Abstract

σήματα CD44 βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με κύτταρα σε έναν αριθμό τύπων όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος (CRC), ενώ παρεκκλίνουσα έκφραση CD44 μεταφέρει αυξημένη εμφάνιση όγκων, της εισβολής, και μεταστατικό δυναμικό. Προηγούμενα δεδομένα δείχνουν ότι CD44 είναι ένας άμεσος στόχος της ρ53 μεσολάβηση μεταγραφική καταστολή στον καρκίνο του μαστού. Από την αδρανοποίηση

p53

μεταλλάξεις είναι συχνές γενετικές γεγονότα στην CRC αυτά θα μπορούσε να εξαπολύσει την έκφραση του CD44. Στην παρούσα μελέτη, ως εκ τούτου, διερεύνησε τη σχέση μεταξύ του

p53

κατάστασης μεταλλάξεων και η έκφραση CD44 σε μια ομάδα 90 εντοπισμένη πρωτοβάθμιας CRCs και μελέτησαν την επίδραση της ενεργοποίησης p53 ακτινοβολίας που προκαλείται στην έκφραση CD44. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε ότι, σε αντίθεση με τον καρκίνο του μαστού, απώλεια της λειτουργίας

ρ53

μεταλλάξεις δεν σχετίζεται με αυξημένη έκφραση CD44 σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Επιπλέον, προκαλούμενη βλάβη του DNA ενεργοποιήσεως ρ53 δεν οδήγησε σε καταστολή της έκφρασης CD44, ούτε σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου ούτε σε φυσιολογικά εντερικά επιθηλιακά κύτταρα. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η έκφραση CD44 σε φυσιολογικά και κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα του εντέρου δεν ρυθμίζεται από το p53, υπονοώντας ότι η ρύθμιση αυτής της δυνητικά σημαντικό θεραπευτικό στόχο είναι ιστού και του καρκίνου του τύπου συγκεκριμένες

Παράθεση:. Zeilstra J, Joosten SPJ, Vermeulen L, Koster J, Medema JP, Versteeg R, et al. (2013) CD44 έκφραση στο εντερικό επιθήλιο και τον καρκίνο του παχέος εντέρου είναι ανεξάρτητη από ρ53 κατάσταση. PLoS ONE 8 (8): e72849. doi: 10.1371 /journal.pone.0072849

Επιμέλεια: Kanaga Sabapathy, Εθνικό Κέντρο Καρκίνου, Σιγκαπούρη

Ελήφθη: 1 Μαρτίου 2013? Αποδεκτές: 15 του Ιουλίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 29 Αυγούστου, 2013

Copyright: © 2013 Zeilstra et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο έχει χρηματοδοτηθεί από το ολλανδικό Ίδρυμα Καρκίνου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

CD44 περιλαμβάνει μια οικογένεια κυτταρικής προσκόλλησης και μόρια τα οποία ασκούν πλειοτροπικές επιδράσεις για σημαντικές βιολογικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων πολλαπλασιασμού, της επιβίωσης, της μετανάστευσης, επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβαση (ΕΜΤ), και μετάσταση καρκίνου σηματοδότησης (που επισκοπείται από τους Zoller [1]) . Στον εντερικό βλεννογόνο, CD44 είναι ένας σημαντικός άμεσο στόχο σηματοδότηση Wnt και εκφράζεται κυρίως σε εντερικά βλαστοκύτταρα [2] – [4]. Υπάρχουν συσσωρευμένα στοιχεία ότι CD44 εμπλέκεται στην έναρξη και την πρόοδο των εντερικών όγκων και την ανάπτυξη μεταστάσεων [1], [3], [5] – [9]. Επιπλέον, εξέχουσα έκφραση του CD44 είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της υψηλής ογκογόνο CRC κύτταρα [10]. Κατά συνέπεια, αποδείχθηκε πρόσφατα ότι

CD44

είναι μέρος ενός εντερικού γονιδίου υπογραφή βλαστοκύτταρα που προβλέπει την υποτροπή της νόσου σε ασθενείς CRC [11]. Αυτή η υπογραφή ήταν ειδικά συνδέονται με τα κύτταρα CRC προικισμένο με υψηλή-όγκου έναρξη δυναμικό, καθώς και τη μακροπρόθεσμη ικανότητα αυτο-ανανέωσης. Ως εκ τούτου, το CD44 αντιπροσωπεύει έναν δυνητικό θεραπευτικό στόχο για την θεραπεία του CRC και, συνεπώς, είναι σημαντικό να κατανοήσουμε τις διάφορους μηχανισμούς που διέπουν τη ρύθμιση του CD44. Στην πλειονότητα των περιπτώσεων CRC, η έκφραση του CD44 αυξάνεται ως αποτέλεσμα της απορρύθμισης του Wnt /β-κατενίνης σηματοδότηση [2], [12]. Ωστόσο, υπάρχουν άφθονα στοιχεία ότι τα άλλα δεν έχουν ακόμη προσδιοριστεί μονοπάτια και μηχανισμοί αυτοί συμβάλλουν στην ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου στόχου /β-κατενίνης Wnt στην εντερική όγκους [13]. Η ρ53 ογκοκατασταλτικό πρωτεΐνη είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην καταστολή του καρκίνου. Σε απάντηση στην ογκογόνο στρες, όπως βλάβη του DNA, η ενεργοποιημένη πρωτεΐνη ρ53 συνδέεται σε σημεία ειδικής αλληλουχίας DNA, ρυθμίζοντας έτσι τη μεταγραφή ενός ευρέος φάσματος των γονιδίων στόχων που εμπλέκονται στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου και επιβίωση σηματοδότηση [14]. Μεταλλακτικές αδρανοποίηση του

p53

γονίδιο είναι ένα συχνό συμβάν γενετική στην εξέλιξη πολλών τύπων ανθρώπινων όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού και του παχέος εντέρου (CRC) [15]. Απεδείχθη προσφάτως ότι η ρ53 μεταγραφικά καταστέλλει

CD44

έκφραση σε φυσιολογικά και προέρχεται από όγκο επιθηλιακά κύτταρα μαστού δια απευθείας συνδέσεως με το

CD44

υποκινητή [16]. Αυτό ρ53-εξαρτώμενη ρύθμιση των CD44 παρατηρήθηκε και στα δύο αδένες ανθρώπου και ποντικού μαστικών, υποδεικνύοντας μια εξελικτική διατηρημένη λειτουργία. Σημαντικά, τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης CD44 βρέθηκε να είναι ένα προαπαιτούμενο για την ρύθμιση της ανάπτυξης ρ53-εξαρτώμενη και επαγωγή απόπτωσης σε μαστικό επιθήλιο [16]. Μια παρόμοια λειτουργική αλληλεπίδραση μεταξύ ρ53 και CD44 θα μπορούσε επίσης να λάβει χώρα σε εντερικά επιθηλιακά κύτταρα και όγκους. Να διερευνήσει κατά πόσον η έκφραση CD44 ελέγχεται από πρωτεΐνη p53 σε CRC, αναλύσαμε μια ομάδα των καρκινωμάτων πρωτογενούς παχέος εντέρου για

p53

κατάστασης μεταλλάξεων και της έκφρασης CD44. Η μελέτη μας αποκαλύπτει ότι η απώλεια της λειτουργίας ρ53 δεν συνδέεται με αυξημένη έκφραση CD44 σε CRC. Επιπλέον, έχουμε καταδείξει ότι η ενεργοποίηση του άγριου τύπου ρ53 δεν είναι σε θέση να καταστέλλει την έκφραση CD44 σε καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου κόλον, καθώς και σε πρωτογενείς καλλιέργειες εντερικής κρύπτης ποντικού-λάχνης organoids.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθικοί

Η μελέτη στην οποία συμμετείχαν ανθρώπινα δείγματα βιοψίας διεξήχθη σύμφωνα με την Διακήρυξη του Ελσίνκι και έχει εγκριθεί από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου του Άμστερνταμ, AIEC (Algemene Instellingsgebonden Ethische Commissie). Οι ασθενείς έδωσαν γραπτή συγκατάθεση για τη συλλογή του δείγματος.

όγκου δείγματα, p53 Μετάλλαξη ανάλυση και η έκφραση γονιδίων Δοκιμασία

Η ομάδα μελέτης αποτελούνταν από 90 AJCC σταδίου ΙΙ ασθενείς CRC που υποβλήθηκαν εκ προθέσεως θεραπευτική χειρουργική επέμβαση στο ακαδημαϊκό Ιατρικό Κέντρο (AMC) στο Άμστερνταμ, Κάτω Χώρες, κατά τα έτη 1997-2006 [17]. Αντιπροσωπευτικά φρέσκος ιστός κατεψυγμένος όγκου κόπηκε σε 20 μm πάχους τομές που τοποθετήθηκαν αμέσως σε αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen Life Technologies, Breda, the Netherlands), μετά το οποίο εκχυλίστηκε ολικό RNA. φορτίο όγκου εξετάστηκε συνήθως από έναν έμπειρο παθολογοανατόμο.

p53

κατάστασης μεταλλάξεων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας RT-PCR. Εν ολίγοις, 2 μg ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε 25 μΙ όγκο αντίδρασης χρησιμοποιώντας pdN6 (Amersham Biosciences, Roosendaal, Ολλανδία) και MMLV μεταγραφάσης (Gibco BRL, Breda, the Netherlands). PCR πραγματοποιήθηκε σε 1 μΙ προτύπου cDNA χρησιμοποιώντας πολυμεράση Taq λευκοχρύσου (Invitrogen Life Technologies). Οι εκκινητές ολιγο παρατίθενται στον Πίνακα 1. PCR προϊόντα ενισχύθηκαν με 35 κύκλους των 45 s στους 95 ° C, 45 s στους 60 ° C, και 1 λεπτό και 30 δευτερόλεπτα στους 72 ° C, και υποβλήθηκαν σε καθορισμό αλληλουχίας χρησιμοποιώντας απευθείας συσκευασία Big Dye Terminator (Amersham) μαζί είτε με νόημα ή αντι-νόημα εναρκτήρας ολιγονουκλεοτιδίου. Οι αλληλουχίες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό CodonCode Aligner (CodonCode Corp., Dedham, ΜΑ). τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης στους όγκους εκτιμήθηκαν με τη χρήση της 2,0 πλατφόρμα συστοιχία Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus (Affymetrix, Santa Clara, CA). Το καθαρισμένο RNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία, υβριδοποιήθηκαν, και σαρώνεται σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού R2 (https://r2.amc.nl), μια web-based εφαρμογή ανάλυσης μικροσυστοιχιών αναπτύχθηκε από την Ι.Κ. Τα δεδομένα ήταν MAS5-εξομαλυνθεί και οι τιμές έκφρασης μεταμορφώθηκαν Log2. Η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA). σετ καθετήρα προσδιορίστηκαν ήταν:

CDKN1A

(

p21

), ID: 202284_s_at?

MDM2,

229711_s_at? και

CD44,

209835_x_at. Άλλες καθετήρα θέτει αναλύοντας

CD44

παράγονται παρόμοια αποτελέσματα, για παράδειγμα? 204489_s_at,

P

& lt? 0.01 και 210916_a_at,

P

& lt?. 0.01)

Η

Η ανοσοϊστοχημεία

παραφίνη-ενσωματωμένες καρκινικού ιστού ήταν λεκιασμένο χρησιμοποιώντας την κύρια ποντικού mAb αντι-ανθρώπινο ρ53 (Dako, Glostrup, Denmark) και του πρωτογενούς mAb ποντικού αντι-ανθρώπινο CD44 (VFF18) το οποίο αναγνωρίζει CD44v6 [18]. σύνδεση αντισώματος οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης PowerVision πολυ-HRP (ImmunoVision Technologies, Daly City, CA) και DAB + (Dako). Η ένταση (Ι) της χρώσης βαθμολογήθηκε σε ημιποσοτική κλίμακα ως εξής: «0», καμία αντίδραση? «1», αδύναμη αντίδραση? «2», μέτρια αντίδραση? και «3», ισχυρή αντίδραση. Η έκταση του σήματος βαθμολογήθηκε ως ποσοστό των θετικών κυττάρων (P). Συνολική βαθμολογία χρώση υπολογίστηκε πολλαπλασιάζοντας την ένταση από το ποσοστό των θετικών κυττάρων (Βαθμός = P * I? Μέγιστο = 300). ακριβής δοκιμασία του Fisher χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση (

P

& lt? 0.001).

Cell Culture, Ανοσοκηλίδωση και σε πραγματικό χρόνο αντίστροφη μεταγραφή-PCR

RKO κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσον McCoy 5Α supplementented με 10% FCS μέχρι υποσυρρέοντα. Ποντίκι του λεπτού εντέρου κρύπτες απομονώθηκαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που εγκρίθηκε από την τοπική επιτροπή των ζώων δεοντολογίας του Πανεπιστημίου του Άμστερνταμ, ΔΕΚ (Dier Ethische Commissie) και καλλιεργήθηκαν για μία εβδομάδα, όπως περιγράφεται από τον

Sato et al

. [19]. Καλλιέργειες εκτέθηκαν σε μία μόνο δόση των 10 Gy από πηγή ακτινοβολίας

137Cs γ-Χ σε ρυθμό δόσης 0,8 Gy /min ή επωάζονται με 500 ng /mL νεοκαρζινοστατίνη (NCS) είτε σε συνδυασμό με 10 μΜ νουτλίνη ή όχι . Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοαποτύπωση ήταν αντι-pan CD44 mAb Hermes-3 [20], αντι-ρ21 mAb sx118 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), και αντι-ρ53 mAb DO-1 (Santa Cruz Biotechnology). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Παράλληλα, το ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το PicoPure Απομόνωση RNA Kit (Arcturus Bioscience, Mountain View, CA) και σε πραγματικό χρόνο qRT-PCR διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [3], [21]. Ένας τρόπος-ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί σημαντικές αλλαγές (

P

& lt? 0,05). Στο χρόνο

Αποτελέσματα

απώλεια της λειτουργίας Μετάλλαξη ρ53 είναι δεν σχετίζεται με αυξημένα CD44 έκφραση στον καρκίνο του παχέος εντέρου

Η πρόσφατη ταυτοποίηση του p53 ως μεταγραφικός καταστολέας του

CD44

στον καρκίνο του μαστού και του μαστικού επιθηλίου [16], μας ώθησε να διερευνήσει κατά πόσο μια παρόμοια λειτουργική σχέση υπάρχει σε καρκίνο του παχέος εντέρου και του εντερικού επιθηλίου. Ως εκ τούτου, εξέτασε τη σχέση μεταξύ της κατάστασης ρ53 μεταλλάξεων και

επίπεδα CD44

mRNA σε μία ομάδα από 90 ορθοκολικού καρκινώματος. Όλες οι όγκοι που περιλαμβάνονται σε αυτή τη μελέτη ήταν αδενοκαρκινώματα με εισβολή μέσω του propria μυϊκό, αλλά χωρίς λεμφαδένα ή μακρινή μετάσταση (Dukes Β, AJCC στάδιο ΙΙ). Μεταλλακτικές κατάσταση αξιολογήθηκε με προσδιορισμό της αλληλουχίας cDNA του ολόκληρη την περιοχή κωδικοποίησης του

p53

γονίδιο, που καλύπτει τα εξόνια 1 έως 11. Η ανάλυση της αλληλουχίας προσδιορίζονται 25 όγκους (28%) με μια μετάλλαξη, καταλήγοντας σε ένα μεταγραφικά ανενεργή πρωτεΐνη p53 σύμφωνα με τον ορισμό των Σούση et al. [22] (Πίνακας 2). Σύγκριση μεταξύ των ομάδων με άγριου τύπου και των μεταλλαγμένων

p53

αποκάλυψε μια σημαντικά μειωμένη έκφραση του mRNA των δύο στόχων κανονική ρ53 μεταγραφικής,

CDKN1A

(

p21

) (

P

& lt? 0.01) [23] και

MDM2

(

P

& lt? 0.001) [24] στους όγκους με

p53

απώλεια των μεταλλάξεων λειτουργίας ( Σχήμα 1Α και Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, σε αντίθεση με μαστικών όγκων κατά την οποία διαπιστώθηκε απώλεια της λειτουργίας ρ53 να συσχετίζεται σημαντικά με αυξημένη

CD44

έκφραση [16],

p53

μετάλλαξη στα καρκινώματα του παχέος εντέρου συσχετίστηκε με μειωμένη

επίπεδα CD44

έκφρασης του mRNA (

P

& lt? 0,01? Σχήμα 1C). Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι η p53 δεν δρα ως μεταγραφικός καταστολέας του

CD44

έκφραση στο CRC.

επίπεδα Σχετική γονιδιακής έκφρασης σε

p53

μεταλλαγμένων και

p53

αδενοκαρκινώματα άγριου τύπου για το (Α)

CDKN1A

(

p21

) (**, Ρ & lt? 0.01), (Β)

MDM2

(***

P

& lt? 0.001), (C)

CD44,

(**,

P

& lt?. 0.01)

Η

Έκφραση CD44 πρωτεΐνη δεν είναι αυξημένη σε Colon καρκινώματα με

p53

Μετάλλαξη

για να επιβεβαιωθεί ότι

p53

κατάστασης μεταλλάξεων και τα επίπεδα του mRNA της

CD44

στην δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου πρωτογενούς αντικατοπτρίζουν τα επίπεδα της πρωτεΐνης, εξετάσαμε ρ53 και έκφραση CD44 με ανοσοϊστοχημεία σε ένα υποσύνολο των όγκων (η = 15 /ομάδα). Μεταλλάξεις σε

ρ53

συχνά οδηγήσουν σε ακατάλληλη σταθεροποίηση της πρωτεΐνης και πυρηνική συσσώρευση [25]. Σύμφωνα, ενώ οι όγκοι φιλοξενούν μόνο άγριου τύπου

αλληλουχίες γονιδίων p53

έδειξαν είτε καμία χρώση για την πρωτεΐνη ρ53 ή πυρηνική χρώση σε διάσπαρτα κύτταρα, οι όγκοι περιέχουν ένα

p53

μεταλλαγμένο γονίδιο έδειξε μια ισχυρή πυρηνική χρώση της πλειονότητας των κακοηθών κυττάρων (

P

& lt? 0.001, Σχήμα 2Α και Β). έκφραση CD44 παρατηρήθηκε στην κυτταρική μεμβράνη της συντριπτικής πλειοψηφίας όγκων είτε με μη μεταλλαγμένο

ρ53

(14 από 15) ή μεταλλαγμένου

ρ53

(14 από 15) (Σχ. 2Α). Σημαντικά, δεν υπήρξε σημαντική διαφορά στο σκορ CD44 χρώση μεταξύ όγκων και των δύο ομάδων (

P

& gt? 0,05? Σχήμα 2Β). Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι, εκτός από τον καρκίνο του μαστού, απώλεια της λειτουργίας ρ53 σε καρκίνο του παχέος εντέρου δεν συνδέεται με αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης CD44.

(Α) Σειριακές τομές ενός καρκινώματος του κόλου χωρίς και με μια απώλεια της λειτουργίας ρ53 μετάλλαξη (

δηλαδή

., R175H, Πίνακας 2), χρωματίστηκαν για p53 και της πρωτεΐνης CD44 (μπάρες δείχνουν 50 μm). (ΣΙ). Ανοσοϊστοχημεία (IHC) βαθμολογία των p53 και της έκφρασης της πρωτεΐνης CD44, αντίστοιχα (***

P

& lt? 0.001, ns = μη σημαντική).

Η

p53 δεν καταστέλλουν

CD44

στον Καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα και κανονική εντερικό επιθήλιο

Τα παραπάνω ευρήματα δεν αποκλείουν την πιθανότητα ότι άγριου τύπου ρ53 μπορεί (εν μέρει) καταστέλλουν την έκφραση CD44 σε φυσιολογικά και νεοπλασματικά εντερικού επιθηλίου μετά από ενεργοποίηση με γονοτοξικό στρες . Για την αντιμετώπιση αυτής της δυνατότητας, προσδιορίσαμε τις επιδράσεις της ενεργοποίησης p53 βλάβη που προκαλείται από DNA στα επίπεδα CD44 σε ανθρώπινα RKO κύτταρα καρκίνου κόλου. Αυτά τα κύτταρα εκφράζουν άγριου τύπου ρ53 και K-Ras και είναι διπλοειδή [26]. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον, RKO κύτταρα περιέχουν επίσης άγριου τύπου

APC

και

CTNNB1

γονίδια και στερούνται συστατική β-κατενίνης /TCF-4-μεσολάβηση μεταγραφής [27]. Αυτό είναι σημαντικό δεδομένου ότι η μεταγραφική ρύθμιση του

CD44 από

ρ53 θα μπορούσε να επικαλυφθεί από συστατική ενεργοποίηση μονοπατιού Wnt, οδηγώντας σε β-κατενίνης /TCF-4 διαμεσολαβούμενη

CD44

έκφρασης. RKO κύτταρα εκτέθηκαν σε 10 Gy από γ-ακτινοβολία μετά από το οποίο η έκφραση του

CDKN1A

(

p21)

και

CD44

και αναλύθηκαν με πραγματικού χρόνου qRT-PCR. Η έκφραση του

c-MYC

, μια άμεση Wnt γονίδιο στόχος [28], [29] αναλύθηκε επίσης για τον έλεγχο για τη διατήρηση μιας σταθερής κατάστασης του β-κατενίνης /TCF-4-καθοδηγείται μεταγραφική δραστικότητα. Επιπλέον, ρ53, ρ21, και τα επίπεδα της πρωτεΐνης CD44 αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση. Όπως ήταν αναμενόμενο, η ιοντίζουσα ακτινοβολία που προκαλείται από βλάβη του DNA οδήγησε σε σταθεροποίηση ρ53 (Εικόνα 3Α) και η επακόλουθη διενεργοποίησης του ρ21 παρατηρήθηκε σε όλα τα χρονικά σημεία (Σχήμα 3Α και Β). Ωστόσο,

CD44

επίπεδα γονιδιακής έκφρασης και την πρωτεΐνη CD44 δεν μειώθηκε πάροδο του χρόνου (Σχήμα 3Α και Β), ενώ

c-myc

επίπεδα mRNA παρέμεινε σταθερή (Εικόνα 3Β). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ρ53 δεν είναι σε θέση να καταστείλει

CD44

έκφραση σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου.

(Α) Ανοσοκηλίδωση ανάλυση του ρ53, ρ21 και τα επίπεδα πρωτεΐνης CD44 σε RKO κύτταρα καρκίνου κόλου σε επεξεργασία με ιοντίζουσα ακτινοβολία. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Αποτελέσματα (Β) qRT-PCR που δείχνουν τα επίπεδα έκφρασης σε σχέση γονιδίου για

CDKN1

Α (

p21

),

CD44,

και

c-myc

. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM διπλών πειραμάτων?. (*,

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με t = 0).

Η

Για να επεκτείνει τις παρατηρήσεις μας στην κανονική εντερικό επιθήλιο, είμαστε δίπλα διερευνήθηκε η απόκριση CD44 στην ενεργοποίηση ρ53 σε επιθηλιακά κύτταρα που ευθυγραμμίζουν τον άξονα κρύπτη-λάχνης του ποντικού λεπτό έντερο. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε

in vitro

καλλιεργημένα ποντίκι εντερικά επιθηλιακά organoids κρύπτες-λάχνης [19]. Organoids περιλαμβάνει πολλούς τομείς κρύπτη (Σχήμα 4Α) εκτέθηκαν σε 10 Gy από γ-ακτινοβολία μετά την οποία

Cdkn1a

,

CD44

, και

c-Myc

επίπεδα έκφρασης του mRNA ήταν αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου qRT-PCR. Παρόμοια με RKO κύτταρα,

Cdkn1a

επίπεδα mRNA αυξήθηκαν στις organoids σε απόκριση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία (Σχήμα 4Β). Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με προηγούμενες μελέτες επί της ενεργοποίησης που προκαλείται από ακτινοβολία ρ53 στο διαμέρισμα της κρύπτης του ποντικιού [30].

CD44

έκφραση mRNA δεν άλλαξε σημαντικά μετά την έκθεση σε ακτινοβολία, ενώ τα επίπεδα έκφρασης

c-Myc

παρέμεινε σταθερή (Σχήμα 4Β). Ομοίως, η χημική επαγωγή της ενεργοποίησης της ρ53 με χρήση NCS είχε επίσης ως αποτέλεσμα αυξημένα επίπεδα

Cdkn1a

mRNA. Ταυτόχρονη επώαση με το νουτλίνη παράγοντα p53 σταθεροποιητικό περαιτέρω αυξημένα

Cdkn1a

επίπεδα mRNA. Σε αμφότερες τις συνθήκες

CD44

έκφραση mRNA δεν μεταβλήθηκε σημαντικά, ενώ η

c-Myc

επίπεδα έκφρασης παρέμειναν σταθερά (Σχήμα 4C) .Οι αποτελέσματα επιβεβαιώνουν τα ευρήματα μας στα ανθρώπινα κύτταρα RKO και στην πρωτοβάθμια παχέος εντέρου καρκινώματα, και αποδεικνύουν ότι

CD44

γονιδιακή έκφραση δεν ρυθμίζεται από το p53, τόσο φυσιολογικά και μετασχηματισμένα επιθηλιακά κύτταρα του εντέρου.

(Α) κρύπτη-λάχνης οργανοειδή μετά από μία εβδομάδα καλλιέργειας. Τα βέλη δείχνουν κρύπτη-όπως διαμερίσματα (Β) αποτελέσματα qRT-PCR δείχνει τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των γονιδίων μετά από θεραπεία ακτινοβολίας για

Cdkn1a

,

CD44,

και

c-Myc.

Δεδομένων αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM διπλών πειραμάτων? (*,

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με t = 0). (C) qRT-PCR αποτελέσματα δείχνουν τα σχετικά επίπεδα γονιδιακής έκφρασης μετά τη θεραπεία μόνο με NCS ή NCS συν νουτλίνη για

Cdkn1a

,

CD44

και

c-Myc

(*,

P

& lt? 0,05, **,

P

& lt?. 0.01 σε σύγκριση με t = 0)

Η

Συζήτηση

Ο προσδιορισμός των p53 ως μεταγραφικός καταστολέας της έκφρασης CD44 σε καρκίνο του μαστού [16] μας ώθησε να διερευνηθεί η σχέση μεταξύ

p53

κατάστασης μεταλλάξεων και η έκφραση CD44 σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Έχουμε αποδείξει ότι, εκτός από τον καρκίνο του μαστού,

CD44

mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης δεν αυξήθηκε σε καρκινώματα του παχέος εντέρου με απώλεια της λειτουργικής ρ53, σε σύγκριση με τους όγκους χωρίς

ρ53

μεταλλάξεις (Εικόνα 1 C, 2Β ). Επιπλέον,

CD44

έκφραση σε φυσιολογικά και νεοπλαστικά εντερικού επιθηλίου δεν επηρεάστηκε με χημικά ή ακτινοβολία διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της ρ53, που δείχνει ότι η ρ53 δεν λειτουργεί σαν ένας μεταγραφικός καταστολέας του

CD44 συστήματα In επιθηλιακά κύτταρα του εντέρου.

Η παρατηρούμενη ιστού συγκεκριμένη διαφορά μεταξύ του μαστού και του παχέος εντέρου στη μεταγραφική ρύθμιση του

CD44

μπορεί να εξηγηθεί από την πολυπλοκότητα της λειτουργίας ρ53. Τουλάχιστον δύο χαρακτηριστικά της πρωτεΐνης ρ53 που απαιτείται για γονιδιακή ρυθμιστική λειτουργία του: p53 πρέπει να αναγνωρίζει και να δεσμεύει ένα ειδικό DNA αλληλουχίες στον υποκινητή του γονιδίου στόχου και p53 πρέπει προσλάβει διάφορες μεταγραφικές συν-ρυθμιστές (ανασκόπηση από Laptenko και Prives [14 ]). Η

CD44

προαγωγέα περιέχει μια μη κανονική αλληλουχία δέσμευσης ρ53 [16], ωστόσο, πολλαπλές αλληλεπιδράσεις με συν-ενεργοποιητές και συν-καταστολείς όπως επίσης και με τα συστατικά του γενικού μεταγραφικό μηχανισμό υπαγορεύουν την ικανότητά του να κατευθύνει προαγωγό ενεργοποίηση [14]. Για παράδειγμα, οι αλληλεπιδράσεις με ASPP1, BRCA1 ή PTEN, ή τη συντονισμένη δράση τόσο της p63 και p73, έχουν αναγνωριστεί ως καθοριστικοί παράγοντες ότι οι άμεσες συγκεκριμένες απαντήσεις [14], [31]. Οι διαφορές στην έκφραση και την δραστηριότητα αυτών των συν-ρυθμιστές μεταξύ του μαστού και εντερικό επιθήλιο θα μπορούσε συνεπώς να συμβάλλει σε αποκλίνουσα ρόλος για το ρ53 στον μεταγραφικό έλεγχο του

CD44

γονιδίου σε κύτταρα του μαστού και επιθήλιο του παχέος εντέρου και του καρκίνου. Επιπλέον, ρ53 μπορούν να υποβληθούν σε διάφορους τύπους μετα-μεταφραστική τροποποίηση, συμπεριλαμβανομένης της φωσφορυλίωσης, ακετυλίωση και ουβικιτινίωση [32], η οποία μπορεί να κατευθύνει την επιλογή προαγωγέα [33]. Ως εκ τούτου, η λειτουργία ρ53 εξαρτάται από ένα πολύπλοκο και σφιχτό ρύθμιση, και κυττάρου-ειδικές τροποποιήσεις ή αλληλεπιδράσεις μπορεί να εξηγήσει την αδυναμία της να καταστείλει CD44 στα εντερικά επιθηλιακά κύτταρα. διαπιστώνοντας ότι η έκφραση CD44 μας σε φυσιολογικό εντερικό επιθήλιο και το κόλον καρκινωμάτων είναι ανεξάρτητη της έκφρασης ρ53 και ρ53 κατάσταση μεταλλάξεων έχει σημασία για την κατανόηση της παθογένεσης της CRC και μπορεί να έχει σημαντικές θεραπευτικές συνέπειες. Η ανώμαλη έκφραση CD44 είναι πλεονεκτικό για την ανάπτυξη, την επιβίωση και τη διάδοση των καρκινικών κυττάρων [1]. Σε CRC αυτές οι βιολογικές λειτουργίες του CD44 εκτείνονται πέρα ​​από την ικανότητά της να ανταγωνίζονται τα προ-αποπτωτικών και κυτταροστατικά λειτουργίες της ρ53 [16], [34]. Αυτό μπορεί, τουλάχιστον εν μέρει, να εξηγήσει τον περιορισμένο ρόλο της p53 στη ρύθμιση της άμεσης φαινότυπο του νεοσύστατου εντερική αδενώματα [35]. Επιπλέον, διάφορες μελέτες έχουν αποδείξει ότι CD44 είναι ένας ισχυρός δείκτης με λειτουργική σημασία για τον καρκίνο του παχέος εντέρου βλαστικών κυττάρων [10], [11], [36] – [38]. Αυτά τα κύτταρα που πιστεύεται ότι είναι σχετικά ανθεκτικό στη θεραπεία και είναι υπεύθυνη για τον όγκο διάδοσης, η οποία κάνει CD44 ένας ελκυστικός στόχος για κατευθυνόμενη θεραπεία του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων, ανεξάρτητη από ρ53.