Αναστολείς

Αφηρημένο

Ιστορικό και στόχος

πρωτεϊνών απόπτωσης (ΙΑΡ) έχουν διερευνηθεί σε ανθρώπινους καρκίνους, όπου συχνά υπερεκφράζονται και σχετίζονται με την κακή πρόγνωση. Εδώ θα διερευνηθεί ο ρόλος της βακουλοϊικών επανάληψης ΙΑΡ που περιέχει 6 (BIRC6), ένα μέλος του ΙΑΡ, σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC).

Μέθοδοι

Χρησιμοποιήσαμε Western και ανοσοϊστοχημεία για να εξετάσει BIRC6 έκφραση σε 7 κυτταρικές γραμμές CRC και 126 CRC κλινικά δείγματα. Προσδιορίσαμε την βιολογική σημασία του BIRC6 σε κυτταρικές γραμμές CRC με μια μέθοδο σίγηση φακοϊό μεσολάβηση.

Αποτελέσματα

ανέφεραν ότι BIRC6 υπερεκφράστηκε σε κυτταρικές σειρές CRC και την κλινική τους ιστούς CRC. BIRC6 υπερέκφραση συσχετίστηκε με το μέγεθος του όγκου και το βάθος εισβολή της CRC. BIRC6 υπερέκφραση συνδέεται με χειρότερη συνολική επιβίωση (OS) (

P

= 0,001) και μικρότερη ελεύθερη νόσου επιβίωση (DFS) (

P

= 0,010). BIRC6 πολλαπλασιασμό νοκ ντάουν ανέστειλε κυττάρων, συνελήφθη κυτταρικού κύκλου στην φάση S, μειωτικά επίπεδα κυκλίνης Α2, Β1, Δ1 και Ε1, και ευαισθητοποιημένα κύτταρα CRC στη χημειοθεραπεία

in vitro

και

in vivo

.

Συμπεράσματα

στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι η υπερέκφραση BIRC6 είναι ένας προγνωστικός δείκτης κακής πρόγνωσης σε καρκίνο του παχέος εντέρου και BIRC6 θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός στόχος της θεραπείας CRC

Παράθεση:. Hu Τ , Weng S, Tang W, Xue R, Τσεν S, Cai G, et al. (2015) Η υπερέκφραση του BIRC6 Είναι μια Predictor των Πρόγνωση για τον καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 10 (5): e0125281. doi: 10.1371 /journal.pone.0125281

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Ajay Goel, Πανεπιστήμιο Baylor Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 15 Ιουλίου του 2014? Αποδεκτές: 23 Μαρτίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: May 1, 2015

Copyright: © 2015 Hu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από τη Σαγκάη Επιστήμης και Τεχνολογίας της Επιτροπής (αριθμοί επιχορήγησης: 10411950100 να XS, 12ZR1405300 να YC), Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (αριθμοί επιχορήγηση : 81100344, 81173078 για την SZ, 81371268 για την SC, 81172273, 81272388 για την LD, 81472673 για να YC, 81272388, 81400628 για να XS), το Εθνικό Κλινική Βασικά Ειδικό Θέμα της Κίνας (αριθμός επιχορήγησης: 371 έως XS), και στη Σαγκάη Πρόγραμμα Pujiang ( αριθμός επιχορήγησης: No.13PJD008 με GC). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη πιο συχνά διαγιγνώσκεται κακοήθεια και η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1]. Λόγω διαλογή και απομάκρυνση των προκαρκινικών πολυπόδων, τα ποσοστά εμφάνισης έχουν μειωθεί κατά τα τελευταία 3 δεκαετίες [2]. Η χρήση των νέων φαρμάκων, όπως η οξαλιπλατίνη, μπεβασιζουμάμπη, cetuximab και panitumumab επιτρέπει στους ασθενείς με μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνο επιβιώνουν περισσότερο [3,4,5,6]. Παρά την πρόοδο στη διάγνωση και θεραπεία του CRC, η θνησιμότητα από την ασθένεια αυτή παραμένει υψηλή. Δεδομένης της κακής πρόγνωσης του CRC, πρέπει να αναπτυχθούν για την περαιτέρω βελτίωση του αποτελέσματος της ορθοκολικού καρκίνου νέων προγνωστικούς δείκτες και θεραπευτικές στρατηγικές.

Οι αναστολείς της πρωτεϊνικής απόπτωσης (ΙΑΡ) οικογένεια έχει αποδειχθεί ότι είναι κρίσιμη στην αντίσταση απόπτωσης σε ένα ευρύ φάσμα της κακοήθειας [7,8,9,10]. Αυτές οι πρωτεΐνες χαρακτηρίζονται από την παρουσία έως τρία αντίγραφα Βακιλλοϊική ΙΑΡ Επανάληψη τομέα (BIR). Η δεσμεύουν ΙΑΡ να καταστείλει και μια ποικιλία από προ-αποπτωτικών παραγόντων, έτσι αναστέλλουν αποτελεσματικά την απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα [11]. Βακιλλοϊική αναστολή της πρωτεΐνης απόπτωσης επανάληψης που περιέχει 6 (BIRC6), γνωστή επίσης και ως Απόλλων ή Bruce, είναι το μεγαλύτερο μέλος της οικογένειας ΙΑΡ με ένα μόνο περιοχή BIR στο Ν-τερματικό του και ένα δραστικό ουμπικουϊτίνης-σύζευξη (UBC) περιοχή ενζύμου σε του C-τερματικό [12]. Εκτός από την ΙΑΡ δραστηριότητα, BIRC6 έχει το διακριτικό ιδιότητα του δραστηριότητα ως χιμαιρικό Ε2 /Ε3 ουμπικουιτίνης λιγάση σε θηλαστικά [13]. Με τον τομέα της UBC, BIRC6 προωθεί την υποβάθμιση των Smac και αναστέλλει τη δράση της κασπάσης-9, που παίζουν σημαντικό ρόλο στην έναρξη της απόπτωσης [14]. Ενώ η ίδια BIRC6 ρυθμίζεται από ουμπικουιτίνωση και την υποβάθμιση του πρωτεασώματος μεσολάβηση Ε2, UbcH5c και Nrdp1 [15].

Ένα μεγάλο μέρος των αποδεικτικών στοιχείων έδειξε ότι BIRC6 ήταν ιδιαίτερα εκφράζεται σε διάφορους τύπους καρκίνου. Έχει αναφερθεί ότι τα καρκινικά κύτταρα του εγκεφάλου με υψηλά επίπεδα BIRC6 ήταν ανθεκτικά σε διάφορα αντικαρκινικά φάρμακα [12]. BIRC6 υπερέκφραση συνδέθηκε με δυσμενή πρόγνωση σε παιδική ηλικία

de novo

οξεία μυελογενή λευχαιμία [16]. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι η ρ53 είναι ένα καθοδικός τελεστής του BIRC6 [17,18]. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι BIRC6 ίσως ένα νέο θεραπευτικό στόχο για κακοήθη όγκο.

Qiu

et al

. [14] Η πρώτη απέδειξε ότι siRNA που στοχεύουν BIRC6 προωθείται αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Στη συνέχεια, διάφορες μελέτες επιβεβαίωσαν ότι φίμωση BIRC6 προκαλείται αυξημένη απόπτωση [17,18,19]. Επιπλέον, προκαταρκτική έρευνα έδειξε ότι η έκφραση BIRC6 ήταν πιο άφθονα σε ιστούς CRC ό, τι σε μη νεοπλασματικά ιστούς χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες cDNA [20]. Παρόμοιο αποτέλεσμα ελήφθη στην συγκριτική μελέτη πρωτεομική των βλαστικών κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου [21]. Ωστόσο, δεν υπήρξαν αναφορές για προγνωστική σημασία της βασίζεται σε κλινικά δεδομένα. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήσαμε τις προγνωστική σημασία και οι βιολογικές λειτουργίες του BIRC6 σε ορθοκολικό καρκίνο. Τα δεδομένα μας έδειξαν μια ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της υπερέκφραση BIRC6 και τα δυσμενή κλινικά χαρακτηριστικά. Επιπλέον, προς τα πάνω ρύθμιση BIRC6 εις το CRC προβλεπόμενη φτωχή πρόγνωση των ασθενών. Επιπλέον, βρήκαμε ότι BIRC6 νοκ ντάουν ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRC, συνελήφθη κυτταρικού κύκλου CRC σε φάση S, μειωτικά κυκλίνη Α2, Β1, Δ1 και Ε1 επίπεδα, και ευαισθητοποιημένα κύτταρα CRC στη χημειοθεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι ασθενείς, τα δείγματα ιστού και παρακολούθηση

Η παρούσα μελέτη ήταν κυρίως διεξήχθη από μια αναδρομική σχεδιασμό. δείγματα CRC (n = 126) ελήφθησαν από ασθενείς που έλαβαν χειρουργική επέμβαση στο Zhongshan Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Fudan μεταξύ Ιανουαρίου 2008 και Αυγούστου 2008. Κανένας από αυτούς έλαβαν ακτινοθεραπεία. Μεταξύ 126 ασθενείς, 42 ασθενείς receieved χημειοθεραπεία οξαλιπλατίνη-based (FOLFOX4? Οξαλιπλατίνη, 5-φθοροουρακίλη και λευκοβορίνη) μετά από θεραπευτική εκτομή. Οι πληροφορίες παρακολούθησης όλων των συμμετεχόντων ενημερώθηκε κάθε 3 μήνες από το τηλέφωνο. Όλοι οι ασθενείς παρακολουθήθηκαν προοπτικά από CEA στον ορό, υπερηχογράφημα, ενδοσκόπιο, αξονική τομογραφία κάθε 3-6 μήνες. Η διάγνωση της επανάληψης βασίστηκε στη μέθοδο απεικόνισης και βιοψία (αν είναι δυνατόν). Οι ασθενείς παρακολουθήθηκαν μέχρι το θάνατο ή την 1η Απριλίου, το 2013, με μέση μετεγχειρητική παρακολούθηση διάρκειας 59 μηνών. Η συνολική επιβίωση (OS) ορίστηκε ως ο χρόνος από την ημερομηνία της επέμβασης σε θάνατο από οποιαδήποτε αιτία, οι ασθενείς ζωντανός λογοκρίνονται κατά την τελευταία παρακολούθηση. Ελεύθερη νόσου επιβίωση (DFS) ορίστηκε ως ο χρόνος που παρήλθε από τη χειρουργική επέμβαση με την πρώτη εμφάνιση οποιασδήποτε από τις ακόλουθες περιπτώσεις: ορθοκολικό καρκίνο μακρινή μετάσταση? υποτροπή του καρκίνου του παχέος εντέρου? ανάπτυξη του δεύτερου μη παχέος κακοήθεια εξαίρεση βασικών κυττάρων καρκινώματα του δέρματος και καρκίνωμα in situ του τραχήλου της μήτρας? ή θανάτου από οποιαδήποτε αιτία, χωρίς τεκμηρίωση ενός γεγονότος σχετίζονται με τον καρκίνο. Οι ασθενείς με όγκους IV στάδιο TNM εξαιρέθηκαν κατά την ανάλυση DFS. Τριάντα ζεύγη φρέσκα εκτομή CRC ιστούς και τα ζεύγη γειτονικών μη-καρκινικούς ιστούς συλλέχθηκαν για κηλίδωση Western. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ερευνών Δεοντολογίας του Zhongshan Νοσοκομείο. Όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση γραπτή έντυπα συγκατάθεσης για τη μελέτη αυτή

μικροδορυφορικού αστάθεια (MSI) ανάλυση και μετάλλαξη KRAS ανάλυση

ανάλυση

MSI εξετάστηκε χρησιμοποιώντας δείκτες επαναλάβετε τρεις μονονουκλεοτιδίου:. BAT25, BAT26 και CAT25 όπως περιγράφεται προηγουμένως [22]. ανάλυση μετάλλαξης KRAS πραγματοποιήθηκε με ενίσχυση PCR του γονιδιωματικού DNA χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές:. νόημα 5′-AAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3 ‘και 5′-αντινόημα AGAATGGTCCTGCACCAGTAA-3’

Ανοσοϊστοχημεία και αξιολόγηση

Παραφίνη -embedded τμήματα φυσιολογικών και καρκινικών ιστών αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν σε φθίνουσα σειρά αιθανόλης αραιωμένο σε απεσταγμένο νερό. Μετά ανάκτηση αντιγόνου με ένα 10 mM ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικών, τομές CRC επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με το πρωτογενές πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-BIRC6 (Abcam, Cambridge, ΜΑ). Μετά από 30 λεπτά επώαση με δευτερογενές αντίσωμα έναντι συζευγμένο με HRP-κουνελιού Ig, οι τομές αναπτύχθηκαν σε 3, διάλυμα 3′-διαμινοβενζιδίνη υπό μικροσκοπική παρατήρηση και με αιματοξυλίνη.

Οι τομές παρατηρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός, για μια ιστολογική αξιολόγηση, για να εξετάσει μικροετερογένεια όγκου στη διανομή του αντιγόνου. Πέντε τυχαιοποιημένες μικροσκοπικές προβολές των 400-πλάσια μεγέθυνση κάθε τμήματος παρατηρήθηκαν και σκόραρε. Τόσο η ένταση του ανοσοϊστοχημική χρώση (0, αρνητικά? 1, αδύναμη? 2, ενδιάμεσα? 3, ισχυρή) και το ποσοστό των θετικών κυττάρων (0, 0% θετικά κύτταρα? 1, 1-10% θετικά κύτταρα? 2, 11- 50% θετικά κύτταρα? 3, & gt? 50% θετικά κύτταρα) αξιολογήθηκαν. Το τελικό αποτέλεσμα του κάθε δείγματος ελήφθη πολλαπλασιάζοντας τις βαθμολογίες των ένταση χρώσης και το ποσοστό των θετικών κυττάρων. Τα δείγματα ταξινομήθηκαν ως αρνητικές, όταν οι τελικές βαθμολογίες ήταν 0 έως 3 και θετική όταν 4 έως 9 [23]. Η χρώση βαθμολογήθηκε BIRC6 ανεξάρτητα από δύο παθολόγους τυφλωμένο στα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών. Η επαναληψιμότητα ενδο-παρατηρητή ελέγχθηκε από την απόκτηση των ευρέως χρησιμοποιούμενη στατιστική κ-βαθμολογίες βαθμό αυτό η δύναμη της συμφωνίας για έξι κατηγορίες [φτωχή (κ-score, & lt? 0.00), ελαφρά (0,00-0,20), δίκαιη (0,21 – 0,40) , μέτρια (0,41 – 0,60), σημαντική (0,61 – 0,80) και σχεδόν τέλεια (0,81 έως 1,00)] [24].

Κυτταρική καλλιέργεια

LoVo, SW620, DLD-1, ΗΤ -29, HCT116, SW480 και SW1116 αγοράστηκαν από το Type Culture Collection της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα), ανθρώπινο παχύ έντερο υγιή κυτταρική σειρά NCM460 αγοράστηκαν από INCELL Corporation. Η SW620, ΗΤ-29, SW480 και HCT116 κύτταρα συνήθως διατηρούνται σε τροποποιημένο Dulbecco μέσο Eagle συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (HyClone, Logan, UT). LoVo, DLD-1 και SW1116 διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 συν 10% ορό εμβρύου μόσχου. NCM460 αναπτύχθηκαν σε Μ3: 10 μέσο. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή κάτω από 5% CO

2.

Δημιουργία σταθερών BIRC6-knockdown κλώνοι

λεντοϊών μεταγωγή χρησιμοποιήθηκε για τον καθορισμό BIRC6 knockdown σταθερών κλώνων. Μια ομάδα shRNA (σύντομη φουρκέτα RNA) φορείς λεντοϊών διέφεραν σε αλληλουχίες BIRC6-στόχευσης (TRCN0000041-57 ~ 61) και pLKO.1-puro κενό φορέα αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich (St Louis, ΜΟ, USA). Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν σε ΜΟΙ 1 για 24 ώρες, σε διαλογή με πουρομυκίνη. Η αποτελεσματικότητα της αναστολής προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western.

κηλίδωση Western

παχέος εντέρου ή του ιστού συγκομίζονται κύτταρα ομογενοποιήθηκαν σε SDS ρυθμιστικού λύσης (40 mM Tris ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % SDS, 1 mM απρωτινίνη, 1 mM PMSF και 10 mg /ml λευπεπτίνη) και στη συνέχεια φυγοκεντρείται για 15 λεπτά στους 4 ° C. Η ολική πρωτεΐνη λύματα που προέρχονται από τα δείγματα ποσοτικοποιήθηκαν με BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Ένα κλάσμα πρωτεΐνης έβρασε με ρυθμιστικό φόρτωσης πρωτεΐνης επί 5 λεπτά, και φορτώθηκε σε SDS γέλη πολυακρυλαμιδίου. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με 8% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) χρησιμοποιώντας μια συσκευή mini-blot trans (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν με PBS-0,05% Tween 20 που περιείχε 5% άπαχο ξηρό γάλα για 1 ώρα, ακολουθούμενη από επώαση με αντίσωμα εναντίον BIRC6 ή αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης αντίσωμα σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Η μεμβράνη στη συνέχεια επωάστηκε με δευτερογενές horseradish υπεροξειδάση-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού ή αντίσωμα αντι-ποντικού (Jackson Immune Research Laboratories Inc, West Grove, ΡΑ). Οι κηλίδες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας μια βελτιωμένη κιτ χημειοφωταύγειας (Tiangen, Κίνα). Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Co., Kumamoto, Japan) σύμφωνα με με τις οδηγίες του προμηθευτή. Τα κύτταρα επωάστηκαν με CCK-8 για 1 ώρα με 3 πολλαπλάσια και ο ρυθμός πολλαπλασιασμού εκτιμήθηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 450 nm με την καθολική Micro-πλάκα Reader. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές [25].

Colony δοκιμασία σχηματισμού

Anchorage ανεξάρτητη ικανότητα ανάπτυξης μετρήθηκε με τη χρήση δοκιμασία μαλακού άγαρ σχηματισμού αποικίας και δοκιμασία σχηματισμού αποικίας πλάκα αντίστοιχα. Για μαλακό άγαρ σχηματισμό αποικιών, τον έλεγχο ή σταθερή BIRC6-knockdown κυττάρων (1 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) επαναιωρήθηκαν σε DMEM ή RPMI 1640 που περιέχει 0,3% ευγενή αγαρόζης (Takara Shuzo Co., Tokyo, Japan) σε έξι- φρεατίων. Το αιώρημα που πάνω DMEM ή RPMI 1640 που περιέχει 0,6% ευγενή αγαρόζης και περαιτέρω καλύπτονται με 0.5 ml ϋΜΕΜ ή RPMI 1640. Τα τρυβλία μετά επωάστηκαν σε ένα 5% CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C για 14 ημέρες, με αναπλήρωση του μέσου κάθε δεύτερη μέρα. Αποικίες απεικονίστηκαν με τη χρήση της Nikon ECLIPSE TE300 και μακροσκοπικά ορατές αποικίες σε 3 τυχαία επιλεγμένους τομείς ανά πηγάδι μετρήθηκαν για τον ποσοτικό προσδιορισμό. Για δοκιμασία σχηματισμού αποικίας πλάκα, κύτταρα από διαφορετικές ομάδες που έλαβαν σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων (800 κύτταρα /φρεάτιο) για 2 εβδομάδες. Οι αποικίες βάφτηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες σε 20% μεθανόλη και αποικίες που περιέχουν περισσότερο από 50 κύτταρα μετρήθηκαν. Επιμετάλλωση αποτελεσματικότητα υπολογίστηκε ως:. Plating αποδοτικότητα = (αριθμός αριθμός επιμετάλλωση κελί /αποικία) × 100%, εις τριπλούν

κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης δοκιμασία

Η επίδραση της BIRC6 knockdown επί του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και σταθεροποιήθηκαν με παγωμένη αιθανόλη 70% στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Για την ανάλυση του περιεχομένου του DNA, τα κύτταρα επωάστηκαν με 50 μg /mL ιωδιούχου προπιδίου (Sigma, St. Louis, ΜΟ) με την παρουσία 100 μg /mL RNase και 0,2% Triton Χ-100 για 30 λεπτά στους 37 ° C. περιεχόμενο DNA προσδιορίστηκε στο BD FACSAria

II. Η κατανομή των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το Πρόγραμμα FlowJo. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν.

Για την ανάλυση απόπτωσης με κυτταρομετρία ροής, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-FU, CDDP, οξαλιπλατίνη ή CPT-11 (όλα από την Sigma, St. Louis, ΜΟ) [26]. Drug-επαγόμενη απόπτωση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας αννεξίνης V (BD Biosciences, San Jose, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

μοντέλα όγκων ξενομοσχεύματος

Είκοσι αρσενικά Balb /c γυμνών ποντικών (ηλικίας 4 εβδομάδων, 12-14 g) αγοράστηκαν από Πειραματόζωα Κέντρο της Σαγκάης Ινστιτούτου Life Science (Σαγκάη, Κίνα) και τέθηκαν υπό συγκεκριμένες συνθήκες χωρίς παθογόνα. Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις πραγματοποιήθηκε υπό αναισθησία με πεντοβαρβιτάλη νατρίου. DLD-1 κύτταρα (σταθερός BIRC6 knockdown 59 και των κλώνων ελέγχου, 10

6) σε 0.1 ml PBS εγχύθηκαν υποδορίως στην δεξιά πλευρά κάθε ποντικού. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν στις 4 εβδομάδες μετά την έγχυση? όγκοι αποκόπηκαν και ζυγίστηκαν. Ο όγκος του όγκου υπολογίσθηκε από τον τύπο: 0,5 × L × W

2 (L = μήκος όγκου? W = πλάτος του όγκου). Τα πειράματα σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τα κριτήρια που περιγράφονται στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των πειραματόζωων, που παρασκευάζεται από την Εθνική Ακαδημία Επιστημών και δημοσιεύονται από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας, καθώς επίσης εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Fudan.

η στατιστική ανάλυση

η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του IBM SPSS στατιστικού λογισμικού (έκδοση 17.0). Κατηγορικές μεταβλητές συγκρίθηκαν με χ

2 δοκιμών ή Συνέχεια Διόρθωση ή ακριβές εξετάσεις του Fisher ανάλογα με την περίπτωση. Συνεχείς μεταβλητές συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας Wilcoxon τεστ ranksum και ανεξάρτητη δύο δειγμάτων

t-test

. Μονοπαραγοντική ανάλυση διεξήχθησαν για να προσδιοριστούν οι παράγοντες που επηρεάζουν την επιβίωση της CRC. Πολυπαραγοντική ανάλυση έγιναν χρησιμοποιώντας το πολυπαραγοντικό μοντέλο παλινδρόμησης αναλογικού κινδύνου Cox. Οι καμπύλες επιβίωσης υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier (η δοκιμασία log-rank). Όλα τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου (SEM) από τρία ανεξάρτητα πειράματα και

P

-τιμές προσδιορίστηκαν από 2 όψεων δοκιμές. Η στατιστική σημαντικότητα εμφανίζεται ως *,

P

& lt? 0,05 ή **,

P

& lt? 0.01.

Αποτελέσματα

Ενισχυμένη έκφραση BIRC6 στο CRC κύτταρα γραμμές και κλινική CRC ιστούς

Εμείς ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά την έκφραση BIRC6 σε 7 κύτταρα CRC. Κηλίδωση Western έδειξε ότι BIRC6 υπερεκφράστηκε σε LoVo, SW620, DLD-1, ΗΤ-29, HCT116, SW480 και SW1116, ενώ ανιχνεύτηκε ασθενώς στο φυσιολογικό κολονικό επιθηλιακή κυτταρική γραμμή NCM460 (Σχήμα 1Α). Εμείς επόμενο πραγματοποιείται κηλίδωση Western για να εξετάσει την έκφραση BIRC6 σε 30 ζεύγη ιστούς CRC και των παρακείμενων nontumorous ιστούς. Τα δεδομένα υπονοείται ότι BIRC6 ανυψώθηκε σε ιστούς όγκων (Σχήμα 1Β). Έχουμε αξιολογηθεί περαιτέρω η έκφραση BIRC6 σε 126 ασθενείς CRC με ανοσοϊστοχημεία. Ως αποτέλεσμα, σημαντική χρώση BIRC6 ανιχνεύθηκε σε ιστούς CRC (θετική, 73, 126), ενώ η χρώση σε αντίστοιχοι φυσιολογικοί ιστοί ήταν πολύ ασθενέστερη (θετική, 17 126) (Εικ 1C και 1D). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η επαναληψιμότητα της κατάταξης μας έκφρασης BIRC6 βρέθηκε να είναι «σχεδόν τέλεια» (κ-τιμή, 0.816), όταν οι 126 διαφάνειες των ιστών CRC αξιολογήθηκαν από δύο ανεξάρτητους παρατηρητές. Τα ανωτέρω αποτελέσματα έδειξαν ότι BIRC6 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε κύτταρα CRC γραμμές και κλινική CRC ιστούς.

(Α) Εκφραση BIRC6 σε 1 ανθρώπινου κόλον υγιούς κυττάρου γραμμής και 7 κυτταρικές γραμμές CRC. Άνω πίνακα: Τυπική μοτίβα έκφρασης BIRC6 σε κυτταρικές σειρές NCM460 και CRC. Κάτω πίνακας: Σχετική ένταση BIRC6 ομαλοποιηθεί σε GAPDH. Δεδομένα παρούσα Μέση ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Β) Έκφραση BIRC6 σε 30 ζευγαρωμένα ιστούς CRC (Τ) και των παρακείμενων ιστών nontumorous (Ν). Άνω πίνακα: Τυπική μοτίβα έκφρασης BIRC6 στους ιστούς CRC. Κάτω πίνακας: Σχετική ένταση BIRC6 ομαλοποιηθεί σε GAPDH. (Γ) χρώση Ανοσοϊστοχημεία των BIRC6 σε ιστούς όγκων και αυτο-αντιστοιχισμένο παρακείμενες μη ογκογόνους ιστούς από τέσσερις αντιπροσωπευτικούς ασθενείς CRC. (D) Δεκάδες χρώση ανοσοϊστοχημείας των BIRC6 σε 126 περιπτώσεις. **

P

& lt? 0.01.

Η

Η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης BIRC6 και κλινικές παθολογικές

δεδομένων

Εμείς διερευνηθεί η συσχέτιση της έκφρασης BIRC6 με κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά σε 126 ασθενείς με CRC. Τα ασθενή κλινικά χαρακτηριστικά που αναφέρονται στον πίνακα S1. Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης BIRC6 και την ηλικία, το φύλο, τη θέση του όγκου, λεμφαδένα μετάσταση (Ν στάδιο), μακρινή μετάσταση (Μ φάση), τον τύπο ιστολογία, βαθμός διαφοροποίησης, την κατάσταση KRAS και την κατάσταση MSI. Ωστόσο, η έκφραση BIRC6 συσχετίζεται θετικά με το μέγεθος του όγκου (

P

= 0,044) και το βάθος εισβολή (στάδιο Τ) (

P

= 0,013) (Πίνακας 1).

Η

προγνωστική αξία της ενισχυμένης έκφρασης BIRC6

Kaplan-Meier και δοκιμασία log-rank χρησιμοποιήθηκαν για να καθορίσουν τη σχέση μεταξύ της έκφρασης BIRC6 και την πρόγνωση. ασθενείς CRC με θετική έκφραση BIRC6 έτειναν να έχουν μικρότερη συνολική επιβίωση (OS) και την ελεύθερη νόσου επιβίωση (DFS) (

P

= 0.001 και

P

= 0,010, αντίστοιχα) (Σχ 2Α και 2Β). Είμαστε δίπλα διαιρείται ασθενείς σε δύο ομάδες: καμία ομάδα χημειοθεραπείας και η χημειοθεραπεία ομάδα. Όπως έδειξε στο σχήμα 2C και 2D, η έκφραση BIRC6 συσχετίστηκε με το OS (

P

= 0,038) και DFS (

P

= 0,041) σε καμία ομάδα χημειοθεραπεία. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στην ομάδα χημειοθεραπεία (

P

= 0.003 και

P

= 0,010) (Εικ 2Ε και 2F). Η μονοπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι η θετική έκφραση BIRC6 σχετίστηκε με χειρότερη OS (

P

= 0,002) και DFS (

P

= 0,013) (Πίνακας 2). Άλλοι παράγοντες που συσχετίζονται με το OS ήταν Τ στάδιο, Ν στάδιο, το στάδιο Μ και το βαθμό του όγκου της διαφοροποίησης. Παράγοντες που επηρεάζουν την DFS περιλαμβάνονται Τ στάδιο, Ν στάδιο, την κατάσταση KRAS και την κατάσταση MSI. Επιπλέον, πολυπαραγοντική ανάλυση εντόπισε αυξημένο επίπεδο BIRC6 ένας παράγοντας κινδύνου τόσο για OS (

P

= 0,045) και DFS (

P

= 0,026) (Πίνακας 3).

η συνολική επιβίωση (Α) και την επιβίωση ελεύθερη νόσου (Β) μεταξύ των ασθενών με θετική και αρνητική έκφραση BIRC6 εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier και συγκρίθηκαν με τη δοκιμασία log rank. Συνολική επιβίωση (C) και ελεύθερη νόσου επιβίωση (D) εκτιμήθηκαν σε καμία ομάδα χημειοθεραπεία. Η συνολική επιβίωση (Ε) και την ελεύθερη νόσου επιβίωση (F) εκτιμήθηκαν στην ομάδα χημειοθεραπεία. Οι ασθενείς με όγκους IV στάδιο TNM εξαιρέθηκαν κατά την ανάλυση επιβίωσης ελεύθερης νόσου.

Η

Η

BIRC6 νοκ ντάουν ανέστειλε CRC κυτταρικού πολλαπλασιασμού

Από το cDNA πλήρους μήκους του BIRC6 εκτείνεται σε 14,5 kb, είναι δύσκολο να υπερεκφράζουν BIRC6 σε μια κυτταρική γραμμή. Αντ ‘αυτού, θα χρησιμοποιηθούν για λεντοϊού μεταγωγής για τη δημιουργία BIRC6 νοκ ντάουν σταθερούς κλώνους σε δύο κυτταρικές σειρές CRC: SW480 και DLD-1. Η έκφραση BIRC6 κάτω ρυθμισμένα παρατηρήθηκε σημαντικά σε δύο BIRC6-knockdown κυτταρικές σειρές (59 και 61), όπως φαίνεται με κηλίδωση Western (Σχήμα 3). Αυτοί οι δύο κλώνοι που χρησιμοποιούνται στην επακόλουθη ανάλυση.

(Α) BIRC6 knockdown αποδοτικότητα ήταν μαρτυρείται από κηλίδωση Western. (Β) σχετική έκφραση BIRC6 κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH υπολογίστηκε. **

P

& lt? 0,01 έναντι του ελέγχου.

Η

CCK-8 δοκιμασία έδειξε ότι BIRC6 knockdown ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων SW480 και DLD-1 σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο

in vitro

(Σχ 4Α ). δοκιμασία σχηματισμού αποικίας έδειξε ότι BIRC6 knockdown μειωμένο σχηματισμό αποικία στην άγαρ σε SW480 και κύτταρα DLD-1 (Εικόνα 4Β). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε σχηματισμό αποικίας σε πλάκες (Σχήμα 4C).

καμπύλες (Α) Η ανάπτυξη των κυττάρων ελέγχου (CS) και δύο BIRC6 knockdown κλώνοι (59 και 61). (Β) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του δοκιμασία μαλακού άγαρ σχηματισμού αποικίας και τα σχετικά επίπεδα των αποικιών σε BIRC6 knockdown κλώνους κανονικοποιήθηκαν με τον έλεγχο. (Γ) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του ποσοτικού προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας πλάκα και τα σχετικά επίπεδα των αποικιών σε BIRC6 knockdown κλώνους κανονικοποιήθηκαν με τον έλεγχο. Δεδομένα παρούσα Μέση ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα. **

P

& lt? 0,01 έναντι του ελέγχου.

Η

BIRC6 νοκ ντάουν που προκαλείται διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση S και μειωτικά κυκλίνη Α2, Β1, επίπεδα D1 και E1 στα κύτταρα CRC

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου έδειξε ότι το ποσοστό των κυττάρων στη φάση S αυξηθεί ενώ το ποσοστό των κυττάρων σε G2 /M φάση μειώθηκε μετά BIRC6 knockdown σε αμφότερες SW480 κύτταρα και DLD-1 κύτταρα (Σχήμα 5Α και 5Β), η οποία έδειξε ότι BIRC6 knockdown εμπόδισε τα κύτταρα CRC από την είσοδο του μιτωτική φάση . Για να ελέγξει εάν BIRC6 θα μπορούσε να ρυθμίσει τα γονίδια που εμπλέκονται στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, ανιχνεύσαμε την επίδραση της BIRC6 στην έκφραση αρκετών κυκλινών. Κηλίδωση Western έδειξε ότι BIRC6 knockdown μείωσε τα επίπεδα της κυκλίνης Α2, Β1, D1 και E1 στις δύο SW480 κύτταρα και DLD-1 κύτταρα (Σχ 5C).

(Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του κυτταρικού κύκλου αξιολογούνται με χρώση ΡΙ . (Β) Ποσοτικοποίηση της κατανομής του κυτταρικού κύκλου. Τα κύτταρα ελέγχου ήταν κύτταρα επιμολυσμένα με pLKO.1-puro κενό φορέα? KD-59 και KD-61 ήταν κύτταρα επιμολυσμένα με φορείς λεντοϊού shRNA διέφεραν σε BIRC6-ακολουθίες στόχευσης. (Γ) έκφραση της κυκλίνης Α2, Β1, D1 και E1 πραγματοποιήθηκαν με κηλίδωση Western για τον έλεγχο και των δύο knockdown κλώνων.

Η

BIRC6 knockdown ευαισθητοποιημένα κύτταρα CRC στη χημειοθεραπεία

in vitro

και

in vivo

η

Έχουμε διερευνήσει το ρόλο των BIRC6 σε chmosensitivity των κυττάρων ESCC. Αν και BIRC6 knockdown μόνο δεν διεγείρει απόπτωση σε κύτταρα SW480 και DLD-1 κύτταρα, BIRC6 knockdown ευαισθητοποιημένα κύτταρα SW480 και DLD-1 κυττάρων σε χημειο-επαγόμενη απόπτωση, συμπεριλαμβανομένων των 5-FU, CDDP, οξαλιπλατίνη και CPT-11 (Σχήματα 6Α και 6Β και S2). Το εύρημα ότι η BIRC6 knockdown ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων και ευαισθητοποιημένα κύτταρα CRC να χημειο-επαγόμενη απόπτωση

in vitro

μας ώθησε να προσδιορίσει αν εξασκεί μια παρόμοια επίδραση

in vivo

. Έλεγχος ή BIRC6 σταθερός knockdown κλώνους DLD-1 εμβολιάζονται υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς. Όταν όλα τα ζώα είχαν εγκατεστημένων όγκων κατά μέσο όρο από 50 έως 100 mm

3, tumorbearing ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με CDDP (4 mg /kg? Ε.π., δύο φορές την εβδομάδα) [27]. Η αντικαρκινική αποτελεσματικότητα μετρήθηκε με παρακολούθηση του όγκου του όγκου και του βάρους μετά τη θεραπεία. BIRC6 knockdown ελαφρώς ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου. Είναι ενδιαφέρον ότι, ο συνδυασμός των BIRC6 knockdown και θεραπεία CDDP ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου σε σύγκριση με κάθε BIRC6 knockdown ή θεραπεία CDDP μόνο του (Σχ 7Α και 7Β).

(Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του κυτταρικής απόπτωσης αξιολογήθηκε με Annexin V /PI χρώση στον έλεγχο (CS) και BIRC6 knockdown κύτταρα κατεργασμένα με CDDP (40 μΜ για SW480 ή 100 μΜ για DLD-1) για 24 ώρες ή όχι. (Β) Αντιπροσωπευτικές εικόνες των κυτταρικής απόπτωσης για τον έλεγχο και την BIRC6 knockdown κυττάρων επεξεργάστηκε με 5-FU (75 μg /mL για SW480 ή 50 μg /mL για DLD-1) επί 48 ώρες ή όχι. (Γ) Ποσοτικοποίηση του ρυθμού απόπτωσης. Δεδομένα παρούσα Μέση ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα. **

P

& lt? 0,01 έναντι του ελέγχου.

Η

DLD-1 κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με τον έλεγχο shRNA και BIRC6 knockdown shRNA (59) εγχύθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς. Tumorbearing ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με CDDP (4 mg /kg? Ε.π., δύο φορές την εβδομάδα). (Α) Το μέγεθος του όγκου παρακολουθήθηκε. (Β) Συνολικό βάρος όγκου κάθε ομάδα ποντικών καταγράφηκε. Δεδομένα παρούσα Μέση ± SEM από 5 ποντίκια από κάθε ομάδα. *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0.01.

Η

Συζήτηση

Η επίκτητη αντίσταση στην απόπτωση είναι ένα από τα καθοριστικά χαρακτηριστικά του καρκίνου [28]. ΙΑΡ, μία ομάδα πρωτεϊνών αντι-απόπτωσης που είναι εντόνως διατηρημένες εξελικτικά σε διάφορα είδη, είναι βασικοί ρυθμιστές της απόπτωσης [29]. BIRC6, επίσης, όπως ονομάζεται Απόλλων, είναι το μεγαλύτερο μέλος της οικογένειας ΙΑΡ με υπολείμματα 4830 αμινοξέων [12]. Είναι επίσης το μόνο γνωστό μέλος ΙΑΡ η οποία σχετίζεται μεμβράνη και εντοπίζεται στο διαμέρισμα Golgi και το θυλακιώδες σύστημα [30]. BIRC6 είναι πολύ συντηρημένη σε διάφορα είδη, γεγονός που υποδηλώνει μια κοινή βιολογική λειτουργία. Η ανάλυση της αλληλουχίας έδειξε ότι BIRC6 μοιράζονται περίπου 92% ταυτότητα αμινοξέος με τον Bruce, ένα μέλος της οικογένειας ΙΑΡ από το ποντίκι [12]. Επιπλέον, υπάρχει η Drosophila ομόλογο του BIRC6 ονομάζεται dBruce [31]. Αντίθετα με τις περισσότερες από τις άλλες ΙΑΡ θηλαστικών, BIRC6 έχουν δειχθεί ότι είναι απαραίτητα για τη βιωσιμότητα. Πλήρης απενεργοποίηση του γονιδίου Bruce οδήγησε στην περιγεννητική θνησιμότητα και καθυστέρηση της ανάπτυξης σε έμβρυα ποντικών μετά την εμβρυϊκή ημέρα 14 [32]. Ομοίως, η διαγραφή του Ο-τερματικό ήμισυ του Bruce προκάλεσε ενεργοποίηση κασπασών και απόπτωσης στον πλακούντα και λεκιθικό σάκο, και οδήγησε σε εμβρυονική θνησιμότητα [17]. Επιπλέον, πολλά αποδεικτικά στοιχεία δείχνουν ότι BIRC6 υπερεκφράστηκε σε μια ποικιλία καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων γλοιώματος, παιδική ηλικία

de novo

οξεία μυελογενή λευχαιμία, καρκίνο μαστού, νευροβλάστωμα, τον καρκίνο του προστάτη και καρκίνο του πνεύμονα μη μικρών κυττάρων, και η υπερέκφραση του BIRC6 συσχετίστηκε με καρκινογένεση, την εξέλιξη και την κακή πρόγνωση των κακοήθων όγκων [12,16,18,33,34,35]. Αν και η προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι BIRC6 ήταν ρυθμισμένη σε καρκίνο του παχέος εντέρου με τη χρήση μικροσυστοιχιών cDNA και ανάλυση qRT-PCR, η σχέση μεταξύ της έκφρασης και του παχέος BIRC6 εξέλιξης του καρκίνου δεν έχει μελετηθεί εκτενώς.

Στην παρούσα μελέτη, παρατηρήθηκε ότι η έκφραση του BIRC6 θα μπορούσε να ανιχνευθεί και στις δύο καρκίνο του παχέος εντέρου και των παρακείμενων ιστών, αλλά με διαφορετικό ποσοστό. Το επίπεδο των BIRC6 προφανώς ρυθμίζεται αυξητικά σε ιστούς CRC σε σύγκριση με τα γειτονικά nontumorous ιστούς. Δείξαμε επίσης ότι η υψηλή έκφραση της BIRC6 συσχετίστηκε με ανεπιθύμητα κλινικά και παθολογικά χαρακτηριστικά σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Επιπλέον, οι ασθενείς με θετική έκφραση BIRC6 έτειναν να επιβιώσουν μικρότερη και είχαν υψηλότερο κίνδυνο υποτροπής από αυτούς με αρνητική έκφραση BIRC6. Μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι η έκφραση BIRC6 συσχετίστηκε σημαντικά με το OS και DFS, υποδεικνύοντας ότι BIRC6 ήταν ένας προάγγελος της πρόγνωσης.

Επίσης, BIRC6 επίσης υπερεκφράζεται σε 7 κυτταρικές σειρές CRC. Εφαρμόσαμε προσέγγιση RNAi για την καταστολή της έκφρασης BIRC6 και να διερευνηθεί ο ρόλος της BIRC6 στην εξέλιξη CRC. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι knockdown του BIRC6 μειωμένη πολλαπλασιασμού CRC κύτταρο, το οποίο είναι συνεπές με την προηγούμενη μελέτη σε αρκετούς άλλους όγκους. Η ανάλυση του κυτταρικού κύκλου έδειξε ότι BIRC6 νοκ ντάουν οδήγησε σε μπλοκ S φάση, εμποδίζοντας έτσι τα κύτταρα CRC από την είσοδο στη μίτωση. Επιπλέον, βρήκαμε ότι BIRC6 knockdown μειωμένη κυκλίνη Α2, Β1, τα επίπεδα D1 και E1 σε κύτταρα CRC. Προτείναμε ότι τα μειωμένα επίπεδα κυκλίνες μπορούν να συμβάλουν στην BIRC6 νοκ ντάουν που προκαλείται μπλοκ S φάση. Συνεπής με την υπόθεσή μας, Lee

et al

. [36] βρέθηκε ότι η ένωση η οποία αποτελείται από ινοκιτιόλη μείωσε τα επίπεδα της κυκλίνης Α και κυκλίνη Ε και οδήγησε στη σύλληψη φάση S σε HCT116 και SW620 κυττάρων. Joe

et al

. [37] ανέφεραν ότι η ρεσβερατρόλη μείωσε τα επίπεδα των κυκλινών D1, Α, Β1 και και είχε ως αποτέλεσμα τη σύλληψη φάση S σε κύτταρα SW480. Ωστόσο, σε αντίθεση με τα αποτελέσματά μας, Kikuchi

et al

. [38] διαπίστωσε ότι BIRC6 ubiquitylated κυκλίνη Α και BIRC6 ανεπάρκεια συσσωρεύσει περισσότερα κυκλίνης Α σε κύτταρα 293Τ. Κατά συνέπεια, η επίδραση της BIRC6 επί κυκλίνες φαίνεται να εξαρτάται από τους τύπους των κυττάρων και πρωτεϊνών στόχων. Τέλος, βρήκαμε ότι το νοκ ντάουν BIRC6 ευαισθητοποιημένα κύτταρα CRC στη χημειοθεραπεία και

in vitro

και

in vivo

, η οποία παρέχει μια λογική για το συνδυασμό BIRC6 ανταγωνισμό με τη χημειοθεραπεία για τη θεραπεία της CRC.

Η παρούσα μελέτη έχει ορισμένους περιορισμούς. Για παράδειγμα, ο συσχετισμός μεταξύ BIRC6 και πρόγνωση προσδιορίστηκε σε έναν περιορισμένο αριθμό ασθενών CRC (n = 126), και ο συσχετισμός αυτός απαιτείται επιβεβαίωση σε βάση μεγαλύτερης κλίμακας. Με την ίδια λογική, το γεγονός ότι δεν παρατηρήσαμε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης BIRC6 και την κατάσταση της MSI χρειάζεται περαιτέρω έρευνα σε μεγαλύτερα δείγματα πριν μπορούν να εξαχθούν πιο σταθερή συμπεράσματα. Αξίζει να σημειωθεί ότι βρήκαμε ότι BIRC6 ρυθμίζονται εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μέσω της διαφοροποίησης των κυττάρων του κύκλου ρύθμισης των πρωτεϊνών. Ενώ ολοένα και περισσότερες ενδείξεις έχουν προτείνει μια βιολογική συσχέτιση μεταξύ της MSI και τροποποιήσεις του κυτταρικού κύκλου ρύθμισης των πρωτεϊνών στον καρκίνο [39,40].

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη παρέχει στοιχεία που αποδεικνύουν ότι λειτουργεί BIRC6 ως προγνωστικός παράγοντας της ανθρώπινης CRC. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι BIRC6 knockdown σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία μπορεί να έχουν θεραπευτικό δυναμικό στην θεραπεία της ανθρώπινης CRC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 συνόλου δεδομένων. Δεδομένων για όλα τα κηλίδωση Western, ανοσοϊστοχημεία και την επιβίωση

doi:. 10.1371 /journal.pone.0125281.s001

(DOCX)

S2 συνόλου δεδομένων. Τα δεδομένα για τον προσδιορισμό του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, του κυτταρικού κύκλου και δοκιμασία απόπτωσης και μοντέλα ξενομοσχεύματος όγκου

doi:. 10.1371 /journal.pone.0125281.s002

(DOCX)

S1 Εικ.