Αφηρημένο

Πρόσφατα miR-182 έχει αναφερθεί ότι είναι υπερ-εκφράζεται σε προστάτη καρκίνος (PC) ιστούς, ωστόσο λεπτομερής λειτουργική ανάλυση του miR-182-5p δεν έχει πραγματοποιηθεί. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να: 1. αναλύσει τη λειτουργία των miR-182-5p στον καρκίνο του προστάτη, 2. εκτιμήσει τη χρησιμότητά του ως καρκινικός δείκτης, 3. τον εντοπισμό miR-182-5p γονιδίων στόχων στο PC, 4. να διερευνήσει την δυναμικό αναστολέα miR-182-5p που θα χρησιμοποιηθεί στη θεραπεία PC. Αρχικά βρήκαμε ότι miR-182-5p έκφραση ήταν σημαντικά υψηλότερη σε προστάτη καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς και τα κύτταρα του προστάτη. Επιπλέον υψηλής miR-182-5p έκφραση σχετίστηκε με μικρότερη συνολική επιβίωση σε ασθενείς με PC. Για τη μελέτη της λειτουργικής σημασίας του miR-182-5p, έχουμε χτυπηθεί κάτω miR-182-5p με αναστολέα miR-182-5p. Μετά miR-182-5p knock-down, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη, τη μετανάστευση και την εισβολή μειώθηκαν. Εντοπίσαμε

FOXF2

,

RECK

και

MTSS1

ως πιθανοί γονιδίων στόχων του miR-182-5p χρησιμοποιώντας διάφορους αλγόριθμους που επιβεβαιώθηκε με δοκιμασία λουσιφεράσης 3’ΙΙΤΡ και ανάλυση Western . Knock-down του miR-182-5p επίσης μειώθηκε σημαντικά

in vivo

ανάπτυξη του όγκου του προστάτη. Συμπερασματικά αυτή είναι η πρώτη έκθεση που τεκμηριώνουν ότι η υπερ-έκφραση του miR-182-5p σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη και πιθανώς χρήσιμα ως προγνωστικός βιοδείκτη. Επίσης γκρεμίσουμε του miR-182-5p προκειμένου να αυξηθεί η έκφραση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων

FOXF2

,

RECK

και

MTSS1

μπορεί να είναι θεραπευτικό όφελος στη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη .

Παράθεση: Hirata Η, Ueno Κ, Shahryari V, Ντενγκ G, Tanaka Υ, Tabatabai ZL, et al. (2013) microRNA-182-5p Προωθεί την κυτταρική διείσδυση και τον πολλαπλασιασμό από κάτω ρύθμιση

FOXF2

,

RECK και MTSS1

γονίδια στο ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 8 (1): e55502. doi: 10.1371 /journal.pone.0055502

Επιμέλεια: Soumitro Pal, Νοσοκομείο Παίδων της Βοστόνης & amp? Ιατρική Σχολή του Χάρβαρντ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 Οκτωβρίου, 2012? Αποδεκτές: 23, Δεκ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 30, Ιαν 2013

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοιχτής πρόσβασης δωρεάν όλων των δικαιωμάτων πνευματικής ιδιοκτησίας, και μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Κέντρο Έρευνας Πόρων των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας, μέσω επιχορήγησης Αριθμός RO1CA138642, RO1CA130860, RO1CA160079, VA κριτική Merit επιχορηγήσεις, VA Πρόγραμμα Έργων και του Ιδρύματος Yamada Επιστημών. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή δεδομένων και την ανάλυση, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη (PC) είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθειες στους άνδρες των ΗΠΑ [1]. Η αιτιολογία της PC είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη, αν και οι διάφοροι παράγοντες κινδύνου, όπως η εθνικότητα, το οικογενειακό ιστορικό και η ηλικία σχετίζεται με την ασθένεια [2]. Επιπλέον, αρκετές διαιτητικά συστατικά έχουν συνδεθεί με τον κίνδυνο PC και την πρόληψη [3], [4]. Ως αντιγόνο (PSA) διαλογή ειδικού προστατικού έχει εξαπλωθεί, ο αριθμός των ασθενών που ιάσιμη τείνει να αυξηθεί. Ωστόσο, ένας σημαντικός αριθμός ασθενών με μετάσταση λεμφαδένα εντοπιστούν κατά ριζική προστατεκτομή, καθιστώντας τη θεραπεία πιο δύσκολη [5].

Πρόσφατα ένας αριθμός έχουν ταυτοποιηθεί και αναφέρεται miRNAs να είναι σημαντική από πολλές καρκίνους [6] . Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρά μη-κωδικοποίησης RNAs περίπου 22 νουκλεοτίδια σε μήκος που είναι ικανά να ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση τόσο σε επίπεδα μεταγραφής και μετάφρασης [7]. MiRNAs προσδένονται στο 3 ‘αμετάφραστη περιοχή (UTR) του mRNA στόχου και καταστέλλει τη μετάφραση από mRNA σε πρωτεΐνη ή να επάγουν διάσπασης mRNA, ρυθμίζοντας έτσι την έκφραση των γονιδίων στόχων όπως καταστολέα όγκων ή ογκογονίδια [8], [9]. Πρόσφατα miR-182 έχει αναφερθεί ότι υπερ-εκφράζεται σε καρκίνο του προστάτη [10]. Ωστόσο λειτουργική ανάλυση του miR-182-5p δεν έχει πραγματοποιηθεί στον καρκίνο του προστάτη. Ως εκ τούτου, υποθέτουμε ότι miR-182-5p μπορεί να λειτουργεί ως ένα ογκογονίδιο και να είναι ένα νέο μοριακό βιοδείκτη σε καρκίνο του προστάτη. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, έχουμε βρει ότι αρχικά miR-182-5p έκφραση ήταν σημαντικά υψηλότερη σε προστάτη καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη. Επιπλέον, η έκφραση του miR-182-5p ήταν σημαντικά υψηλότερη σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου προστάτη (LNCaP, PC-3, DU145) σε σύγκριση με φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα προστάτη (RWPE-1). Για τις μελέτες λειτουργική ανάλυση, miR-182-5p χτυπήθηκε κάτω χρησιμοποιώντας ένα αναστολέα miR-182-5p. Χρησιμοποιήσαμε επίσης αρκετές αλγόριθμους για να ψάξετε πιθανών ογκοκατασταλτικών γονιδίων, όπως στόχευση για miR-182-5p. δοκιμασίας λουσιφεράσης 3’UTR και Western αναλύσεις διεξήχθησαν για να επιβεβαιώσει την άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ miR-182-5p και αυτών των γονιδίων-στόχων. Τέλος καθιερώσει σταθερές χαμηλές miR-182-5p κυτταρικές σειρές που εκφράζουν και εκτελούνται

in vivo

μελέτες προκειμένου να παρατηρήσουν τις πιθανές επιδράσεις στην καταστολή του όγκου σε ένα ξενομόσχευμα γυμνό μοντέλο ποντικού.

Αποτελέσματα

miRNA-182 έκφραση είναι σημαντικά αυξημένη σε προστάτη καρκινικούς ιστούς και συσχετίστηκε με τη συνολική επιβίωση

επίπεδα έκφρασης

MiR-182-5p σε κλινικά δείγματα (52 δείγματα) επιβεβαιώθηκαν με PCR πραγματικού χρόνου. MiR-182-5p έκφραση παρουσιάζεται ως ο λόγος του όγκου (Τ) και /φυσιολογικό (Ν) έκφραση (αναλογία Τ /Ν) σε κάθε συνδεδεμένο δείγμα (Σχήμα 1). Έτσι, εάν ο λόγος T /N είναι πάνω 1,0, miR-182-5p έκφραση κρίθηκε να είναι υψηλότερη σε καρκινικούς ιστούς του προστάτη σε σύγκριση με εκείνη σε συμφωνημένα παρακείμενο φυσιολογικό ιστό. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1-Α, σε 5 ασθενείς (9,7%), η αναλογία T /N ήταν μικρότερη από 1,0, ενώ στις άλλες 47 ασθενείς (90,3%), η αναλογία Τ /Ν ήταν περισσότερο από 1,0. Ως εκ τούτου miR-182-5p έκφραση ήταν σημαντικά υψηλότερη σε προστάτη καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς συμφωνημένα προστάτη. Χωρίσαμε τις ασθενείς με καρκίνο του προστάτη 52 σε δύο κατηγορίες με βάση τη μέση Τ Ν δείκτης /(2.27) ως εξής: 1) υψηλής miR-182-5p εκφράζουν ομάδα (miR-182-5p Τ Ν αναλογία /υψηλότερη από 2,27), 2 ) χαμηλής miR-182-5p εκφράζουν ομάδα (αναλογία miR-182-5p Τ /Ν χαμηλότερη από 2,27). Στη συνέχεια ερευνήσαμε την ένωση του miR-182-5p και αρκετές κλινικές παραμέτρους, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1-Β. Σχεδιαγράμματα Kaplan Meier έδειξε ότι η συνολική επιβίωση ήταν σημαντικά μικρότερη στην υψηλή miR-182-5p εκφράζουν ομάδα (p value = 0,0117, δοκιμασία log-rank) (Σχήμα 1-C).

Α. Σχετική miR-182-5p έκφραση [κάθε ιστό του όγκου (Τ) /φυσιολογικό ιστό του προστάτη (Ν)] βασίζονται σε πραγματικό χρόνο τα αποτελέσματα της PCR, Β σύνδεσης μεταξύ miR-182-5p έκφρασης και κλινική-παθολογική παραμέτρους (ηλικία κατά τη διάγνωση, PT , Gleason σκορ, η αποτυχία PSA και τη συνολική επιβίωση) σε προστάτη καρκινικούς ιστούς με βάση τα αποτελέσματα της Q-PCR. Γ Kaplan-Meier για πάνω από όλους την επιβίωση μετά από ριζική προστατεκτομή.

Η

miRNA-182-5p έκφραση είναι σημαντικά αυξημένη σε καρκίνο του προστάτη κυτταρικές σειρές

MiR-182-5p έκφρασης ήταν σημαντικά υψηλότερη σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου προστάτη (LNCaP, PC-3 και DU145) σε σύγκριση με την κανονική κυτταρική σειρά προστάτη (RWPE-1) (Σχήμα 2Α).

A. Η έκφραση του miR-182-5p ήταν σημαντικά υψηλότερη σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη τρία σε σύγκριση με ένα φυσιολογικό κύτταρο προστάτη γραμμή (RWPE-1), Β Σχετική miR-182-5p έκφρασης (πρόδρομος miR-NC ή miR-182-5p επιμολυσμένα κύτταρα 1 RWPE-), Β δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας (miR-NC ή miR-182-5p πρόδρομος επιμολυσμένα RWPE-1 κύτταρα), Γ επούλωση των πληγών δοκιμασία (miR-NC ή miR-182-5p πρόδρομος επιμολυσμένα RWPE-1 κύτταρα). Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± Τ.Α. (Τυπική απόκλιση).

Η

Επίδραση των microRNA-182-5p υπερ-έκφραση για τη βιωσιμότητα των κυττάρων και τη μετανάστευση σε ένα φυσιολογικό κύτταρο του προστάτη γραμμή

Για να επιβεβαιώσετε τη λειτουργία των miR-182- 5ρ, επιμολύναμε πρόδρομος miR-182-5p σε μια κανονική κυτταρική σειρά προστάτη (RWPE-1). Στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση του miR-NC ή miR-182-5p πρόδρομα κύτταρα σε RWPE-1, το επίπεδο του miR-182-5p έκφραση επαληθεύτηκε με PCR πραγματικού χρόνου (fold αλλαγή? 526, Σχήμα 2-Β.). Στη συνέχεια, η βιωσιμότητα των κυττάρων (δοκιμασία MTS) και επούλωσης τραυμάτων δοκιμασίες διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας κύτταρα RWPE-1 παροδικά επιμολυσμένα με miRNA-182-5p πρόδρομο. Παρατηρήσαμε σημαντικά αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχ. 2-C) και τη μετανάστευση (Σχ. 2-Α) στον miRNA 182-5p επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με miR-NC επιμολυσμένων κυττάρων.

Επίδραση του microRNA-182- 5P γκρεμίσουμε στη βιωσιμότητα των κυττάρων, την εισβολή και τη μετανάστευση σε κυτταρικές σειρές PC

Χρησιμοποιήσαμε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη δύο (PC-3 και DU145) με υψηλή έκφραση του miR-182-5p για περαιτέρω πειράματα δεδομένου ότι το miR-182 -5p έκφραση ήταν σημαντικά υψηλότερη σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές. Στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση του αναστολέα-NC ή miR-182-5p αναστολέα σε κύτταρα PC-3 και DU145, το miR-182-5p knock-down επαληθεύτηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR (0.003, 0.034, αντιστοίχως) (Σχ . 3-Α). Η βιωσιμότητα των κυττάρων (MTS δοκιμασία), δοκιμασίες μετανάστευσης και εισβολής διεξήχθησαν (Σχ. 3-Β, 3-C, 3-D) και παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχ. 3-Β), εισβολή (Σχ. 3 -C) και τη μετανάστευση (Σχ. 3-D) σε miRNA-182-5p knockdown PC-3 και DU-145 κύτταρα σε σύγκριση με αναστολέα-NC επιμολυσμένων κυττάρων.

Δύο καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές (PC-3 και DU145) διαμολύνθηκαν παροδικά είτε με αναστολέα miR-182-5p ή miR-αρνητικό έλεγχο (mIR-NC-αναστολέα). A. Σχετική miR-182-5p έκφρασης (αναστολέας miR-NC ή αναστολέα επιμολυσμένα κύτταρα PC miR-182-5p), Β δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας (αναστολέας miR-NC ή miR-182-5p αναστολέας επιμολυσμένα κύτταρα PC), Γ δοκιμασία εισβολή, D. Οι επουλωτικές των πληγών δοκιμασίας (24 ώρες). Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± Τ.Α. (Τυπική απόκλιση).

Η

miR-182-5p άμεσα ρυθμίζει FOXF2, RECK και MTSS1

Έχουμε εντοπίσει τρεις ογκοκατασταλτικά γονίδια (

FOXF2

,

RECK, MTSS1

) ως πιθανοί γονιδίων στόχων για miR-182-5p βασίζεται σε τρεις αλγόριθμοι (miRDB, TargetScan, microRNA.org).

FOXF2 mRNA έχει δύο πιθανές θέσεις πρόσδεσης για το miR-182-5p μέσα σε 3 ‘UTR του (Σχ. 4-Α). Η σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης εμφανίζεται ως μια αναλογία δραστικότητας λουσιφεράσης πυγολαμπίδας και Renilla για κάθε δείγμα. Μεταξύ των δύο θέσεων, η σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης μειώθηκε σημαντικά στη θέση 670 σε miR-182-5p πρόδρομος επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 4-Β). RECK mRNA έχει ένα δυναμικό χώρο πρόσδεσης (θέση 812) για miR-182-5p μέσα σε 3 ‘UTR (Σχ. 4-Α) του. Η σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης μειώθηκε σημαντικά όταν το κατασκεύασμα θέση 812 χρησιμοποιήθηκε σε miR-182-5p πρόδρομος επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 4-Β). MTSS1 mRNA έχει τέσσερις πιθανές θέσεις πρόσδεσης για miR-182-5p εντός 3’UTR της και η σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης μειώθηκε σημαντικά στην θέση 1909 σε miR-182-5p πρόδρομος επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 4-Β). Με μεταλλαγμένο πλασμίδια (εμφανίζονται ως «Μ»), δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην δραστικότητα λουσιφεράσης μεταξύ των ελέγχων και miR-182-5p πρόδρομος μορφομετατροπείς (Σχ. 4-Β). Από την έκφραση της πρωτεΐνης του γονιδίου-στόχου είναι χαμηλή σε PC-3 και DU145, πραγματοποιήσαμε ανάλυση Western να τηρούν τυχόν αλλαγές στην έκφραση της πρωτεΐνης με αναστολέα miR-182-5p. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4-C, η έκφραση της πρωτεΐνης των γονιδίων στόχων ήταν σημαντικά αυξημένη μετά αναστολέα miR-182-5p διαμόλυνση (Εικ. 4-C). Το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει ότι τα mRNAs FOXF2, RECK και MTSS1 είναι άμεσοι στόχοι του miR-182-5p.

Α. FOXF2, RECK και MTSS1 3’ΙΙΤΡ θέσης και συμπληρωματικές miR-182-5p ακολουθία. Β 3’ΙΙΤΡ λουσιφεράσης δοκιμασία (miR-NC και miR-182-5p πρόδρομος), ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± Τ.Α. (τυπική απόκλιση). C. Πρωτεΐνη έκφραση FOXF2, RECK, MTSS1, ΜΜΡ-2 και β-τουμπουλίνης σε αναστολέα miR-NC ή miR-182-5p αναστολέα επιμολυσμένα κύτταρα καρκίνου του προστάτη (PC-3, DU145).

Η

Επιβεβαιώσαμε επίσης ενεργό έκφραση της πρωτεΐνης ΜΜΡ-2, δεδομένου ότι είναι ένας καθοδικός τελεστής του RECK. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4-C, η έκφραση της πρωτεΐνης που διασπάται ΜΜΡ-2 (ενεργός τύπος) μειώθηκε σημαντικά σε miR 182-5p αναστολέα επιμολυσμένων κυττάρων.

miR-182-5p επίδραση αναστολέα επί της ανάπτυξης όγκου σε ένα in vivo γυμνό μοντέλο ποντικού

για να τηρηθεί miR-182-5p αναστολέας επιδράσεις στην ανάπτυξη του όγκου σε γυμνά ποντίκια, χρησιμοποιήσαμε ένα σύστημα που βασίζεται λεντοϊού και καθιέρωσε σταθερές χαμηλές miR-182-5p εκφράζουν PC-3 κύτταρα και τους ελέγχους (Σχ. 5-Α). Χρησιμοποιήσαμε 8 ποντίκια (4 ποντίκια? Σταθερό χαμηλό miR-182-5p, 4 ποντικοί? Έλεγχος) και παρατήρησε ότι σταθερό χαμηλό miR-182-5p κυτταρικές σειρές που εκφράζουν είχε μειώσει σημαντικά τον όγκο του όγκου σε γυμνούς ποντικούς σε σύγκριση με τους ελέγχους (Σχ 5-. ΣΙ). Από τη στιγμή που δεν μπορούσαν να ανιχνεύσουν όγκου σε έναν από τους χαμηλής miR-182-5p ομάδες έκφραση, αποκλείστηκε από το πείραμα. Μετρήσαμε τα επίπεδα microRNA σε όγκους ξενομοσχεύματος (MIR-182-5p-αναστολέα και αναστολέα-NC), και βρήκαν ότι miR-182-5p έκφραση ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε miR-182 ξενομοσχεύματα αναστολέα σε σύγκριση με εκείνη του αναστολέα-NC ξενομοσχεύματα (Σχ. 5-Β). Τα τυπικά ακαθάριστα εικόνες εμφάνιση όγκων φαίνεται στο Σχ. 5-C. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5-D, πρωτεΐνη έκφραση των τριών γονιδίων στόχων (FOXF2, RECK, MTSS1) ήταν σημαντικά υψηλότερο σε σταθερό χαμηλό miR-182-5p εκφράζουν ιστούς όγκων ξενομοσχεύματος.

A. Χρόνο ρεκόρ του μεγέθους του όγκου σε miR-NC και ξενομοσχευμάτων αναστολέας miR-182-5p. B. Σχετική miR-182-5p έκφραση κατά την έγχυση των κυττάρων και τη συγκομιδή των ξενομοσχευμάτων. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± Τ.Α. (τυπική απόκλιση). MiR-182-5p έκφραση ήταν σημαντικά χαμηλότερη στην ομάδα του αναστολέα miR-182-5p. Γ Τυπικά ακαθάριστα εμφάνιση του γυμνού όγκους ποντικών στον έλεγχο και miR-182-5p ομάδες αναστολέα. Δ Έκφραση FOXF2, RECK και MTSS1 πρωτεΐνης σε ξενομοσχεύματα όγκου.

Η

Επίδραση της υπερ-έκφραση της RECK και MTSS1 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη (PC-3 και DU 145) λειτουργία

Για να εξεταστεί η λειτουργία του RECK και MTSS1, υπερεκφράσαμε RECK και MTSS1 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη τα οποία επιβεβαιώθηκαν με μέτρηση mRNA (εικ. 6-Α) και τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης (Εικ. 6-Β). Στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε αρκετές λειτουργικές αναλύσεις. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6, η βιωσιμότητα των κυττάρων (Σχ. 6-C), εισβολή (Εικ. 6-D) και της μετανάστευσης (Εικ. 6-Ε) ήταν σημαντικά αναστέλλεται RECK και MTSS1 επιμολυσμένα κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

σε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση είτε pCMV6-άδειο, pCMV6-RECK ή pCMV6-MTSS1 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη (PC-3 και DU 145), τα επίπεδα έκφρασης RECK και MTSS1 ελέγχθηκε από το πραγματικό χρόνο RT-PCR (Α) και στη Δυτική (Β) ανάλυση προσδιορισμού C. Κυτταρική βιωσιμότητα, δοκιμασία D. Invasion, Ε επούλωσης της πληγής δοκιμασία, ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± SD (Τυπική απόκλιση).

Η

Επίδραση της FOXF2 siRNA νοκ ντάουν στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την εισβολή και τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη

Μετά FOXF2 siRNA γκρεμίζω (Εικ. 7-Α), υπάρχει ήταν καμία διαφορά στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μεταξύ si-NC και SI-FOXF2 επιμολυσμένα κύτταρα PC (Σχ. 7-Β). Ωστόσο κύτταρο εισβολή και την επούλωση τραυμάτων ήταν σημαντικά αυξημένη σε σι-FOXF2 επιμολυσμένα κύτταρα PC (Σχ. 7-C, Σχ. 7-D).

A. έκφραση FOXF2 πρωτεΐνη (si-NC ή si-FOXF2 επιμολυσμένα κύτταρα PC). Β δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας (si-NC ή si-FOXF2 επιμολυσμένα κύτταρα PC). C. Εισβολή δοκιμασία, D. Οι επουλωτικές των πληγών δοκιμασίας (8 ώρες), ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± Τ.Α. (Τυπική απόκλιση).

Η

Συζήτηση

Αρκετές microRNAs έχουν ταυτοποιηθεί ως ογκογόνος σε καρκίνο προστάτη με βάση την αυξημένη έκφραση τους σε ιστούς καρκίνου του προστάτη ή του καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές [10], [ ,,,0],11] – [14]. Οι Λειτουργικές αναλύσεις έχουν διεξαχθεί με μερικούς από αυτούς ογκογόνο microRNAs. Για παράδειγμα, miR-21 έχει αναφερθεί για την προώθηση εισβολή και την αντίσταση απόπτωσης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη [15], [16] και miR-125b προωθείται αύξηση των όγκων του καρκίνου του προστάτη ξενομοσχεύματος με τη στόχευση προ-αποπτωτικών γονιδίων [14]. MiR-373 και miR-520c έχουν επίσης αναφερθεί για την προώθηση εισβολή και μετάσταση όγκου στον καρκίνο του προστάτη [12].

Μία έκθεση έδειξε ότι miR-182 είναι ένας καταστολέας όγκων σε ένα καρκίνο του πνεύμονα κυτταρική γραμμή [17 ], ενώ miR-182-5p έχει αναφερθεί να είναι ένα ογκογονίδιο σε αρκετούς καρκίνους [18] – [23]. Segura et al ανέφεραν ότι παρεκκλίνουσα miR-182-5p έκφραση προωθείται μελανώματος μετάσταση [18]. Liu et al βρήκαν ότι miR-182-5p υπερέκφραση αυξημένη μετατροπή του όγκου και εισβολή όγκου

in vitro

και ενισχυμένη μετάσταση

in vivo

στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [21]. Ως εκ τούτου, μόνο δύο εκθέσεις έχουν δείξει ότι το miR-182-5p είναι ένα ογκογονίδιο με βάση την λειτουργική ανάλυση σε μελάνωμα και τον καρκίνο των ωοθηκών [18], [21].

Παρόμοια με τα αποτελέσματά μας, δύο άλλες μελέτες διαπιστώθηκε miR-182 -5p έκφραση να είναι σημαντικά υψηλότερη σε προστάτη καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς προστάτη [10], [22], ωστόσο δεν εκτελούν λειτουργική ανάλυση. Στη μελέτη μας, παρατηρήσαμε ότι miR-182-5p έκφραση ήταν σημαντικά υψηλότερη σε προστάτη καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη και κυτταρικές γραμμές. Είναι ενδιαφέρον βρήκαμε ότι υψηλά miR-182-5p έκφραση συσχετίστηκε με μικρότερη συνολική επιβίωση μετά από ριζική προστατεκτομή σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη. Έτσι, την επόμενη στόχος μας ήταν να διευκρινίσει κατά πόσον λειτουργίες miR-182-5p ως ογκογονίδιο στον καρκίνο του προστάτη. Για να απαντηθεί αυτό το ερώτημα, μπορούμε αρχικά επιμολυσμένα miR-182-5p σε ένα φυσιολογικό κύτταρο του προστάτη γραμμή (RWPE-1) και παρατήρησε ότι το miR-182 αύξησε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την επούλωση πληγών ικανότητα. Μπορούμε επίσης να εκτελεστεί

in vitro

λειτουργικές αναλύσεις με τη χρήση ενός αναστολέα miR-182-5p στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Από miR-182-5p έκφραση ήταν υψηλότερη σε όλες τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη τρία (LNCaP, PC-3, DU145) σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα επιθηλιακά προστάτη, χρησιμοποιήθηκαν οι δύο υψηλότερες κυτταρικές σειρές miR-182-5p εκφράζουν (PC-3 και DU145) για τη λειτουργική νοκ ντάουν αναλύσεις. Όπως αναμενόταν, miR-182-5p knockdown μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη μετανάστευση και εισβολή σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές. Όπως έχει προηγουμένως αναφερθεί ότι miR-182-5p υπερέκφραση προωθείται μετάσταση μελανώματος και ήταν ογκογόνο χαρακτήρα, τα αποτελέσματά μας δείχνουν επίσης ότι miR-182-5p μπορεί να είναι ένα ογκογονίδιο στον καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές.

επόμενο μας στόχος ήταν να προσδιοριστούν τα γονίδια-στόχους του miR-182-5p αφού microRNAs ασκούν τη δράση τους με τη ρύθμιση της έκφρασης άλλων γονιδίων στόχων. Χρησιμοποιήσαμε αρκετές αλγόριθμους (miRDB, microRNA.org, TargetScan) και εντόπισε τρία πιθανά γονίδια-στόχους (FOXF2, RECK, MTSS1). Όπως φαίνεται με δοκιμασία λουσιφεράσης 3’ΙΙΤΡ και αναλύσεις Western, τα τρία πιθανά γονίδια-στόχους (FOXF2, RECK, MTSS1) έκφραση ρυθμίζεται από miR-182-5p.

Από τα τρία γονίδια-στόχους (RECK, MTSS1, FOXF2), RECK υπερέκφραση αναφέρθηκε να μειώνει κυτταρική εισβολή με αναστολή MMPs, συμπεριλαμβανομένων των ΜΜΡ-2 [24]. έκφραση RECK έχει αναφερθεί ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω σε αρκετούς καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη [24]. Στη μελέτη μας, παρατηρήσαμε ότι ο αναστολέας miR-182 μειώθηκε δραστική ΜΜΡ-2-έκφραση σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, καθώς και προς τα πάνω ρύθμιση του RECK πρωτεΐνης. Επιπλέον διερευνήσαμε λειτουργία RECK πάνω από το εκφράζει σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη (PC-3 και DU 145). Όπως φαίνεται, RECK ανέστειλε τη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Rabien et al έδειξε ότι RECK υπερέκφραση μείωσε την επεμβατική δυναμικό της DU 145 κύτταρα [25] και τα αποτελέσματά τους είναι παρόμοια με τα δικά μας. Ωστόσο παρατηρήσαμε ότι RECK ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε δύο καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές (PC-3 και DU 145), ενώ Rabien et al βρήκαν καμία επίδραση της RECK στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε DU 145 κύτταρα. Ωστόσο RECK έχει αναφερθεί ότι μειώνουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε άλλους καρκίνους [26], [27]. Έτσι, οι επιπλέον πειράματα για να διασαφηνιστούν οι διαφορές αυτές. Μέχρι στιγμής miR-21 και miR-222 έχουν βρεθεί να στοχεύουν RECK στον καρκίνο του προστάτη και γαστρικού καρκίνου [28], [29], αλλά δεν έχουν υπάρξει αναφορές σχετικά με miR-182-5p και RECK. Ωστόσο τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι miR-182-5p ρυθμίζει άμεσα την έκφραση RECK σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη.

MTSS1 (μετάσταση καταστολέα-1 όγκου) αρχικά αναγνωρίστηκε ως ογκοκατασταλτικό γονίδιο στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης [30]. Πρόσφατα η λειτουργία του MTSS1 εξετάστηκε σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη και βρέθηκε να καταστέλλουν σημαντικά την κυτταρική μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό [31]. Επιπλέον miR-182 έχει αναφερθεί ότι μειορυθμίζουν MTSS1 και να προωθήσει τη μετάσταση του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος [32], ένα αποτέλεσμα πολύ παρόμοιο με το δικό μας.

FOXF2 έχει αναφερθεί να ρυθμίσει προς τα κάτω την ΜΜΡ-1 και ρυθμίζουν Timp3, ένας γνωστός αναστολέας των ΜΜΡ [33]. Επιπλέον FOXF2 μειώνει Wnt5a [34], η οποία ενεργεί μέσω μη κανονικών μονοπατιών σηματοδότησης Wnt να προωθήσουν την αγγειογένεση και την επιβίωση των κυττάρων. έκφραση Wnt5a σε προστάτη καρκινικούς ιστούς έχει συσχετισθεί με υψηλές βαθμολογίες Gleason και βιοχημικές υποτροπή του καρκίνου του προστάτη [35]. Knockdown και υπερέκφραση του Wnt5a σε καρκινικές κυτταρικές γραμμές ανθρώπινου προστάτη μειώνεται και διεγείρονται αντίστοιχα, δραστηριότητα εισβολή [35]. Επιπλέον Wnt5a επαγόμενη την έκφραση της μεταλλοπρωτεϊνάσης-1 (ΜΜΡ-1) στον καρκίνο του προστάτη [34], [35]. Στη μελέτη μας, FOXF2 γκρεμίζω αυξημένη εισβολή των κυττάρων και τη μετανάστευση σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη. Ετσι τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι ογκο-miR-182-5p μπορεί να εμπλέκεται στη ρύθμιση αυτών των γονιδίων εισβολής και μεταστατικό καταστολέα. Πρόσφατα miR-301 ορίστηκε ως ένα ογκογονίδιο και αναφέρθηκε ότι μεσολαβεί πολλαπλασιασμός μέσω ρύθμισης FOXF2 στον καρκίνο του μαστού [36]. Εκτός από την miR-301, υπάρχουν μελέτες έχουν δείξει άμεση ρύθμιση των FOXF2 από miRNA.

Ερευνήσαμε επίσης την πιθανή χρήση του αναστολέα miR-182-5p ως πιθανή θεραπεία PC. Για να επιτευχθεί αυτό, χρησιμοποιήσαμε ένα

in vivo

μοντέλο ξενομοσχεύματος γυμνού ποντικού με σταθερή χαμηλή miR-182-5p εκφράζουν καρκινικά κύτταρα του προστάτη για την παρούσα μελέτη. Ο όγκος του όγκου σε γυμνά ποντίκια μειώθηκε σημαντικά σε χαμηλές miR-182-5p εκφράζουν κυττάρων σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου. Επιπλέον, τα επίπεδα του FOXF2, RECK και MTSS1 ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ξενομόσχευμα ιστούς από χαμηλή miR-182-5p εκφράζουν καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι knockdown του miR-182-5p αυξημένη έκφραση αυτών των γονιδίων στόχων ογκοκατασταλτικά

in vitro

και

in vivo

. Από τη στιγμή που επικεντρώθηκε σε τρία γονίδια-στόχους (

RECK

,

MTSS1

και

FOXF2

) και διερευνήθηκαν μόνο 52 κλινικά δείγματα, συμπληρωματικές μελέτες θα χρειαστούν για τη διαλεύκανση του ρόλου του miR -182-5p στον καρκίνο του προστάτη και η χρήση της σε κλινικές εφαρμογές.

εν κατακλείδι αυτή είναι η πρώτη έκθεση που τεκμηριώνουν ότι η υπερ-έκφραση του miR-182-5p σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη και πιθανώς χρήσιμα ως προγνωστικός βιοδείκτη. Επιπλέον χτυπήσει κάτω του miR-182-5p με αναστολέα μπορεί να είναι θεραπευτικό όφελος για την ενίσχυση της έκφρασης των ογκοκατασταλτικών γονιδίων FOXF2, RECK και MTSS1 στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

φορμόλη-σταθερό, έχει εμπεδωθεί με παραφίνη δείγματα καρκίνου (FFPE) του προστάτη ελήφθησαν από τους Σαν Φρανσίσκο Υποθέσεων Βετεράνων (VA) Ιατρικό Κέντρο. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς και η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή UCSF για τα Ανθρώπινα Ερευνών (αριθμός έγκρισης: H9058-35751-01).

Ζώα

Όλα φροντίδα των ζώων ήταν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές του Σαν Φρανσίσκο Ιατρικό Κέντρο Βετεράνων Υποθέσεων και τη μελέτη εγκρίθηκε από το Σαν Φρανσίσκο VA IACUC (αριθμός πρωτοκόλλου: 08-003-01). χρήστες ζώων έχουν ολοκληρώσει προγράμματα κατάρτισης για να χειριστεί και να συνεργαστεί με τα ποντίκια μέσω AALAS (Αμερικανική Ένωση για Εργαστήριο Επιστήμης Ζωικής Παραγωγής) πριν από τα πειράματα σε ζώα. Ένα σύνολο 8 γυμνών ποντικών (στέλεχος BALB /c ηυ /ηυ? Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκαν και αρχικά καρκίνου του προστάτη κύτταρα υποδορίως και το μέγεθος του όγκου παρακολουθήθηκε όπως αναφέρθηκε στη σελίδα 7. Μετά την ανάπτυξη του όγκου , τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με μία υπερβολική δόση ισοφλουράνης με εισπνοή. Στη συνέχεια ξενομόσχευμα ιστός αφαιρέθηκε.

Κλινικά δείγματα

Ένα σύνολο από 52 ασθενείς με παθολογικά επιβεβαίωσε τον καρκίνο του προστάτη είχαν εγγραφεί στη μελέτη αυτή (Veterans Affairs Medical Center στο Σαν Φρανσίσκο). Τα δείγματα ελήφθησαν από ασθενείς μετά από έγγραφη συγκατάθεση. Λεπτομερείς πληροφορίες για τον ασθενή φαίνεται στον Πίνακα 1.

Η

Κυτταρική καλλιέργεια

κύτταρα Κανονική προστάτη επιθηλιακά (RWPE-1? ATCC αριθμό-CRL-11609) και τον καρκίνο του προστάτη κυτταρικές σειρές (LNCaP? ATCC αριθμός-CRL-1740, PC-3? ATCC αριθμός-CRL-1435, DU145? ATCC αριθμός-ΗΤΒ-81) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Οι κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό. κύτταρα RWPE-1 καλλιεργήθηκαν σε κερατινοκυττάρων-SFM (GIBCO /Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Όταν αγοραστεί, μόνιμη αποθέματα των κυττάρων παρασκευάστηκαν και όλα τα κύτταρα αποθηκεύτηκαν στους -80 βαθμός μέχρι τη χρήση. Τα κύτταρα που χρησιμοποιούνται για πειράματα εντός 6 μηνών.

Το συνολικό RNA και πρωτεϊνών εξόρυξη

RNA (microRNA και το συνολικό RNA) εξήχθη από φορμόλη σταθερό, έχει εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη ( n = 52) και συμφωνημένα παρακείμενες μη-καρκινικές φυσιολογικούς ιστούς προστάτη (n = 43) ή υπερπλασία καλοήθους προστάτη (ΒΡΗ) (n = 9) χρησιμοποιώντας ένα κιτ miRNeasy FFPE (Qiagen) μετά τη σύλληψη λέιζερ μικρο-ανατομή βασίζεται σε παθολόγο κριτικές. RNA (microRNA και το συνολικό RNA) εκχυλίστηκε επίσης από ανθρώπινες κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας ένα κιτ miRNeasy mini (QIAGEN) και εκχυλίζεται από ξενομοσχεύματος ιστοί ομογενοποιούνται σε 1 ml αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA) και στη συνέχεια καθαρίζεται με στήλες RNeasy (Qiagen). Για να αφομοιώσουν το DNA, χρησιμοποιήθηκε ένα κιτ Qiagen RNase-Free DNase. Τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Pierce, Brebieres, Γαλλία) που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης (Sigma, St. Louis, ΜΟ). Η πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από ιστούς ξενομοσχεύματος χρησιμοποιώντας Αντιδραστήριο Tissue Protein Extraction (Τ-PER) (Thermo Scientific, Rockford, IL). Πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση έγινε χρησιμοποιώντας ένα κιτ προσδιορισμού πρωτεΐνης BCA (Pierce, Brebieres, Γαλλία).

microRNA και αναστολέα microRNA επιμόλυνση

Anti-miR ™ miRNA αναστολέα [αρνητικού ελέγχου (miR-NC αναστολέα) ή αναστολέα miR-182-5p (αναστολέας miR-182-5p), Ambion] επιμολύνθηκαν παροδικά σε καρκινικά κύτταρα με siPORT NeoFX Μορφομετατροπή Agent (Ambion) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. -MiR Pre προδρόμων ™ miRNA [αρνητικό έλεγχο (MIR-NC) ή HSA-miR-182-5p (MIR-182-5p), Ambion] επιμολύνθηκαν σε κύτταρα με Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

η βιωσιμότητα των κυττάρων, κυτταρική εισβολή και την επούλωση των πληγών δοκιμασία

η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε 3 ημέρες μετά την επιμόλυνση (αναστολέας miR-NC /miR-182-5p αναστολέα της επιμόλυνσης) με MTS (CellTiter 96 Υδατικό One Λύση κυττάρων Δοκιμασία διάδοση, Promega). Τα δεδομένα είναι η μέση τιμή ± S.D. 3 ανεξαρτήτων πειραμάτων. προσδιορισμοί κυττάρων εισβολή πραγματοποιήθηκαν με το κιτ προσδιορισμό κυτταρικής εισβολής CytoSelect 24 φρεατίων (Cell BioLab, San Diego, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα επιμολυσμένα κύτταρα (αναστολέας miR-NC /miR-182-5p αναστολέα μορφομετατροπέα-48 ώρες) επαναιωρήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας χωρίς FBS και τοποθετήθηκαν στον ανώτερο θάλαμο εις τριπλούν. Μετά από 48 ώρες επώασης στους 37 ° C (5% CO2), τα κύτταρα μεταναστεύουν μέσω της μεμβράνης βάφτηκαν. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως εισβάλει κύτταρα ποσοτικοποιούνται σε OD 560 nm. Οι επουλωτικές των πληγών δοκιμασία πραγματοποιήθηκε με το CytoSelect 24 φρεατίων επούλωσης τραυμάτων κιτ δοκιμασίας σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για να δημιουργηθεί ένα πεδίο πληγή, επιμολυσμένα κύτταρα (αναστολέας miR-NC ή miR-182-5p αναστολέα μορφομετατροπέα-48 ώρα επιμόλυνση) καλλιεργήθηκαν μέχρι να σχηματιστεί μια μονοστοιβάδα γύρω από το ένθετο. Μετά την απομάκρυνση του ενθέτου, ένα πεδίο ανοιχτό τραύμα 0,9 πιπί που παράγονται και τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν από κάθε πλευρά του κενού. Το κλείσιμο της πληγής παρακολουθείται και το ποσοστό κλεισίματος μετρήθηκε. [Ποσοστό κλεισίματος Ποσοστό (%) = εμβαδόν μετανάστευσαν κυτταρικής επιφάνειας /συνολικής επιφάνειας x100)].

ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR

ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν με ένα Applied Biosystems Prism 7500 Fast Σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας, χρησιμοποιώντας TaqMan καθολικής PCR μάστερ μιξ σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). Οι ανιχνευτές και εκκινητές TaqMan αγοράστηκαν από την Applied Biosystems. RNU48 χρησιμοποιήθηκε σαν ενδογενής έλεγχος. Τα επίπεδα έκφρασης του RNA προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το 7500 γρήγορο σύστημα SDS έκδοση λογισμικού 1.3.1 (Applied Biosystems).

ανάλυση Western

συνολικής κυτταρικής πρωτεΐνης (15-20 μg) χρησιμοποιήθηκε για κηλίδωση Western . Τα δείγματα αναλύθηκαν σε 4-20% Precise Gels Πρωτεΐνη (Pierce, Brebieres, Γαλλία) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Amersham Biosciences, Fairfield, CT). Οι μεμβράνες εμβαπτίζονται σε 0,3% αποβουτυρωμένο γάλα σε TBS που περιέχει 0.1% Tween 20 για 1 ώρα και ανιχνεύθηκαν με πρωτογενές πολυκλωνικό και μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι FOXF2 (# ab23306, Abcam, Cambridge, ΜΑ), RECK (# 3433, Cell Signaling Technology), MTSS1 (# 4385, Cell Signaling Technology), ΜΜΡ-2 (# 4022, Cell Signaling Technology) και βήτα-τουμπουλίνης (# 2128, Cell Technology σηματοδότηση) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Οι κηλίδες πλύθηκαν σε TBS που περιέχει 0.1% Tween20 και σημάνθηκαν με υπεροξειδάση (HRP) δευτερεύον (Technology Cell Signaling, Beverly, ΜΑ) αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού αντίσωμα. Οι πρωτεΐνες ενισχύεται με χημειοφωταύγεια (Amersham ECL συν το σύστημα Western Blotting ανίχνευσης, Fairfield, CT) για οπτικοποίηση. Τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης εκφράστηκαν σε σχέση με το β-τουμπουλίνης επίπεδα.

κατασκευή πλασμιδίου και ανάλυσης 3’UTR-λουσιφεράσης

Εμείς κατασκευαστεί μεμονωμένα πλασμίδια για κάθε θέση πρόσδεσης στην 3’UTR του mRNA από πιθανών γονιδίων στόχων με βάση τις πληροφορίες microRNA.org. Στη συνέχεια, επιβεβαίωσε miR-182-5p δέσμευση στην 3’UTR του mRNA του γονιδίου-στόχου με τη δοκιμασία λουσιφεράσης με miR-182-5p πρόδρομο. PmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target φορέας έκφρασης χρησιμοποιείται για την εκτέλεση ανάλυσης 3’UTR λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI, USA). Οι αλληλουχίες εναρκτήρα που χρησιμοποιούνται για το πλασμίδιο ένθετα φαίνονται στον Πίνακα 2. Σε ένα συνολικό όγκο 20 μΐ, 5 μΐ έκαστο 100 μΜ πρόσθιου εκκινητή και αντίστροφο εκκινητή, 2 μΐ 10Χ ρυθμιστικού ανόπτησης (100 mM Tris-HCl, ρΗ 7.5, 1 Μ NaCl, 10 mM EDTA) και 8 μΙ ύδατος προστέθηκαν σε 200 μΙ PCR σωληνάριο και επωάζονται στους 95 ° C για 5 λεπτά και στη συνέχεια τοποθετήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Τα ολιγονουκλεοτίδια συνδέθηκαν εντός του

Pme

I-

Xba Ι θέση

της Έκφρασης pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target φορέα. Αποικία άμεση PCR εκτελέστηκε για αναγνώριση ενθέτου χρησιμοποιώντας REDTaq (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για PCR είχαν ως εξής: εμπρόσθιος εναρκτήρας, 5′-cgtgctggaacacggtaaaa-3 ‘? αντίστροφο εκκινητή, 5’-gcagccaactcagcttcctt-3 ‘. παράμετροι της PCR για το ποδήλατο ήταν ως ακολούθως: 94 ° C για 3 λεπτά, 30 κύκλοι PCR στους 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 55 ° C για 30 δευτερόλεπτα και 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 72 ° C για 10 λεπτά και 4 ° C για 10 λεπτά. Το PCR προϊόν υπέστη πέψη με NotI (Takara /Fisher Scientific, Pittsburgh, ΡΑ, USA). Τα μεγέθη των φορέων που περιέχουν ένθετα ήταν περίπου 200 bp και 100 bp με ηλεκτροφόρηση, δεδομένου ότι η αλληλουχία αναγνώρισης NotI ενσωματώθηκε εκκινητών.

Η

Για miR-182-5p πρόδρομος επιμόλυνση, κύτταρα καρκίνου του προστάτη ήταν συν- επιμολυσμένα με miR-NC και pmirGLO ή miR-182-5p και pmirGLO Dual-Luciferase miRNA στόχος φορέων έκφρασης χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Η δραστικότητα λουσιφεράσης αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το Σύστημα Dual-Luciferase® Reporter Assay (Promega) (48 ώρες μετά την επιμόλυνση).

Καθιέρωση σταθερό χαμηλό miR-182-5p εκφράζουν καρκινικών κυττάρων του προστάτη και επίδραση στο

in vivo

ανάπτυξη του όγκου

για να τηρηθεί η

in vivo

επίδραση του αναστολέα miR-182-5p σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη, έχουμε καθιερώσει σταθερές χαμηλές miR-182-5p έκφραση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη γραμμές με βάση την lenti-ιικό σύστημα. Στη συνέχεια χρησιμοποίησε ένα

in vivo

μοντέλο ξενομοσχεύματος γυμνού ποντικού. Lentivirus διαμόλυνση διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα Lenti-Pac HIV Kit Έκφραση συσκευασία (κατάλογος #? ΗΡΚ-LvTR-20, GeneCopoeia, Rockville, MD, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Δηλαδή HSA-miR-182-5p φορέα αναστολέα (κατάλογος #? HmiR-AN0239-AM03, GeneCopoeia, Rockville, MD) ή ένας αναστολέας miRNA κωδικοποιημένο κλώνο ελέγχου pEZX-AM03 (κατάλογος #? CmiR-AN0001-AM03, GeneCopoeia, Rockville, MD) με Lenti-Pac mix HIV επιμολύνθηκαν σε 293 κύτταρα Ta (GeneCopoeia) και επωάστηκαν για 14 ώρες στους 37 °. Το μέσο στη συνέχεια αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει 1/500 όγκο του αντιδραστηρίου TiterBoost. Μετά από 48 ώρες επώασης στους 37 °, το υπερκείμενο που περιέχει σωματίδια φακοϊική υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση σε 500 χ g για 10 λεπτά, διηθείται χρησιμοποιώντας φίλτρο 0.45 μm PES (Whatman /Fisher Scientific) και συλλέγονται σε αποστειρωμένους σωλήνες. κύτταρα PC-3 μολύνθηκαν με λεντοϊού σωματίδια χρησιμοποιώντας Polybrene (8 μg /ml) (Sigma-Aldrich). Ένα

σ

-τιμή του & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε τον Δρ Ρότζερ Erickson για την υποστήριξη και τη βοήθειά του με την προετοιμασία του χειρογράφου. .