άμεσα με την υποθετική υποκινητή του miR-375. Επιπλέον, η υπερέκφραση του σαλιγκαριού μπορεί να αντιστρέψει εν μέρει την αναστολή της γαστρικής μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων που προκαλείται από miR-375. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι το miR-375 μπορεί να ρυθμίζεται αρνητικά από σαλιγκάρι και να συμμετέχουν σε γαστρικό μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και την εισβολή δυνητικά στοχεύοντας JAK2

Παράθεση:. Xu Y, Jin J, Liu Υ, Huang Ζ, Ντενγκ Υ, μπορείτε T, et al. (2014) σαλιγκάρι-Ρυθμιζόμενη MiR-375 Αναστέλλει τη Μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικά κύτταρα γαστρικού από Στόχευση JAK2. PLoS ONE 9 (7): e99516. doi: 10.1371 /journal.pone.0099516

Συντάκτης: Μινγκ Tan, Πανεπιστήμιο της Νότιας Αλαμπάμα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 Φλεβάρη, 2014? Αποδεκτές: 15 Μάη, 2014? Δημοσιεύθηκε: 23 του Ιούλη 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από Φυσικό Επιστημονικό Ίδρυμα της Κίνας (31301149, 31071221, 31190063, 31125017 και 31100975), Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας της Κίνας (2013CB945603, 2012CB945004 και (2011CBA01001), Υπουργείο Παιδείας της Κίνας (20110101110103 και (20130101120001), Φυσικό επιστημονική Ίδρυμα της επαρχίας Zhejiang, Κίνα (LQ13H160013, LQ14H160003, Z2100247 και Y2100106), το 111 Έργου (B13026), το βασικό Κονδυλίων Έρευνας για τις Κεντρικές πανεπιστήμια (2014QNA7015) και Zhejiang Provincial Πρόγραμμα για την καλλιέργεια υψηλού επιπέδου Καινοτόμες ταλέντα Υγείας. η χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχουν

Εισαγωγή

η μετάσταση είναι το πιο φοβερό πτυχές του καρκίνου και έχει μελετηθεί για περισσότερα από 100 χρόνια [1], [2]. Σε καρκίνο του στομάχου, η υψηλή θνησιμότητα αποδίδει κυρίως στην καθυστερημένη διάγνωση, λόγω της έλλειψης συγκεκριμένων συμπτωμάτων σε πρώιμο στάδιο. Και μετάσταση είναι υπεύθυνη για το γαστρικό θνησιμότητα σχετιζόμενη με τον καρκίνο [3], [4]. Μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων είναι απαραίτητες διαδικασίες κατά τη διάρκεια του μεταστατικού καρκίνου πομπή που αποτελείται από μια σειρά αλληλένδετων σταδίων, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού, αποκόλληση, την κυκλοφορία, τις μεταφορές, τη σύλληψη στα όργανα, η προσήλωση στο τοίχωμα των αγγείων, εξαγγείωση, δημιουργία ενός μικροπεριβάλλοντος, και τον πολλαπλασιασμό σε απομακρυσμένα όργανα. Σε γαστρικό καρκίνο, τα κύτταρα εισβολή στον περιβάλλοντα ιστό είναι ένα κρίσιμο πρώτο βήμα [3], [5]. Ωστόσο, οι μηχανισμοί της γαστρικής καρκινικών κυττάρων μετανάστευση, εισβολή και μετάσταση δεν έχουν κατανοηθεί πλήρως.

Τα τελευταία χρόνια, διάφορα μόρια, για παράδειγμα, αυξητικούς παράγοντες, κυτοκίνες, μόρια εξωκυττάριας ουσίας-αναδιαμόρφωση, και ορισμένοι παράγοντες μεταγραφής όπως σαλιγκάρι, Twist και ZEB1 [6], [7], [8], [9], [10], [11], έχουν αποκαλυφθεί για να οδηγήσει την πρόοδο των καρκινικών κυττάρων μετανάστευση, εισβολή και μετάσταση. Τον τελευταίο καιρό, έχει γίνει προφανές ότι, εκτός από την ανωμαλίες στα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, οι μεταβολές στη μη κωδικοποιητική γονιδίων μπορεί επίσης να συμβάλει στην καρκινικά κύτταρα μετανάστευση, εισβολή και μετάσταση, όπως miRNAs, τα οποία είναι μία τάξη μικρών μονόκλωνου μη-κωδικοποίησης των μορίων RNA που ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση με μεγάλες δυνατότητες και έχουν εμπλακεί στη ρύθμιση των καρκινικών κυττάρων μετανάστευση, εισβολή και μετάσταση ως ενεργοποιητές ή καταστολείς [12], [13], [14], [15], [16] . Μέχρι σήμερα, ένας αριθμός miRNAs έχουν μελετηθεί να εμπλέκεται σε γαστρικό εξέλιξη μετάστασης καρκίνου, για παράδειγμα, miR-218, miR-9, miR-7, και miR-146a [6], [17], [18], [19]. Έχουμε μελετήσει τη συσχέτιση μεταξύ συγκεκριμένων απορυθμισμένη miRNA και συγκεκριμένο βήμα μετάσταση του καρκίνου του στομάχου, η οποία θα παρέχει γνώσεις σχετικά με τις πιθανές μηχανισμούς των γαστρικών καρκινικών κυττάρων μετανάστευση, την εισβολή και τη μετάσταση.

Σε προηγούμενη μελέτη μας, miR-375 ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε καρκίνο του στομάχου και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των γαστρικών καρκινικών κυττάρων με τη στόχευση JAK2 [20]. Είναι ενδιαφέρον, στην παρούσα μελέτη, βρήκαμε περαιτέρω ότι το επίπεδο έκφρασης της miR-375 ήταν ακόμα χαμηλότερο σε γαστρικό καρκίνο δείγματα από ασθενείς μετάσταση θετικά compaired με εκείνη από ασθενείς μετάσταση-free. Έτσι, προτείναμε ότι το miR-375 θα μπορούσε να έχει αιτιώδη ρόλο στο γαστρικό μετάσταση του καρκίνου. Οι μελέτες μας αποκάλυψαν ότι η έκτοπη έκφραση του miR-375 ανέστειλε τη μετανάστευση και την εισβολή των γαστρικών καρκινικών κυττάρων και εν μέρει με τη στόχευση JAK2. Εμείς σας ζητηθεί περαιτέρω για να μάθετε πώς η έκφραση του miR-375 ρυθμιζόταν σε καρκίνο του στομάχου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το miR-375 ήταν ένας στόχος της συνδεδεμένης μετάσταση μεταγραφικού παράγοντα Snail και η έκφρασή της ήταν αντιστρόφως ανάλογη με το σαλιγκάρι σε καρκίνο του στομάχου. Η υπερέκφραση του σαλιγκαριού μπορεί να αντιστρέψει εν μέρει την αναστολή της γαστρικής μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων που προκαλείται από miR-375. Έτσι, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι το miR-375 αναστέλλει τη γαστρική καρκινικά κύτταρα μετανάστευση και την εισβολή μέσω Σαλιγκάρι /miR-375 /ρύθμισης JAK2 οδού.

Υλικά και Μέθοδοι

Κλινικά δείγματα (Δήλωση Ηθικής) και κυττάρων γραμμές

Κλινική γαστρικό δείγματα καρκίνου και ζευγάρι ταιριαστό μη κακοήθη γαστρικό δειγμάτων τους από 39 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε γαστρικό εκτομή καρκίνου του δόθηκαν από τον Sir Run Run Shaw Νοσοκομείο (Hangzhou, Κίνα). Όλα τα δείγματα που συλλέχθηκαν με τη γραπτή συγκατάθεση των ασθενών, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Τόσο γαστρικών καρκινικών ιστών και των παρακείμενων nontumorous γαστρικών ιστών που συλλέγονται μετά την επέμβαση ήταν και χωρίζεται σε δύο μέρη. Ένα καταψύχθηκε σε υγρό άζωτο αμέσως για περαιτέρω χρήση, ένα άλλο μέρος αποθηκεύθηκε σε φορμόλη για ανάλυση παθολογία. Οι ασθενείς που συμμετείχαν στη μελέτη μας χωρίστηκαν σε μετάσταση-free και μετάσταση θετικά ομάδες (9/30). Οι κυτταρικές σειρές γαστρικού καρκίνου (AGS και MGC-803) και ένα μη-κακοήθεις γαστρικού επιθηλίου κυτταρική σειρά (GES-1) που περιγράφηκε προηγουμένως [20].

RNA εκχύλιση

Ολικό RNA από γαστρικό δειγμάτων και κυτταρικών γραμμών εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας το mirVana miRNA Απομόνωση Kit (Ambion, ΤΧ, USA) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση

Η έκφραση του miR-375 ήταν προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας την Taqman microRNA Δοκιμασίες (Applied Biosystems, CA, USA) με ειδικούς εκκινητές (P /N: 4373151, Applied Biosystems). Η αντίστροφη αντίδραση μεταγραφής έγινε ξεκινώντας από 10 ng ολικού RNA χρησιμοποιώντας τους βρόγχους εκκινητές. Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το πρότυπο πρωτόκολλο Taqman microRNA Αναλύσεις για ABI7500 Real-Time Σύστημα Ανίχνευσης PCR. Η μέθοδος ΔΔCt για σχετική κβαντισμού χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η έκφραση miRNA. Η Ct είναι ο αριθμός κλασματική κύκλος στον οποίο ο φθορισμός κάθε δείγματος περνά το σταθερό κατώφλι. Η ΔCt υπολογίστηκε αφαιρώντας το Ct των snRNA U6 (RNU6B, P /N: 4373381, Applied Biosystems) από την Ct του miRNA ενδιαφέροντος. Η ΔΔCt υπολογίστηκε αφαιρώντας την ΔCt του δείγματος αναφοράς (ζεύγη μη κακοήθη ιστό για χειρουργική δείγματα, φυσιολογικούς ιστούς και GES-1 κυττάρων για κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου) από την ΔCt κάθε δείγματος. Διπλώστε αλλαγή προσδιορίστηκε ως 2

-ΔΔCt.

Μετανάστευση και

δοκιμασία εισβολής

Τα κύτταρα επιμολυσμένα με 20 nM προ-miR-375 ή αρνητικό έλεγχο με τη χρήση Η επιμόλυνση Agent (Ambion, ΤΧ, USA) ακολουθώντας το πρωτόκολλο κατασκευαστή σε πλάκες 24 φρεατίων. 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, δοκιμασία μετανάστευσης Transwell και δοκιμασία εισβολής Matrigel διεξήχθησαν ξεχωριστά χρησιμοποιώντας 24-καλά Transwell ένθετα με 8 μm μέγεθος πόρων (Corning Costar Corp). Για δοκιμασία μετανάστευσης Transwell, 2 × 10

4 AGS ή 3 × 10

4 MGC-803 κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 100 μΙ μέσου που αντιστοιχεί καλλιέργειας χωρίς ορό εμβρύου μόσχου (FBS) φορτώθηκαν στην κορυφή του θαλάμου του transwell ενθέτου με μη επικαλυμμένη μεμβράνη. Για την ανίχνευση εισβολής Matrigel, 5 × 10

4 AGS ή MGC-803 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 100 μΙ μέσου χωρίς ορό στο άνω Matrigel επικαλυμμένα θάλαμος αντ ‘αυτού. Σε αμφότερες τις δοκιμασίες, ο θάλαμος πυθμένα που περιέχει 600 μΙ μέσου με 20% FBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια αφέθηκαν να μεταναστεύσει ή εισβολή για 12 ώρες στους 37 ° C. Τα κύτταρα που μετανάστευσαν ή εισβάλει στον κάτω θάλαμο σταθεροποιήθηκαν, χρωματίστηκαν με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλιο (ϋΑΡΙ, 1:1000), οπτικοποιούνται υπό μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης και φωτογραφήθηκαν. Συνολικός αριθμός μετανάστευσαν ή εισέβαλε κύτταρα μετρήθηκε από IPP (Image-Pro Plus 6.0) του λογισμικού. Όλα τα πειράματα ανεξάρτητα επαναλαμβάνεται τουλάχιστον τρεις φορές.

επούλωση πληγών γρατζουνιές

δοκιμασία

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως και αφέθηκαν να αναπτυχθούν προς συρροή. Τα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε αντίστοιχο μέσο χωρίς FBS για 12 ώρες και στη συνέχεια γδαρμένο με ένα ρύγχος πιπέτας. Τραύματος περιοχές χαρακτηρίστηκαν και φωτογραφήθηκαν σε 0 h, 12 h, 24 h και 36 h, αντίστοιχα. Το ποσοστό των κυττάρων μετανάστευση εκτιμήθηκε τόσο από φωτογράφηση και ποσοτικοποίηση της μετανάστευσαν απόσταση των κυττάρων μεταφέρθηκε από το άκρο του τραύματος προς το κέντρο, χρησιμοποιώντας IPP σύστημα 6.0. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

Κατασκευάσματα

Για την παραγωγή pGL3-375pro πλασμίδιο, η αλληλουχία DNA που περιέχει pri-miR-375 (πρωτογενής miR-375) προαγωγός ενισχύθηκε με RT-PCR χρησιμοποιώντας οι εκκινητές 5′-ATCG CTCGAG ACA GAC CCT GCT AAG CGA CTC-3 ‘και 5′-ATCG AAGCTT ACG CCT TGG AGC TTG TCC-3′ και στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε σε pGL3-βασικό φορέα (Promega). Για την κατασκευή του πλασμιδίου που εκφράζει Σαλιγκάρι στα κύτταρα, η ακολουθία ανοικτού πλαισίου ανάγνωσης (ORF) του σαλιγκαριού κλωνοποιήθηκε σε φορέα έκφρασης θηλαστικών pEGFP-C1 (Clontech, CA, USA) χρησιμοποιώντας τους εκκινητές 5’-ATCG ΑΑ GCT TCG ATG CCG CGC TCT TTC CTC G-3 ‘και 5′-ATCG GGA TCC TCA ΟΟΟ ΟΟΟ ACA TCC TGA GCA-3’. Για έκτοπη έκφραση του FLAG-tagged JAK2, ανθρώπινο JAK2 με κωδικοποιητική περιοχή κλωνοποιήθηκε σε φορέα pCMV 2C-Tag. Για την κατασκευή του πλασμιδίου που εκφράζει miR-375 σε κύτταρα θηλαστικών, τα ζευγαρωμένα ολιγονουκλεοτίδια με βάση την πρωτοταγή αλληλουχία του έχει-miR-375 και πλευρικές περιοχές του κλωνοποιήθηκαν σε φορέα έκφρασης θηλαστικών pEGFP-C1 (Clontech, CA, USA). Όλα τα κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση.

Λουσιφεράσης δοκιμασία

Σαράντα χιλιάδες κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων 24 ώρες πριν από την επιμόλυνση. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με pGL3-375pro ή pGL3-Basic φορέα. Ο φορέας ρΡΙ_-ΤΚ (Promega, WI, USA) που περιέχει

Renilla

λουσιφεράσης επίσης συνεπιμολύνθηκε ως έλεγχος αναφοράς. Firefly και

Renilla

λουσιφεράσης μετρήθηκαν με τη χρήση Δοκιμασία Dual-Luciferase Reporter (Promega) 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Firefly δραστικότητα λουσιφεράσης κανονικοποιήθηκε προς δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla.

Στατιστικές αναλύσεις

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα (SE) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι σχέσεις μεταξύ της έκφρασης του miR-375 και την έκφραση του mRNA σαλιγκάρι είχαν διερευνηθεί από

συντελεστής συσχέτισης Pearson, η οποία περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Μαθητή

t-test

και

X

2 τεστ διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα.

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

MiR-375 είναι δραματικά προς τα κάτω σε γαστρικό καρκίνο κύτταρα και ιστούς από ασθενείς μετάσταση θετικούς

.

Για να καταλάβω αν miR-375 συνδέεται με γαστρικό μετάσταση του καρκίνου, ανιχνεύσαμε πρώτα το επίπεδο έκφρασης του miR-375 στην πρωτοβάθμια γαστρικό καρκινικούς ιστούς από μετάσταση θετικά και μετάσταση χωρίς ασθενών. Σε σύγκριση με δείγματα από ασθενείς χωρίς μετάσταση, το επίπεδο έκφρασης του miR-375 ήταν σχεδόν δύο φορές μείωση σε ιστούς από ασθενείς μετάσταση-θετικό (

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 1Α). Σε συνήχηση με αυτό το αποτέλεσμα, το επίπεδο έκφρασης του miR-375 στο γαστρικό κυτταρικές σειρές αρνητικά που συνδέονται με τις ικανότητες των κυττάρων μετανάστευση και εισβολή. Οι μεταστατικές ιδιότητες των γαστρικών επιθηλιακών κυτταρικών σειρών (GES-1, MGC-803, AGS) χαρακτηρίστηκαν. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 1C και 1D, τη μετανάστευση και εισβολή ικανότητες κυτταρικής γραμμής AGS ήταν μεγαλύτερη από εκείνη του MGC-803 και GES-1 κυτταρικές γραμμές (

P

& lt? 0,01). Αντιστρόφως, miR-375 έκφραση σε κύτταρα AGS ήταν χαμηλότερη από εκείνη των MGC-803 και GES-1 κύτταρα (

P

& lt? 0,01) (Σχήμα 1Β). Με μια λέξη, miR-375 ρυθμίζεται μειωτικά σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς από ασθενείς μετάσταση-θετικά και στο γαστρικό καρκινικά κύτταρα με μεγαλύτερη μετανάστευση και εισβολή ικανότητες. Η συσχέτιση αυτή δείχνει ότι το miR-375 θα μπορούσε να έχει αιτιώδη ρόλο στο γαστρικό μετάσταση του καρκίνου.

Η έκφραση του miR-375 ερευνήθηκε από qRT-PCR. (A) Σχετική αλλαγές φορές (Tumor ιστού /Κανονική ιστού, Τ /Ν) μεταξύ γαστρικό δείγματα καρκίνου από μετάσταση-δωρεάν ή -θετικό ασθενών και των παρακείμενων μη-κακοήθεις ιστούς τους. Το επίπεδο έκφρασης του miR-375 ήταν σχεδόν δύο φορές μείωση σε ιστούς από 30 μετάσταση-θετικούς ασθενείς από ότι από 9 ασθενείς μετάσταση-free,

* Ρ

& lt? 0.05. (Β) Το επίπεδο έκφρασης του miR-375 σε τρία ανθρώπινα γαστρικού επιθηλίου κυτταρικές γραμμές με διαφορετικές ικανότητες μετανάστευση και εισβολή. Το επίπεδο έκφρασης του miR-375 σε κύτταρα AGS ήταν χαμηλότερη από εκείνη των MGC-803 και GES-1 κύτταρα.

** P

& lt? 0,01. (C, D) Οι μετανάστευση και την εισβολή ικανότητες των τριών γαστρικού επιθηλίου κυτταρικές γραμμές μετρήθηκαν με επικοινωνούντα δοχεία. Οι φωτογραφίες είναι αντιπροσωπευτικά πεδία μετανάστευσαν (C) ή μεταστατικών κυττάρων (D) πάνω στη μεμβράνη. γραφικές παραστάσεις Bar αντιπροσωπεύουν το μέσο αριθμό των κυττάρων στην κάτω πλευρά της μεμβράνης ± SE. **

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με μη-κακοήθεις γαστρικών επιθηλιακών κυττάρων γραμμή GES-1

Η

Η υπερέκφραση του miR-375 αναστέλλει τη γαστρική καρκινικά κύτταρα μετανάστευση και την εισβολή

.

για να διερευνήσουν το ρόλο του miR-375 στο γαστρικό μετάσταση του καρκίνου, εξετάσαμε την επίδραση της miR-375 υπερέκφραση για τη μετανάστευση και την εισβολή του AGS και MGC-803 γαστρικά καρκινικά κύτταρα με χαμηλές endougenous έκφραση του miR-375. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με miR-375 πρόδρομος (MIR-375) ή με ολιγονουκλεοτίδια ελέγχου πρόδρομος-αρνητικό (αρνητικό) ή κανένα από τα παραπάνω (Mock). Η δοκιμασία μετανάστευσης Transwell έδειξε ότι η υπερέκφραση του miR-375 ανέστειλε σημαντικά την μετανάστευση του AGS (Σχήμα 2Α, 2Β) και MGC-803 κύτταρα (Σχήμα S1A, S1B). Σε συνεπείς με αυτά τα αποτελέσματα, η επούλωση μηδέν-πληγή δοκιμασία αποκάλυψε επίσης ότι οι ταχύτητες των AGS (Σχήμα 2C, 2D) και MGC-803 κύτταρα (Σχήμα S1c, S1D) μετανάστευση προς την περιοχή του τραύματος μειώθηκαν σημαντικά μετά την υπερέκφραση του miR-375 . Χρησιμοποιήσαμε περαιτέρω δοκιμασία εισβολή Matrigel και διαπίστωσε ότι η υπερέκφραση του miR-375 οδήγησε σε περισσότερο από δύο φορές μείωση των επεμβατική ιδιότητες του AGS (Σχήμα 3Α, 3Β) και MGC-803 κύτταρα (Σχήμα 3C, 3D). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η υπερέκφραση του miR-375 είναι επαρκής για την αναστολή τόσο η μετανάστευση και εισβολή ικανότητες των γαστρικών καρκινικών κυττάρων.

AGS κύτταρα επιμολυσμένα με miR-375 πρόδρομος (MIR-375), αρνητικό μάρτυρα (Αρνητική ) ή κανένα από τα παραπάνω (Mock) υποβλήθηκαν σε δοκιμασία μετανάστευσης Transwell (Α) και γρατσουνιά-επούλωσης πληγών ανάλυση (C). (Α) Αντιπροσωπευτική πεδία μετανάστευσαν κυττάρων στην κάτω πλευρά της μεμβράνης που μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ. (Β) Συνολικός αριθμός μετανάστευσαν κυττάρων στην κάτω πλευρά της μεμβράνης μετρήθηκε με ΙΡΡ 6.0 λογισμικό. (C) Τα κύτταρα μετανάστευση στον πληγωμένο περιοχή φωτογραφήθηκε με μικροσκόπιο σε 0 h, 12 h, 24 h και 36 h μετά τον τραυματισμό. Οι διακεκομμένες γραμμές δείχνουν τις περιοχές που στερούνται κυττάρων. (D) Το ποσοστό της μετανάστευσης εξετάστηκε με μέτρηση της απόστασης των κυττάρων μεταφέρθηκε από το άκρο του τραύματος προς το κέντρο σε 36 ώρες μετά το ξύσιμο. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Μπαρ, 50 μm. **

P

& lt?. 0.01

Η

AGS και MGC-803 κύτταρα επιμολυσμένα με προ-miR-375 (miR-375), αρνητικός έλεγχος (αρνητική) ή κανένα από τα παραπάνω (Mock) υποβλήθηκαν σε ανάλυση Matrigel εισβολής. (A, C) έχουν δείξει Αντιπροσωπευτικά πεδία από τα κύτταρα επί του πυθμένα του θαλάμου σε 12 ώρες μετά την εισβολή. Ράβδοι κλίμακας, 50 μm. (Β, D) Ο συνολικός αριθμός των μεταστατικών κυττάρων στην κάτω πλευρά της μεμβράνης μετρήθηκε με ΙΡΡ 6.0. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE από τρία ανεξάρτητα πειράματα. **

P

& lt?. 0.01

Η

MiR-375-ρυθμίζονται JAK2 εμπλέκεται στη ρύθμιση της γαστρικής καρκινικών κυττάρων μετανάστευση και την εισβολή

προηγούμενη μελέτη μας έχει προσδιορίζονται JAK2 ως μεταγενέστερος στόχος των miR-375 [20]. Εδώ, μας ενδιαφέρει να μελετά κατά πόσον JAK2 εμπλέκεται στη ρύθμιση της γαστρικής καρκινικών κυττάρων μετανάστευση και την εισβολή. Χρησιμοποιήσαμε φορέα με βάση την τεχνική RNAi να καταστρέφουν τα ενδογενή JAK2 και διαπίστωσε ότι τα μετανάστευση και εισβολή δραστηριότητες του AGS (Σχήμα 4) και MGC-803 κύτταρα (Σχήμα S2) έχουν και οι δύο ανέστειλαν σε μεγάλο βαθμό. Ταυτόχρονα, μελετήσαμε εάν JAK2 θα μπορούσε να αντισταθμίσει την επίδραση της αναστολής των γαστρικών καρκινικών κυττάρων μετανάστευση και την εισβολή που προκαλούνται από miR-375. Τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με miR-375 πρόδρομος και είτε JAK2 διάνυσμα υπερέκφραση (MIR-375 + JAK2) ή ελέγχουν κενό φορέα (MIR-375 + Vec). Η υπερέκφραση του JAK2 προωθείται σαφώς κύτταρα μετανάστευση και εισβολή, όπως φαίνεται στο Σχήμα 4 και S2. Έτσι, σε σύμφωνη με την υπόθεσή μας, miR-375 μπορεί να αναστέλλουν τη μετανάστευση και την εισβολή του γαστρικού καρκίνου κυττάρων εν μέρει με τη στόχευση JAK2. Προσδιορίσαμε επίσης ότι η υπερέκφραση JAK2 έχει καμία επίδραση στο επίπεδο έκφρασης του miR-375 όπως φαίνεται στο Σχήμα S3. Ωστόσο, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα ότι η απορύθμιση του miR-375 παρεμβαίνει με άλλους στόχους που απαιτούνται για γαστρικά καρκινικά κύτταρα μετανάστευση και εισβολή.

Τα κύτταρα επιμολυσμένα με τα υποδεικνυόμενα φορείς ή ολιγονουκλεοτίδια υποβλήθηκαν με μετανάστευση Transwell (Α) ή δοκιμασία εισβολής Matrigel (C). Τα πειράματα διάσωσης για miR-375 υπερέκφραση πραγματοποιήθηκαν από έκτοπη έκφραση της JAK2 χωρίς 3′-UTR στην miR-375-κατεργασμένα κύτταρα. (A, C) έχουν δείξει Αντιπροσωπευτικά πεδία από τα κύτταρα επί του πυθμένα του θαλάμου σε 12 ώρες μετά τη μετανάστευση ή την εισβολή. Ράβδοι κλίμακας, 50 μm. (Β, D) Ο συνολικός αριθμός των μετανάστευσαν ή επεμβατικές κύτταρα από εννέα τυχαία επιλεγμένα πεδία μετρήθηκε από IPP 6.0. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01

Η

σαλιγκάρι ρυθμίζει προς τα κάτω miR-375 έκφρασης

Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι miR-375 μπορεί να στοχεύονται από ορισμένους παράγοντες μεταγραφής που σχετίζονται με την εισβολή καρκίνου και μετάσταση διαδικασία. Φυσικά, έχουμε επικεντρωθεί στο πώς η έκφραση του miR-375 ρυθμίζεται. Πρέπει πρώτα ανακαλύψαμε ένα συζήτησε περιοχή του DNA ανάντη του pri-miR-375 γονίδιο, το οποίο έχει αναφερθεί ότι περιέχει το γονίδιο υποκινητή pri-miR-375 [21]. Στη συνέχεια εκτελείται το πρόγραμμα Consite (https://asp.ii.uib.no:8090/cgi-bin/CONSITE/consite) και διαπίστωσε ότι υπήρχαν έξι θέσεις πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα Snail στην περιοχή του DNA (Εικόνα 5Α). Η περιοχή DNA κλωνοποιήθηκε σε pGL3-βασικό φορέα (Promega) (pGL3-375pro) για να μετρηθεί η δραστικότητα προαγωγέα. Στην σύμφωνη με τα δεδομένα από την ομάδα Walker [21], τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι αυτή η περιοχή του DNA περιέχει το γονίδιο υποκινητή PRI-miR-375 και είναι ικανό να κατευθύνει έκφραση λουσιφεράσης (Σχήμα 5Β). Η δραστικότητα λουσιφεράσης αποτελεσματικά καταστέλλεται όταν φορέα pGL3-375pro συν-επιμολύνθηκαν με φορέα έκφρασης Σαλιγκάρι (Σαλιγκάρι), αλλά όχι όταν συν-επιμολυσμένα με τον κενό φορέα ελέγχου (Mock) (Σχήμα 5C). Επιπλέον, σαλιγκάρι υπερέκφραση θα μπορούσε να μειώσει το επίπεδο έκφρασης του miR-375 κατά 46% (Σχήμα 5D). Προκειμένου να προσδιοριστεί η κλινική σημασία αυτών των αποτελεσμάτων, έχουμε συσχετίζεται περαιτέρω το επίπεδο έκφρασης του miR-375 με το επίπεδο mRNA σαλιγκάρι στους ίδιους ασθενείς με γαστρικό καρκίνο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Ε, μια ξεχωριστή αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου έκφρασης του miR-375 και Σαλιγκάρι mRNA (

P

& lt? 0,05, r = -0,6). Ως εκ τούτου, οι παρατηρήσεις αυτές καταδεικνύουν ότι σαλιγκάρι είναι ένα δυναμικό ανάντη ρυθμιστή του miR-375 έκφρασης.

ανάλυση (Α) Βιοπληροφορική χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Consite αποκάλυψε πιθανές θέσεις πρόσδεσης και διαπίστωσε ότι υπήρχαν έξι θέσεις πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα Snail σε η περιοχή DNA η οποία περιέχει το γονίδιο υποκινητή PRI-miR-375. (Β) Η υποθετική περιοχή προαγωγού του γονιδίου miR-375 συνδέθηκε ανοδικά προς το γονίδιο αναφοράς λουσιφεράσης πυγολαμπίδας στον υποκινητή-λιγότερο pGL3-βασικό φορέα (pGL3-375pro), με αποτέλεσμα ένα 20-πλάσια αύξηση στην δραστικότητα της λουσιφεράσης. (C) δραστικότητα λουσιφεράσης των pGL3-375pro σε κύτταρα μεταδιεγείρονται με φορέα σαλιγκάρι. Η δραστικότητα λουσιφεράσης αποτελεσματικά καταστέλλεται όταν φορέα pGL3-375pro συν-επιμολύνθηκε με φορέα έκφρασης σαλιγκάρι. (Δ) Το επίπεδο έκφρασης του miR-375 σε κύτταρα που μετατρέπονται από σαλιγκάρι που υπερεκφράζουν φορέα. Σαλιγκάρι υπερέκφραση θα μπορούσε να μειώσει το επίπεδο έκφρασης του miR-375 κατά 46%. (Ε) αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του miR-375 έκφρασης και το επίπεδο σαλιγκάρι mRNA σε πρωτογενή γαστρικού καρκινικούς ιστούς. Μια στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ του miR-375 και σαλιγκάρι παρατηρήθηκε από

μέθοδο Pearson με ένα συντελεστή συσχέτισης -0,6. **

P

& lt?. 0.01

Η

σαλιγκάρι εμπλέκεται στη ρύθμιση της γαστρικής μετανάστευση καρκινικών κυττάρων με τη στόχευση miR-375

Για να διευκρινιστεί περαιτέρω η συσχέτιση της miR-375 και σαλιγκάρι, μελετήσαμε αν σαλιγκάρι εμπλέκεται στη ρύθμιση της γαστρικής μετανάστευση καρκινικών κυττάρων με τη στόχευση miR-375. Χρησιμοποιήσαμε την τεχνική φορέα με βάση το ότι απορυθμίζει σαλιγκάρι επίπεδο έκφρασης και διαπίστωσε ότι η δραστηριότητα της μετανάστευσης των κυττάρων AGS (Σχήμα 6) προωθήθηκαν σε μεγάλο βαθμό. Ταυτόχρονα, μελετήσαμε εάν σαλιγκάρι θα μπορούσε να αντισταθμίσει την επίδραση αναστολή της γαστρικής μετανάστευση καρκινικών κυττάρων που προκαλείται από miR-375. Τα κύτταρα συν-επιμολυσμένα με miR-375 φορέα υπερέκφραση και διάνυσμα υπερέκφραση σαλιγκάρι (Σαλιγκάρι + miR-375). Η υπερέκφραση του σαλιγκαριού σαφώς προωθείται κύτταρα μετανάστευση και θα μπορούσε να εξουδετερώσει μερικώς το αποτέλεσμα αναστολή της γαστρικής μετανάστευση καρκινικών κυττάρων που προκαλείται από miR-375, όπως φαίνεται στο Σχήμα 6. Έτσι, σε σύμφωνη με την υπόθεσή μας, σαλιγκάρι μπορεί να αναστέλλει τη μετανάστευση των γαστρικών καρκινικών κυττάρων εν μέρει με τη στόχευση miR-375.

τα κύτταρα επιμολυσμένα με τα υποδεικνυόμενα φορείς υποβλήθηκαν με δοκιμασία μετανάστευσης Transwell. (Α) δείχθηκε Αντιπροσωπευτικά πεδία από τα κύτταρα επί του πυθμένα του θαλάμου σε 12 ώρες μετά τη μετανάστευση. Ράβδοι κλίμακας, 50 μm. (Β) Ο μέσος αριθμός των μετανάστευσαν κυττάρων από εννέα τυχαία επιλεγμένα πεδία μετρήθηκε από IPP 6.0. **

P

& lt?. 0.01

Η

Συζήτηση

έχουν miRNAs έχουν αναφερθεί για τη ρύθμιση της μετανάστευσης των όγκων, την εισβολή και τη μετάσταση συμπεριλαμβανομένου του γαστρικού καρκίνου [6], [22 ]. MiR-375 είχε προηγουμένως αποδειχθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα πολλαπλασιασμού [20], [23]. Ωστόσο, οι ρυθμιστικοί μηχανισμοί παραμένουν ασαφείς. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε περαιτέρω τη λειτουργία και των πιθανών μηχανισμών του miR-375 στη μετανάστευση και την εισβολή του γαστρικού καρκίνου κύτταρα. Βρήκαμε ότι η υπερέκφραση του miR-375 παρεμπόδισε τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή του γαστρικού καρκίνου κυττάρων εν μέρει με τη στόχευση JAK2. Έχει περάσει πάνω από μια δεκαετία από JAK2 κλωνοποιήθηκε για πρώτη φορά [24]. JAK2 εκφράζεται σχεδόν σε κάθε ιστό και συνδέεται με πολλές παθολογικές εξελίσσεται. Αν και είναι προφανές ότι JAK2 δρα ως ένα ογκογονίδιο και στις δύο μυελοπολλαπλασιαστικές διαταραχές και ορισμένων συμπαγών όγκων [25], [26], [27], χωρίς άμεση εμπλοκή των JAK2 στη μετανάστευση του καρκίνου, εισβολή ή μετάσταση έχει αναφερθεί. Το ενδιαφέρον η μελέτη μας απέδειξε πρώτος ότι χτυπήσει κάτω JAK2 με RNAi ανέστειλε τις δραστηριότητες μετανάστευση και εισβολή του γαστρικού καρκίνου κύτταρα παρόμοια με εκείνη της υπερέκφραση του miR-375. Εκτός αυτού, η υπερέκφραση του JAK2 μπορούσε να προωθήσει την μετανάστευση και την εισβολή του γαστρικού καρκίνου κύτταρα. Έτσι, θεωρείται ότι θα μπορούσαν να JAK2 εξουδετερώσει την ανασταλτική επίδραση στην μετανάστευση κυττάρων και εισβολή προκαλούνται από miR-375. Δεδομένου τον κρίσιμο ρόλο της miR-375 και JAK2 ως ρυθμιστές master στο γαστρικό καρκίνο κύτταρα πολλαπλασιασμός, μετανάστευση, και εισβολή, και οι δύο από αυτά έχει θεραπευτικές δυνατότητες σε γαστρικό θεραπεία του καρκίνου. Ως εκ τούτου, μένει να διερευνηθεί αν υπάρχει άλλων στόχων συμμετέχουν σε miR-375 με τη μεσολάβηση του γαστρικού μετάσταση.

Ιδιαίτερο ενδιαφέρον, μελετήσαμε περαιτέρω πώς miR-375 που εμπλέκονται στην γαστρική καρκινογένεση. Παρά το γεγονός ότι υπάρχει μια εμφανής ότι η μεθυλίωση του DNA και απακετυλίωση ιστόνης είναι οι πιθανοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην ρύθμιση προς τα κάτω του miR-375 σε γαστρικό καρκίνο [23]. Οι μηχανισμοί που διέπουν miR-375 απορρύθμισης στο γαστρικό μετάσταση του καρκίνου είναι ακόμη πλήρως κατανοητό. Υπάρχει δυνατότητα για μεταγραφική μπλοκάρισμα της έκφρασης του γονιδίου miR-375 σε αυτή τη διαδικασία. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η σχετική μετάσταση παράγοντας μεταγραφής σαλιγκάρι είναι ένα δυναμικό ανάντη ρυθμιστή της έκφρασης miR-375. Σαλιγκάρι είναι μια δεσμευτική του DNA πρωτεΐνη δακτύλου ψευδαργύρου και έχει αναφερθεί ως μεταγραφικός καταστολέας [28]. Acumulating αποδείξεις δείχνουν ότι Σαλιγκάρι δεσμεύεται στην Ε-κουτιά στον προαγωγό του Ε-καδερίνης και καταστέλλει τη μεταγραφή της να ρυθμίζει ανάπτυξη εισβολή όγκου [29]. Επιπλέον, η υπερέκφραση του σαλιγκαριού σε καρκίνους βρέθηκε να σχετίζεται με μετάσταση λεμφαδένα, υποτροπή του όγκου και την πρόγνωση [30], [31], [32], [33], [34], [35]. Σε συνάδει με άλλες εκθέσεις, η μελέτη μας διαπίστωσε ότι Σαλιγκάρι mRNA υπερεκφράζεται σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με παρακείμενες μη-κακοήθεις ιστούς τους. Δεδομένου ότι η δραστικότητα προαγωγέα του miR-375 θα μπορούσε να κατασταλεί με σαλιγκάρι και υπερέκφραση του σαλιγκαριού μπορεί να μειώσει σημαντικά το επίπεδο έκφρασης miR-375, βρήκαμε περαιτέρω μια ξεχωριστή αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου έκφρασης του miR-375 και του επιπέδου του σαλιγκαριού mRNA σε γαστρικό καρκίνο δείγματα. Σαλιγκάρι επίσης βρέθηκε να εμπλέκεται στην ρύθμιση της γαστρικής μετανάστευση καρκινικών κυττάρων με τη στόχευση miR-375.

Εν κατακλείδι, έχουμε εντοπίσει ότι miR-375 ήταν παρεκκλίνοντα εκφράζεται στα γαστρικά καρκινικούς ιστούς από ασθενείς θετικούς μετάσταση ή γαστρική καρκινικά κύτταρα με μεγαλύτερη μετανάστευση και δραστηριότητες εισβολή σε σύγκριση με τους ιστούς από ασθενείς μετάσταση ελεύθερο ή μη επεμβατική γαστρικού επιθηλίου κυτταρική γραμμή GES-1 αντίστοιχα. Η υπερέκφραση του miR-375 μειωμένη γαστρική δραστηριότητες καρκινικά κύτταρα μετανάστευση και την εισβολή, τουλάχιστον εν μέρει με τη στόχευση JAK2. Επιπλέον, σαλιγκάρι μπορεί να είναι ένας ρυθμιστής της ανάντη miR-375 η οποία ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση του miR-375 και εμπλέκονται στη ρύθμιση του γαστρικού μετανάστευση καρκινικών κυττάρων με τη στόχευση miR-375. Μαζί, τα αποτελέσματα μας παρέχουν μια undescribed μονοπάτι, στην οποία ένας παράγοντας μεταγραφής Σαλιγκάρι ρυθμίζει την έκφραση του miR-375, η οποία καταστέλλει την άμεση JAK2 στόχο της, οδηγώντας σε αναστέλλουν τη μετανάστευση και την εισβολή του γαστρικού καρκίνου κύτταρα. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η αποκατάσταση του miR-375 ή η αναστολή της Σαλιγκάρι ή JAK2 μπορεί να είναι χρήσιμες θεραπευτικές στρατηγικές για γαστρικό θεραπεία του καρκίνου. Σίγουρα θα είναι πολύ ενδιαφέρον να διερευνήσει περαιτέρω την πιθανή αποτελεσματικότητα αυτών των μορίων που στοχεύουν miR-375, JAK2 ή σαλιγκάρι στη θεραπεία του καρκίνου του στομάχου. Ένα άλλο ενδιαφέρον θέμα για μελλοντική έρευνα θα είναι ο εντοπισμός των άλλων πιθανών στόχων του miR-375, και, πιο συγκεκριμένα, η πιθανή εμπλοκή της JAK2 στο γαστρικό μετάσταση του καρκίνου.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

έκτοπη έκφραση του miR-375 καταστέλλει τη μετανάστευση των MGC-803 κύτταρα. MGC-803 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-375 πρόδρομος (MIR-375), αρνητικό μάρτυρα (αρνητικός) ή κανένα από τα παραπάνω (Mock) υποβλήθηκαν σε δοκιμασία μετανάστευσης Transwell (Α) και γρατσουνιά-επούλωσης πληγών ανάλυση (C). (Α) Αντιπροσωπευτική πεδία μεταστατικών κυττάρων στην κάτω πλευρά της μεμβράνης που μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ. (Β) Συνολικός αριθμός μετανάστευσαν κυττάρων στην κάτω πλευρά της μεμβράνης μετρήθηκε με ΙΡΡ 6.0 λογισμικό. (C) Τα κύτταρα μετανάστευση στον πληγωμένο περιοχή φωτογραφήθηκε με μικροσκόπιο σε 0 h, 12 h, 24 h και 36 h μετά τον τραυματισμό. Οι διακεκομμένες γραμμές δείχνουν τις περιοχές που στερούνται κυττάρων. (D) Το ποσοστό της μετανάστευσης εξετάστηκε με μέτρηση της απόστασης των κυττάρων μεταφέρθηκε από το άκρο του τραύματος προς το κέντρο σε 36 ώρες μετά το ξύσιμο. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Μπαρ, 50 μm. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01

doi:. 10.1371 /journal.pone.0099516.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2 .

υπερέκφραση του JAK2 αντιστρέφει miR-375 που προκαλείται από την αναστολή της MGC-803 κύτταρα μετανάστευση και την εισβολή. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα φορείς ή ολιγονουκλεοτίδια υποβλήθηκαν με μετανάστευση Transwell (Α) ή δοκιμασία εισβολής Matrigel (C). Τα πειράματα διάσωσης για miR-375 υπερέκφραση πραγματοποιήθηκαν από έκτοπη έκφραση της JAK2 χωρίς 3′-UTR στην miR-375-κατεργασμένα κύτταρα. (A, C) έχουν δείξει Αντιπροσωπευτικά πεδία από τα κύτταρα επί του πυθμένα του θαλάμου σε 12 ώρες μετά τη μετανάστευση ή την εισβολή. Ράβδοι κλίμακας, 50 μm. (Β, D) Ο συνολικός αριθμός των μετανάστευσαν ή επεμβατικές κύτταρα από εννέα τυχαία επιλεγμένα πεδία μετρήθηκε από IPP 6.0. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01

doi:. 10.1371 /journal.pone.0099516.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3 .

JAK2 έχει καμία επίδραση στην έκφραση miR-375. Οι AGS και MGC-803 κύτταρα επιμολύνθηκαν με φορέα JAK2 υπερέκφραση ή φορέα ελέγχου και υποβλήθηκαν σε ανάλυση RT-PCR για το επίπεδο έκφρασης του miR-375. Το επίπεδο του RNA U6 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος

doi:. 10.1371 /journal.pone.0099516.s003

(ΔΕΘ)