Αφηρημένο

Στόχος

πλούσιες σε λευκίνη-επαναλαμβάνω-περιέχουν G-πρωτεΐνη-υποδοχέα συζευγμένο 5 (lgr5 ) είναι ένας υποψήφιος δείκτης για καρκίνο του παχέος εντέρου βλαστικά κύτταρα (CSC). Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η κατάσταση μεθυλίωσης στο thelgr5 υποκινητή και αξιολογήθηκε η σχέση της με την CSC διαφοροποίηση, πρόγνωση για καρκίνο του παχέος εντέρου, και κλινικοπαθολογοανατομικές τις δυνατότητές του.

Μέθοδοι

Η κατάσταση μεθυλίωσης στο Lgr5 υποστηρικτής ανιχνεύθηκε με ένα μεθυλίωσης ειδικό PCR σε έξι ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές σειρές όπως επίσης και πρωτογενή ορθοκολικό 169 ιστούς όγκων. Διαφοροποίηση της CSC εξετάστηκε με ανοσοφθορισμό και ανοσοκυτταροχημεία. Κάτω ρύθμιση των lgr5 επιτεύχθηκε με ειδική γονιδιακή siRNA. Οι συσχετίσεις μεταξύ lgr5 μεθυλίωσης και των κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά, καθώς και την επιβίωση των ασθενών αναλύθηκαν με στατιστικές μεθόδους.

Αποτελέσματα

Ο προαγωγός lgr5 μεθυλιώθηκε σε διαφορετικούς βαθμούς για τις έξι παχέος κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν, με πλήρη μεθυλίωση παρατηρήθηκε σε κύτταρα HCT116 στα οποία η έκφραση lgr5 μερικώς ανακτήθηκε μετά τη θεραπεία DAC. Ο σχηματισμός σφαίρα βλαστικών κυττάρων από κύτταρα HCT116 συνοδεύτηκε από αύξηση της μεθυλίωσης εντός του υποκινητή lgr5 και μειώνοντας την έκφραση του lgr5. Να χτυπήσει κάτω lgr5 από siRNA οδήγησε επίσης σε βλαστικών κυττάρων σχηματισμό σφαίρες. Μεταξύ πρωτογενών ορθοκολικών όγκων, 40% (67/169) ήταν θετικά για lgr5 μεθυλίωση, ενώ κανένας από τους φυσιολογικούς ιστούς κόλου ήταν θετικά για lgr5 μεθυλίωση. Επιπλέον, lgr5 μεθυλίωση σχετίζεται σημαντικά με υψηλότερο βαθμό του όγκου, και αρνητικές μακρινή μετάσταση (ρ & lt? 0,05), καθώς και καλύτερη πρόγνωση (p = 0.001) σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου

Συμπεράσματα

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι lgr5 μεθυλίωση, μέσω της ρύθμισης της έκφρασης lgr5 και του παχέος διαφοροποίηση CSC, μπορεί να αποτελέσει ένα νέο προγνωστικό δείκτη για τους ασθενείς με καρκίνο του παχέος

Παράθεση:. Su S, το Χονγκ F, Liang Υ, Zhou J, Liang Υ, Chen Κ, et al. (2015) Lgr5 μεθυλίωσης σε καρκινικά βλαστικά κυτταρική διαφοροποίηση και πρόγνωση-Πρόβλεψη στον Καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 10 (11): e0143513. doi: 10.1371 /journal.pone.0143513

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 20, Μάρτη του 2015? Αποδεκτές: 5, Νοέμβρη του 2015? Δημοσιεύθηκε: 24 του Νοέμβρη, 2015

Αυτό είναι ένα ανοικτό άρθρο πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 δημόσιο τομέα αφοσίωση

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Σχετικά στοιχεία είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Το έργο αυτό ήταν εν μέρει υποστηρίζεται από Εθνικό φυσικό Ίδρυμα Επιστημών της Κίνας (NSFC. NO. 81302156), Guangzhou Πιλοτικό Πρόγραμμα Κλινικής και Ερευνητικό Κέντρο Μεταγραφική (αρχές του γαστρεντερικού καρκίνου, No.7415696196402), Guangdong Provincial Βιο-μηχανικής Ερευνητικό Κέντρο για Γαστρεντερολογία Ασθένειες. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Συσωρευτική αποδείξεις υποστηρίζουν την υπόθεση ότι ένας μικρός αριθμός των αδιαφοροποίητα βλαστικά ή βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν, τα λεγόμενα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (CSC), είναι υπεύθυνα για την έναρξη του όγκου, την ανάπτυξη, τη συντήρηση, τη διάδοση, την αναγέννηση και τη θεραπευτική αντίσταση . Αργότερα, η παρουσία CSC επιβεβαιώθηκε σε μια ποικιλία στερεών καρκίνων, όπως του καρκίνου του μαστού [1, 2], γλοιοβλαστώματα [3], ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [4], και ούτω καθεξής, η οποία επιτεύχθηκε με τη βοήθεια της, και με τη σειρά της, προώθησε την ταυτοποίηση πολλών ογκο-ειδικά αντιγόνα κυτταρικής επιφάνειας, επίσης γνωστή ως δείκτες CSC. Για τον ορθοκολικό καρκίνο, αρκετές δείκτες CSC έχουν ταυτοποιηθεί, συμπεριλαμβανομένων CD133 [5, 6], ΕρΟΑΜ /CD44 /CD166 [7], CD24 /CD29 [8] και lgr5 [9, 10]. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τη βιολογική σημασία αυτών των δεικτών, που μπορεί να έχει ισχυρές επιπτώσεις στην ικανότητα σε πολλαπλές διαφοροποίηση των CSC [8].

Μεταξύ των παχέος δείκτες CSC, lgr5, επίσης γνωστή ως GPR49, είναι ένα ορφανό G-πρωτεΐνη υποδοχέα (GPCR) που ανήκει στην πλούσια σε λευκίνη που περιέχει επανάληψη GPCR [11]. Πρόσφατα, αναφέρθηκε ότι lgr5 είναι θετική σε βλαστικά κύτταρα του λεπτού εντέρου, του παχέως εντέρου και θύλακα της τρίχας [9, 12, 13], γεγονός που υποδηλώνει δυνητική σημασία της lgr5 σε βλαστικά κυτταρική βιολογία. Σταθερά, τα lgr5 εκφράζουν βλαστικά κύτταρα ήταν ικανές να κατασκευάσουν οργανοειδούς δομών in vitro, η οποία αποδεικνύεται πειραματικά στο έντερο [14-16], το στομάχι [17] και το ήπαρ [18]. Επιπλέον, οι δέκτες ποντικοί με επιφανειακά κατεστραμμένο κόλον μεταμοσχεύθηκαν με organoids που προέρχονται από ένα μόνο βλαστοκύτταρο Lgr5

+ κόλον μετά από εκτενείς in vitro επέκταση, συνεπώς σχηματίζεται αυτο-ανανέωση κρύπτες που ήταν λειτουργικά και ιστολογικά φυσιολογικό [15]. Αντιθέτως, ο lgr5-null ποντίκια εμφάνισαν νεογνική θνησιμότητα λόγω ankyloglossia και γαστρεντερικές διάταση [19]. Η αυξητική ρύθμιση του lgr5 έχει αναφερθεί σε πολλούς ανθρώπινους συμπαγείς όγκους, όπως ηπατοκυτταρικά καρκινώματα [20, 21], του παχέος εντέρου [22], όγκους των ωοθηκών [22], καρκίνωμα βασικών κυττάρων [23] και γαστρικού καρκίνου [24]. Λειτουργικά, αυξημένη έκφραση lgr5 προωθείται τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και ογκογονικότητα [23], ενώ η σίγηση του lgr5 μειωμένη πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και τον σχηματισμό αποικίας, ογκογονικότητα [25] και επαγόμενη κυτταρική απόπτωση [22]. Lgr5 είναι ένας προς τα κάτω στόχος για μονοπατιού σηματοδότησης Wnt-β-κατενίνης [26]. Σε υγιή ζώα, lgr5 ήταν μέρος ενός αρνητική αλληλεπίδραση τελειοποίηση Wnt σηματοδότηση κατά τη διάρκεια του εντέρου μορφογένεση. ανεπάρκεια Lgr5 επαγόμενη πρόωρο διαφοροποίηση των κυττάρων Paneth, η οποία είναι η ταυτόχρονη με την ανοδική ρύθμιση του Wnt δραστηριότητα, υποδηλώνοντας lgr5 είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής του σηματοδότηση Wnt σε προγονικά κύτταρα του αναπτυσσόμενου εντέρου [27]. Επιπλέον, lgr5 ομόλογα είναι προαιρετική συστατικά υποδοχέα Wnt που μεσολαβούν Wnt ενίσχυση σήματος από διαλυτές πρωτεΐνες R-spondin [28].

Αύξηση στοιχεία δείχνουν τη σημασία της lgr5, σε διαφορετικές εκφραστικές επίπεδα, σε διάφορα παραδείγματα των ασθενειών και αναπτυξιακά στάδια. Ωστόσο, οι υποκείμενοι μηχανισμοί για την εκφραστική κανονισμού σχετικά με lgr5 εξακολουθούν να παραμένουν ασαφείς.

μεθυλίωσης του DNA έχει αποδειχθεί ως ένα σημαντικό επιγενετική μηχανισμό για την απενεργοποίηση των γονιδίων κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης [29, 30]. Πρόσφατα, υπάρχουν ολοένα αυξανόμενες έρευνες που αποκαλύπτουν ότι η μεθυλίωση κάποιων γονιδίων ρυθμίζουν την ανάπτυξη, την εξέλιξη, και την επανάληψη των όγκων [31-33], από τις οποίες περιλαμβάνουν καρκίνο του παχέος εντέρου [34]. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την κατάσταση μεθυλίωσης των νησιών CpG εντός της περιοχής άμεση υποκινητή του γονιδίου lgr5 σε ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές και ιστούς όγκων, και αναλύθηκαν σύνδεσή της με CSC διαφοροποίηση, κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά, καθώς και την πρόγνωση των ασθενών με ορθοκολικό καρκίνους.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρική καλλιέργεια και θεραπεία

Ο ορθοκολικός καρκίνος κυτταρικές γραμμές (HCT116, SW480, ΗΤ29, LoVo, ΟοΙο205, SW620, SW1116) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Sijiqing, Beijing, Κίνα). Για τη θεραπεία απομεθυλίωση, καλλιεργημένα κύτταρα επωάστηκαν με 3 μΜ 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (DAC, Sigma, St. Louis, ΜΟ) για 72 ώρες με μέσο αλλάζονται κάθε μέρα. Mock φαρμακευτικές αγωγές διεξήχθησαν παράλληλα με PBS (ρΗ 7.4).

δείγματα ανθρώπινων ιστών και πληροφορίες για τον ασθενή

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Ιατρικού Πανεπιστημίου της Νότιας (Guangzhou, Κίνα) και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες. 169 ασθενείς (μέση ηλικία 57 ± 22,3 χρόνια) είχαν διαγνωστεί με καρκίνο του παχέος εντέρου σποραδικά σε Τμήμα Παθολογίας (Nanfang Νοσοκομείο, Νότια Ιατρικό Πανεπιστήμιο) μεταξύ των ετών 1999 και 2001. Όλες οι διαγνώσεις ιδρύθηκαν με βάση την ιστολογική εξέταση του προτύπου HE-βάφονται τμήματα σύμφωνα με την οι κατευθυντήριες γραμμές της ΠΟΥ. Οι όγκοι οργανώθηκαν με βάση το σύστημα σταδιοποίησης Dukes. Οι ασθενείς αυτοί δεν έλαβαν εισαγωγική ραδιο-χημειοθεραπεία ούτε έχουν οποιαδήποτε complicattions με άλλες γνωστές κακοήθειες κατά τη στιγμή της διάγνωσης. Οι ασθενείς πέθαναν εντός έξι μηνών μετά από χειρουργική εκτομή αποκλείστηκαν.

ανάλυση Western blotting

25 μg της συνολικής πρωτεΐνης επωάστηκε με ρυθμιστικό διάλυμα αποδιάταξης (0.3 Μ Tris ρΗ 6,8, 10% 2-μερκαπτοαιθανόλη, 40% γλυκερόλη, 20% SDS, 0,02% μπλε βρωμιοφαινόλης) για 5 λεπτά στους 95 ° C, φορτώνεται σε 10% SDS-πολυακρυλαμιδίου για ηλεκτροφόρηση, μεταφέρθηκε σε μεμβράνες PVDF, μπλοκαριστεί σε 5% άπαχο γάλα /TBS-Tween για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C σε ένα πρωτεύον αντίσωμα έναντι lgr5 (1: 500, Abcam, Cambridge, ΜΑ) ή ένα αντίσωμα ποντικού άλφα-τουμπουλίνης (εσωτερικός έλεγχος, 1: 1000, Cell Signaling, Danvers, ΜΑ). Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου δευτερογενή αντισώματα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η ανοσοαντιδραστικότητα ανιχνεύθηκε χημειοφωταύγειας (Pierce, Rockford, IL).

RT-PCR

Ολικό RNA εκχυλίστηκε με το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA) και 2 μg ολικού RNA υποβλήθηκε σε πρώτου κλώνου σύνθεση cDNA (Fermentas, Ontario, Canada) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Primer αλληλουχίες για RT-PCR ήταν παρατίθενται στον Πίνακα 1, με GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

Η

εκχύλιση του DNA, η μεθυλίωση-ειδική PCR (MSP) και όξινο θειώδες αλληλούχισης PCR (BSP)

Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από κυτταρικές σειρές ή πρωτογενών όγκων μετά από μια τυπική μέθοδο εκχύλισης φαινόλης-χλωροφορμίου (Qiagen, Valencia, CA). Τροποποίηση όξινου θειώδους του γονιδιακού DNA διεξήχθη με τη χρήση του κιτ μεθυλίωση EZ DNA (Zymo Research, Orange, CA). Το πρότυπο μεθυλίωσης των CpG νησίδες εντός υποκινητή lgr5 προσδιορίστηκε με MSP χρησιμοποιώντας κατεργασμένου με όξινο θειώδες DNA ως μήτρα και MSP εναρκτήρες που απαριθμούνται στον Πίνακα 1. εκκινητές MSP σχεδιάστηκαν σύμφωνα με την αρχή όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35] και δοκιμάστηκαν για την ενίσχυση όχι μη bisulfited DNA. MSP διεξήχθη στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 38 κύκλους στους 94 ° C για 30s και 72 ° C για 30s, στη συνέχεια, με ένα 5-λεπτών επέκταση στους 72 ° C. Τα προϊόντα MSP στη συνέχεια διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα αγαρόζης 1.5% που βάφτηκε με βρωμιούχο ethiium και οπτικοποιούνται υπό υπεριώδες φασματοφωτόμετρο. κενά Νερό χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος.

Για διθειώδες αλληλούχιση, BSP εκκινητές (Πίνακας 1) χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχύσουν ένα 428-bp που καλύπτει τον προαγωγό-εξονίου 1 (-362 έως 96) περιοχή του lgr5 γονίδιο. Τα BSP εκκινητές σχεδιάστηκαν όχι για την κάλυψη τυχόν CpG θέσεις. Τα προϊόντα PCR στη συνέχεια υποκλωνοποιήθηκαν σε ρΟΚ2.1-ΤΟΡΟ (Invitrogen) πλασμίδια και επιλέχθηκαν το πλασμιδιακό DNA από πέντε βακτηριακές κλώνους για ανάλυση αλληλουχίας DNA σύμφωνα με την προηγούμενη περιγράφεται [36].

Stem δημιουργία και τη διαφοροποίηση των κυττάρων σφαίρα

Για την εξέταση του σχηματισμού σφαίρας βλαστικών κυττάρων, 5 × 10

5 κύτταρα HCT116 καλλιεργήθηκαν σε 60-mm δίσκο καλλιέργειας σε εναιώρημα σε ελεύθερο ορού ϋΜΕΜ /F12 (Gibco, Carlsbad, CA), συμπληρωμένο με Β27 ( 1:50, Invitrogen), 40 ng /ml EGF (Sigma) και 20 ng /ml FGF-2 (Chemicon, Billerica, ΜΑ), 100 U /mL πενικιλλίνη G, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (Gibco, Αυστραλία). CSC σφαίρες άρχισαν να σχηματίζονται περίπου δύο εβδομάδες αργότερα. Για να προκληθεί CSC διαφοροποίηση, οι σφαίρες CSC πλύθηκαν με PBS τρεις φορές και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 U /mL πενικιλλίνη G, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Πυρηνική οξύ και πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από αυτά τα κύτταρα κατά την ημέρα 0, 1, 3 και 7, αντίστοιχα, όπως περιγράφεται [37-39]. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 0C σε ατμόσφαιρα υγρασίας που περιέχει 5% CO2.

ανοσοφθορισμού (IF) και ανοσοϊστοχημεία (IHC)

Για IF, CSC σφαίρες μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη σε PBS για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια κατέστησαν διαπερατά με PBS που περιέχει 0.1% Triton Χ-100. Μετά από αποκλεισμό με 1% αλβουμίνη βόειου ορού για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, τα σφαιρίδια CSC επωάστηκαν με ΟΚ20 μονοκλωνικό αντίσωμα πρωτογενούς ποντικού (1: 300, Santa Cruz, CA) στους 4 ° C όλη τη νύκτα και στη συνέχεια με FITC-συζευγμένο αντι-κουνελιού lgG (Santa Cruz).

Για IHC περιγράφονται ως οι προηγούμενες μέθοδοι μας [40], τμήματα ιστού ενσωματωμένα σε παραφίνη σταθεροποιημένα με φορμαλίνη αποκηρώθηκαν σε ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν με απεσταγμένο νερό., και εκτελέστηκε με τη μεσολάβηση θερμότητα ανάκτηση αντιγόνου με κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα ρΗ 6,0 και μπλοκ με 3% BSA. Οι πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν με το αντίσωμα lgr5 (1: 300, # 137484, Abcam) στους 4 ° C όλη τη νύχτα, με το σήμα ενισχύεται και αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα ABC και χρωμογόνο υπόστρωμα DAB (Maixin Bio, Κίνα), αντίστοιχα, μετά από αιματοξυλίνη αντιχρωματισμός. Η έκφραση θεωρείται ότι είναι «θετικό» όταν βάφτηκαν πιο καρκινικών κυττάρων κατά 10% ή.

Επιμόλυνση μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA)

Η αλληλουχία στόχευσης για lgr5-ειδικών νουκλεοτιδίων siRNA ήταν 5 ‘ -GATCTGTCTTACAACCTAT-3 ‘και το περιπλεγμένο siRNA αλληλουχία 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’ χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Και οι δύο siRNA δίπολα συντέθηκαν από GenePharma (Σαγκάη, Κίνα). Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο επιμόλυνσης Lipofectamine (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Στατιστική ανάλυση

Για να εκτιμηθεί η ανεξάρτητη συσχέτιση του lgr5 μεθυλίωσης με άλλες μεταβλητές, πολυπαραγοντική ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης διεξήχθη. Για την ανάλυση επιβίωσης, μέθοδος Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση του χρόνου επιβίωσης σε σχέση με τη διανομή lgr5 μεθυλίωση.

σ

τιμή μικρότερη του 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Lgr5 ήταν διαφορικά μεθυλιώνονται στον καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές

Για να δοκιμαστεί το δυναμικό της η μεθυλίωση του DNA στη ρύθμιση της έκφρασης lgr5, εξετάσαμε για πρώτη φορά την έκφραση της lgr5 σε επτά καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές και αλλοίωση της σε απάντηση 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (ΕΑΒ), την κλασική αναστολέα μεθυλίωσης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α και 1Β, για HCT116, SW480 και SW620 κύτταρα, η έκφραση lgr5 στις δύο σταθερής κατάστασης του mRNA και το επίπεδο πρωτεΐνης πάνω ρυθμισμένα σε απόκριση προς θεραπεία DAC, υποδηλώνοντας έκφραση lgr5 μπορούσε να ανασταλεί σε αυτά τα κύτταρα μέσω μεθυλίωσης DNA. Σε αντίθεση, η έκφραση στο SW1116, LoVo, ΗΤ29 και κύτταρα ΟοΙο205 δεν είχε αλλάξει δραματικά μετά από θεραπεία DAC, υπονοώντας μια ασχετοσύνη τους μηχανισμούς μεθυλίωσης-που εμπλέκονται. Σε συμφωνία με αυτές τις παρατηρήσεις, ανιχνεύσαμε πλήρης μεθυλίωση της περιοχής προαγωγού CpG νησίδων σε κύτταρα HCT116, μερική μεθυλίωση σε SW480 και SW620 κυττάρων και καμία μεθυλίωση σε ΗΤ29, ΟοΙο205, κύτταρα SW1116 ή LoVo (Σχήμα 1 C) με ανάλυση MSP. Η ακρίβεια του προσδιορισμού MSP επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με όξινο θειώδες αλληλουχίας (Εικ 1D). Ως εκ τούτου, η έκφραση του lgr5 σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου συσχετίζεται καλά με την κατάσταση μεθυλίωσης των CpG νησίδων υποκινητή, υποστηρίζοντας μεθυλίωσης DNA ως μηχανισμός για τη ρύθμιση επιπέδου lgr5.

A. Ολικό RNA εκχυλίστηκε από υποδεικνύεται κύτταρα χωρίς (-) ή με (+) θεραπεία DAC και RT-PCR πραγματοποιήθηκε για να εξετάσει lgr5 επίπεδο σταθερής κατάστασης του mRNA, με GAPDH ως εσωτερικός έλεγχος. B. Το επίπεδο πρωτεΐνης του lgr5 μετρήθηκε σε όλες τις επτά καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα που κατεργάζονται όπως στο Α με ανάλυση κηλίδας Western. α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Γ DNA κατάσταση μεθυλίωσης του νησιού CpG μέσα στην περιοχή εγγύς υποκινητή του γονιδίου lgr5 προσδιορίστηκε με ανάλυση MSP. Μ, σήμα μεθυλίωση? U, unmethylation σήμα.

dd

H2O, το νερό που δεν περιέχει γονιδιακό DNA. πυκνότητα D. Η μεθυλίωση εντός της περιοχής εγγύς υποκινητή του γονιδίου lgr5 σε επτά κυτταρικές σειρές ορθοκολικού καρκίνου προσδιορίστηκε με ανάλυση BSP. Άνω πάνελ, διάγραμμα της κατανομής των CpG θέσεων εντός του 5 ‘UTR του γονιδίου lgr5. Κάθε κάθετη γραμμή αντιπροσώπευε μια ιστοσελίδα CpG. Κάτω πάνελ, BSP 14 CpG θέσεις εντός -150 έως +42 περιοχή σε σχέση με τη θέση αστέρι μεταγραφής (TSS) σε επτά ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές. Κάθε σειρά αντιπροσωπεύει ένα άτομο κλωνοποιημένο αλλήλιο που αλληλουχήθηκε ακόλουθη τροποποίηση όξινου θειώδους DNA. Κύκλοι αντιπροσωπεύουν CpG θέσεις και την απόσταση μεταξύ τους, αντανακλά με ακρίβεια την πυκνότητα CpG της περιοχής. Μαύρο κύκλο, μετουσιωμένες ιστοσελίδα CpG? λευκό κύκλο, μη μεθυλιωμένα CpG τοποθεσία.

Η

Lgr5 μεθυλίωσης συσχετίζεται με CSC- διαφοροποίηση in vitro

Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η έκφραση lgr5 ήταν υψηλότερη σε μη διαφοροποιημένα κύτταρα σε σύγκριση με τα διαφοροποιημένα κύτταρα σε καρκίνο του παχέος εντέρου [9]. Για να διερευνηθεί η συμμετοχή της μεθυλίωσης του DNA lgr5 στην CSC διαφοροποίηση, μπορούμε βλαστικά καρκίνο ή βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν από κυτταρική σειρά HCT116 μετά από ένα μοντέλο σφαίρες όπως περιγράφεται [41], όπου τα βλαστικά κύτταρα του καρκίνου του μαστού εμπλουτίστηκαν με καλλιέργεια σε αναστολή ως μη προσκολλημένα σφαίρες. Δύο εβδομάδες μετά την καλλιέργεια σε μέσο χωρίς ορό που περιέχει EGF και FGF-2, λάβαμε CSC σφαίρες από HCT116 κυτταρική γραμμή (Σχήμα 2Α, πρώτο τμήμα). Αριθ έκφραση κυτοκερατίνης 20 (ΟΚ20), ένα δείκτη για διαφοροποίησης επιθηλιακών κυττάρων, ήταν ανιχνεύσιμη στους τομείς CSC με IF (Σχήμα 2Β, πρώτο τμήμα). Στη συνέχεια, αυτές οι σφαίρες CSC θα μπορούσε να αυξηθεί από την κατάσταση αναστολής, και σταδιακά έγινε σφιχτό και συγχωνεύονται (Σχήμα 2, άνω φωτογραφία). Αλλά αυτές οι σφαίρες επωάστηκαν με ορό που περιέχει μέσο όπου βαθμιαία προσκολλάται στην επιφάνεια της πλάκας καλλιέργειας, το οποίο ήταν το χαρακτηριστικό της differenation cellsby διαστάσεως των κυττάρων από τις σφαίρες (Σχήμα 2Α, κάτω πάνελ), και προς τα πάνω ρύθμιση του ΟΚ20 (Εικ 2Β) από την ημέρα 0 έως την ημέρα 7. η ταυτόχρονη με τη διαδικασία διαφοροποίησης, η έκφραση lgr5 επίσης μειώθηκε κατά qPCR και κηλίδα western (Σχήμα 2C και 2D). Η προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης lgr5 επίσης συσχετίζεται καλά με μια σημαντική αύξηση στην πυκνότητα της μεθυλίωσης προαγωγό (Σχήμα 2Ε).

A. CSC σφαίρες από κυτταρικές σειρές HCT116 αυξήθηκε με μέσο CSC χωρίς ορό (άνω πάνελ)? Ή, CSC σφαίρες άλλαξε σε κανονικό μέσο με 10% FBS (κάτω πάνελ). χρονικό σημείο παρατήρησης: 1 ημέρα, 3 ημέρες. Και 7 ημέρες και φωτογραφήθηκαν κάτω από οπτικό μικροσκόπιο. Β χρώση ανοσοφθορισμού ΟΚ20 στην CSC σφαίρες? Πράσινο έδειξε χρώση ΟΚ20. Γ RNA συλλέχθηκε σε διαφορετικό σημείο του χρόνου και αναλύθηκε με qPCR σε μέσο με 10% FBS ομάδα. D. Η πρωτεΐνη συλλέχθηκε σε διαφορετικά χρονικό σημείο σε μέσο με 10% FBS ομάδα, lgr5 ανιχνεύθηκε με τη δυτική blot.westernblot α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Ε BSP ανάλυση των lgr5 υποστηρικτής πυκνότητα μεθυλίωσης σε σφαίρες CSC και χρονικό σημείο στο μέσο με την ομάδα FBS 10%. Μαύρο κύκλο, μετουσιωμένες ιστοσελίδα CpG? λευκό κύκλο, μη μεθυλιωμένα CpG θέση.

Η

Η κατάρριψη προκαλείται από lgr5 διαφοροποίηση της CSC σφαίρες

Για να εξεταστεί η αιτιώδης σχέση μεταξύ μειωμένη έκφραση και τη διαφοροποίηση της CSC σφαίρες lgr5, εμείς επιμολυσμένα CSC σφαίρες με lgr5 ειδικό siRNA. Σε σύγκριση με κωδικοποιημένα ελέγχου siRNA, lgr5 ειδικό siRNA μείωσε σημαντικά την έκφραση lgr5 (Σχήμα 3Α, σ & lt? 0.001). Η θεραπεία siRNA οδήγησε επίσης σε αυξητική ρύθμιση του ΟΚ20, καθώς και διαστάσεως του CSC σφαιρών (Σχήμα 3Β). Αυτό είναι σύμφωνο με τις φαινοτύπους που συνδέονται με την CSC διαφοροποίηση, υποδεικνύοντας ότι η ρύθμιση προς τα κάτω της lgr5 ήταν αρκετή για να επάγει την διαφοροποίηση των CSC σφαιρών.

A. B.Expression της lgr5 mRNA και πρωτεΐνης σε CSC σφαίρες επιμολυσμένα με είτε αγωνίζομαι ή lgr5 ειδικά siRNAwas εξετάζεται από qPCR και κηλίδα western (άνω τμήμα) Γ χρώση ανοσοφθορισμού ΟΚ20 (πράσινο) στην CSC σφαίρες επιμολυσμένα όπως και στην Α Μπλε: DAPI πυρηνική χρώση.

Η

Lgr5 μεθυλίωση ήταν ανιχνεύσιμη σε καρκίνους του παχέος εντέρου, αλλά δεν φυσιολογικούς ιστούς του παχέος εντέρου

στη συνέχεια, μελετήσαμε μεθυλίωση προαγωγού του γονιδίου lgr5 σε φυσιολογικούς ιστούς του παχέος εντέρου σε σχέση με ορθοκολικό καρκινικούς ιστούς. Όπως φαίνεται στο Σχ 4Α και 4Β, θετικός μεθυλίωση ήταν ανιχνεύσιμη μόνο σε ορθοκολικό καρκίνο ιστούς αλλά όχι φυσιολογικούς ιστούς κόλου. MSP ανάλυση επί συνολικού 169 του παχέος εντέρου αποκάλυψε ότι 67 δείγματα (40%) ήταν θετικά για μεθυλίωση lgr5 υποκινητή. Επιπλέον, εξετάσαμε επίσης την έκφραση lgr5 από IHC.Lgr5 αρνητική έκφραση συσχετίστηκε με lgr5 μεθυλίωση στο ίδιο ασθενείς με καρκίνο του ιστού με MSP. Και χαμηλή μεθυλίωση ή unmethlation έκφραση lgr5 ήταν προφανώς υψηλότερο σε χαμηλές μεθυλίωση ή ομάδα unmethlation από MSP (Σχ 4C). Υπάρχουν δεδομένα υποδηλώνουν ότι lgr5 μεθυλίωση έκλεισε με την έκφραση του.

Α. MSP εκτελέστηκε σε φυσιολογικούς ιστούς κόλου (Α) ή πρωτογενή παχέος εντέρου. Μ, σήμα μεθυλίωση? U, unmethylation σήμα. έκφραση Β Lgr5 ήταν σε φυσιολογικούς ιστούς ιστού και του καρκίνου, σκούρα βέλη εκπροσώπησε την lgr5 θετικά κύτταρα με χρώση ανοσοϊστοχημική. Ν1 αντιπροσώπευε το ένα από τα φυσιολογικούς ιστούς του παχέος εντέρου? Τ5 και Τ22 που απεικονίζονται αντίστοιχα τις ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου.

Η

Lgr5 μεθυλίωσης συσχετίζεται αρνητικά με το βαθμό του όγκου, μετάσταση όγκου και θετικά με την καλή πρόγνωση του καρκίνου του παχέος εντέρου

Για να αξιολογηθεί η κλινική σημασία της lgr5 μεθυλίωση, αναλύσαμε τη συσχέτιση μεταξύ της κατάστασης μεθυλίωσης lgr5 υποκινητή, όπως προσδιορίζεται με MSP, με μια ποικιλία από κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των ασθενών με ορθοκολικό καρκίνο (Πίνακας 2). Εντοπίσαμε μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ των θετικών μεθυλίωση lgr5 και ανώτερο βαθμό του όγκου (p & lt? 0.001), θετική κομβικό συμμετοχή (p = 0.04) και θετική μακρινή μετάσταση (p = 0,024), όμως, δεν είχαμε εντοπίσει όχι άλλα χαρακτηριστικά, όπως η ηλικία του ασθενούς , το φύλο, τη θέση του όγκου ή Dukes στάσης. Οι αντίστροφη συσχετίσεις πρότεινε ότι lgr5 μεθυλίωσης που σχετίζονται με τον καρκίνο του μια λιγότερο επεμβατική φαινότυπο,

i

.

e

., Ανώτερο βαθμό του όγκου, αρνητική λεμφαδένα και μακρινή μετάσταση, η οποία ενισχύεται περαιτέρω από η ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier (Σχήμα 5). Μεταξύ των 169 ασθενών που αναλύθηκαν, το ποσοστό επιβίωσης των 100 μηνών ήταν σημαντικά υψηλότερη σε περιπτώσεις με lgr5 μεθυλίωση από εκείνα unmethylation (

p =

0,001). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι lgr5 μεθυλίωση ήταν ανεξάρτητο προγνωστικό βιοδείκτη για την καλή πρόγνωση του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Η

Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier για τους ασθενείς που ομαδοποιούνται με βάση την κατάσταση μεθυλίωσης lgr5. Συνεχής γραμμή: καρκίνο του παχέος εντέρου θετικό για lgr5 μεθυλίωση, n = 67? διακεκομμένη γραμμή: καρκίνο του παχέος εντέρου αρνητικό για lgr5 μεθυλίωση, n = 102. HR: Λόγος Κινδύνου? 95% CI: 95% διάστημα εμπιστοσύνης

Η

Συζήτηση

Ο ιστός αυτο-ανανέωση συντηρείται από βλαστοκυττάρων κόγχες.. Το μοτίβο μεθυλίωσης εντός των κόγχες ρυθμίζει βλαστικών κυττάρων του κύκλου εργασιών, που επηρεάζουν μοίρα των κυττάρων, ετερογένεια, και ούτω καθεξής. Όταν το υπόλοιπο αυτού του προτύπου διαταράσσεται, τα βλαστικά κύτταρα με φαινοτυπική και γενετικές αλλαγές μπορούν να υποβληθούν σε ογκογένεση. Μια μεγάλη ποσότητα του στοιχεία έχουν καταδείξει ότι επιγενετικές μεταβολές, όπως υπερμεθυλίωση νησίδων CpG εντός περιοχές προαγωγού διαφόρων γονιδίων, είναι πιθανόν σημαντικοί συνεισφέροντες στην ογκογένεση σε ένα ευρύ φάσμα καρκίνων [42] και CpG νησί ακτές στις ακολουθίες μέχρι 2 kb μακρινό συνδέθηκε έντονα με την έκφραση του γονιδίου στον καρκίνο του παχέος εντέρου [43]. Επιπλέον, αρκετές καρκινικά βλαστικά δείκτες κυτταρικής επιφάνειας επίσης ρυθμίζεται από το γονίδιο μεθυλίωσης. Furhtermore, κατάσταση υπερμεθυλίωση σχετιζόταν με χαμηλή ή καθόλου έκφραση και κυτταρική διαφοροποίηση, για παράδειγμα, CD133 σε καρκίνο του παχέος εντέρου και του γλοιώματος [44, 45], και EpCAM στον καρκίνο του μαστού [36]. Στην παρούσα μελέτη, υποθέσαμε ότι αθόρυβη ή μειωμένη έκφραση lgr5 σχετιζόταν με CpG νησί μεθυλίωση. Σε υποστήριξη αυτής της υπόθεσης, η θεραπεία με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης αποκατασταθεί η έκφραση lgr5 σε μια-δυο παχέος καρκινικών κυτταρικών σειρών, με δραματική ρύθμιση προς τα πάνω σε κύτταρα HCT116 που περιέχουν πλήρως μετουσιωμένο lgr5, και μέση ή χωρίς ρύθμιση προς τα πάνω σε άλλο κύτταρο γραμμές που περιέχουν μερικώς ή καθόλου μεθυλιωθεί lgr5. Επιπλέον, η θεραπεία της ΕΑΒ δεν μετέβαλε την έκφραση lgr5 σε Melo δημοσιευμένη μελέτη [34] στην κυτταρική σειρά SW620, αλλά μια μικρή αύξηση στην παρούσα μελέτη μας. Αναλύσαμε lgr5 μεθυλίωσης σε περίπου ~ 1 kb υποστηρικτής της lgr5, και θα μπορούσε να είναι κάποια νησιά CpG σε άλλες & gt? Θραύσμα 1 kb. Έτσι μπορούμε να `t ανίχνευση της μεθυλίωσης lgr5 στην κυτταρική σειρά SW620, αλλά η έκφραση lgr5 ήταν μια μικρή αύξηση μετά τη θεραπεία DAC ή άλλες ασαφείς αιτία. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η μεθυλίωση του DNA έπαιξε σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης lgr5.

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι lgr5 έπαιξε καθοριστικό ρόλο στη διατήρηση των ιδιοτήτων του εντέρου και του παχέος εντέρου βλαστικά κύτταρα. Χαμηλή ή καθόλου lgr5 έκφραση ανιχνεύθηκε σε διαφοροποιημένα κύτταρα. Αντίθετα, μια υψηλή έκφραση ΟΚ20, ένα διαφοροποιημένο δείκτη κυττάρου, βρέθηκε επίσης σε διαφορετικούς καρκίνους [38, 46]. Σε συμφωνία με αυτά τα ευρήματα, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η έκφραση lgr5 ήταν υψηλή σε ορθοκολικό CSC, και μειωμένη διαφοροποίηση, η οποία συνοδεύτηκε από αυξημένη μεθυλίωση του DNA και ΟΚ20 πάνω ρύθμιση. Επιπλέον, να χτυπήσει κάτω lgr5 στην CSC σφαίρες που προκαλείται CSC διαφοροποίηση. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι κάτω ρύθμιση των lgr5, οι οποίες προέκυψαν από μεθυλίωσης του DNA, ήταν υπεύθυνη για την διαφοροποιημένο φαινότυπο της CSC.

Ερευνήσαμε περαιτέρω την κλινική σημασία των lgr5 μεθυλίωσης σε σποραδικές καρκίνο του παχέος εντέρου. Έχουμε παρατηρήσει ότι αυτή δεν ήταν η πρώτη μελέτη που εξετάζει την επιγενετική τροποποίηση των δεικτών CSC. Έχει αναφερθεί ότι υπερμεθυλίωση των CpG νησίδες που βρίσκονται στην περιοχή του υποκινητή του CD44 δείκτη βλαστικών κυττάρων /προδρόμων, ένας από τους δείκτες του παχέος εντέρου και άλλων επιφανειακών καρκίνο βλαστικών κυττάρων, θα μπορούσε να προβλέψει βιοχημική υποτροπή σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη που υποβάλλονται σε ριζική προστατεκτομή [47] . Η υπομεθυλίωση του CpG θέσεων σε τρία εγγύς υποκινητές προσδιορίζεται έκφραση CD133 σε γλοιοβλαστώματα [42, 48] (delet: και υπερμεθυλίωση CD133 σε HCT116 οδήγησε στο σχηματισμό όγκου ξενομοσχεύματος σε γυμνά ποντίκια, σε σύγκριση με τα κύτταρα χωρίς CD133 μεθυλίωση). Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε επίσης ότι lgr5 ήταν συχνότερα μεθυλιώθηκε σε ορθοκολικό καρκίνο παχύ έντερο από ό, τι στην κανονική παχύ έντερο, και ότι η έκφραση lgr5 ρυθμιζόταν αυστηρά με μεθυλίωση. Κλινικοπαθολογοανατομικές ανάλυση κατέρρευσε η αντίστροφη συσχέτιση των θετικών lgr5 μεθυλίωσης με υψηλότερο βαθμό του όγκου και εισβολής, σε συμφωνία με την άποψη ότι η υπερ-έκφραση της lgr5 συνδέθηκε με τις πιο κακοήθεις και διηθητικού καρκίνου. Επιπλέον, βρήκαμε επίσης ότι lgr5 μεθυλίωση συσχετίστηκε σημαντικά με καλύτερη πρόγνωση μεταξύ των ασθενών με ορθοκολικό καρκίνο.

Ήταν προηγουμένως αναφερθεί ότι η απώλεια της έκφρασης lgr5 παρατηρείται στο 40% περίπου του ορθοκολικού καρκίνου [22]. Στη μελέτη μας, παρατηρήσαμε επίσης θετικό μεθυλίωση lgr5 προαγωγό σε περίπου 40% των καρκίνων του παχέος εντέρου, και επαλήθευσε ότι η αρνητική έκφραση lgr5 συσχετίστηκε σημαντικά με τη μεθυλίωση του DNA υποκινητή. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι lgr5 παρέχει μια ισορροπία μεταξύ πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και τη διαφοροποίηση CSC. Ως εκ τούτου, απορρυθμισμένη έκφραση lgr5 μπορεί να ανατρέψει την ισορροπία προς μια πιο μετασχηματίζονται και ογκογόνο φαινότυπο, όπως παρατηρήθηκε σε άλλη δείκτη βλαστικών κυττάρων, Oct4 [49] .Similarly, ανεπάρκεια lgr5 σε κανονική λεπτό έντερο οδηγεί σε πρόωρη διαφοροποίηση κυττάρων Paneth στο λεπτό έντερο [ ,,,0],27]. Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίσαμε ένα νέο μηχανισμό για να ελέγχουν την έκφραση των lgr5,

i

.

e

. μέσω μεθυλίωσης του υποκινητή. Δείξαμε ότι ο προς τα κάτω ρύθμιση lgr5, ως αποτέλεσμα είτε της θεραπείας siRNA ή μεθυλίωση προαγωγού, ήταν αρκετή για να επάγει CSC διαφοροποίηση. Παρόμοιες ρυθμίσεις έχουν παρατηρηθεί σε άλλους δείκτες αρχέγονων κυττάρων, όπως Oct4 [49]. Έχει προταθεί ότι η αποτελεσματική μεθυλίωση του DNA είναι σε θέση να εξασφαλίσει αποσιώπηση αυτού του ισχυρού γονιδίου καρκίνο κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Υπερμεθυλίωση lgr5 αποτελέσματα στη διαφοροποίηση του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων. Όπως γνωρίζουμε, διαφοροποιημένα κύτταρα δεν είναι ικανά ισχυροί αυτο-ανανέωση και aresensitive με τα παραδοσιακά φάρμακα χημειοθεραπείας, έτσι lgr5 μεθυλίωση μπορεί να αυξάνει τη χημειοθεραπεία που είναι ευαίσθητο στο ορθοκολικό καρκίνο κύτταρο. Ωστόσο, είναι αξιοσημείωτο ότι το DNA μεθυλίωση δεν είναι ο μοναδικός μηχανισμός ρυθμίσεως ετερογένεια μοριακού καρκίνο βλαστικών κυττάρων. Άλλοι μηχανισμοί, όπως οι τροποποιήσεις των ιστονών, microRNA, αναδιαμορφωτές χρωματίνης και ούτω καθεξής [50], μπορεί επίσης να λειτουργεί κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης, που είναι πέρα ​​από το πεδίο εφαρμογής της παρούσας μελέτης. Τι περισσότερο είναι ότι η μεθυλίωση του DNA μπορεί να έχει μια στιχομυθία με άλλες οδούς σηματοδότησης ή ρύθμιση άλλων γονιδιακής έκφρασης. Melo [34]

et al

. ανέφεραν ότι η μεθυλίωση προαγωγού των γονιδίων στόχων Wnt αποτελεί ισχυρό προγνωστικό για υποτροπή καρκίνου του παχέος εντέρου, και ότι ένας ιδιαίτερα πιθανός μηχανισμός είναι ότι η αναστολή αυτών των γονιδίων προέκυψαν από μεθυλίωση θα μπορούσε εκ των πραγμάτων να ενισχύσει Wnt επίπεδα δραστηριότητας και να οδηγήσει σε εξέλιξη της νόσου και υποτροπής μέσω ενεργοποίησης ακόμη ανεξερεύνητο θετική στόχους. Η άλλη πλευρά, Lgr5 υψηλή έκφραση ήταν συνδεδεμένη με τον κακή πρόγνωση στον καρκίνο του παχέος εντέρου [51, 52]. Σίγαση της έκφρασης lgr5 θα μπορούσε να προωθήσει την απόπτωση του κόλου καρκινικό κύτταρο και μείωσε την μετάσταση [22]. Η μεθυλίωση του υποκινητή μείωσε την έκφραση lgr5 σε ανθρώπινες σειρές ιστό καρκίνου του παχέος εντέρου και κυττάρων σε Melo et al. αναφορά και στη μελέτη μας. Φάνηκε ότι lgr5 μεθυλίωση έδειξε την καλή πρόγνωση και λιγότερο εισβολή, και τα αποτελέσματά μας ήταν παρόμοια με αυτό. Υπήρχε κάπως διαφορετική με Melo et al. αποτελέσματα, μπορεί να είναι η προκατάληψη των δειγμάτων μας. Τα δείγματα μετάσταση είναι 31 (μόνο 18,3%, 31/169) στη μελέτη μας, αλλά τα δείγματα σχεδόν ήταν σταδίου ΙΙ στο άρθρο Melo`s.

Σε γενικές γραμμές, η μελέτη μας έδειξε ότι lgr5 μεθυλίωση isresponsible για γονιδιακή σίγηση lgr5 και διαφοροποίηση των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Επιπλέον, lgr5 μεθυλίωση είναι επίσης αντίστροφα σχετίζεται με υψηλού βαθμού όγκου και θετική μακρινή μετάσταση. Επιπλέον, μπορεί να χρησιμεύσει ως δείκτης για την πρόβλεψη καλύτερη επιβίωση μεταξύ των ασθενών με πρωτοπαθή καρκίνο του παχέος εντέρου. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η silencingof γονίδιο lgr5 μέσω CpG νησιού μεθυλίωση μπορεί να εμπλέκονται στην εξέλιξη της CRC και μπορεί δυνητικά να χρησιμεύσει ως θεραπευτικός στόχος (συμπληρωματικό στην παραδοσιακή χημειοθεραπεία για καρκίνο του παχέος εντέρου). Περαιτέρω μελέτες είναι απαραίτητες για τη διαλεύκανση των λεπτομερών ρυθμιστικών μηχανισμών in vivo.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 δεδομένων. Τα δεδομένα για ανάλυση επιβίωσης (επεκταθεί Σχήμα 5)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0143513.s001

(XLSX)

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε τον Δρ Shunhua Jin (Τμήμα Γαστρεντερολογίας, Nanfang Νοσοκομείο, Νότια Ιατρικό Πανεπιστήμιο) για MSP τεχνική βοήθεια.