Αφηρημένο

Η προεγχειρητική διάγνωση των νεοπλασμάτων των ωοθηκών βασίζονται στην απεικόνιση υπερήχων και το CA125 βιοδεικτών του ορού και HE4. Ωστόσο, αυτοί οι δείκτες μπορεί να είναι αυξημένα σε μη νεοπλασματικά συνθήκες και μπορεί να αποτύχει να προσδιορίσει τα πλέον μη ορώδες επιθηλιακών υποτύπους καρκίνου. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει histotype ειδικών βιοδεικτών ορού για βλεννώδες καρκίνο των ωοθηκών. Τα υποψήφια γονίδια με βλεννώδες histotype προφίλ ειδική έκφραση ταυτοποιήθηκαν από τις δημόσια διαθέσιμες βάσεις δεδομένων γονιδιακής έκφρασης και την περαιτέρω στην εξόρυξη δεδομένων silico πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων MediSapiens. επικύρωση υποψήφια βιοδεικτών έγινε χρησιμοποιώντας qRT-PCR, κηλίδωση Western και η ανοσοϊστοχημική χρώση των μικροσυστοιχιών ιστού όγκου. Το επίπεδο έκφρασης του υποψήφιου γονιδίου σε ορό σε σύγκριση με το CA125 στον ορό και των επιπέδων HE4 σε έναν ασθενή από κοόρτη προοπτικά συλλέγονται προχωρημένο καρκίνο των ωοθηκών. αναζητήσεις βάσης δεδομένων που προσδιορίζονται REG4 ως πιθανό βιοδείκτη με ειδικότητα για το βλεννώδες υπότυπο καρκίνου των ωοθηκών. Η συγκεκριμένη έκφραση μέσα επιθηλιακών όγκων των ωοθηκών επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με ανάλυση mRNA. Ανοσοϊστοχημική χρώση των συστοιχιών ιστού ωοθηκών όγκου έδειξε χαρακτηριστική κυτταροπλασματική πρότυπο έκφρασης μόνο σε βλεννώδες καρκίνωμα και πρότεινε διαφορική έκφραση μεταξύ καλοήθων και κακοήθων νεοπλασμάτων βλεννώδες. Τέλος, μία δοκιμασία βιοδείκτης ορό ELISA με βάση επιδείξει αυξημένο έκφραση μόνο σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών βλεννώδη. Αυτή η μελέτη προσδιορίζει REG4 ως πιθανό βιοδείκτη ορού για histotype-ειδική ανίχνευση του καρκίνου των ωοθηκών βλεννώδες και προτείνει μέτρηση REG4 ορού ως μη επεμβατικό διαγνωστικό εργαλείο για μετεγχειρητική παρακολούθηση των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών βλεννώδες

Citation.: Lehtinen L, Vesterkvist P, Roering P, Korpela Τ, Hattara L, Kaipio K, et al. (2016) REG4 εκφράζεται έντονα στο βλεννώδες Καρκίνος των ωοθηκών: μια πιθανή νέα Ορός βιοδεικτών. PLoS ONE 11 (3): e0151590. doi: 10.1371 /journal.pone.0151590

Επιμέλεια: Kwong-Kwok Wong, Το Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Cancer Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 19 του Νοέμβρη, 2015? Δεκτές: 1 Μάρ του 2016? Δημοσιεύθηκε: 16 Μαρ 2016

Copyright: © 2016 Lehtinen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από την Sigrid Ίδρυμα Juselius, https://www.sigridjuselius.fi/foundation, με LL, ΤΚ, ΚΚ? Φινλανδική Αντικαρκινική Εταιρεία, https://www.cancersociety.fi/grants/, με LL, PR, ΤΚ, ΚΚ? Turku University Hospital Research Fund, https://www.vsshp.fi/en/toimipaikat/tyks/Pages/default.aspx, με LL, PR, ΚΚ? Ευρωπαϊκό Ταμείο Περιφερειακής Ανάπτυξης (A31859), https://ec.europa.eu/regional_policy/EN/funding/erdf/, με LL, PR, KK, PV, LH, ΚΙ, HS, OC. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή καρκίνο των ωοθηκών

τα επιθηλιακά (ΕΓΚ) είναι η πιο θανατηφόρος γυναικολογικός καρκίνος [1]. Παρά το γεγονός ότι νέες μέθοδοι θεραπείας παρέτεινε την επιβίωση κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών, η συνολική πρόγνωση δεν έχει βελτιωθεί [2,3]. Τα συμπτώματα, όπως κοιλιακός πόνος, αυξημένη κοιλιακή μέγεθος, φούσκωμα ή ναυτία, είναι συχνά μη-ειδική μέχρι αργά την εξέλιξη της νόσου, που οδηγεί σε καθυστερημένη διάγνωση. Οι περισσότεροι ασθενείς που διαγνώστηκαν σε προχωρημένο στάδιο και αντιμετωπίζεται με χειρουργική επέμβαση σε συνδυασμό με πλατίνα-ταξάνιο χημειοθεραπεία. EOC αποτελείται από έξι κύρια ιστολογικών υποτύπων (histotypes)? χαμηλού βαθμού ορώδες καρκίνωμα (LGSC), υψηλής ποιότητας ορώδες καρκίνωμα (HGSC), σαφές καρκίνωμα (CC), ενδομητριοειδές καρκίνωμα (ΕΚ), βλεννώδες καρκίνωμα (MC) και καρκίνωμα μεταβατικών κυττάρων (TC) με διακριτές γενετικές προφίλ, βιολογική συμπεριφορά και το αποτέλεσμα.

Η διάγνωση του καρκίνου των ωοθηκών βασίζεται σε κλινικά χαρακτηριστικά, απεικόνιση με υπερήχους και Καρκίνος βιοδεικτών του ορού αντιγόνο 125 (CA125). Επιπλέον, τα νέα βιοδεικτών του ορού Ανθρώπινα επιδιδυμίδα 4 (HE4) μπορεί να φέρει πρόσθετες πληροφορίες διαφορική διάγνωση των γυναικών με πυελική μάζα [4]. Αυτές οι βιοδείκτες, ωστόσο, δεν είναι απολύτως αξιόπιστα για τη διάγνωση μη ορώδες histotypes. Οι τιμές CA125 έχει αποδειχθεί ότι είναι μικρότερη για τους ασθενείς με MC σε σύγκριση με ασθενείς με SC [5,6]. Δεδομένου ότι η διάγνωση δεν μπορεί να βασίζεται στις τρέχουσες βιοδείκτες ορό, στις περισσότερες περιπτώσεις η σωστή διάγνωση αποκαλύπτεται μόνο μετά τη χειρουργική επέμβαση. Σε παγκόσμιο επίπεδο, βλεννώδες καρκίνωμα αντιπροσωπεύουν ~ 11% του ΕΓΚ [7]. Αν και η πρόγνωση είναι συνήθως ευνοϊκή, σε ορισμένες περιπτώσεις καρκινώματα επαναληφθεί και την πρόοδο επιθετικά [8,9]. Περαιτέρω, βλεννώδες όγκοι των ωοθηκών έχει αποδειχθεί ότι έχουν χαμηλότερο ποσοστό ανταπόκρισης στην πλατίνα χημειοθεραπεία με βάση σε σύγκριση με HGSC [5,6]. Ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών δείχνει ότι διαφορετικές histotypes καρκίνο των ωοθηκών θα πρέπει να θεωρούνται ως ξεχωριστές ασθένειες και ως εκ τούτου απαιτούν διαφορετική μεταχείριση [10]. Μη επεμβατικές διαγνωστικές μέθοδοι, όπως εξετάσεις ορού histotype διαφοροποίηση, θα μπορούσε να είναι πολύτιμα για τη βελτιστοποίηση της θεραπευτικής στρατηγικής πριν από τη χειρουργική επέμβαση.

Αυτή η μελέτη αποσκοπεί στην αναγνώριση των βλεννωδών histotype ειδικών βιοδεικτών του ορού για τον καρκίνο των ωοθηκών. Βασισμένο σε

in silico

αναλύσεις, μελετήσαμε την έκφραση της Αναγέννησης Νησίδα-πρωτεϊνών που προέρχονται IV (REG4) σε ένα σύνολο βλεννωδών ιστών καρκίνου των ωοθηκών, ορούς ασθενών και υγρά ασκίτη. Επιπλέον, η συγκέντρωση REG4 μετρήθηκε σε χρόνο σειρά δειγμάτων ορού για τον προσδιορισμό της αντιστοιχίας του φορτίου του όγκου. Επιπλέον, εξετάσαμε CA125, HE4 και REG4 στα ίδια δείγματα για να συγκρίνουν τις επιδόσεις τους.

Υλικά και Μέθοδοι

Στο silico

εξόρυξη δεδομένων

Η βάση δεδομένων MediSapiens (www.medisapiens.com) εφαρμόστηκε για τη μελέτη των επιπέδων έκφρασης γονιδίου σε όλους τους φυσιολογικούς και νεοπλασματικούς ανθρώπινους ιστούς [11]. Τα δείγματα που περιλαμβάνονται σε αυτή την βάση δεδομένων έχουν αναλυθεί στην πλατφόρμα Affymetrix και, λόγω των μοναδικών κανονικοποίησης και την ποιότητα των δεδομένων επαληθεύσεων, τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης που συλλέγονται από διάφορες μελέτες μπορούν να συνδυαστούν για να δημιουργήσουν μια γενική εικόνα του προφίλ έκφρασης σε ανθρώπινους ιστούς. Τα δεδομένα από την κανονική ωοθήκη (n = 10) και τα δείγματα καρκίνου των ωοθηκών (n = 288) που διατίθενται στη βάση δεδομένων MediSapiens χρησιμοποιήθηκαν σε συγκεκριμένη ανάλυση της έκφρασης των ιστών.

Κλινική υλικό

Ο μελέτες που περιελάμβαναν κλινικές υλικό έχουν πραγματοποιηθεί σύμφωνα με τα δεοντολογικά πρότυπα που ορίζονται στο 1975 Διακήρυξη του Ελσίνκι. Η μικροσυστοιχία ωοθηκικού ιστού (ΤΜΑ) κατασκευάστηκε από χειρουργικά δείγματα που συλλέγονται από το αρχείο του ιστού του Τμήματος Παθολογίας, Turku University Hospital Central, όπως περιγράφεται προηγουμένως [12]. Η χρήση των δειγμάτων εγκρίθηκε από την η επιτροπή δεοντολογίας του νοσοκομείου περιοχή της νοτιοδυτικής Φινλανδίας. ορούς ασθενών και μέρος των κατεψυγμένων δειγμάτων ιστού όγκου συλλέχθηκαν από ασθενείς που έλαβαν στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Turku. Τα δείγματα ορού που περιλαμβάνονται τόσο πρωτοθεραπευόμενα προεγχειρητική δείγματα και διαχρονικά δείγματα κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Η χρήση όλων των κλινικών υλικό εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Νοσοκομείου περιοχή της νοτιοδυτικής Φινλανδίας (ETMK, 53/180/2009 § 238) και η εθνική εποπτική αρχή για την Πρόνοια και την Υγεία (Valvira, DNRO 6550 /05.01.00.06 /2010 και STH507A). Πρόσθετες κατεψυγμένα βλεννώδες υλικό όγκου ωοθηκών ελήφθη από το Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο του Όσλο, Νορβηγία. έγκριση της μελέτης δόθηκε από την Περιφερειακή Επιτροπή για την Ιατρική Έρευνα Ηθική στη Νορβηγία και εν επιγνώσει συναίνεση υπεγράφη από τη νορβηγική ασθενείς.

Ιστός μικροσυστοιχιών και ανοσοϊστοχημεία

Η TMA περιείχε 185 δείγματα από 100 ασθενείς με νεοπλάσματα των ωοθηκών ? ορώδης cystadenomas (n = 16), ορώδες οριακά όγκοι (n = 27), ορώδες καρκίνωμα (n = 47), βλεννώδες cystadenomas (n = 14), βλεννώδες καρκίνωμα (n = 36), endometroid καρκινώματα (n = 45). Το ΤΜΑ χρωματίστηκε με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού REG4 [13], όπως περιγράφεται [14]. REG4 ανοσοχρώση αξιολογηθεί ανεξάρτητα από δύο ερευνητές (ΤΚ και OC)? σε περίπτωση disconcordance συναίνεση βαθμολογία χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω αξιολόγηση.

Ποσοτική RT-PCR

Το συνολικό RNA εξήχθη από κατεψυγμένα δείγματα ωοθηκικού όγκου (10 mg κομμάτι) και τα πρωτογενή κύτταρα χρησιμοποιώντας RNeasy μίνι κιτ (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και υποβάλλονται σε επεξεργασία σε cDNA (Applied Biosystems, Foster City, CA). ανιχνευτές TaqMan αποκτήθηκαν από την Probe Βιβλιοθήκη Οικουμενική (Roche Diagnostics, Espoo, Φινλανδία) και εκκινητές παραγγέλθηκαν από Ολιγομερές (Ελσίνκι, Φινλανδία) για REG4 (προς τα εμπρός: atgcggctgctcctattg? αντίστροφη: taaaaccatccaggagcaca) και GAPDH (προς τα εμπρός: tggctctaccttagaaccctga? αντίστροφη: ttttgctctttgccgtacct) . Πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR) έγινε με ΑΒΙ Prism 7900 (Applied Biosystems). Ο ποσοτικός προσδιορισμός πραγματοποιήθηκε με τον διευθυντή RQ 1.2 του λογισμικού χρησιμοποιώντας το

μέθοδο ΔΔCT (Applied Biosystems). Τρία ή περισσότερα πανομοιότυπα δείγματα χρησιμοποιήθηκαν για να μελετηθεί η έκφραση του mRNA του REG4 και GAPDH. Μέσος όρος έκφραση των δειγμάτων ελέγχου θεωρήθηκε για τον υπολογισμό της πτυχής αλλαγές και GAPDH χρησιμοποιήθηκε σαν ενδογενής έλεγχος. Τρία ή περισσότερα πανομοιότυπα δείγματα μελετήθηκαν για την ανίχνευση της έκφρασης mRNA. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε με μαθητή t-test, και p-τιμές & lt? 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

κηλίδωση Western

Για προϊόντα λύσης πρωτεΐνης, περίπου 20 mg τεμάχια κόπηκαν από τα κατεψυγμένα όγκους και λύθηκαν με υπερήχους σε RIPA ρυθμιστικό λύσης. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας BioRad πρωτεΐνης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Bio-Rad Laboratories, CA). Τα δείγματα παρασκευάστηκαν αναμιγνύοντας κατάλληλες ποσότητες λύματος πρωτεΐνης με 5 χ ρυθμιστικό Laemmli και έβρασαν για 5 λεπτά. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (20 μg) διαχωρίστηκαν σε 15% πήκτωμα SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (πλάτος πόρου 0,2 μm). Ίση φόρτωση επιβεβαιώθηκε με χρώση Ponceau. Οι μεμβράνες δεσμεύτηκαν με 5% γάλα-TBST και ανιχνεύτηκαν με πολυκλωνικό αντίσωμα REG4 (1: 1000, AF1379, R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ) και συζευγμένο με HRP αντι-κατσίκας δευτερογενές αντίσωμα (1: 5000, Dako, Glostrup, Δανία ). Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια.

ELISA δοκιμασία

Το σάντουιτς REG4 δοκιμασίες ELISA πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του Ανθρώπου REG4 ELISA Ζεύγος Σετ (Sino Βιολογικών Inc., Πεκίνο, Κίνα), σύμφωνα με τον κατασκευαστή οδηγίες. Τα δείγματα ορού αραιώθηκαν 1: 1000 και τα δείγματα ασκίτη 1: 500 σε ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης δείγματος. Ένα σύνολο δειγμάτων ορού από υγιείς άνδρες (n = 4) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Η απορρόφηση στα 450 nm μετρήθηκε με Victor 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer, Waltham, ΜΑ). Όλοι οι έλεγχοι και τα δείγματα αναλύθηκαν σε δύο αναπαράγουν πηγάδια σε τρεις επιμέρους πίστες.

Αποτελέσματα

Στο silico

εξόρυξη δεδομένων προσδιορίζει REG4 ως υποψήφιο βιοδείκτη για βλεννώδες καρκίνο των ωοθηκών

για τον εντοπισμό υποθετικών υποψηφίων βιοδεικτών του ορού για την ανίχνευση του καρκίνου των ωοθηκών και τις προδιαγραφές histotype, πραγματοποιήσαμε

in silico

ανάλυση των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο GTI [15] και τη βάση δεδομένων MediSapiens [11]. Η ανάλυση οδήγησε σε έναν κατάλογο 57 γονιδίων με βλεννώδες histotype προφίλ έκφρασης ειδικού mRNA (S1 πίνακα). Ο στόχος ήταν να επικεντρωθεί σε γονίδια υψηλής έκφρασης σε κακοήθεις ιστούς με ένα εκκρινόμενο μεταφραστικό προϊόν. Από τους υποψηφίους με αποτέλεσμα, ήδη γνωστό βιοδείκτες του καρκίνου των ωοθηκών είχαν αποκλειστεί (π.χ. SPINK1 /Tati [16]), μετά το οποίο μια πιο λεπτομερή ανάλυση των

in silico

δεδομένων έκφρασης, καθώς και σχετική βιβλιογραφία διεξήχθη. Η τελική επιλογή υποψήφιων προσδιορίζονται αναγεννώμενο Islet-πρωτεϊνών που προέρχονται IV (REG4) ως πιθανό βιοδείκτη ορού για βλεννώδες histotype καρκίνο των ωοθηκών. REG4 είναι ένα μέλος της οικογένειας αναγέννησης γονίδιο (REG), το οποίο ανήκει στην εξαρτώμενη από ασβέστιο λεκτίνη υπεροικογένειας. Αποτελείται από 17 μέλη, από τα οποία REG1, REG2, REG3 και REG4 έχουν συσχετιστεί με φλεγμονή, διαβήτη και καρκίνους [17].

REG4

mRNA έκφραση επίπεδα μελετήθηκαν σε περισσότερες λεπτομέρειες, χρησιμοποιώντας η βάση δεδομένων MediSapiens η οποία περιλαμβάνει τα στοιχεία έκφρασης των δειγμάτων ανθρώπινου ιστού (βλέπε S1 και S2 σχήματα για πλήρη αποτελέσματα). Η συνολική

REG4

mRNA έκφραση ήταν σημαντικά ισχυρότερη σε κακοήθεις ιστούς (n = 15392) από ό, τι στους υγιείς ιστούς (n = 3082). Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στο Σχ 1, που δείχνει κακοήθεις ιστούς (Σχήμα 1Α) με τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του mRNA REG4 (& gt? 500 σε κάθε δείγμα) και τα αντίστοιχα τους υγιείς ιστούς (Σχήμα 1 Β). Υψηλή έκφραση του

REG4

mRNA βρέθηκε σε κακοήθη γαστρικό, του παχέως και του παγκρέατος ιστούς, καθώς και σε υγιή παχέος και του παγκρέατος ιστούς. Το υψηλότερο επίπεδο των

REG4

έκφραση του mRNA παρατηρήθηκε σε βλεννώδες καρκίνο των ωοθηκών, ενώ το επίπεδο έκφρασης παρέμειναν πολύ χαμηλά σε υγιή ωοθηκικό ιστό. Ειδικότερες ανάλυση του

REG4

έκφραση mRNA σε υγιείς ωοθήκη (n = 10) και κακοήθεις (n = 288) των ωοθηκών ιστούς διαφόρων ιστολογίες, επιβεβαίωσε το ιδιαίτερο προφίλ έκφρασης βλεννώδες histotype (ρ & lt? 0,001, σχ 1C). Με άλλα histotypes καρκίνο των ωοθηκών,

REG4

έκφραση του mRNA παρέμεινε στο επίπεδο των υγιών ιστών

(Α) Κακοήθη ιστούς με έκφραση mRNA υψηλή REG4 (exp τιμή & gt?.. 500, n = 14 ). (Β) έκφραση mRNA REG4 σε αντίστοιχες υγιείς ιστούς (εάν είναι διαθέσιμο, η = 8). (C) Λεπτομερής ανάλυση της έκφρασης mRNA REG4 σε υγιή και κακοήθεις ιστούς ωοθήκης. Το κουτί αναφέρεται σε τεταρτημόριο διανομής (25-75%) εύρος, με τη διάμεση τιμή εμφανίζεται ως μια κάθετη γραμμή (πράσινο σε υγιή δείγματα, κόκκινο σε κακοήθεις). Οι παρατηρήσεις των δεδομένων που βρίσκονται πάνω από 1,5 * ενδοτεταρτημοριακό εύρος υψηλότερο από το τρίτο τεταρτημόριο, θεωρείται ως ακραίες τιμές και αναφέρεται χωριστά.

Η

REG4 εκφράζεται έντονα σε δείγματα όγκων που προέρχονται από βλεννώδες καρκίνο των ωοθηκών

Το

in silico

ανάλυση έδειξε ειδική έκφραση του

REG4

mRNA σε βλεννώδεις histotype των όγκων των ωοθηκών. Για την επικύρωση των στοιχείων αυτών,

REG4

έκφραση του mRNA και της πρωτεΐνης μελετήθηκε σε δείγματα από βλεννώδες (MUC) και υψηλής ποιότητας ορώδες (SER) οι όγκοι των ωοθηκών. Η

REG4

έκφραση του mRNA μελετήθηκε με qRT-PCR χρησιμοποιώντας mRNA από ορώδες όγκους ως αρνητικός μάρτυρας. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στο Σχ 2Α. Το mRNA REG4 έδειξε υψηλή συνολική έκφραση σε βλεννώδες καρκίνωμα (MUC_C_4-10, Σχήμα 2Α), ενώ δεν ανιχνεύθηκε έκφραση σε υψηλής ποιότητας ορώδης όγκους (SER_1-3). Είναι ενδιαφέρον,

REG4

δεν ήταν εκφρασμένα σε βλεννώδες κυσταδένωμα (MUC_A_1) και έδειξε σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης του mRNA και στο βλεννώδες οριακά όγκους (MUC_B_2-3). REG4 έκφραση πρωτεΐνης στο ίδιο σύνολο δειγμάτων όγκων εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western. Τα αποτελέσματα έδειξαν επίπεδα πρωτεΐνης υψηλής REG4 στο

REG4

mRNA θετικούς όγκους (Σχήμα 2Β). Συνολικά, η έκφραση της πρωτεΐνης REG4 ήταν είτε πολύ υψηλή ή πολύ χαμηλή περιεκτικότητα σε αυτά τα δείγματα, ενώ η ανάλυση του mRNA εντοπίστηκαν επίσης δείγματα με ενδιάμεση ή χαμηλή έκφραση. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν τα ευρήματα του

in silico

ανάλυση και δείχνουν ότι η έκφραση REG4 είναι ειδικό για βλεννώδες histotype καρκίνο των ωοθηκών.

(Α) Η ποσοτική ανάλυση RT-PCR της έκφρασης REG4 mRNA σε ορώδες καρκίνωμα (SER_C), βλεννώδες cystadenomas (MUC_A), βλεννώδες οριακά όγκους (MUC_B) και βλεννώδες καρκίνωμα (MUC_C). (Β) Ανάλυση στυπώματος Western της έκφρασης πρωτείνης REG4 στο ίδιο σετ δειγμάτων. Η συνολική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη του κάθε δείγματος ήταν 20 μg και ίση φόρτωση επιβεβαιώθηκε με χρώση Ponceau.

Η

REG4 εκφράζεται από κυπελλοειδή κύτταρα των κακοήθων βλεννώδεις όγκοι των ωοθηκών

μοτίβο έκφρασης REG4 μελετήθηκε σε TMAs περιέχουν κλινικά δείγματα από όγκους των ωοθηκών με διαφορετικές histotypes. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον Πίνακα 1 και στο Σχήμα 3. συμφωνώ με τις προηγούμενες αναλύσεις, δεν ανιχνεύθηκε χρώση σε ορώδης (n = 90) ή ενδομητριοειδές νεοπλάσματα (n = 45), ενώ θετική χρώση REG4 βρέθηκε στο 83% (30 /36) του βλεννώδους καρκινωμάτων. Αυτό δείχνει ότι η έκφραση REG4 είναι ειδικό για βλεννώδες histotype. Σε όλες τις REG4 θετικά δείγματα η χρώση ήταν πολύ ισχυρή. Τα δείγματα βλεννώδες ιστό επιβεβαιώθηκαν να είναι του πρωτογενούς προέλευσης όγκου των ωοθηκών με την εξέταση της διαμήκους ηλεκτρονικές πληροφορίες ρεκόρ για την υγεία του κάθε ασθενή με ειδική αναφορά στις προηγούμενες διαγνώσεις, διαγνωστικές εξετάσεις και λαπαροτομία κατάσταση, καθώς και με χρώση CK7 /ΟΚ20. Το ΤΜΑ περιείχε επίσης δείγματα από καλοήθεις βλεννωδών cystadenomas (n = 14). Σημαντικά, καμία έκφραση REG4 ανιχνεύθηκε σε αυτά τα δείγματα. Συσχέτιση των αποτελεσμάτων χρώσης με τα δεδομένα των ασθενών δεν έδειξε συσχέτιση της έκφρασης REG4 σε άλλους εκτός από βλεννώδες histotype. Έντονη χρώση REG4 ανιχνεύθηκε εξίσου σε χαμηλής και υψηλής ποιότητας βλεννώδες καρκίνωμα. Λεπτομερέστερη εξέταση του προτύπου χρώσης REG4 αποκάλυψε την ισχυρότερη χρώση στο εσωτερικό και μεταξύ των βλεννωδών εγκλείσματα των καρκινικών κυττάρων κυπελλοειδή. Επιπλέον, REG4 βρισκόταν αποκλειστικά στην κορυφαία επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων, ενώ το στρώμα ήταν αρνητική.

Ανοσοϊστοχημική χρώση REG4 σε ΤΜΑ των κακοηθών ιστών των ωοθηκών. Παραδείγματα ορώδες καρκίνωμα (ΑΒ), καρκίνωμα ενδομητριοειδές (CD) και βλεννώδες καρκίνωμα (EF) που παρουσιάζονται.

Η

Εκκρίνεται REG4 μπορεί να ανιχνευθεί από τον ορό και ασκίτη των ασθενών με καρκίνο βλεννωδών

για να αναλυθεί το δυναμικό των REG4 ως βιοδείκτη ορού για τον καρκίνο των ωοθηκών βλεννώδες, χρησιμοποιήσαμε ένα REG4 ειδική δοκιμασία σάντουιτς ELISA. Τα δείγματα που περιλαμβάνονται ορών και ασκιτικό υγρό από ασθενείς με ορώδες ή βλεννώδες όγκους των ωοθηκών. Λεπτομερής περιγραφή του δείγματος και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον Πίνακα S2. Τα δείγματα ορού ελήφθησαν πριν (προ-εγχειρητική) και μετά (μετεγχειρητική) χειρουργική επέμβαση σε διάφορα χρονικά σημεία κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης. Υγρό ασκίτη συλλέγεται κατά την διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης. Για να εκτιμηθεί η εξειδίκευση της REG4 για βλεννωδών histotype καρκίνο των ωοθηκών, αναλύσαμε CA125, HE4 και συγκεντρώσεις REG4 από προεγχειρητική δείγματα ορού ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών με υψηλής ποιότητας ορώδης (n = 4) ή βλεννώδες (n = 3) καρκίνους. Όλα προεγχειρητική ορών ήταν από ασθενείς με διάχυτη (σταδίου III-IV) της νόσου. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχ 4Α. Για να είναι σε θέση να συγκρίνουν άμεσα τις ELISA-αναλύσεις με διαφορετικές μονάδες μέτρησης, τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως πολλαπλή μεταβολή (FC) του αντίστοιχου κακοήθειας αναφέροντας τιμή αποκοπής (35 kU /l για CA125 και 150 ρΜ για HE4 ). Οι επιλεγόμενες τιμές cut-off με βάση τις τρέχουσες συστάσεις. Οι αριθμητικές τιμές παρουσιάζονται στον Πίνακα S2. Για REG4 η τιμή αποκοπής ορίστηκε σε 2 μg /l με βάση την υψηλότερη συγκέντρωση REG4 που λαμβάνονται από υγιείς άνδρες και ένα μεγαλύτερο σύνολο των μη βλεννωδών ελέγχους ορού (S3 Πίνακας). Μια τιμή FC & gt? 1 θεωρείται ως ένα θετικό αποτέλεσμα που υποδηλώνουν για κακοήθεια,

i

.

e

. υψηλότερη συγκέντρωση από ό, τι δείκτης κανονικά υπάρχει σε υγιή άτομα. FC τιμές ≤ 1 θεωρούνται ως αρνητικά αποτελέσματα. Το χρησιμοποιούνται συνήθως βιοδείκτες ορού CA125 και HE4 έδειξαν αυξημένες συγκεντρώσεις στον ορό των ασθενών με ορώδες καρκίνου υψηλής ποιότητας (FC & gt? 1), ενώ η συγκέντρωση REG4 παρέμεινε κάτω από την τιμή αποκοπής (FC & lt? 1) (Σχήμα 4Α). Στους ορούς ασθενών με καρκίνο βλεννώδες, η συγκέντρωση του CA125 και HE4 παρέμεινε σε χαμηλά επίπεδα. Σε αυτά τα τρία δείγματα, το επίπεδο REG4 ήταν 10-70 φορές πάνω από την τιμή αποκοπής. Αν και η ποσότητα των δειγμάτων ήταν χαμηλό, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι REG4 είναι ειδική για όγκους βλεννώδες τύπου και μπορεί να ανιχνευθεί σε υψηλές συγκεντρώσεις στους ορούς ασθενών με διαδίδονται βλεννώδες καρκίνο. Εκτός από τα δείγματα ορού, συγκέντρωση REG4 μετρήθηκε από ελεύθερο κυττάρων υγρά ασκίτη από δύο ασθενείς με βλεννώδες όγκους (Μ1 και Μ2, S2 Πίνακα). Αμφότερα τα δείγματα ήταν θετικά (33 pg /ml και 187 pg /ml, αντίστοιχα) για την πρωτεΐνη REG4 υποδεικνύοντας ότι βλεννώδες καρκινικά κύτταρα εκκρίνουν REG4 επίσης στο ρευστό ασκίτη.

(Α) ανάλυση ELISA της συγκέντρωσης πρωτεΐνης REG4 σε ορούς των ασθενών που διαγιγνώσκονται με ορώδες (SER) ή βλεννώδες (MUC) ωοθηκικών καρκινωμάτων. (Β) Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης REG4 σε μια σειρά προ- (ημέρα -1) και μετεγχειρητική δείγματα ορού σε έναν ασθενή με διαγνωσμένη βλεννώδες καρκίνωμα.

Η

Για να προσδιοριστεί η συσχέτιση του REG4, CA125 και HE4 συγκεντρώσεις στο φορτίο όγκου, δείγματα ορού μετρήθηκαν σε πολλαπλές χρονικές στιγμές από έναν ασθενή (Μ1) σε θεραπεία για διαδίδονται βλεννώδες καρκίνωμα (βλέπε πίνακα S4 για τα λεπτομερή αποτελέσματα). Τα αποτελέσματα (FC της τιμής αποκοπής, Σχήμα 4Β) έδειξε ότι η υψηλή συγκέντρωση REG4 (FC = 73,6) ανιχνεύονται στον προεγχειρητικό δείγμα (ημέρα 0) μειώθηκε γρήγορα μετά το χειρουργείο (ημέρα 13? FC = 4.9) και έμεινε για ένα χαμηλό επίπεδο αν και υψηλότερη από την τιμή αποκοπής 2 μg /l. Η συγκέντρωση του CA125 υποδεικνύεται κακοήθειας στα πρώτα τρία χρονικά σημεία (47 kU /l, 67 kU /L και 43 kU /l, αντίστοιχα) μετά την οποία έπεσε κάτω από την τιμή αποκοπής 35 kU /l, ενώ τα επίπεδα του HE4 παρέμεινε κάτω από την τιμή αποκοπής των 150 μΜ σε όλα τα δείγματα. Αυτό υποδηλώνει ότι η συγκέντρωση REG4 συσχετίζεται με φορτίο όγκου καλύτερα από CA125 ή HE4 σε βλεννώδες καρκίνο των ωοθηκών. Ενώ η μέτρηση CA125 αναφέρεται κακοήθεια στον προεγχειρητικό δείγμα, μέτρηση HE4 απέτυχε να εντοπίσει τον όγκο σε δείγματα ορού.

Συζήτηση

ωοθηκών νεοπλάσματα διαφέρουν ως προς το γενετικό προφίλ τους, βιολογική συμπεριφορά και το αποτέλεσμα, και θα πρέπει να αντιμετωπίζονται ως διακριτές ασθένειες ήδη κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης. Έτσι, ένας συγκεκριμένος προεγχειρητική διάγνωση είναι κρίσιμη για την επιλογή της βέλτιστης θεραπευτικής στρατηγικής. Επί του παρόντος δεν υπάρχουν μέθοδοι για την προεγχειρητική διάκριση των υποτύπων καρκίνου των ωοθηκών και η συγκεκριμένη διάγνωση επιτυγχάνεται μόνο με την περιεγχειρητική τμήμα κατεψυγμένων ή μετεγχειρητική ιστοπαθολογική ανάλυση. Εδώ σας προτείνουμε REG4 ως μια πολλά υποσχόμενη βιοδείκτης ορού για το διαχωρισμό βλεννώδες καρκίνους από άλλα επιθηλιακά υποτύπων καρκίνου των ωοθηκών. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, την ανάλυση REG4 ορού μπορεί επίσης να έχουν δυνατότητες για διαφοροποίηση μεταξύ καλοήθων και κακοήθων νεοπλασμάτων βλεννώδες και για την παρακολούθηση των ασθενών με βλεννώδη καρκίνο των ωοθηκών.

Η συγκεκριμένη βλεννώδες έκφραση γενεαλογία της REG4 μέσα νεοπλασμάτων των ωοθηκών αποδεικνύεται από διάφοροι τρόποι. Τα πρώτα στοιχεία ελήφθησαν από

in silico

αναλύσεων, η οποία αναφέρεται πολύ συγκεκριμένο προφίλ έκφρασης του mRNA της REG4 στο βλεννώδες καρκίνους μεταξύ των διαφόρων υποτύπων των όγκων των ωοθηκών. έκφραση REG4 περαιτέρω επικυρωθεί με qRT-PCR και κηλίδωση western από κατεψυγμένα δείγματα φρέσκου ωοθηκικού ιστού του όγκου που προέρχονται από ορώδες και βλεννώδες υποτύπους. Όπως ήταν αναμενόμενο με βάση το

in silico

δεδομένων, REG4 ήταν άκρως εκφράζεται μόνο σε κακοήθεις βλεννώδες όγκους των ωοθηκών. Τέλος, ανοσοϊστοχημική χρώση μιας μικροσυστοιχίας ιστού όγκου που αποτελείται από 185 πυρήνες όγκου από καλοήθη και κακοήθη ορώδης, endometroid και βλεννώδες νεοπλάσματα επιβεβαίωσε περιορισμένη έκφραση στο βλεννώδες γενεαλογία. Είναι ενδιαφέρον, κανένας έκφραση REG4 ανιχνεύθηκε σε βλεννώδες cystadenomas υποδηλώνοντας ότι ανοσοϊστοχημική ανάλυση REG4 θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως ένα επιπλέον μέθοδος για διάκριση μεταξύ καλοήθων και κακοήθων όγκων βλεννώδες ωοθηκών. Όλα τα βλεννώδη δείγματα επιβεβαιώθηκαν να είναι του πρωτογενούς προέλευσης όγκου των ωοθηκών. σύνολο του δείγματος μας δεν περιέχει δείγματα από τα πιο σπάνια είδη βλεννώδες καρκίνωμα ωοθηκών? όπως endocervical /seromucinous ή foveolar τύπους. Ως εκ τούτου, προκειμένου να καθοριστεί το πραγματικό δυναμικό του REG4 ως ανοσοϊστοχημική δείκτη, επιπλέον αναλύσεις με ευρύτερο φάσμα διαφορετικών τύπων δειγμάτων απαιτούνται.

Η βιοδείκτες ορού CA125 και HE4 χρησιμοποιούνται για τη διάγνωση του καρκίνου των ωοθηκών και τη συνέχεια που πάνω. Οι δείκτες αυτοί ανιχνεύουν κυρίως ορώδες καρκίνους [4,18,19], αλλά δεν είναι αξιόπιστα για τη διάγνωση της μη-ορώδες histotypes, ειδικά το βλεννώδες υπότυπο [20,21]. Εδώ, σε σύγκριση με δείγματα ορού από ασθενείς με υψηλής ποιότητας ορώδες ή βλεννώδες καρκίνο των ωοθηκών. Τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν με προηγούμενες μελέτες επειδή στο δείγμα μας που τόσο CA125 και HE4 ήταν σημαντικά αυξημένα σε προεγχειρητική δείγματα ορού ασθενών ορώδες καρκίνωμα, αλλά παρέμεινε χαμηλή στις βλεννώδες καρκινώματα. Αντίθετα, σε ορούς και των τριών ασθενών βλεννώδες καρκίνο », επίπεδο REG4 ανυψώθηκε πάνω από δέκα φορές πάνω από την υψηλότερη τιμή των ορών ελέγχου. Το επίπεδο REG4 ορό δεν ήταν αυξημένα σε κανένα από τα δείγματα ορού των ασθενών ορώδες καρκίνο ». Έτσι, ένας συνδυασμός του REG4 με CA125 και HE4 θα μπορούσε να προσφέρει μια πιο ολοκληρωμένη πάνελ ενδεικτών για την προεγχειρητική διάγνωση των δυνητικά νεοπλασματικών μαζών των ωοθηκών, και επιτρέπουν διάκριση των βλεννωδών καρκίνο των ωοθηκών από άλλα histotypes καρκίνο των ωοθηκών. Ωστόσο, καθώς ορισμένοι κακοήθεις όγκους δεν παρουσίασαν θετική χρώση REG4, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα ότι ένα κλάσμα των βλεννωδών καρκίνων θα μπορούσε να παραμείνει μη ανιχνεύσιμο στην ανάλυση REG4 ορό. Από τη συλλογή του δείγματος ορού μας ήταν περιορισμένη, χρειάζονται περαιτέρω αναλύσεις για να προσδιοριστεί πλήρως το ρόλο της μέτρησης REG4 ορού ως προεγχειρητική μέθοδος για βλεννώδες τη διάγνωση του καρκίνου των ωοθηκών.

REG4 έχει προηγουμένως αναφέρεται ως βιοδείκτη ορού σε γαστρικό , του παχέος εντέρου και του καρκίνου του προστάτη [22-24]. Έτσι, η ανάλυση REG4 ορού από μόνη της μπορεί να μην είναι σε θέση να διακρίνουν μεταξύ της πρωτοβάθμιας βλεννώδες καρκίνο των ωοθηκών και των μεταστάσεων των ωοθηκών προέρχονται από το γαστρεντερικό σωλήνα. Από την άλλη πλευρά, η προσθήκη της ανάλυσης REG4 από τον ορό από την πλευρά του CA125 ή /και HE4 θα μπορούσε να παράσχει τη δυνατότητα για μετεγχειρητική παρακολούθηση των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών βλεννωδών με επιβεβαιωμένη διάγνωση. Ένδειξη για αυτό προήλθε από ένα διαμήκη σειρά δειγμάτων ορού από έναν ασθενή με καρκίνο βλεννώδες. Σε αυτόν τον ασθενή, η υψηλή προεγχειρητική συγκέντρωση REG4 ορού μειώθηκε γρήγορα μετεγχειρητικά και παρέμειναν χαμηλά κατά τη διάρκεια της αδιατάρακτο περίοδο παρακολούθησης. Για να αποκτήσετε σαφή απόδειξη της χρησιμότητας των REG4 ορού σε έλεγχο της νόσου, ωστόσο, οι περισσότεροι ασθενείς με διαμήκη δείγματα ορού πρέπει να ελέγχονται.

Η λειτουργία του REG4 στον καρκίνο των ωοθηκών είναι ελάχιστα κατανοητή και δεν έχει γίνει ευρέως διερευνηθεί. Μια πρόσφατη μελέτη δείχνει ότι REG4 ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση, τη μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, και έχει έναν σημαντικό ρόλο στην πρώιμη καρκινογένεση ωοθηκών [25]. Αυτή η μελέτη επίσης αναφέρει ανοσοϊστοχημική χρώση REG4 από διαφορετικούς υποτύπους του καρκίνου των ωοθηκών. Ορός τιμές REG4 δεν προσδιορίστηκαν ποσοτικά σε καμία υποτύπους καρκίνου των ωοθηκών. Σε αντίθεση με τα αποτελέσματά μας, θετική χρώση REG4 (από αδύναμη να ισχυρή) βρέθηκε επίσης στο ορώδες δείγματα. Στο υλικό πρωτεΐνης REG4 μας έκφραση ήταν είτε πολύ υψηλή ή πολύ χαμηλή, και δεν παρατηρήθηκε καμία ενδιάμεση χρώση. Ωστόσο, η ανάλυση qRT-PCR της έκφρασης REG4 mRNA από φρέσκο ​​κατεψυγμένο βλεννώδεις όγκοι των ωοθηκών εντοπίζονται δείγματα με ενδιάμεση ή χαμηλή έκφραση, ακόμη καμία έκφραση ανιχνεύθηκε σε δείγματα από ορώδεις όγκους των ωοθηκών. Αυτό μπορεί να οφείλεται σε διαφορές στην εξειδίκευση αντισώματος και της κλιμάκωσης της χρώσης δύναμη.

Εν κατακλείδι, εντοπίσαμε REG4 ως πιθανό βιοδείκτη για υπότυπο ειδική διάγνωση της βλεννώδους καρκίνου των ωοθηκών, καθώς και για τη νόσο παρακολούθηση. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα μας πρωτεΐνη REG4 εκκρίνεται σε κυκλοφορία από βλεννώδες καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών και μπορεί να ανιχνευθεί με ένα τεστ ELISA που βασίζεται. Μετρήσαμε τρεις βιοδείκτες από ορούς ασθενών? CA125, HE4 και REG4 και βρέθηκαν υψηλές συγκεντρώσεις των REG4 στην προεγχειρητική δείγματα των ασθενών βλεννώδες καρκίνο των ωοθηκών, ενώ CA125 και HE4 απέτυχαν να ανιχνεύσουν πειστικά κακοήθειας σε αυτά τα δείγματα. Η μελέτη μας δείχνει ότι ο συνδυασμός REG4 με CA125 και HE4 θα μπορούσε να προσφέρει προστιθέμενη αξία για την προεγχειρητική διάγνωση των ωοθηκών μάζες των πιθανών νεοπλασματικών προέλευσης, και να καταστεί δυνατή η διάκριση των βλεννωδών καρκίνο των ωοθηκών από άλλα ωοθηκών υποτύπων καρκίνου με μη επεμβατικές μεθόδους.

Υποστήριξη πληροφορίες

Πίνακας S1. Γονίδια με βλεννώδες συγκεκριμένο προφίλ έκφρασης σε κλινικά δείγματα καρκίνου των ωοθηκών

doi:. 10.1371 /journal.pone.0151590.s001

(XLSX)

S2 πίνακα. Λεπτομερής περιγραφή του δείγματος και τα αποτελέσματα της δοκιμασίας ELISA

doi:. 10.1371 /journal.pone.0151590.s002

(DOCX)

S3 πίνακα. τιμή αποκοπής REG4 έχει οριστεί με βάση την υψηλότερη συγκέντρωση REG4 που λαμβάνονται από υγιείς άνδρες και ένα μεγαλύτερο σύνολο των μη βλεννωδών ελέγχους ορού

doi:. 10.1371 /journal.pone.0151590.s003

(DOCX)

S4 πίνακα. Τα αναλυτικά αποτελέσματα της ορό ELISA-ανάλυση σε πολλαπλά χρονικά σημεία από έναν ασθενή

doi:. 10.1371 /journal.pone.0151590.s004

(DOCX)

S1 Εικ. .

in silico

ανάλυση των

REG4

mRNA έκφρασης στη βάση δεδομένων MediSapiens σε όλη την κακοήθη δείγματα ανθρώπινου ιστού (n = 15392)

doi: 10.1371 /journal.pone.0151590.s005

(PDF)

S2 Εικ. .

in silico

ανάλυση των

REG4

mRNA έκφρασης στη βάση δεδομένων MediSapiens σε όλη την υγιή δείγματα ανθρώπινου ιστού (n = 3082)

doi: 10.1371 /journal.pone.0151590.s006

(PDF)

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε Sinikka Kollanus και Piia Mikkonen για την εξαιρετική τεχνική βοήθεια. Ο γιατρός Kaisa Huhtinen είναι ευχαρίστησε για την καθοδήγηση ανάλυσης δεδομένων.