Αφηρημένο

Το πεδίο της έρευνας και της θεραπείας του καρκίνου έχει σημειώσει σημαντική πρόοδο, αλλά είμαστε μακριά από το να έχουν απολύτως ασφαλείς, αποτελεσματικές και συγκεκριμένες θεραπείες που στοχεύουν τα καρκινικά κύτταρα και τα ανταλλακτικά τους υγιείς ιστούς. Οι φυσικές ενώσεις μπορούν να μειώσουν τα προβλήματα που σχετίζονται με τη θεραπεία του καρκίνου. Επί του παρόντος, πολλά φυτικά προϊόντα που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία του καρκίνου. Σε αυτή τη μελέτη, Rohitukine, ένα φυσικό αλκαλοειδές που συμβαίνουν χρωμόνη εξάγεται από

Dysoxylum binectariferum

, διερευνήθηκε για κυτταροτοξικές ιδιότητες κατά εκβλάστηση ζύμη καθώς και κατά του καρκίνου του πνεύμονα (Α549) κυττάρων. Εμείς προσπαθήσαμε να μελετήσουμε συγκεκριμένα Rohitukine στο

S

.

cerevisiae

στο πλαίσιο της ΜΑΡΚ ως μαγιά αντιπροσωπεύει ίσως το πειραματικό μοντέλο, όπου η οργάνωση και ρύθμιση των ΜΑΡΚ είναι καλύτερα κατανοητή. ΜΑΡΚ είναι εξελικτικά συντηρημένες πρωτεϊνικές κινάσες που μεταφέρουν εξωκυτταρικά σήματα στα μηχανήματα που ελέγχει βασικές κυτταρικές διεργασίες όπως η ανάπτυξη, μετανάστευση, διαφοροποίηση, την κυτταρική διαίρεση και την απόπτωση. Έχουμε στόχο την υλοποίηση υπόθεση οδηγείται μελέτες προς την κατεύθυνση με στόχο το σημαντικό δίκτυο της κυτταρικής επικοινωνίας, μια κρίσιμη διαδικασία που παίρνει στραβά στον καρκίνο. Χρησιμοποιεί μεταλλαγμένα στελέχη του συστήματος γενετικού μοντέλου

Saccharomyces cerevisiae

.

S

.

cerevisiae

κωδικοποιεί πέντε MAPKs εμπλέκονται στον έλεγχο των διακριτών κυτταρικών αποκρίσεων όπως η ανάπτυξη, η διαφοροποίηση, τη μετανάστευση και την απόπτωση. Η μελέτη μας περιλαμβάνει γονίδιο knockouts του

Slt2

και

Hog1

το οποίο είναι λειτουργικά ομόλογα της ανθρώπινης ERK5 και p38 ΜΑΡΚ θηλαστικών, αντίστοιχα. Πραγματοποιήσαμε ανάλυση κυτταροτοξικότητας για να αξιολογηθεί η επίδραση της Rohitukine στη βιωσιμότητα των κυττάρων και προσδιορίζεται επίσης τα αποτελέσματα του φαρμάκου για την παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου, επαγωγή της απόπτωσης και της έκφρασης του

Slt2

και

Hog1

γονιδίου σε επίπεδο του mRNA με την παρουσία του φαρμάκου. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης δείχνουν μια διαφορετική επίδραση στη δραστηριότητα του φαρμάκου μεταξύ του WT,

Slt2

και

Hog1

στέλεχος διαγραφή του γονιδίου που υποδεικνύουν την εμπλοκή του ΜΑΡΚ μονοπατιού. Περαιτέρω, ερευνήσαμε Rohitukine επάγεται κυτταροτοξικά αποτελέσματα στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα και διεγείρονται τα παραγωγές ROS μετά από έκθεση για 24 ώρες. Τα αποτελέσματα από κηλίδωση Western δείχνουν ότι Rohitukine προκάλεσε απόπτωση στην κυτταρική σειρά Α549 μέσω προς τα πάνω ρύθμιση της ρ53, caspase9 και κάτω ρύθμιση πρωτεΐνης Bcl-2. Το πεδίο εφαρμογής της παρούσας μελέτης είναι η κατανόηση του μηχανισμού της αντικαρκινικής δράσης των Rohitukine να αυξήσει το ρεπερτόριο των αντικαρκινικών φαρμάκων, έτσι ώστε το πρόβλημα που δημιουργήθηκε από την εμφάνιση της αντίστασης προς την τυπική αντικαρκινικές ενώσεις μπορούν να μετριαστούν

Παράθεση:. Safia, Kamil Μ, Jadiya P, Sheikh S, Haque Ε, Nazir A, et al. (2015) χρωμόνης Alkaloid, Rohitukine, παρέχει Αντικαρκινική Δραστηριότητα μέσω Αναλογικός απόπτωση Pathways στο Α549 γραμμή κυττάρων και μαγιά Μιτογόνο Activated πρωτεϊνικής κινάσης (ΜΑΡΚ). PLoS ONE 10 (9): e0137991. doi: 10.1371 /journal.pone.0137991

Επιμέλεια: Muzamil Ahmad, Ινδικό Ινστιτούτο Integrative Medicine, ΙΝΔΙΑ

Ελήφθη: 13 του Απρίλη του 2015? Αποδεκτές: 24 του Αύγ 2015? Δημοσιεύθηκε: 25 Σεπτεμβρίου 2015

Copyright: © 2015 Safia et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς που χρηματοδοτούνται από Integral Πανεπιστήμιο και το Πανεπιστήμιο Επιχορήγηση της Επιτροπής Ινδία. Η κα Safia είναι ευγνώμων στο Πανεπιστήμιο της Επιτροπής Χορηγιών (UGC), η κυβέρνηση της Ινδίας για Maulana Azad Εθνική Fellowship, (F1-17.1 /2011 /MANF-ΜΕΤ-UTT-5405). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η διαρκώς εξελισσόμενη θλίψη του καρκίνου τοποθέτηση προκλήσεις για τους ερευνητές και τους κλινικούς γιατρούς, όπως η νόσος συνεχίζει να επιβάλει τεράστιο ποσό της επιβάρυνσης της υγείας σε μια καταστροφική παγκόσμια κλίμακα. Σημαντική κατανόηση των μηχανιστικών συνθήματα του έχει επιτευχθεί μέσα από ερευνητικές προσπάθειες που έχουν πλέον αποδείξει ότι αυτή η ασθένεια βρίσκει μια ισχυρή αιτία αλλάξει την επικοινωνία μεταξύ και εντός των κυττάρων [1]. Μέχρι στιγμής, η αποτελεσματική μη χειρουργική θεραπείες κατά της νόσου περιλαμβάνουν χημειοθεραπεία και θεραπευτικά σχήματα ακτινοβολίας βασίζεται. Ωστόσο, ένας αριθμός δυνητικών αντικαρκινικών θεραπειών, με βάση τα μόρια φυσικής προέλευσης, έχουν επιδείξει υπόσχεση για τη θεραπεία του καρκίνου, ενώ ασκώντας ελάχιστη ανεπιθύμητες επιδράσεις (αναιμία, ναυτία και τριχόπτωση) και για την αντιμετώπιση του προβλήματος της ανθεκτικότητας στα φάρμακα [2]. Εκτός από την παρενέργεια και αντοχής φαρμάκου, το κόστος του φαρμάκου χημειοθεραπείας είναι επίσης πολύ υψηλή σε σύγκριση με την φυσική ένωση από τις φαρμακευτικά φυτά

Rohitukine (C16H19NO5?. 5, 7-διϋδροξυ- 8- (3- υδροξυ-1-μεθυλ-4-πιπεριδινυλ) -2-μεθυλο- 4Η-χρωμεν-4-όνη), που απομονώθηκε από

Amoora rohituka

,

Dysoxylum binectariferum

και

Schumanniophyton problematicum

, είναι γνωστό ότι διαθέτουν αντι-φλεγμονώδη, αντι-εμφύτευση, αντι-γονιμότητας, αντι-πολλαπλασιαστικές και ανοσορρυθμιστικές ιδιότητες [3]. Ωστόσο αντικαρκινική μηχανισμός δράσης του Rohitukine δεν είναι γνωστή και ως ανά κατανόηση μας για πρώτη φορά, έχει αξιολογηθεί σε σύστημα γενετικό μοντέλο εκβλάστησης ζύμης καθώς επίσης και σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Εκατοντάδες γονίδια ζύμης παρουσιάζουν μια σύνδεση με γονίδια ανθρώπινων ασθενειών, όπως σχεδόν το 30% του περιβόητου γονιδίων που εμπλέκονται σε ανθρώπινες ασθένειες έχουν ορθόλογα μαγιά [4]. Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι το 47% των γονιδίων ζυμομύκητα θα μπορούσε να εξανθρωπιστεί επιτυχώς [5].

S

.

cerevisiae

επίσης βοηθά στην αποκάλυψη σημαντικών πτυχών των πολλών ασθενειών, όπως ο τύπος νευροϊνωμάτωση l, καρκίνο του παχέος εντέρου [6].

Εμείς προσπαθήσαμε να μελετήσουμε συγκεκριμένα Rohitukine στο

S

.

cerevisiae

στο πλαίσιο της ΜΑΡΚ ως μαγιά αντιπροσωπεύει το πειραματικό μοντέλο όπου η οργάνωση και ρύθμιση των ΜΑΡΚ κατανοούνται καλύτερα [7]. ΜΑΡΚ είναι εξελικτικά συντηρημένες πρωτεϊνικές κινάσες που μεταφέρουν εξωκυτταρικά σήματα στα μηχανήματα που ελέγχει βασικές κυτταρικές διεργασίες όπως η ανάπτυξη, μετανάστευση, διαφοροποίηση, την κυτταρική διαίρεση και την απόπτωση. Ως εκ τούτου, η μετάλλαξη σε οποιαδήποτε από τις κινάσες αυτών των οδών είναι άμεσα συνδεδεμένη με τον καρκίνο [8]. Είναι, ως εκ τούτου, είναι φρόνιμο να εστιάσει περαιτέρω ερευνητικές προσπάθειες για την σχεδίαση του μηχανισμού που βασίζεται αντικαρκινικές ενώσεις που δρουν σε συγκεκριμένους μοριακούς στόχους που συνδέονται με την αιτιολογία της νόσου [9]. Ως εκ τούτου κινάσης καταρράκτη παρουσιάζει νέες ευκαιρίες για την ανάπτυξη νέων θεραπειών του καρκίνου σχεδιαστεί ώστε να είναι λιγότερο τοξικά από τα συμβατικά χημειοθεραπευτικά φάρμακα [10]. Οι μελέτες διεξήχθησαν απασχολούν σύστημα γενετικό μοντέλο

Saccharomyces cerevisiae

όπως έχει επωφελώς αξιοποιηθεί για την αποσαφήνιση της αντικαρκινική θεραπεία σε συνδυασμό με την έκθεση σε 5-φθοριοουρακίλη [11]. Μαγιά επίσης αποτιμάται ως ένα εντυπωσιακό μοντέλο για την έρευνα αντικαρκινικού φαρμάκου [12], όπως έχει αποδειχθεί χρήσιμη για την αποκάλυψη των κυτταρικών στόχων των διαφόρων φαρμάκων συμπεριλαμβανομένων των πολύτιμων αντικαρκινικό φάρμακο KP1019 [13]. Ο εκκολαπτόμενος μαγιά έχει πέντε τύπους ΜΑΡΚ, συμπεριλαμβανομένων: FUS3, KSS1, Smk1, Hog1 και Slt2. Slt2 είναι η ΜΑΡΚ του μονοπατιού ακεραιότητα του κυτταρικού τοιχώματος και λειτουργικό ομόλογο της ανθρώπινης ERK5 που ενεργοποιούνται σε απόκριση σε αυξητικούς παράγοντες και συνθήκες στρες [14]. Hog1 είναι λειτουργικό ομόλογο της p38 ΜΑΡΚ θηλαστικών και κυρίως ενεργοποιείται σε απάντηση ωσμωτική καταπόνηση [15].

Οι μελέτες που αναφέρονται στο παρόν, να κάνει χρήση του συστήματος γενετικού μοντέλου

S

.

cerevisiae

προς την αποκρυπτογράφηση των επιπτώσεων της Rohitukine σε όλα τα σημαντικά διαδικασία της κυτταρικής επικοινωνίας διαμεσολαβείται από διαδρομή ΜΑΡ κινάσης, επηρεάζοντας έτσι την κυτταρική επιβίωση και το θάνατο μέσω απόπτωσης. Η μελέτη ερευνά επίσης την επίδραση των Rohitukine στην απόπτωση στο ανθρώπινο πνεύμονα καρκίνου κυτταρική γραμμή και διερευνά τους πιθανούς μηχανισμούς που εμπλέκονται, μέσω μελετών για σημαντικά διαμορφωτές της διαδικασίας.

Υλικά και Μέθοδοι

Εξόρυξη Rohitukine

Rohitukine απομονώθηκε από στέλεχος του

Dysoxylum binectariferum

όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Εν συντομία, ξηραίνεται στον αέρα στέλεχος φλοιό του φυτού εκχυλίζεται με 95% αιθανόλη και κατόπιν συμπυκνώθηκε με ελαττωμένη πίεση. Είναι περαιτέρω κλασματώνεται σε τέσσερα κλάσματα (χλωροφόρμιο, διαλυτές η-βουτανόλη, η-εξάνιο και αδιάλυτο κλάσμα κ-βουτανόλη). Από κλάσμα χλωροφόρμιο, έναν γνωστό αλκαλοειδές rohitukine {5,7-διυδροξυ-2-μεθυλο-8- [4- (3-υδροξυ-1-μεθυλ) -πιπεριδινυλ] -4Η-1-βενζοπυραν-4-όνη) απομονώθηκε} με χρωματογραφία επαναλαμβανόμενη στήλης πάνω σε σιλικαζέλ και περαιτέρω καθαρισμό με HPLCLC- 20AD χρησιμοποιώντας μεθανόλη διαλύτη 55:45 ν /ν, ρυθμός ροής 1,0 ml /min. Ο χαρακτηρισμός της ένωσης πραγματοποιήθηκε με τη χρήση IR, NMR, μάζας, παραγώγων, και η σύγκριση με τα διαθέσιμα λογοτεχνίες. Η καθαρότητα της rohitukine ήταν 99,6% και η απόδοση ήταν 1%.

πολιτισμό μαγιά και

συντήρησης

Στην παρούσα μελέτη, η άγριου τύπου στέλεχος BY4741 (ΜΑΤα his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) και νοκ-άουτ στέλεχος του

Slt2

και

Hog1

γονίδιο (δώρο από τον Dr. A. Chakrabarti και ο Δρ RC Meena από Άμυνας Ινστιτούτου Φυσιολογίας και Συναφών Επιστημών, DRDO, Ινδία) χρησιμοποιήθηκαν. Τα κύτταρα ζύμης αναπτύχθηκαν σε YPD μέσο (1% εκχύλισμα ζύμης, 2% βακτοπεπτόνη, 2% γλυκόζη) όπως στη μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως [17].

Προσδιορισμός της ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης

Ελάχιστο ανασταλτική συγκέντρωση (MIC) του φαρμάκου προσδιορίζεται τόσο φασματοφωτομετρικά (μετρώντας OD στα 600 nm με τη χρήση πολλαπλών φρεατίων αναγνώστη μικροπλάκας: Πολλαπλό Skan, Thermo Scientific) και οπτικά. Rohitukine διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο. Η MIC για Rohitukine προσδιορίστηκε με γραφική παράσταση O.D. στα 600 nm έναντι των συγκεντρώσεων του φαρμάκου (20 μg /ml έως 100 μg /ml) [18]. Η συγκέντρωση στο MIC του φαρμάκου χρησιμοποιήθηκε σε όλα τα πειράματα.

Αξιολόγηση της αναστολής της ανάπτυξης με κηλίδωση δοκιμασία

μετά την επεξεργασία φάρμακο αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων ζύμης εκτιμήθηκε με κηλίδωση δοκιμασίας. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πρότυπο εκχύλισμα ζύμης-πεπτόνης-δεξτρόζη μέσα μαζικής ενημέρωσης (YPD). Για τον εντοπισμό προσδιορισμούς, 5-φορές σειριακές αραιώσεις σε YPD μέσα παρασκευάστηκαν από εκθετικά αυξανόμενης καλλιέργειας των διαφορετικών στελεχών. 2 μί από κάθε αραίωση κατόπιν κηλίδα επί ΥΡϋ πλακών σε απουσία και παρουσία του φαρμάκου [19] .Οι διαφορές ανάπτυξης καταγράφηκαν μετά από επώαση των πλακών για 24 ώρες στους 30 ° C.

Ανίχνευση αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS ) σε εκβλάστηση

ζύμη

Η ανίχνευση των αντιδραστικών ειδών οξυγόνου διεξήχθη με τη χρησιμοποίηση 2 ‘7’ Dichlorofluoresceindiacetate (Η2-DCF-DA?. Cat Νο-D399? Invitrogen) χρώση όπως περιγράφηκε προηγουμένως με κάποια τροποποίηση [ ,,,0],20]. Εν συντομία, τα επίπεδα των ROS μετρήθηκαν μετά από 24 ώρες της φαρμακευτικής αγωγής με την προσθήκη 0,5 μΜ Η2-DCF-DA στα κύτταρα για 15 λεπτά σε σκοτάδι. Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με 1Χ PBS. μικροσκοπία φθορισμού πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Zeiss Axioplan-2 μικροσκόπιο χρησιμοποιώντας μήκος κύματος διέγερσης 485 nm και μήκος κύματος εκπομπής 520 nm. παραγωγή ROS ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό εικόνας J (Εικόνα J, National Institutes of Health, Bethesda και, MD). Ένα σύνολο των 50 κυττάρων από κάθε ομάδα ποσοτικά για την ένταση φθορισμού και η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε σε σχέση με την ομάδα ελέγχου χωρίς θεραπεία.

Εκτίμηση του μιτοχονδριακού περιεχομένου που απασχολούν Mitotracker Deep Red χρώση

Για να ελέγξετε το αποτέλεσμα του φαρμάκου στη μιτοχονδριακή περιεχόμενο, Mito Tracker Deep Red χρώσης (Cat. Νο-22426, Invitrogen) έγινε όπως περιγράφεται προηγουμένως με ορισμένες τροποποιήσεις [20]. Εν συντομία, 100 μΙ κύτταρα ζυμομύκητα επωάστηκαν με 100 ηΜ Mito Tracker λεκέ για 50 λεπτά στους 30 ° C σε σκοτεινό ακολουθείται από τρεις φορές το πλύσιμο σε 1Χ PBS. Απεικόνιση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού με ένα μήκος κύματος διέγερσης 637 nm και μήκος κύματος εκπομπής 660 nm. Η ένταση φθορισμού του μιτοχονδριακού περιεκτικότητα ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Image-J λογισμικό.

Δοκιμασία για αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο χρησιμοποιώντας πορτοκαλί της ακριδίνης (AO) χρώση

χρώση πορτοκαλί ακριδίνης έγινε για να ελεγχθεί η επαγωγή της απόπτωσης στάδιο νωρίς . Ακριδίνης πορτοκαλί (Hi-Media-116) διαλύθηκε σε PBS (ρΗ = 7). Ένας όγκος 100 μΙ κυττάρων ζυμομυκήτων χρωματίστηκε με 1 μΙ 2.5 mg /ml του AO για να πάρει την συγκέντρωση εργασίας 25μg /ml. Η χρώση διεξήχθη για 30 λεπτά σε σκοτάδι και τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS [21]. Απεικόνιση βαμμένων κυττάρων διεξήχθη χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού με ένα μήκος κύματος διέγερσης 502 nm και μήκος κύματος εκπομπής 520 nm. Η ένταση φθορισμού των κυττάρων χρωματίζονται ποσοτικοποιήθηκε με λογισμικό Image J.

Δοκιμασία για τη μελέτη κατακερματισμού του DNA

κατάτμηση DNA προσδιορίστηκε με Stain κυττάρων Nuc Μπλε Ζωντανά (R37605 Ζωή Technology Corporation) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή . Απεικόνιση βαμμένων κυττάρων έγινε με μικροσκόπιο φθορισμού με ένα μήκος κύματος διέγερσης 352 nm και μήκος κύματος εκπομπής 460 nm και η ένταση φθορισμού των χρωματισμένων κυττάρων μετρήθηκε ποσοτικά με λογισμικό Image J.

ημι-Quantitative PCR αντίστροφης μεταγραφής για το ανάλυση των επιπέδων του mRNA της

Slt2

και

Hog1

γονίδιο με την παρουσία του Rohitukine

το συνολικό RNA εκχυλίζεται και αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας Επαναφορά Ενίσχυση ™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas Life Sciences, CAT- K1622). cDNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές που παρατίθενται στον Πίνακα 1 και την PCR προϊόντα διαχωρίστηκαν σε 1.5% πηκτή αγαρόζης και οπτικοποιούνται με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου.

Η

αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-συνδέτη που χρησιμοποιούν υπολογιστικά εργαλεία

Ο 3-διαστάσεων (3D) δομή των p38 και ERK5 που χρησιμοποιούνται για τη μελέτη σύνδεσης ανακτήθηκε από την τράπεζα δεδομένων πρωτεΐνης με το ΠΣΠ αναγνωριστικά: 1WFC και 4IC8 αντίστοιχα. Η δομή του συνδέτη (Rohitukine) (CID: 13422573) ήταν προσβάσιμο από «ένωση Pubchem». Χρησιμοποιώντας τα εργαλεία ΑυΤΌϋΟΟΚ Essential άτομα υδρογόνου, Kollman ενωμένοι επιβαρύνσεις τύπος άτομο, και προστέθηκαν παραμέτρους επιδιαλύτωσης. Affinity (πλέγμα) χάρτες της 60 × 60 × 60 πόντους ένα πλέγμα και 0.375 Å απόσταση δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Autogrid που εστιάζει σε δίκτυο συντονίζει σε εγγύτητα με το ενεργό κέντρο των στόχων. Κατά συνέπεια, οι τιμές των χ, γ και ζ συντεταγμένες που χρησιμοποιούνται για τη στόχευση την ενεργό θέση Hog1 και ERK5 ήταν 18.783, 35.698, 30.394 για Hog1 και 15.928, -17.057, 1.101 για ERK5 αντίστοιχα. προσομοιώσεις σύνδεσης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το Λαμαρκιανή γενετικού αλγορίθμου (LGA) και το Solis & amp? Βρέχει μέθοδο τοπικής αναζήτησης. Δέκα διαφορετικές εκτελέσεις πραγματοποιήθηκαν για κάθε σύνδεσης. Τα τελικά στοιχεία δημιουργήθηκαν με τη βοήθεια του Discovery Studio Visualizer (ΑοοβΙτγδ).

Cell Culture

κύτταρα Α549 (ανθρώπινου πνεύμονα καρκίνου κυτταρική γραμμή) ελήφθησαν από το Εθνικό Κέντρο Επιστημών κυττάρων (NCCS) Pune της Ινδίας, και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Μέσο Eagle Τροποποιημένο Media) F-12 (1: 1) (HIMEDIA AL187A) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 0,2% όξινο ανθρακικό νάτριο και 1% αντιβιοτικό και αντιμυκητιακό διάλυμα. Οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37 ° C και 5% CO2 και 95% υγρή ατμόσφαιρα.

ΜΤΤ

δοκιμασία

ΜΤΤ (HIMEDIA-TC191) δοκιμασία βασίζεται στη μείωση των ΜΤΤ με μιτοχονδριακής αφυδρογονάσης προς ένα μωβ προϊόν φορμαζάνης, δίνει μια ένδειξη του μιτοχονδριακού ακεραιότητα, η οποία ερμηνεύεται ως εκτίμηση της βιωσιμότητας τοις εκατό των κυττάρων [22]. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες ιστοκαλλιέργειας 96 φρεατίων (10

4 κύτταρα /φρεάτιο) σε πλήρες DMEM F-12, που ακολουθείται από επώαση σε 5% CO2, 95% ατμόσφαιρα για 24 ώρες στους 37 ° C. Μετά 24 ώρες έκθεση του φαρμάκου (10 μΜ-60 μΜ), ΜΤΤ (5 mg /ml αποθέματος σε PBS) προστέθηκε (10 ml /φρεάτιο σε 100 ml κυτταρικού εναιωρήματος), και οι πλάκες επωάστηκαν για 4 ώρες. Μετά την επώαση, το μίγμα της αντίδρασης προσεκτικά αφαιρεθεί και 200 ​​μΙ διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, τα περιεχόμενα αναμίχθηκαν καλά με πιπέτα πάνω και κάτω αρκετές φορές. Οι πλάκες διατηρούνται επί rocker αναδευτήρα για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια αναγνώστηκε στα 550 nm με τη χρήση πολλαπλών φρεατίων μικροπλάκα αναγνώστη (Multi Skan, Thermo Scientific). Τα ανεπεξέργαστα κύτταρα λειτουργούν υπό τις ίδιες συνθήκες και υπηρέτησε ως βασικό έλεγχο. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές ήταν και οι τυπικές αποκλίσεις προήλθαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Προσδιορισμός των δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα

παραγωγή ROS εκτιμήθηκε με τη χρήση 2 ‘, 7’ -diclorodihydrofluorescein δι-οξική (Η2-DCF-DA?. Cat Νο-D399? Invitrogen) όπως περιγράφεται προηγουμένως [23]. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μαύρη πλάκα 96-φρεατίων σε μια πυκνότητα των 10

4 κύτταρα /φρεάτιο επωάστηκαν με 1 mM Η2-DCF-DA? για 30 λεπτά στους 37 ° C που ακολουθείται από επώαση με διαφορετικές συγκεντρώσεις του φαρμάκου για 24 ώρες. Η μέτρηση της ROS διεξήχθη κατά τη διάρκεια της περιόδου θεραπείας στα 485 nm διέγερση και 535 nm μήκη κύματος εκπομπής. γενιά ROS επιβεβαιώθηκε και από μικρογραφία φθορισμού της κυτταρικής ROS. Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκα ιστοκαλλιέργειας 48 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 1 mM Η2-DCF-DA? για 30 λεπτά που ακολουθείται από επώαση με διαφορετικές συγκεντρώσεις Rohitukine για 24 ώρες στους 37 ° C. εικόνες φθορισμού συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Zeiss Αχίορίαπ-2 μικροσκόπιο χρησιμοποιώντας φίλτρο FITC στο πλαίσιο του στόχου 20Χ.

Απομόνωση της συνολικής κυτταρικής πρωτεΐνης από τα κύτταρα Α549

Rohitukine επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν, πλύθηκαν με κρύο PBS και λύθηκαν σε RIPA ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 1 mM EDTA, 50 mM Tris, ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 1% ΝΡ-40, 0,25% δεοξυχολικό νάτριο, 0.1% SDS, 1 mM NaF, 1 mM Na

3VO4, 1 mM PMSF και 1 μg /ml λευπεπτίνη [24]. Κυτταρόλυμα απαλά στροβιλίστηκε για 30 δευτερόλεπτα μετά από 1 ώρα επώαση σε ρυθμιστικό λύσης. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση στα 14.000 χ g για 15 λεπτά και αποθηκεύθηκε σε κλάσματα στους -20 ° C. Η περιεκτικότητα πρωτεΐνης ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία πρωτείνης Bradford.

Ανάλυση Western Blot Ανίχνευση απόπτωσης που σχετίζονται πρωτεΐνες

κυτταρολύματα μετουσιώθηκαν και είκοσι μικρογραμμάρια της πρωτεΐνης διαχωρίστηκε σε ηλεκτροφόρηση 12% SDS-πολυακρυλαμιδίου. Ήταν ηλεκτρο-μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου με 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris (TBS) με 0,05% Tween-20 (ΤΒδ-Τ) για 2 ώρες. Μετά από πλύσιμο με TBS-T μεμβράνες επωάστηκαν με τα πρωτογενή αντισώματα έναντι ρ53 (1: 3000), caspase9 (1: 3000), Bcl-2 (1: 5000) και β-ακτίνη (1: 4000) για μία νύχτα σε 4 ° ΝΤΟ. Μετά την πλύση, η μεμβράνη επωάστηκε με HRP-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (αντι-κουνέλι ή αντι-ποντίκι, 1: 10.000? Invitrogen, USA) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. λωρίδες στυπώματος Western ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας υπόστρωμα χημειοφωταύγειας (Millipore) με χρήση Chemidoc (GE). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για ίση φόρτωση και την ομαλοποίηση της πρωτεΐνης. Πρωτεΐνη Ladder (3Β BlackBio Biotech-3B75) (3.5-245kDa) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του μοριακού βάρους των πρωτεϊνών μπάντες. Πυκνομετρία των ζωνών που λαμβάνονται έγινε με λογισμικό ΝΙΗ Image J έκδοση 1.41 (USA).

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM Η στατιστική σημαντικότητα μεταξύ διαφόρων ομάδων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποίηση του Student t test χρησιμοποιώντας Graph Pad πρίσματος 5 λογισμικού. Για

in vitro

δεδομένα της μελέτης εκφράσθηκαν ως μέση τιμή ± Τ.Α. και η στατιστική σημαντικότητα των αποτελεσμάτων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA με δοκιμή πολλαπλής σύγκρισης Tukey του.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

ΔSlt2 και ΔHog1 στελέχη είναι υπερευαίσθητοι σε Rohitukine θεραπεία

η μελέτη αυτή, προσδιορίσαμε κυτταροτοξικότητα Rohitukine σε εκκολαπτόμενους μαγιά και επίσης να διερευνήσει εάν οι πορείες της ΜΑΡ κινάσης εμπλέκεται στην Rohitukine κυτταρικό θάνατο που επάγεται, έτσι ώστε να προσδιοριστεί η επίδραση της Rohitukine επί του κυττάρου βιωσιμότητα του ΔSlt2 και ΔHog1 στελέχη. Rohitukine δείχνει κυτταροτοξικότητα εναντίον όλων των τύπων στελεχών ζυμομύκητα. Το MIC

50 για Rohitukine προσδιορίσθηκε με γραφική απεικόνιση Ο.Π. στα 600 nm έναντι συγκεντρώσεις του φαρμάκου. MIC

50 τιμή για WT βρέθηκε να είναι 80 μγρ /ml και για τα δύο στελέχη knock-out γονίδιο βρέθηκε να είναι 60 μg /ml. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σε δόση κάτω από την MIC

50 τιμή (40μg /ml). Το σχήμα 1 δείχνει ότι Rohitukine ασκεί κυτταροτοξικά αποτελέσματα επί της ζύμης. Αν και η συγκέντρωση του Rohitukine που σκοτώνει το 50% περίπου των κυττάρων ζύμης είναι υψηλότερο από το IC

50 τιμές που αναφέρθηκαν για τα καρκινικά κύτταρα in vitro [25] το αποτέλεσμα αυτό δεν αποτελεί έκπληξη δεδομένου ότι ζυμομυκήτων συχνά εμφανίζουν υψηλότερα επίπεδα αντοχής σε αντινεοπλασματικών παραγόντων [ ,,,0],26] είναι πιθανό ότι η παρουσία του κυτταρικού τοιχώματος ζυμομύκητα μπορεί να είναι η παρεμπόδιση της εισόδου του φαρμάκου σε κύτταρο και τα μέρη των εξαγωγών μεταφορέα που θα παρεμβαίνουν με την είσοδο του φαρμάκου στο εσωτερικό του κυττάρου και μαγιά κύτταρα είναι επίσης πολύ αποτελεσματική στη μείωση ενδοκυτταρική συγκέντρωση των τοξικών μικρά μόρια χρησιμοποιώντας έναν μεγάλο αριθμό πρωτεϊνών μεταφοράς [27].

(α) Yeast κύτταρα βιωσιμότητα σε διαφορετική συγκέντρωση Rohitukine μετά από 24 ώρες της θεραπείας απεξάρτησης, 5-φορές σειριακές αραιώσεις από εκθετικά αναπτυσσόμενες καλλιέργειες του WT, ΔSlt2 και ΔHog1 στελέχη κηλιδώθηκαν επί ΥΡϋ μέσου που περιέχει 40 μg /ml, 80 μg /ml και 100 μg /ml του φαρμάκου. (Β) Το ποσοστό των κυττάρων που επιβιώνουν σε σχέση με τους χωρίς θεραπεία ελέγχους.

Η

Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα στελέχη γονίδιο knockout ήταν πιο ευαίσθητα στο φάρμακο σε σύγκριση με το στέλεχος WT στο ίδιο MIC (40μg /ml) όπως υποδεικνύεται με πυκνότητα των κηλίδων στην επισήμανση δοκιμασία για την κυτταρική βιωσιμότητα (Σχήμα 1Α) και με OD στα 600 nm (Σχήμα 1 Β) Αποτέλεσμα της κηλίδωσης δοκιμασίας επιβεβαίωσε ότι τα κύτταρα ζύμης όταν θεραπεύτηκαν με Rohitukine έχασε τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε δοσοεξαρτώμενη τρόπο. Σε περίπτωση WT κύτταρα τόπου έλεγχος βαθμολογήθηκε ως 0, 40 μg /ml του Rohitukine κατεργασμένων κυττάρων κηλίδα βαθμολογήθηκε ως 1, τα κύτταρα βαθμολογήθηκαν ως 2 στα 80 μγρ /κ.εκ φαρμάκου και σε 100 μg /ml κηλίδα κύτταρα βαθμολογήθηκαν ως 3 μετά από 24 ώρες από φαρμακευτική αγωγή. Και για τους δύο τύπους γονιδίου knockouts (Δslt2, Δhog1) κηλίδα μάρτυρα στέλεχος βαθμολογήθηκε ως 0, 40 μg /ml από κύτταρα που κατεργάζονται φαρμάκου βαθμολογήθηκε ως 2, 80 μγρ /κ.εκ κύτταρα που κατεργάζονται φαρμάκου βαθμολογήθηκε ως 3 και 100 μg /ml κυττάρων αντιμετωπίζεται φαρμάκου βαθμολογήθηκε ως 4 μετά από 24 ώρες από την φαρμακευτική αγωγή. στέλεχος ΔSlt2 ήταν υπερευαίσθητοι σε διάφορες γονοτοξικούς παράγοντες που έχουν διαφορετικό τρόπο δράσης, συμπεριλαμβανομένων methylmetanosulfonate, την υπεριώδη ακτινοβολία και φλεομυκίνη [28]. Slt2 ενεργοποίηση μετά την επαγωγή μιας ενιαίας DSB (διπλό σκέλος διάλειμμα) στην GAL1: στέλεχος ΗΟ, η οποία έχει μια συγκεκριμένη επίδραση στην ακεραιότητα του DNA, που δείχνει ένα ουσιαστικό ρόλο για Slt2 στην απόκριση σε γενοτοξικό στρες [29]. Κατά συνέπεια, αυτά τα γονίδια να ενεργοποιηθεί με την παρουσία του φαρμάκου σε WT κύτταρα έτσι θα μπορούσε να είναι δυνατό ότι ΔSlt2 και ΔHog1 στελέχη έδειξαν υπερευαισθησία στο φάρμακο [30].

Rohitukine πυροδοτεί τον κυτταρικό θάνατο μέσω επαγωγής οξειδωτικό στρες και τη μείωση της περιεκτικότητας μιτοχονδριακού σε ΔSlt2 και ΔHog1 στελέχη

παραγωγής

ROS μετρήθηκε να αναλύσει το ρόλο των ROS στο κύτταρο ζύμης θάνατο που προκαλείται από Rohitukine. Βρήκαμε ότι Rohitukine που προκαλείται σημαντική ποσότητα ROS μετά από 24 ώρες της θεραπείας από τα ναρκωτικά σε WT και σε στελέχη του γονιδίου νοκ-άουτ (Σχήμα 2Α). Ποσοτικοποίηση της έντασης φθορισμού της χρώσης Η2-DCF-DA (Σχήμα 2Β) έδειξε επίσης ότι Rohitukine επεξεργασμένα κύτταρα ζυμομύκητα που παράγεται συγκριτικά αυξημένα επίπεδα ROS σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα, αυξάνουν είναι 1,3 (Ρ & lt? 0.001), 2,0 (Ρ & lt? 0.001) και 1,7 (Ρ & lt? 0.001) φορές για WT, ΔSlt2 και ΔHog1 στελέχη αντίστοιχα μετά τη θεραπεία Rohitukine σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Ωστόσο ΔSlt2 και ΔHog1 στελέχη παρήγαγαν περισσότερο ROS σε σύγκριση με κύτταρα WT μετά την επεξεργασία και την αύξηση είναι 1,4 (Ρ & lt? 0.001) και 1,2 (Ρ & lt? 0.001) φορές για ΔSlt2 και ΔHog1 στελέχη αντίστοιχα σε σύγκριση με την WT μετά τη θεραπεία φαρμάκου, η οποία ενισχύει περαιτέρω την υπερευαισθησίας και των δύο μεταλλαγμένων στελεχών σε φάρμακο. Η διαφορά αυτή μπορεί να οφείλεται σε έλλειψη ΜΑΡΚ η οποία είναι γνωστό ότι ενεργοποιείται από το οξειδωτικό στρες. Επιπλέον ΜΑΡΚ ελλειμματικά κύτταρα ζύμης συσσωρεύονται ROS σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι WT κύτταρα κατά τη διάρκεια της στατικής φάσης [31]. Τα μονοπάτια της ΜΑΡ κινάσης επηρεάζεται όχι μόνο από τις αλληλεπιδράσεις συνδέτη υποδοχέα, αλλά και από διάφορα στρεσογόνους παράγοντες, όπως το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από το δυναμικό ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ. Σε γενικές γραμμές, η αυξημένη παραγωγή ROS στα κύτταρα προκαλεί ενεργοποίηση MAPKs, αλλά οι μηχανισμοί με τους οποίους ROS μπορεί να ενεργοποιήσει αυτά τα κινάσες είναι ασαφείς [32]. Αυτές οι μεταλλάξεις μπορεί να μειωθεί σε αυτοφαγία μονοπάτι που απαιτείται για να αποφευχθεί η υπερβολική συσσώρευση των ROS. Αδυναμία να αυξήσει την έκφραση των συστατικών της αναπνευστικής αλυσίδας και ROS καθαριστές πιθανόν οδηγεί στη συσσώρευση των ROS σε autophagy-ελαττωματικά κύτταρα.

S

.

cerevisiae

Hog1 ΜΑΡΚ ενεργοποιείται σε απάντηση στην υψηλή ωσμωτικότητα και είναι απαραίτητη για την επιβίωση των κυττάρων υπό αυτές τις συνθήκες [33]. Σε απόκριση σε διάφορες καταπονήσεις, Hog1p φωσφορυλιώνεται και μετατοπίζεται στον πυρήνα. Hog1 null μεταλλάξεις βρέθηκαν να είναι υπερευαίσθητοι σε αυτές τις συνθήκες στρες, οι οποίες οδηγούν σε ενεργοποίηση Hog1p, ιδίως για την εξωκυττάρια οξειδωτικοί παράγοντες [34].

(α) χρώση DCFDA (β) Γραφική αναπαράσταση Σχετική σχηματισμό των αντιδραστικών είδη οξυγόνου (ROS) που μετράται με χρώση H2DCFDA σε WT και γονίδιο knockout στελέχη ζυμομύκητα ως ποσοτικά χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image J *** ρ & lt? 0.001 (γ) Mitotracker Deep Red χρώση (δ) Γραφική αναπαράσταση για την ένταση φθορισμού του μιτοχονδριακού περιεχόμενο της εκκολαπτόμενους μαγιά, όπως ποσοτικά με τη χρήση του λογισμικού J Image *** p & lt?.. 0.001

Η

Επίσης, ελέγχεται έκθεσης αν Rohitukine επηρεάζει μιτοχονδριακό περιεχόμενο. Παρατηρήσαμε ότι το μιτοχονδριακό περιεχόμενο μειώθηκε σε μεγαλύτερο βαθμό σε ΔSlt2 και ΔHog1 στελέχους μετά από 24 ώρες θεραπείας Rohitukine αλλά WT κύτταρα παρουσίασαν αύξηση της περιεκτικότητας σε μιτοχόνδρια μετά τη θεραπεία φαρμάκου (Εικ 2C). Ποσοτικοποίηση της έντασης φθορισμού του μιτοχονδριακού περιεχόμενο (Σχήμα 2D) έδειξαν ότι Rohitukine επεξεργασμένα κύτταρα WT δείχνει ένα (LT P &? 0.001) 1,6 φορές αύξηση ενώ Rohitukine αντιμετωπίζονται ΔSlt2 και ΔHog1 στελεχών που επιδεικνύουν 1,2 (Ρ & lt? 0.001) και 2,0 (Ρ & lt? 0.001) φορές μείωση αντίστοιχα, σε σύγκριση με μη κατεργασμένο έλεγχο τους. Ωστόσο, ΔSlt2 έδειξε 2.3 (P & lt? 0.001) και ΔHog1 στέλεχος παρουσίασαν 2.2 (P & lt? 0.001) φορές μείωση σε σύγκριση με το WT παρουσία του φαρμάκου

Τα μιτοχόνδρια παίζουν επίσης πολύ σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση πολλών μηχανισμών. ελέγχουσα την επιβίωση των κυττάρων και του θανάτου [35]. Οι αλλαγές στα μιτοχόνδρια σχετίζονται με τη γήρανση, μειωμένη σύνθεση των μιτοχονδριακών πρωτεϊνών και μειωμένη δραστηριότητα των οξειδωτικών ενζύμων προκαλεί μείωση στην μιτοχονδριακή ΑΤΡ σύνθεση [36]. Οι οδοί ΜΑΡ κινάσης εμπλέκονται σε εγγενείς απόπτωση παρουσία isoorientin σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα ηπατοβλάστωμα [37]. Η φλαβοπιριδόλη (Rohitukine παράγωγο) προκαλεί κυτταρικό θάνατο μέσω μείωσης του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης σε ανθρώπινα κύτταρα λευχαιμίας [38]. Η φλαβοπιριδόλη προκαλεί επίσης STI571 (Bcr /Abl κινάσης) επήγαγε απόπτωση και βλάβη των μιτοχονδρίων και απόπτωσης σε BCR-ABL θετικά ανθρώπινα κύτταρα λευχαιμίας [39]. Κατά συνέπεια ΜΑΡΚ μεταλλάξεις δείχνουν την αυξημένη παραγωγή των ROS που ίσως η πιθανή αιτία που οδηγεί σε δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων.

Rohitukine προκαλεί επαγωγή πρώιμη απόπτωση στάδιο και βλάβη στο DNA

μαγιά

Τα στοιχεία της χρώσης ΑΟ έδειξε ότι Rohitukine προκαλεί επαγωγή απόπτωσης σε στελέχη knockout γονίδιο, σε σύγκριση με το στέλεχος WT μετά από 24 ώρες της φαρμακευτικής αγωγής (Σχήμα 3Α). Ποσοτικοποίηση της έντασης φθορισμού του ΑΟ χρώσης (σχήμα 3Β) έδειξε ότι η WT, ΔSlt2 και ΔHog1 λεκέδες της μαγιάς που παρουσιάζει ένα 1.3 (ρ & lt? 0.001), 2.0 (ρ & lt? 0.001) και 1.7 (ρ & lt? 0.001) φορές αύξηση αντίστοιχα μετά την αγωγή του φαρμάκου ως σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο έλεγχο τους. Ωστόσο, στέλεχος ΔSlt2 έδειξε 1,7 (p & lt? 0.001) και το στέλεχος ΔHog1 παρουσίασαν 1.2 (p & lt? 0.001). Πλάσια αύξηση σε σύγκριση με το στέλεχος WT όταν έλαβαν θεραπεία με Rohitukine

(α) Α.Ο. χρώση (β) Γραφική αναπαράσταση για ένταση φθορισμού του αποπτωτικού θανάτου των κυττάρων ζυμομυκήτων ως ποσοτικά χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image J *** ρ & lt? 0.001 (γ) βλάβη του DNA αποκάλυψε Nuc Μπλε ζωντανών κυττάρων Stain (δ) Γραφική αναπαράσταση για την ένταση φθορισμού των νουκλεϊκών οξέων των κυττάρων μαγιάς ως ποσοτικά χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image J *** ρ & lt? 0.001.

Η

Επίσης, παρατηρείται DNA κατακερματισμό μετά από 24 ώρες από την φαρμακευτική αγωγή σε MIC από NucBlue Ζωντανή Stain κυττάρων για το DNA. Αποτέλεσμα της χρώσης DNA (Σχήμα 3C) έδειξε σαφώς κατάτμηση του DNA σε WT όσο και στους δύο τύπους στελεχών γονιδίου knockout μετά την αγωγή του φαρμάκου που υποδηλώνει αποπτωτικό φαινότυπο. Εμείς ποσοτικοποιηθεί εικόνων για ένταση φθορισμού της χρώσης DNA (Σχήμα 3D). Υπήρχε 1,5 (p & lt? 0.001), 3,0 (p & lt? 0.001) και 3.9 (ρ & lt? 0.001) φορές αύξηση Rohitukine αντιμετωπίζονται WT, ΔSlt2 και ΔHog1 στέλεχος αντίστοιχα, σε σύγκριση με το μάρτυρα. Ωστόσο, ΔSlt2 έδειξε 1.1 (ρ & lt? 0.001) και το στέλεχος ΔHog1 εμφάνισαν 1.3 (ρ & lt? 0.001) πλάσια αύξηση σε σύγκριση με το Rohitukine επεξεργασμένα κύτταρα WT

κατάτμηση του DNA, ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της απόπτωσης [40] παρατηρήθηκε σε. όλοι οι τύποι στελεχών ζύμης μετά την αγωγή του φαρμάκου, όπως φαίνεται με χρώση ϋΑΡΙ. Το βαλπροϊκό οξύ προκαλεί απόπτωση από ROS παραγωγή και DNA κατακερματισμό ανεξάρτητη από Yca1p σε συγκεντρώσεις που επηρεάζουν ήπια τον πολλαπλασιασμό των ζυμομυκήτων [41].

αλληλεπίδραση Rohitukine επηρεάζει την έκφραση του

Slt2

και

Hog1

γονιδίου στο στέλεχος άγριου τύπου

Τα επίπεδα mRNA της

Slt2

και

Hog1

βρέθηκαν να είναι 3,7 και 2,8 φορές αυξημένη αντίστοιχα στο στέλεχος WT αντιμετωπίζονται με Rohitukine σε σύγκριση με εκείνη της ομάδας ελέγχου (Εικόνα 4Α). Ωστόσο, η έκφραση του mRNA της

Slt2

γονιδίου σε στέλεχος ΔHog1 και έκφραση

Hog1

γονιδίου στο στέλεχος ΔSlt2 παρέμειναν un-επηρεαστούν μετά τη θεραπεία Rohitukine. Το Σχήμα 4Β απεικονίζει τις φορές τις αλλαγές στα επίπεδα mRNA μέσα σε διαφορετικές ομάδες θεραπείας κανονικοποιήθηκαν έναντι εκείνη του μάρτυρα. Η επιλεκτική αύξηση των Slt2 και Hog1 σε συνθήκες άγριου τύπου και όχι στα knockouts είτε γονιδίου μπορεί να είναι αποτέλεσμα της πολλαπλής συνομιλιών μεταξύ διαφορετικών οδών ΜΑΡΚ που είναι πολύ κοινά [42]. Η υπερέκφραση του

Hog1

γονίδιο μετά τη θεραπεία Rohitukine μπορεί να εξαρτάται από την παρουσία του

Slt2

γονίδιο ή το αντίστροφο.

Η

Zymolyase ενεργοποιεί και τις δύο MAPKs και Slt2 ενεργοποίησης εξαρτάται από το υποκατάστημα Sho1 της οδού HOG. Και τα δύο μονοπάτια ΜΑΡΚ είναι απαραίτητα για την επιβίωση των κυττάρων παρουσία του στρες, επειδή τα μεταλλαγμένα στελέχη με ανεπάρκεια σε διαφορετικά συστατικά και των δύο οδών είναι υπερευαίσθητοι σε ζυμολάσης [43]. Ετσι, μπορεί να απαιτείται μία διαδοχική ενεργοποίηση δύο οδούς ΜΑΡΚ για κυτταρική προσαρμογή να τονίσει κατάσταση και κυτταρικό τοίχωμα βλάβη μετά την αγωγή Rohitukine.

Από προηγούμενες μελέτες είναι γνωστό ότι η θεραπεία υδροξυουρία αυξάνει φωσφορυλίωση Slt2 ΜΑΡ κινάσης [28 ]. Slt2 είναι υπεύθυνη για την ακεραιότητα του κυτταρικού τοιχώματος και ενεργοποιείται από βλάβη του κυτταρικού τοιχώματος, έτσι θα μπορούσε να είναι η πιθανή αιτία για την υπερευαισθησία του slt2 μεταλλαγμένης στη φαρμακευτική θεραπεία. Πρόσφατες μελέτες έχουν ενοχοποιήσει το ρόλο της Hog1 ΜΑΡΚ στην πρόκληση ανοχής σε μια ποικιλία συνθηκών στρες, συμπεριλαμβανομένων οσμωτική, οξειδωτική, θερμική, αρσενικό, και το άγχος κιτρικό οξύ [44].