Αφηρημένο

RGS10 ρυθμίζει την ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου των ωοθηκών και την επιβίωση, και η έκφραση RGS10 καταστέλλεται στο κελί μοντέλα χημειοαντίσταση καρκίνου των ωοθηκών. Ωστόσο, οι μηχανισμοί που διέπουν την έκφραση RGS10 στον καρκίνο των ωοθηκών είναι ελάχιστα κατανοητή. Εδώ αναφέρουμε καταστολή RGS10 σε πρωτογενή καρκίνο των ωοθηκών και CaOV-3 ωοθηκών καρκινικά κύτταρα συγκριτικά με κύτταρα αθανατοποιημένη επιφάνεια επιθηλιακών ωοθηκών (IOSE), και Α2780-AD στη χημειοθεραπεία κυττάρων σε σύγκριση με γονικά κύτταρα Α2780. Οι RGS10-1 και RGS10-2 μεταγραφές εκφράζονται σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, αλλά μόνο RGS10-1 καταστέλλεται σε Α2780-AD και τα κύτταρα CaOV-3, και ο προαγωγός RGS10-1 μοναδικά εμπλουτισμένο σε CpG δινουκλεοτίδια. Φαρμακολογική αναστολή της DNA μεθυλο-τρανσφεράσης (DNMTs) αυξημένη έκφραση RGS10, γεγονός που υποδηλώνει την πιθανή ρύθμιση από μεθυλίωση του DNA. ανάλυση Bisulfite αλληλούχιση εντοπιστεί μία περιοχή του υποκινητή RGS10-1 με σημαντικά ενισχυμένη μεθυλίωση του DNA σε χημειοθεραπεία κύτταρα Α2780-AD σε σχέση με τα γονικά κύτταρα Α2780. Μεθυλίωσης του DNA σε CaOV-3 και IOSE κυττάρων ήταν παρόμοια με τα κύτταρα Α2780. Πιο σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν σε ακετυλίωση ιστονών του υποκινητή RGS10-1. Ακετυλιωμένο H3 ιστόνης συνδέονται με τον υποκινητή RGS10-1 ήταν σημαντικά χαμηλότερη στα κύτταρα Α2780-Αϋ σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα, με αντίστοιχη αύξηση της αποακετυλάσης ιστόνης (HDAC) ένζυμο σύνδεσης. Ομοίως, ακετυλιωμένο ιστόνης επίπεδα στον υποκινητή RGS10-1 ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε CaOV-3 κύτταρα σε σύγκριση με κύτταρα IOSE και HDAC1 πρόσδεση διπλασιάστηκε σε CaOV-3 κύτταρα. Τέλος, δείχνουμε ότι η φαρμακολογική αναστολή της DNMT ή HDAC ένζυμα σε χημειοθεραπεία κύτταρα Α2780-Αϋ αυξάνει την έκφραση και ενισχύει RGS10 τοξικότητα σισπλατίνης. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ιστόνης de-ακετυλίωση και μεθυλίωση DNA συσχετίζονται με καταστολή RGS10 και χημειοαντίσταση στον καρκίνο των ωοθηκών. Δείκτες για την απώλεια της έκφρασης RGS10 μπορεί να εντοπίσει καρκινικά κύτταρα με τη μοναδική απάντηση στην θεραπευτική

Παράθεση:. Ali MW, Cacan Ε, Liu Υ, Pierce JY, Creasman WT, Murph MM, et al. (2013) Μεταγραφική καταστολή, μεθυλίωση του DNA, και απακετυλίωση ιστόνης του ρυθμιστή της G-πρωτεΐνης σηματοδότησης 10 (RGS10) Gene στο ωοθηκών καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 8 (3): e60185. doi: 10.1371 /journal.pone.0060185

Ακαδημαϊκό Συντάκτης: James Porter, Πανεπιστήμιο της Βόρειας Ντακότα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20 Νοεμ, 2012? Αποδεκτές: 22 Φεβρουαρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 22 Μάρτη του 2013

Copyright: © 2013 Ali et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση το έργο αυτό προβλέπεται από τις επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) (CA151006 να SBH και ΜΜ, CA131200 να STE), την αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία (σε SFG), και η Marsha Rivkin Κέντρο για καρκίνο των ωοθηκών Ερευνών (στο SBH). (Www.nih.gov/, www.cancer.org/, www.marsharivkin.org/) Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου.

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα καρκινικά κύτταρα εκμεταλλεύονται πολλαπλές αύξηση των υποδοχέων και την επιβίωση οδών σηματοδότησης, προκειμένου να αποφύγει την κανονική ηρεμία και κυτταρικό θάνατο απαντήσεις. Η ενίσχυση αυτών των οδών είναι ένα κοινό μηχανισμό εξέλιξης του καρκίνου. Η ενεργοποίηση των υποδοχέων που συνδέονται με G-πρωτεϊνη ο συνδέτες λυσοφωσφατιδικό οξύ (LPA), ενδοθηλίνη, στρωματικά προερχόμενο αυξητικός παράγοντας-1 (SDF1), προσταγλανδίνες, και θρομβίνη συμβάλλουν στην εξέλιξη των πολλαπλών καρκίνων, και τα φάρμακα που μπλοκάρουν αυτούς τους υποδοχείς είναι επί του παρόντος σε διάφορες στάδια των κλινικών δοκιμών ως θεραπευτικές του καρκίνου [1]. Αυτές οι GPCRs ξεκινήσει την ανάπτυξη και την επιβίωση σηματοδότησης καταρράκτες, με την ενεργοποίηση κυτταρικών G-πρωτεΐνες. δραστικότητα G-πρωτεΐνη τερματίζεται με ρυθμιστής της σηματοδότησης G-πρωτεΐνη (RGS) πρωτεΐνες που απενεργοποιούν ταχέως G-πρωτεΐνες και να ελέγχει την ένταση και τη διάρκεια του GPCR-ξεκίνησε οδών [2]. Οι RGS πρωτεΐνες που καταστέλλουν ογκογόνα σήματα που προκαλούνται από συνδετήρες GPCR έτοιμη για να αναστέλλουν την ανάπτυξη του καρκίνου. Πράγματι, οι συγκεκριμένες RGS πρωτεΐνες έχουν δειχθεί ότι καταστέλλουν την ανάπτυξη των υποδοχέων που διεγείρονται και σηματοδότησης επιβίωσης σε μαστού, του προστάτη, των ωοθηκών και του καρκίνου [3] – [5]

Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η κύρια αιτία θανάτου από γυναικολογικών καρκίνων. και η πέμπτη πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο στις γυναίκες. Λιγότερο από το 50% των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών επιβιώνουν πέντε χρόνια μετά τη διάγνωση τους [6]. Αν και ο καρκίνος των ωοθηκών χαρακτηρίζεται από υψηλό ποσοστό ανταπόκρισης στη χημειοθεραπεία, υψηλό ποσοστό θνησιμότητας της οφείλεται σε μεγάλο βαθμό στην ανάπτυξη αντοχής στους παράγοντες πρώτης γραμμής χημειοθεραπευτικών [7]. Η πλειονότητα των ασθενών που αντιδρούν αρχικά στη χημειοθεραπεία θα υποτροπιάσουν με χημειοθεραπεία ασθένεια μέσα σε δύο χρόνια [8]. Η κατανόηση των μοριακών και γενετικών αλλαγών που οδηγούν την εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών και την ανάπτυξη των κεκτημένων χημειοαντίσταση μπορεί να οδηγήσει σε στρατηγικές για την πρόβλεψη και την πρόληψη της εμφάνισης των πυρίμαχων νόσου.

Έχουμε δείξει ότι η ενδογενής RGS πρωτεΐνες καταστέλλουν την ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, μετανάστευση και ενεργοποίηση ΜΑΡ κινάσης σε απόκριση σε LPA, ένας σημαντικός αυτοκρινής αυξητικός παράγοντας για τον καρκίνο των ωοθηκών [3], [9]. Πιο πρόσφατα, έχουμε εντοπίσει RGS10 ως σημαντικός ρυθμιστής της κυτταρικής επιβίωσης και χημειοαντίσταση. έκφραση μεταγράφου RGS10 ρυθμίζεται μειωτικά σε πολλαπλά μοντέλα επίκτητης χημειοαντίσταση στον καρκίνο των ωοθηκών, και τα επίπεδα έκφρασης RGS10 μεταβάλλει την ευαισθησία των ωοθηκών των καρκινικών κυττάρων στη σισπλατίνη και ταξάνη κυτταροτοξικότητα [10]. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι η καταστολή της έκφρασης RGS10 μπορεί να συμβάλει στην εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών και την ανάπτυξη των χημειοαντίσταση με ενίσχυση GPCR μεσολάβηση της ανάπτυξης και οδούς σηματοδότησης επιβίωσης. Ωστόσο, ο μηχανισμός της καταστολής της έκφρασης RGS10 στον καρκίνο των ωοθηκών δεν έχει τεκμηριωθεί.

έκφραση πρωτεΐνης RGS δυναμικά ρυθμίζεται νευρικά και καρδιαγγειακό σύστημα [11] και σε πρόοδο του καρκίνου [12], που επιτρέπει τον έλεγχο συγκρότημα GPCR οδούς σηματοδότησης. Μεταγραφική και μετα-μεταφραστική τους μηχανισμούς ελέγχου της έκφρασης RGS έχουν ορισθεί σαφώς [13] – [16], ενώ επιγενετική έλεγχο της έκφρασης RGS με ομοιοπολικές τροποποιήσεις στο DNA ή ιστόνες έχει σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητη. Γονιδιακή σίγηση με μεθυλίωση του DNA και απακετυλίωση ιστόνης είναι μια καθιερωμένη μηχανισμός σε πρόοδο πολλών καρκίνων [17], συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου των ωοθηκών [18] – [20]. Η προσθήκη ομάδων μεθυλίου σε CpG δινουκλεοτίδια με DNA μεθυλ τρανσφεράσης (DNMT) ένζυμα και η απομάκρυνση των ομάδων ακετυλίου επί υπολειμμάτων λυσίνης σε πρωτεΐνες ιστόνης με αποακετυλάσης ιστόνης (HDAC) Ένζυμα συντονισμένα καταστέλλουν την μεταγραφική δραστικότητα [21]. DNA μεθυλίωση και την αύξηση της έκφρασης DNMT στην πρόοδο του καρκίνου των ωοθηκών [22], και αποακετυλάσες ιστόνης (HDACs) επίσης υπερεκφράζονται σε ιστούς με καρκίνο των ωοθηκών [23]. Αυτό υποδηλώνει ότι επιγενετική ρύθμιση των γονιδίων RGS μπορεί επίσης να συμβάλει στην δυναμική έκφραση τους στην εξέλιξη του καρκίνου.

Στην παρούσα μελέτη, διερευνήσαμε την επιγενετική ρύθμιση της έκφρασης RGS10 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Εστιάζουμε σε δύο μοντέλα της καταστολής RGS10 – CaOV-3 ωοθηκών καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με καλοήθη επιθηλιακά κύτταρα των ωοθηκών, και στη χημειοθεραπεία κύτταρα Α2780-AD και χημειοευαίσθητων γονικών κυττάρων τους. Έχουμε εντοπίσει σημαντικές αυξήσεις στην μεθυλίωσης του DNA σε χημειοθεραπεία κύτταρα, και αξιοσημείωτες μειώσεις στην ακετυλίωση των ιστονών και αυξήσεις σε συνεργασία HDAC1 στο υποστηρικτής RGS10 στις δύο CaOV-3 και Α2780-AD κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι επιγενετικές τροποποιήσεις των ιστονών μπορεί να συμβάλει στην απώλεια της έκφρασης RGS10 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών και ότι η μεθυλίωση του DNA μπορεί να συμβάλει στην περαιτέρω απώλεια της έκφρασης κατά τη διάρκεια αποκτηθεί χημειοαντίσταση.

Πειραματικές Διαδικασίες

Cells και αντιδραστήρια

CaOV-3 και SKOV-3 κύτταρα αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ATCC) και μέσης McCoy 5Α (Mediatech, Inc.), αντίστοιχα, συμπληρωμένο με 10% FBS (ΡΑΑ Laboratories, Inc.). Η χημειοευαίσθητων Α2780 γονική κυτταρική σειρά και πολυανθεκτική κόρη ομόλογό κύτταρα Α2780-AD της (που προέρχεται όπως περιγράφεται [24]) έχουν γενναιόδωρα από τον Dr. Bob Brown, Imperial College του Λονδίνου. Αυτά τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (ATCC) συμπληρωμένο με 10% FBS και 5 mM L-γλουταμίνη. Χημειοθεραπεία κύτταρα περαιτέρω διατηρήθηκαν σε 1,5 μΜ cisplatin. Απαθανάτισε επιθηλιακά κύτταρα της επιφάνειας των ωοθηκών (IOSE-80, [25]) έχουν γενναιόδωρα από τον Dr. Nelly Auersperg (University of British Columbia) και διατηρούνται στο Media 199: MCDB 105 (1:01) συμπληρωμένο με 15% FBS. Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 5 mM πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη στους 37 ° C με διοξείδιο του άνθρακα 5%.

5-Αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη και σισπλατίνη αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Τα αντισώματα που αναγνωρίζουν ιστόνης Η3 και ακετυλιωμένης ιστόνης Η3 ήταν από την Millipore (Lake Placid, ΝΥ). Αντίσωμα που αναγνωρίζει Η3 ιστόνης (ακετυλο Κ18) ήταν από Abcam (Cambridge, ΜΑ). Αντισώματα που αναγνωρίζουν RGS10 και HDAC1 ελήφθησαν από Σάντα Κρουζ (Santa Cruz, CA).

κυτταρικές δοκιμασίες Βιωσιμότητας

1 × 10

4 Α2780 ή Α2780-AD κύτταρα σπάρθηκαν σε τρία αντίτυπα στην 96-φρεατίων πλάκες και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες πριν από τη θεραπεία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης για 48 ώρες. κυτταρική ανάλυση βιωσιμότητας διεξήχθη σε ορό ελεύθερο μέσα που περιέχουν αντιδραστήριο CellTiter-Blue® (Promega Corporation) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10].

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

mRNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ ( Invitrogen) και cDNA συντέθηκε από 2 μg ολικού RNA με τη χρήση της υψηλής χωρητικότητας Reverse Transcriptase cDNA kit (Applied Biosystems /Life Technologies). Ποσοτική πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματοποιήθηκε με χρήση κιτ Superscript III για RT-PCR (Invitrogen) και Power SYBR Green αντιδραστήριο (Applied Biosystems). Οι αντιδράσεις ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το γονίδιο GAPDH οικοκυρική και οι υπολογισμοί πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με το 2

-ddCT μέθοδο. Fold μεταβολή στην έκφραση προσδιορίστηκε εις τριπλούν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα, και πειραματικών αντιγράφων ελέγχθηκαν για σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων με τη χρήση ζευγών t-tests. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν βασίστηκαν σε αλληλουχίες αλγόριθμο που δημιουργείται από Primer Τράπεζα (https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/). RGS10 Forward: GAC CCA ΟΑΑ ΟΟΟ ΟΤΟ ΑΑΑ AGA, RGS10 Αντίστροφη: GCT GGA CAG ΑΑΑ GGT CAT GTA GA, RGS10 παραλλαγή-1 Forward: CCC ΟΟΟ ΟΟΟ ATG TTC AAC C, RGS10-παραλλαγή-1 αντίστροφη: CTC CAG GGA TGC ΚΕΔ CCA TT, RGS10-παραλλαγή-2 Forward: TGC ΟΤΟ GAA CTT CTC ΑΓΓ ΤΟΟ ACA, RGS10 παραλλαγή-2 Reverse: CCG CCC ΑΤΤ ΤΟΟ CTG TGC TCT, RGS2 Forward: ΑΑΟ ΑΤΤ GGA AGA CCC Γ.Ο.Σ. TGA G, RGS2 Αντίστροφη: GCA AGA CCA ΤΑΤ TTG CTG GCT, RGS5 Forward: CCC ACT CAT GCC TGG ΑΑΑ GG, RGS5 Αντίστροφη: CTT GGC ΤΟΟ ΤΤΤ CTC ΤΟΟ CT, GAPDH Forward: GCC AAG GTC ATC CAT GAC AAC Τ, GAPDH Αντίστροφη: GAG GGG CCA TCC ACA GTC ΤΤ.

για να προσδιοριστεί η επίδραση της έκθεσης 5-Αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη για έκφραση μεταγράφου RGS, 7 × 10

5 SKOV-3 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας ιστού 100 mm και αφήνονται να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Την επόμενη ημέρα, μέσο αναρροφήθηκε και αντικαταστάθηκε με 20 μΜ 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης για τον έλεγχο του οχήματος DMSO ή DMSO. Μετά από 3, 5, 7 και 9 ημέρες επώασης φαρμάκου, το μέσο αναρροφήθηκε και προστέθηκαν 7 mL αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen). απομόνωση RNA, σύνθεση του DNA, και qRT-PCR πραγματοποιήθηκαν όπως παραπάνω.

Απομόνωση του καρκίνου των ωοθηκών κύτταρα από την περιτοναϊκή ασκίτη

περιτοναϊκή ασκίτη από ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών στο Ιατρικό Πανεπιστήμιο της Νότιας Καρολίνας (MUSC ) ελήφθησαν υπό MUSC Διοικητικό Institutional Review (IRB) πρωτόκολλο # 18983, η οποία περιελάμβανε μια κριτική της ηθικής της μελέτης και συγκεκριμένα ενέκρινε τη μελέτη. Αυτό το πρωτόκολλο περιλαμβάνει τη χρήση των ανθρώπινων δειγμάτων de-εντοπίστηκαν για τη μελέτη της έκφρασης και την τροποποίηση των πρωτεϊνών που εμπλέκονται σε κυτταρικές σηματοδότηση και αντοχή φαρμάκου σε πρωτογενή καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Απομάκρυνση της περιτοναϊκής ασκίτη είναι ένα πρότυπο φροντίδας για ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών και ο ασκίτης συνήθως απορρίπτεται. Όλα τα δείγματα που ελήφθησαν de-εντοπίστηκαν πριν από την παράδοση σε εργαστηριακό προσωπικό. Οι ασθενείς ενημερώθηκαν για την επιλογή να συμμετάσχουν στη μελέτη και προφορική συγκατάθεση λήφθηκε από τον ιατρό. Γραπτή συγκατάθεση κρίθηκε κίνδυνο για τον ασθενή εμπιστευτικότητας από την IRB μετά την υπογραφή ένα έντυπο συγκατάθεσης για την άδεια να χρησιμοποιήσει ένα δείγμα αποχαρακτηριστούν θα είναι η μόνη καταγραφή της ταυτότητας και της συμμετοχής των ασθενών, και ως εκ τούτου ο μόνος κίνδυνος παραβίασης στο απόρρητο του ασθενούς. Ένα ρεκόρ των δειγμάτων που λαμβάνονται στο εργαστήριο ήταν συνδεδεμένοι μόνο από την ημερομηνία της συλλογής. Απομάκρυνση της περιτοναϊκής ασκίτη είναι ένα πρότυπο φροντίδας για ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών. Δεν υπάρχουν πληροφορίες ασθενής προσδιορισμό λήφθηκε από ερευνητές στο εργαστήριο. Περιτοναϊκή ασκίτη φυγοκεντρήθηκαν στις 1000 rpm για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και τα σφαιρίδια του κυττάρου πλύθηκαν με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS). Τα ερυθρά αιμοσφαίρια υποβλήθηκαν σε λύση σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης RBC (eBioscience, San Diego, CA) για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το ρυθμιστικό διάλυμα λύσεως αραιώνεται με PBS, τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν όπως παραπάνω και επαναιωρήθηκαν σε μέσο RPMI με 10% FBS. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 1 ώρα στους 37 ° C με 5% CO2 για να επιτραπεί η σύνδεση των ινοβλαστών και των μακροφάγων. Τα μη συνδεδεμένα επιθηλιακά κύτταρα απομακρύνθηκαν και επωάστηκαν χωριστά σε πλήρες μέσο RPMI που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου.

Rgs10 ανοσοστυπώματα

Για την αξιολόγηση της έκφρασης RGS10 στην πρωτοβάθμια ασκίτη και τα κύτταρα IOSE, λύματα κυττάρων παρήχθησαν σε RIPA ρυθμιστικού (50 mM Tris ρΗ 7,4, 10% γλυκερόλη, 150 mM NaCl, 1% Triton Χ100, 0.5% SDS, 0.5 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 5 mM Na4P2O7, 40 mM β-γλυκεροφωσφορικό, 50 mM NaF, 2 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο φθορίδιο και απροτινίνη). Μετά κατεργασία με υπερήχους και φυγοκέντριση, ίσες ποσότητες διαλυτής πρωτεΐνης έτρεξαν σε ένα πήκτωμα 10-12% δϋδ PAGE, μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη, και ανοσοστυπώθηκαν με RGS10 αντίσωμα. Για την αξιολόγηση της έκφρασης RGS10 σε κυτταρικές σειρές, 10

5 κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS-PAGE. Τα προϊόντα λύσης έβρασαν για πέντε λεπτά και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας SDS-PAGE. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με RGS10 πρωτογενή αντισώματα (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) και συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα κουνελιού (Pierce) και οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια ECL (Pierce). Οι μεμβράνες στη συνέχεια καθάρισε με αντισώματα GAPDH (Life Technologies) ως έλεγχος φόρτωσης.

Bisulfite αλληλουχίας

Η ιστοσελίδα Methprimer [26] (https://www.urogene.org/methprimer/index1 .html) χρησιμοποιήθηκε για να αναλύσει το περιεχόμενο CpG των προαγωγών RGS και να σχεδιάσουν εκκινητές που στοχεύουν διαφορετικές περιοχές στον υποκινητή RGS10-1. Τέσσερα διαφορετικά ζεύγη εκκινητών σχεδιάστηκαν, RGS10-BS1, RGS10-BS2, RGS10-BS3 και RGS10-BS4: RGS10-BS1forward: ΑΑΟ ΑΑΑ ATG GGG Γ.Ο.Σ. ΑΑΤ GAT ΑΤΤ Τ, RGS10-BS1reverse: TAC CTC ΤΑΑ CAA AAC CTT CAA ACT C , περιοχή ενίσχυση RGS10-BS1: -121.303.236000000–121303086000000 εκατομμύρια. RGS10-BS2forward: TGT ΤΤΤ ΤΑΑ AGT TAG AGA AGT Γ.Ο.Σ. Τ, RGS10-BS2reverse: CAC ΑΑΑ CTA ΑΑΑ AAC CTA AAC CTC, περιοχή ενίσχυσης RGS10-BS2: -121303076000000000000–121302726000000000000 τρισεκατομμύρια. RGS10-BS3forward: GAG GAG GTA AAG GTT ΑΤΑ GGT ΤΟΟ, RGS10-BS3reverse: AAA TAC ACT AAC CCA ΑΑΑ ΑΑΑ ACC CC, περιοχή ενίσχυσης RGS10-BS3: -121.302.800000000–121302514000000 εκατομμύρια. RGS10-BS4forward: Γ.Ο.Σ. ΤΟΟ ΤΤΑ GGA GGA GG, RGS10-BS4reverse: CTC ΥΠΑ TCT ΑΑΑ ΑΑΑ TAC CAC, περιοχή ενίσχυσης RGS10-BS4:. -121.302.327000000000000–121.301.988000000000000 Τρισεκατομμύρια

Το γονιδιακό DNA συλλέχθηκε από τα κύτταρα και bisulfite- μετατρέπονται χρησιμοποιώντας EZ μεθυλίωσης του DNA-Direct Kit (Zymo Research Corp). ZymoTaq ™ DNA πολυμεράση (Zymo Research Corp) χρησιμοποιήθηκε για την ενίσχυση των διαφόρων περιοχών της RGS10 υποκινητή του κατεργασμένου με όξινο θειώδες γονιδιωματικού DNA και τα προϊόντα PCR αναλύθηκαν με πηκτώματα 2.5% DNA-αγαρόζης και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας PureLink Quick Gel Extraction και Kit PCR καθαρισμός Combo (Invitrogen ). Τα καθαρισμένα προϊόντα συνδέθηκαν σε πλασμίδια χρησιμοποιώντας StrataClone PCR Cloning Kit (Agilent Technologies) που στη συνέχεια μετασχηματίστηκαν σε ικανά βακτήρια. 20 μεμονωμένες αποικίες απομονώθηκαν από τις πλάκες LB-agar καρβενικιλλίνη και να επεκταθούν. Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen Sample & amp? Δοκιμασία Technologies) χρησιμοποιήθηκε για τον καθαρισμό των πλασμιδίων από κάθε αποικία, τα οποία στη συνέχεια αποστέλλονται για προσδιορισμό αλληλουχίας χρησιμοποιώντας Τ7 ή /και Τ3 πριμοδότες προσδιορισμού αλληλουχίας υποκινητή στο UGA Genomics διευκόλυνσης. αλληλουχίες Κλώνος υποβλήθηκαν σε οθόνες για την ποιότητα και την πλήρη μετατροπή, και να στοιχηθούν με προαγωγέα DNA γονιδιωματικού RGS10 χρησιμοποιώντας λογισμικό BIQ Analyzer [27].

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (chip) Δοκιμασία

Τα κύτταρα απλώνονται σε μια πυκνότητα 2,5 × 10

6 σε 15 πλάκες καλλιέργειας cm-ιστού και σταυροειδείς δεσμούς με 1% φορμαλδεΰδη για 8 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η αντίδραση διασύνδεσης διακόπηκε με την προσθήκη 0.125 Μ γλυκίνη για πέντε λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. πυρήνες των κυττάρων απομονώθηκαν και συμπυκνώθηκαν με λύση σε φρέσκο ​​ρυθμιστικό λύσης SDS (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris ρΗ 8,0, dH

2O) συν αναστολείς πρωτεάσης για 25 λεπτά σε πάγο που ακολουθείται από flash κατάψυξη σε υγρό άζωτο. Πυρήνες υποβλήθηκαν σε υπερήχους χρησιμοποιώντας ένα Bioruptor λουτρό υπερήχων για 30 δευτερόλεπτα «On», 30 δευτερόλεπτα «Off» 3X να παράγει κατά μέσο όρο 500 bp από κομμένο DNA. DNA διάτμηση επιβεβαιώθηκε με την υποβολή λύματα σε ηλεκτροφόρηση και οπτικοποίηση 1% πήκτωμα αγαρόζης με ασφαλή βαφή SYBR. Σε υπερήχους προϊόντα λύσης στη συνέχεια προκαταρκτική διαύγαση με χάντρες σπέρματος σολομού /αγαρόζης (Upstate) και 5% του συνολικού προϊόντος λύσης αποθηκεύονται ως είσοδος για ομαλοποίηση. Το ήμισυ του υπόλοιπου προϊόντος λύσεως ανοσοκαταβυθίζεται με 5 μg ενδεικνυόμενο αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C και το άλλο ήμισυ ανοσοκαταβυθίζεται με αντίσωμα ελέγχου. Μετά από δύο επιπλέον ώρα ανοσοκαταβύθιση με 60 μΙ σφαιριδίων αγαρόζης επικαλυμμένα σπέρματος σολομού, όλα τα δείγματα πλύθηκαν με κάθε ένα από τα ακόλουθα ρυθμιστικά διαλύματα: ρυθμιστικό διάλυμα χαμηλού άλατος (0.1% SDS, 1% Triton Χ-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris ρΗ 8,0, 150 mM NaCl, dH2O), ρυθμιστικό υψηλού άλατος (0.1% SDS, 1% Triton Χ-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris ρΗ 8,0, 500 mM NaCl, dH2O), LiCI (0.25Μ LiCl, 1% ΝΡ40, 1% DOC, 1 mM EDTA, 10 mM Tris ρΗ 8,0, dH2O), και 1xTE. DNA εκλούστηκε με ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης SDS (1% SDS, 0,1 Μ NaHCO3, dH2O). Μετά την έκλουση, διασυνδέσεις αντιστράφηκαν τη διάρκεια της νύχτας με 5 Μ NaCl στους 65 ° C και ανοσοκατακρημνίσθηκαν DNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας φαινόλη: χλωροφόρμιο: ισοπροπανόλη μίγματος (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Απομονωμένα DNA ποσοτικοποιήθηκε με πραγματικού χρόνου PCR σε ένα ΑΒΙ PRISM 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA) χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές και ανιχνευτή για RGS10: προς τα εμπρός, 5′-GGA ACC GCG AGT CCT CAC-3 ‘, αντίστροφη, 5’ -CCC GGA GCT CTA GGT CCC-3 ‘και ο ανιχνευτής, 5′-ΤΟΟ CTA GGA GGA GGG CGG CG-3′? και για GAPDH: διαβιβάσει, 5’-ΑΑΤ GAA TGG GCA GCC GTT Α-3 ‘, αντίστροφη, 5′-TAG ΚΔ ΚΕΔ TCC ACC TGA CT-3′ και ο ανιχνευτής, 5’-ΚΔ GCC GGT GAC ΤΑΑ CCC TGC GCT ΚΔ -3 ‘. Τιμές που προκύπτουν από Real Time PCR αντιδράσεις υπολογίζεται με βάση τις τυπικές καμπύλες που δημιουργούνται, έτρεξαν εις τριπλούν αντιδράσεις, και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα SDS 2.0.

Αποτελέσματα

Καταστολή της Rgs10 Έκφραση Σε καρκίνου των ωοθηκών κύτταρα

προηγούμενα δεδομένα μας έδειξαν υποστροφή των RGS10 μεταγραφές σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών με επίκτητη χημειοαντίσταση [10]. Για να προσδιοριστεί εάν RGS10 επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω σε πρωτογενή καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, εμείς ανοσοστυπώθηκαν λύματα από την καλοήθη, αθανατοποιημένο κύτταρο IOSE και από έξι πρωτογενών επιθηλιακών δείγματα καρκινικού κυττάρου ωοθήκης απομονώθηκε από ασκίτη ασθενή (Σχήμα 1Α). έκφραση πρωτεΐνης RGS10 ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε κύτταρα από κάθε ασθενή, γεγονός που υποδηλώνει ότι η έκφραση RGS10 καταστέλλεται σε κλινικές καρκίνου των ωοθηκών. Από τα δείγματα των ασθενών είναι ετερογενή και μη ανανεώσιμες πηγές, η χρήση τους στον καθορισμό των μηχανισμών καταστολής είναι περιορισμένη. Προκειμένου να δημιουργηθεί μια ανανεώσιμη, ομοιογενές μοντέλο κύτταρο της απώλειας της έκφρασης RGS10 στον καρκίνο των ωοθηκών, συγκρίναμε την έκφραση σε κύτταρα RGS10 IOSE και το ορώδες επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών κυτταρική γραμμή CaOV-3 (Σχήμα 1Β, C). RGS10 απομαγνητοφώνηση και πρωτεΐνη ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε CaOV 3-κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου IOSE.

Α. Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα απομονώθηκαν από ασθενή κακοήθη ασκίτη και τα επίπεδα έκφρασης RGS10 συγκρίθηκαν με κύτταρα IOSE μέσω κηλίδωση Western. Π.Χ. RGS10 μεταγραφής (Β) και τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης (C) συγκρίθηκαν σε CaOV-3 κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών και IOSE καλοήθη επιθηλιακά κύτταρα των ωοθηκών χρησιμοποιώντας qRT-PCR και κηλίδωση Western. D. Cisplatin καμπύλες απόκρισης δόσης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς βιωσιμότητας CellTiter-Μπλε σε Α2780 και Α2780-AD κύτταρα. E.-F. RGS10 μεταγραφής (Ε) και τα επίπεδα πρωτεΐνης (F) συγκρίθηκαν σε χημειοθεραπεία κύτταρα Α2780-AD σε σχέση με τη γονική χημειοευαίσθητων κυτταρική σειρά Α2780 τους. **: P & lt? 0,01, ***: ρ. & Lt? 0,0001

Η

προηγούμενη παρατήρηση μας που RGS10 καταστέλλεται σε χημειοθεραπεία κύτταρα έγινε στις δημοσιευμένες σύνολα δεδομένων έκφρασης μεταγραφή από νόσο ευαίσθητη και χημειοθεραπεία ζεύγη καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών [ ,,,0],10]. Για την παρούσα μελέτη, λαμβάνεται Α2780 ωοθήκης καρκινικά κύτταρα και πολυ-φαρμάκου ανθεκτικά παράγωγο Α2780-AD τους. κύτταρα Α2780-AD προήλθαν από μητρικά κύτταρα Α2780 μέσω χρόνιας έκθεσης σε χαμηλές δόσεις κυτταροτοξικών φαρμάκων, και έτσι μπορούν να αποτελέσουν πρότυπο για αποκτήθηκε χημειοαντίσταση [28], [29]. Επιβεβαιώσαμε την απώλεια ευαισθησίας στη σισπλατίνη που προκαλείται κυτταροτοξικότητα στα κύτταρα Α2780-AD, και απέδειξαν ότι μεταγραφή και έκφραση πρωτεΐνης RGS10 μειώνεται στα κύτταρα Α2780-Αϋ σε σύγκριση με τη γονική Α2780 κύτταρα (Σχήμα 1 D-F). Στο σύνολό τους, μεταγραφή και πρωτεΐνη έκφραση RGS10 είναι μειωμένη σε πρωτογενή καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών και ο CaOV-3 κυτταρική σειρά καρκίνου σε σχέση προς αθανατοποιημένα επιθηλιακά κύτταρα των ωοθηκών, και σε Α2780 κυττάρων σε σχέση με τα γονικά κύτταρα. Εστιάσαμε τις ακόλουθες μελέτες για τις δύο αυτές συγκρίσεις.

Rgs10 υποψήφιοι

Το ανθρώπινο γονίδιο RGS10 κατοικεί στο αρνητικό σκέλος του χρωμοσώματος 10 και περιέχει δύο μεταγραφικές θέσεις εκκίνησης, δίνοντας αφορμή για δύο διαφορετικές μεταγραφές και γονιδιακά προϊόντα (Σχήμα 2Α, Β). Οι παραλλαγές έχουν μοναδική πρώτη εξώνια, και να μοιράζονται τέσσερις κοινούς εξώνια. Όσο περισσότερο μεταγραφής RGS10-1 δημιουργεί μία 21 kDa πρωτεΐνη RGS10a περιέχει 181 αμινοξέα. Η μικρότερη παραλλαγή μεταγραφής RGS10-2 δημιουργεί ένα RGS10b 19.5 kDa πρωτεΐνη που αποτελείται από 167 αμινοξέα. Μόνο ένα RGS10 ανοσοδραστική ζώνη είναι ανιχνεύσιμη σε κύτταρα των ωοθηκών, και είναι σύμφωνο με το προβλεπόμενο μοριακό βάρος του RGS10a (Σχήμα 1). Για να καθοριστεί εάν οι δύο μεταγραφές είναι ανιχνεύσιμα και παρομοίως καταστέλλεται στον καρκίνο των ωοθηκών, εκτελέσαμε qRT-PCR χρησιμοποιώντας την παραλλαγή-ειδικούς εκκινητές. Τόσο οι θετικές και αρνητικές μεταγραφές ανιχνεύτηκαν σε όλες τις κυτταρικές σειρές από qRT-PCR, αλλά RGS10-2 εκφράστηκε σε πολύ χαμηλότερα επίπεδα από RGS10-1. RGS10-1 έκφραση μεταγράφου σε CaOV-3 καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών είναι περίπου 20% του επιπέδου έκφρασης παρατηρήθηκε σε κύτταρα IOSE, συγκρίσιμη με τη μείωση που παρατηρείται φορές για σύνολο μεταγραφής RGS10. Ωστόσο, όσο μικρότερη είναι πρακτικά, RGS10-2, δεν είναι σημαντικά διαφορετική μεταξύ των δύο κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 2C). Περαιτέρω, η έκφραση μεταγράφου RGS10-1 ήταν μειωτικά στην χημειοθεραπεία Α2780-AD παράγωγο κυτταρική γραμμή, ενώ RGS10-2 επίπεδα αυξήθηκαν (Εικόνα 2D). Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η καταστολή της RGS10 μεταγραφή σε CaOV-3 και Α2780-AD καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών είναι μοναδική για RGS10-1, και προτείνει ότι ο μηχανισμός μπορεί να στοχεύει στη μοναδική περιοχή του υποκινητή.

Α. Το γονίδιο RGS10 (geneID: 6001) βρίσκεται στο αρνητικό σκέλος του χρωμοσώματος 10 (ένταξη NCBI: NC_000010.10) στη θέση -121.302.222000000000–121.259.339000000000 δισεκατομμύρια. Δύο μεταγραφή παραλλαγές RGS10-1 (ένταξη: NM_001005339) και RGS10-2 (ένταξη: NM_002925) έχουν αναφερθεί για RGS10 βασίζονται σε εναλλακτικές θέσεις εκκίνησης που οδηγούν σε διακριτά πρώτα εξώνια. B. Η ισομορφές πρωτεΐνη που προκύπτει RGS10a (ένταξη: NP_001005339) και RGS10b (ένταξη: NP_002916) ποικίλλουν από μόνο τα πρώτα 18 ή τρία αμινοξέα. Η συντηρημένη περιοχή RGS υπογραμμίζεται. CD. Η έκφραση της συνολικής RGS10 μεταγραφής (RGStot), RGS10-1, και RGS10-2 προσδιορίστηκαν σε IOSE και κύτταρα CaOV-3 (C) και σε γονικά κύτταρα Α2780 και Α2780 κύτταρα στη χημειοθεραπεία-AD (D). **: P & lt? 0,01, ***: ρ. & Lt? 0,0001

Η

μεθυλίωσης του DNA του Rgs10 υποψήφιοι Στην ωοθηκών καρκινικά κύτταρα

Οι υποψήφιοι που περιέχει G-C πλούσια «CpG νησίδες» συνήθως έχουν χαμηλά επίπεδα μεθυλίωσης σε φυσιολογικούς ιστούς, αλλά να γίνει κατά τη διάρκεια της υπερμεθυλιωμένων εξέλιξης του καρκίνου [30], [31], υποδηλώνοντας ότι τα γονίδια με CpG νησίδες σε υποκινητές τους είναι δυνητικοί στόχοι για μεταγραφική σίγηση από προαγωγέα DNA μεθυλίωση σε καρκινικά κύτταρα. Ανάλυση μιας περιοχής 1 kilobase ανάντη των μεταγραφικές θέσεις εκκίνησης και 0,5 kilobase κατάντι των θέσεων έναρξης των μεταγραφών RGS10-1 και RGS10-2 αποκαλύπτει μια εντυπωσιακή διαφορά στο περιεχόμενο CG και τον αριθμό των CpG δινουκλεοτιδίων μεταξύ των δύο περιοχών RGS10 προαγωγό ( Σχήμα 3Α). Η περιοχή προαγωγέα του RGS10-1 περιέχει 60-80% περιεκτικότητα σε CG και περιλαμβάνει περίπου 120 δινουκλεοτίδια CpG, ενώ ο προαγωγέας RGS10-2 περιέχει λιγότερο από 30. Σε σύγκριση, η ανάλυση του προαγωγού RGS2 έχει περιεχόμενο CpG παρόμοια με RGS10-1, ενώ ο υποκινητής της RGS5 περιέχει λίγα δινουκλεοτίδια CpG.

Α. Οι περιοχές υποκινητή της RGS10-1, RGS10-2, RGS2 και RGS5 αναλύθηκαν για το περιεχόμενο CpG χρησιμοποιώντας την ιστοσελίδα Methprimer. Για κάθε υποκινητής, μία περιοχή του γενωμικού DNA 1.000 ζεύγη βάσεων 5 ‘της θέσης έναρξης της μεταγραφής και 500 ζεύγη βάσεων 3’ της θέσης έναρξης αξιολογήθηκαν για περιεκτικότητα τοις εκατό GC και ατομικά δινουκλεοτίδια CpG. Νουκλεοτιδίων θέση υποδεικνύεται κατά μήκος το περιεχόμενο χ-άξονα και GC απεικονίζεται γραφικά επί του άξονα γ? Οι νησίδες CpG σημειώνονται με σκίαση. Κάθε δινουκλεοτίδιο CpG υποδεικνύεται με ένα σημάδι hash κάτω από την αρίθμηση των νουκλεοτιδίων, και η θέση έναρξης της μεταγραφής υποδεικνύεται με ένα βέλος. Οι περιοχές ενίσχυσης για τέσσερις θειώδους ζεύγη εκκινητών αλληλουχίας υποδεικνύεται από οριζόντιες μπάρες (BS10-1, BS10-2, BS10-3, BS10-4). Β κύτταρα SKOV-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα ή τον αναστολέα DNMT 5-Αζα για εννέα ημέρες, και μετρήθηκαν τα επίπεδα μεταγραφής των υποδεικνυόμενων RGS και ελέγχων GAPDH στις 3, 5, 7, και 9 ημέρες θεραπείας. Η μεταγραφή RGS κανονικοποιήθηκε προς GAPDH, και απεικονίζεται γραφικά σε σχέση με την έκφραση σε μάρτυρες που έλαβαν φορέα σε κάθε χρονικό σημείο.

Η

Η υψηλή συγκέντρωση των CpG δινουκλεοτιδίων στον υποκινητή RGS10-1 υποδηλώνει ότι το γονίδιο είναι RGS10 ένας πιθανός στόχος για τη ρύθμιση από τα ένζυμα DNMT και μπορεί να κατασταλεί με την εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών από ενισχυμένο μεθυλίωση του DNA. Για να ελέγξετε αυτήν την πρόβλεψη, προσδιορίσαμε την επίδραση της αναστολής της μεθυλίωσης του DNA για την έκφραση RGS10. Η DNMT αναστολέας της 5-Αζα 2’δεοξυκυτιδίνη (5-Αζα) δεσμεύει την προσθήκη ομάδες μεθυλίου σε CpG δινουκλεοτίδια νεοσυντιθέμενους DNA των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων [32]. Έτσι, τα αποτελέσματα της 5-Αζα για μεθυλίωση του DNA και η έκφραση του γονιδίου είναι προφανή μετά πολλαπλούς γύρους της κυτταρικής διαίρεσης. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή 5-Αζα για συνολικά εννέα ημέρες και το αποτέλεσμα επί των επιπέδων μεταγραφής του RGS10-1, RGS2 και RGS5 προσδιορίστηκε κάθε δύο ημέρες. Συνεπής με CpG νησίδας προβλέψεις, η έκφραση RGS5 δεν αλλάζει με 5-Αζα θεραπεία, ενώ τα επίπεδα μεταγραφής RGS10-1 και RGS2 είναι περίπου 8 φορές υψηλότερη σε 5-Αζα κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν φορέα (Σχήμα 3Β). Το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει ότι τα ένζυμα DNMT πιθανό να συμβάλει στην καταστολή των επιπέδων μεταγραφής RGS10-1.

Bisulfite αλληλουχίας των Rgs10-1 υποψήφιοι

Σας περαιτέρω προέβλεψε ότι η συχνότητα της μεθυλίωσης σε υποστηρικτές RGS10-1 θα να είναι υψηλότερη σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών με χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης RGS10-1. Μεθυλιωμένων και μη-μεθυλιωμένες ρίζες κυτοσίνης διακρίνονται με κατεργασία με όξινο θειώδες, που μετατρέπει μη μεθυλιωμένα, αλλά δεν μεθυλιώνεται, βάσεις κυτοσίνης σε ουρακίλη. Πραγματοποιήσαμε το πρώτο θειώδους αλληλουχίας για να συγκρίνουν τη συχνότητα της μεθυλίωσης του DNA σε υποστηρικτές RGS10-1 μεταξύ των γονικών Α2780 και των κυττάρων στη χημειοθεραπεία Α2780-AD. Κατεργασμένου με όξινο θειώδες γενωμικό DNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας τέσσερα ζεύγη επικαλυπτόμενων εκκινητή σχεδιασμένο για να καλύψει πλήρως ένα περιοχή από 1000 ζεύγη βάσεων ανοδικά και 200 ​​ζευγών βάσεων καθοδικά της έναρξης μεταγραφής RGS10-1 τοποθεσία. Απομονωμένη κλώνοι επεξεργασμένων όξινο θειώδες γενωμικού DNA αλληλουχήθηκαν και ευθυγραμμίζεται προς το γενωμικό DNA χρησιμοποιώντας λογισμικό BIQ Analyzer για να προσδιοριστεί η κατάσταση μεθυλίωσης των CpG κάθε θέση στον υποκινητή RGS10-1 σε τουλάχιστον 10 κλώνους. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν με BS10-2 ζεύγος εκκινητών φαίνεται στο Σχήμα 4, και τα αποτελέσματα που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας BS10-1, BS10-3 και BS10-4 φαίνονται στο Σχήμα S1.

RGS10 υποκινητή γονιδιωματικό DNA ευθυγραμμίστηκε με μεμονωμένες αλληλουχίες των κλωνοποιημένων προϊόντων PCR από εκκινητή ενίσχυσης ζεύγος BS10-2 κατεργασμένων με όξινο θειώδες γενωμικού DNA από τις υποδεικνυόμενες κυτταρικές σειρές. Οι αλληλουχίες υποβλήθηκαν σε ανάλυση ελέγχου ποιότητας και ευθυγραμμίζονται χρησιμοποιώντας λογισμικό BIQ Analyzer. Σε αυτό το συμβατικό «γλειφιτζούρι» παράσταση, κάθε τοποθεσία CpG στην περιοχή (-121 303 076 → -121302726) υποδεικνύεται με έναν κύκλο? μαύροι κύκλοι είναι μεθυλιωμένα, κενές κύκλοι είναι μεθυλιωμένη. Lollipop αναπαραστάσεις της κατάστασης μεθυλίωσης του κάθε τόπου CpG σε περιοχές υποκινητή RGS10-1 ενισχύεται από BS10-1, BS10-3, και σύνολα εκκινητών BS10-4 είναι διαθέσιμα στην συμπληρωματική πληροφορία.

Η

Χρησιμοποιώντας το δεδομένα διθειώδες αλληλούχιση, προσδιορίσαμε την συχνότητα της μεθυλίωσης των περιοχών CpG σε ολόκληρη την προαγωγό RGS10-1 σε Α2780 και Α2780-AD κύτταρα (Σχήμα 5, του πίνακα S1). Η συχνότητα της μεθυλίωσης σε θέσεις CpG σε ολόκληρη την προαγωγό RGS10-1 ήταν χαμηλή? η πλειονότητα των CpG θέσεων ήταν εντελώς μη μεθυλιωμένα ή μεθυλιώθηκαν σε 10-20% των κλώνων. Μία εξαίρεση ήταν η δινουκλεοτίδιο στη θέση -121 030 162, η οποία ήταν ιδιαίτερα μεθυλιώθηκε στις δύο κυτταρικές σειρές. Για το σύνολο της προαγωγό, ο ρυθμός μεθυλίωσης ήταν ελαφρώς υψηλότερη σε κύτταρα Α2780-AD σε σχέση με τη γονική Α2780 κύτταρα (Σχήμα 5Α, ένθετο). Αυτή η διαφορά ήταν πιο έντονη σε πολλές γειτονικές θέσεις CpG στην περιοχή -121303155 → -121303007 (υποδεικνύεται με διακεκομμένη οριζόντια γραμμή, το σχήμα 5Α). Το συνολικό ποσοστό της μεθυλίωσης σε όλη αυτή την περιοχή διπλασιάστηκε στα χημειοθεραπεία κυττάρων σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα (Εικόνα 5Α, ένθετο). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η τοπική μεθυλίωση ενισχυμένη DNA σε μια περιοχή περίπου 800 ζεύγη βάσεων ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής συσχετίζεται με απώλεια της έκφρασης RGS10 σε αποκτήθηκαν χημειοαντίσταση. Είμαστε δίπλα πραγματοποιηθεί την ίδια ανάλυση σε υποστηρικτές RGS10-1 στην IOSE και τα κύτταρα CaOV-3. ποσοστά μεθυλίωσης σε ολόκληρο το προαγωγό RGS10-1 και στην περιοχή που αναφέρονται ανωτέρω ήταν παρόμοιες σε IOSE και κύτταρα CaOV-3 (Σχήμα 5Β).