Αφηρημένο

Ιστορικό

Καρκίνος στομάχου (GC) σχετίζεται με υψηλά ποσοστά θνησιμότητας και δυσμενή πρόγνωση σε προχωρημένα στάδια. Επιπλέον, δεν υπάρχουν αποτελεσματικές μέθοδοι για τη διάγνωση καρκίνου του στομάχου σε πρώιμο στάδιο ή για την πρόβλεψη του αποτελέσματος για το σκοπό της επιλογής θεραπευτικές επιλογές ειδικά για τον ασθενή. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να διερευνηθεί νέες μεθόδους για τη διάγνωση GC.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Για να διευκολυνθεί η χρήση του σε ένα διαγνωστικό περιβάλλον, μια ομάδα 74 γονιδίων με διαγνωστικές και προγνωστικές πληροφορίες μεταφράστηκε σε μια προσαρμοσμένη μικροσυστοιχιών που περιέχει μια περιορισμένη σειρά 1.042 ανιχνευτές κατάλληλο για υψηλή επεξεργασία απόδοση. Στην παρούσα έκθεση, δείχνουμε για πρώτη φορά ότι η προσαρμοσμένη mini-συστοιχία μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένα αξιόπιστο διαγνωστικό εργαλείο σε γαστρικό καρκίνο. Με μια τιμή AUC του 0,565 (95% CI 0,305 έως 0,825), υποδεικνύοντας μια τέλεια δοκιμή, την ευαισθησία και την ειδικότητα της διάγνωσης από την καμπύλη ROC ήταν υπολογίζεται να είναι 70% και 80%, αντίστοιχα.

Συμπεράσματα /Σημασία

Τα στοιχεία καταδεικνύουν σαφώς την επαναληψιμότητα και την ευρωστία του μικρού custom-made μικροσυστοιχιών. Η σειρά είναι ένα εξαιρετικό εργαλείο για την ταξινόμηση και την πρόβλεψη της έκβασης της νόσου σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου

Παράθεση:. Yin Υ, Zhuo W, Zhao Υ, Τσεν S, Li J, Wang L, et al. (2013) Μετατρέποντας ένα Υπογραφή μικροσυστοιχιών σε διαγνωστικού ελέγχου: Μια δοκιμή της συνήθειας 74 Gene γεννήτριας για διευκρίνιση και πρόβλεψη την πρόγνωση του καρκίνου του στομάχου. PLoS ONE 8 (12): e81561. doi: 10.1371 /journal.pone.0081561

Επιμέλεια: Courtney Γ Montgomery, Οκλαχόμα Ίδρυμα Ιατρικής Έρευνας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 25 Ιούν, 2013? Αποδεκτές: 14 Οκτ 2013? Δημοσιεύθηκε: 3 Δεκ 2013

Copyright: © 2013 Yin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81302070, 81272678, 81071961) (https://www.nsfc.gov.cn), Εθνικό πρόγραμμα βασικής έρευνας της Κίνας (973 Program) (2012CB945004) (www.973.gov .cn). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος στομάχου (GC) έχει υψηλή συχνότητα και είναι η δεύτερη κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο [1,2]. Η πρόγνωση της GC εξαρτάται από το στάδιο της νόσου κατά τη διάγνωση και τη θεραπευτική μέθοδο [3] ιδιαίτερα. Το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών σε ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του στομάχου είναι περίπου 20%, ενώ στις αρχές του σταδίου καρκίνο του στομάχου είναι πάνω από το 60% [4-6]. Ωστόσο, δεν υπήρξαν αποτελεσματικές και εφικτές μεθόδους για την ανίχνευση του καρκίνου πρώιμο στάδιο και για την πρόβλεψη της πιθανής πρόγνωση για την παροχή κατάλληλη θεραπεία για κάθε ασθενή. Στην Ιαπωνία, αν και θα μπορούσαν πιο αποτελεσματικά να ανιχνεύσει και να θεραπεύσει νωρίς γαστρικού καρκίνου (EGC) μέσω του εκτεταμένου ελέγχου, μόνο ενδοσκόπηση θα μπορούσαν να χρησιμοποιούνται συνήθως για την ανίχνευση EGC. Αυτός είναι ο λόγος έγκαιρη διάγνωση και την ικανότητα να διακρίνει κακοήθεις και προκακοήθεις αλλοιώσεις είναι σημαντικά [7]. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να διερευνηθεί νέες μεθόδους για GC διαγνωστικούς ή προγνωστικούς προβλέψεις για κλινικές εφαρμογές.

Ορισμένες γονίδιο αλλαγές θα μπορούσαν να συνδέονται με την καρκινογένεση και την εξέλιξη της GC [8-11]. Για παράδειγμα, τα προηγούμενα δεδομένα μελετήσαμε πρότειναν ότι τα γονίδια του κολλαγόνου μπορεί να είναι ένας πιθανός βιολογικός δείκτης για τη διάκριση κακοηθών από προκακοήθων αλλοιώσεων στο στομάχι [12]. Επειδή η εξέλιξη της νόσου από τις προκαρκινικές συνθήκες με GC είναι μια δυναμική διαδικασία [13-15], η ανίχνευση του γονιδίου μεταβολών θα μπορούσε να επιτρέψει την αναγνώριση των γονιδίων που σχετίζεται με τη νόσο νωρίτερα από παθολογική εξέταση. Επιπλέον, η γονιδιακή έκφραση παρέχει πρόσθετες πληροφορίες σχετικά με την κατάσταση του ασθενούς [16]. Ως εκ τούτου, η ανάλυση μικροσυστοιχιών μπορεί να είναι μια σημαντική και χρήσιμη μέθοδος για τη διάγνωση και τη διαστρωμάτωση του κινδύνου για τον καρκίνο του στομάχου.

Επιπλέον, χρησιμοποιώντας προσαρμοσμένες μίνι-σειρές για την κλινική πρακτική μπορεί όχι μόνο να είναι φθηνότερο, αλλά μπορεί επίσης να απαιτούν λιγότερες εισροές RNA δείγματος για την επισήμανση και την υβριδοποίηση, και ο χρόνος επεξεργασίας δεδομένων θα μπορούσε να είναι ουσιαστικά μειωμένη σε σύγκριση με την κανονική μικροσυστοιχίες [17]. Ένα έθιμο μικροσυστοιχιών 70 γονίδια για την πρόγνωση του καρκίνου του μαστού, το οποίο έχει εγκριθεί από την Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA), επαληθεύει τη σκοπιμότητα του εθίμου των μικροσυστοιχιών στην κλινική χρήση [18,19]. Αν και έχουν υπάρξει πολλές μελέτες για ορισμένες ομάδες γονιδίων για τη διάγνωση GC, η τεχνολογία μικροσυστοιχιών είναι προς το παρόν δεν έχουν χρησιμοποιηθεί ως διαγνωστικό εργαλείο σε γαστρικό καρκίνο.

Σε αυτή την εργασία, περιγράφουμε για πρώτη φορά η ανάπτυξη μιας προσαρμοσμένες διαγνωστικές GC mini-συστοιχίας και αποδεικνύουν ότι η συνήθεια mini-συστοιχία θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως αξιόπιστα διαγνωστικά και πρόβλεψη εργαλείο σε γαστρικό καρκίνο.

Αποτελέσματα

Ένα έθιμο μίνι-σειρά από μια ομάδα πιθανών γονιδίων που σχετίζονται με την καρκινογένεση GC και την πρόοδο

Σε μια προηγούμενη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ένα ολιγονουκλεοτίδιο μικροσυστοιχιών των 38.500 γονιδίων στο εξετάζει συστηματικά διαφορική γονιδιακή έκφραση μεταξύ 33 δείγματα από φυσιολογικά, προκαρκινικές και κακοήθεις αλλοιώσεις στον στόμαχο [12]. Ένα κλάσμα των 696 γονιδίων που διαφοροποιούνται-έκφραση βρέθηκε στην επίσημη μελέτη σχεδιάστηκαν στο έθιμο μίνι-σειρά, ως μέρος μιας ερευνητικής βάσης. Επιπλέον, για ορισμένες ομάδες στις οποίες τα γονίδια βρέθηκαν ότι είχαν πιθανώς σχετίζεται στενά με GC, το έθιμο μίνι-συστοιχίας περιλαμβάνονται επίσης 44 γονίδια που σχετίζονται κολλαγόνου [20-22], 54 γονίδια για υποδοχείς ορμονών του φύλου και τις οδούς, βρέθηκε γονίδια διαφοροποιημένα-έκφραση σε άλλες μελέτες, και τα γονίδια 915 κανονικοποίηση (αναλυτικά στοιχεία στον πίνακα S1). Σε αυτή τη μελέτη, το προφίλ έκφρασης 1042-γονιδιακή ιδρύθηκε ως ένα ισχυρό διάγνωση και προγνωστικός παράγοντας της έκβασης της νόσου σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου.

Σύγκριση της Array Performance 1042-Gene με εκείνο της αρχικής 25k μικροσυστοιχιών

Για να προσδιοριστεί εάν η προσαρμοσμένη δοκιμασία μίνι-σειρά εκτελεί παρόμοια με τα αρχικά 25 k μικροσυστοιχίες [12], δύο δείγματα ( LYXT και LYXS) από ίδιους ασθενείς που χρησιμοποιήθηκε στην αρχική σειρά για την ανάπτυξη του 1042, διαγνωστικές ταξινομητή ανακτήθηκαν. Οι εκφράσεις του 696 γονιδίων που δημιουργείται χρησιμοποιώντας το διαγνωστικό mini-συστοιχία ήταν πολύ παρόμοια (Pearson συσχέτιση του 0,957, ρ & lt? 0,01) με τα αρχικά δημοσιευμένα δεδομένα (Εικόνα 1)

Τα δεδομένα έδειξαν την αναλογία έκφραση του κακοήθους. /προκαρκινικών. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων.

Η

Αναγνώριση των γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά σε κακοήθεις και προκαρκινικές γαστρικό ιστούς

Όλα τα δεδομένα της υβριδισμοί φόντο διορθωμένη, κανονικοποιημένη, και αναλύονται για τον εντοπισμό τα γονίδια διαφοροποιημένα-έκφραση σε 40 δείγματα που αντιπροσωπεύουν κακοήθεις αλλοιώσεις και προκαρκινικές αλλοιώσεις (n = 20 σε κάθε ομάδα). Ένα σύνολο 371 γονιδίων βρέθηκε να διαχωρίσετε κακοήθεις αλλοιώσεις από προκαρκινικές αλλοιώσεις χρήση ιεραρχικής ομαδοποίησης και SVM αφήσει-one-out επιβεβαίωση, ενώ ένα προκαρκινικές δείγμα (MGFS) ταξινομήθηκαν σε κακοήθη ομάδα και πέντε κακοήθη δείγματα (XSHT, GJFT, CXCT , XYT και QLTT) ταξινομήθηκαν στην προκαρκινικές ομάδα. Η MGFS και το δείγμα συλλέχθηκε από τον περιβάλλοντα ιστό του καρκινώματος σφραγίδα δακτύλιο. Η παθολογική έκθεση έδειξε ότι το δείγμα XSHT ήταν μια μέτρια διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα, το δείγμα GJFT ήταν μια μέτρια έως καλά διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα, ενώ CXCT, XYT και τα δείγματα QLTT ήταν καλά διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα. Αυτά τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια περιλαμβάνονται 199 ρυθμισμένα προς τα πάνω γονίδια και 172 ρυθμισμένα προς τα κάτω γονιδίων σε κακοήθεις αλλοιώσεις σε σύγκριση με προκαρκινικές αλλοιώσεις (Σχήμα 2).

Κάθε στήλη αντιπροσωπεύει δείγμα και κάθε σειρά ένα γονίδιο. Ο χαρακτήρας του «Τ» αναφέρεται σε όγκο και ο χαρακτήρας «S» αναφέρεται σε προκαρκινικές ιστού σε ονόματα δείγμα. Οι εκφράσεις των γονιδίων μεταξύ των δύο ομάδων έχουν σημαντικές διαφορές, φορές καταγραφής αλλαγής

2 & gt? = 1 ή & lt? = -1, Η P & lt? 0,01

Η

Η διάκριση την πρόγνωση του καρκίνου του στομάχου

Μια χωρίς επίβλεψη, ιεραρχικό αλγόριθμο μας επέτρεψε να συγκεντρωθούν τα 20 GC κακοήθεις αλλοιώσεις βάσει των ομοιοτήτων τους μετράται κατά τη διάρκεια σημαντικών γονιδίων των 371 διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων μεταξύ κακοήθεις και προκαρκινικές αλλοιώσεις. Αξίζει να σημειωθεί ότι, στο αριστερό ομάδα, 4 από 10 σποραδικές ασθενείς ήταν σε πρώιμο στάδιο του GC και οι άλλοι παρουσιάζονται με μεγάλες διαφορές βλάβες, ενώ στη δεξιά ομάδα, 2 από 10 σποραδικές ασθενών ήταν από την ομάδα που ανέπτυξε απομακρυσμένες μεταστάσεις εντός 5 ετών ή με υψηλό στάδιο και κακώς διαφοροποιημένα βλάβες. Έτσι, χρησιμοποιώντας ανεξέλεγκτους ομαδοποίηση, μπορούμε να διακρίνουμε μεταξύ «καλή πρόγνωση» και «κακή πρόγνωση» όγκους σε κάποιο βαθμό (Εικόνα 3). Επιπλέον, το είδος και το στάδιο της GC των ασθενών που σχετίζονται με τις υπο-ομάδες των φτωχών ή καλή πρόγνωση (Πίνακας 1, λεπτομερή στοιχεία στον πίνακα S2).

Κάθε στήλη αντιπροσωπεύει έναν όγκο και κάθε σειρά, μία γονίδιο. Το μήκος και η υποδιαίρεση των κλάδων εμφανίσει την σχετικότητα του GC (κάτω) και την έκφραση των γονιδίων (δεξιά). Η κίτρινη γραμμή σηματοδοτεί την υποδιαίρεση σε δύο κυρίαρχες ομάδες. Οι εκφράσεις των γονιδίων μεταξύ των δύο ομάδων έχουν σημαντικές διαφορές, φορές καταγραφής αλλαγής

2 & gt? = 1 ή & lt? = -1, Η P & lt?. 0.01

Η Ομάδα 1 (καλή πρόγνωση)

Ομάδα 2 (κακή πρόγνωση)

Age62.8 ± 7.1161.3 ± 7.02Gender (Άνδρας /Γυναίκα) 7/38 /2Stage (I /II /III /IV) 2/1/7/01/0/5 /τύπος 4Pathological (μέτρια έως καλά διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα /κακώς διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα /καρκίνωμα σφραγιστικό δαχτυλίδι /βλεννώδες αδενοκαρκίνωμα) 7/2 /1/03/4/1 /2Metastasis με 5 years13Table 1. Το στάδιο των ασθενών με καρκίνο του στομάχου σε δύο ομάδες.

CSV Λήψη CSV

Προσαρμοσμένη σειρά με ελάχιστο αριθμό γονιδίων για τη διάγνωση GC και πρόβλεψη

Ανεξέλεγκτη δισδιάστατη ανάλυση σύμπλεγμα των γονιδίων ομαδοποίησης και GC ομαδοποίηση έγινε ανεξάρτητα χρησιμοποιώντας ένα agglomerative ιεραρχικό αλγόριθμο ομαδοποίησης με 371 γονίδια που θα μπορούσε να προσδιορίσει κακοήθη GC και προκαρκινικές αλλοιώσεις. Ο συντελεστής συσχέτισης της έκφρασης για κάθε γονίδιο με αποτέλεσμα ασθένεια υπολογίστηκε, και 252 γονίδια βρέθηκαν να σχετίζονται σημαντικά με την έκβαση της ασθένειας (συντελεστής συσχέτισης & lt? -0,3 Ή & gt? 0,3) (αναλυτικά στοιχεία στον πίνακα S1).

Αυτά τα 252 γονίδια rank-διέταξε, βάσει του μεγέθους του συντελεστή συσχέτισης. Ο αριθμός των γονιδίων στο «προγνωστική ταξινομητή» βελτιστοποιήθηκε με διαδοχική προσθήκη υποσύνολα 5 γονίδια από την κορυφή αυτού του rank-διέταξε λίστα και αξιολόγηση εξουσία της για ορθή κατάταξη με τη μέθοδο της «αφήστε-one-out» για cross-επικύρωσης. Η κατάταξη έγινε με βάση τη συσχέτιση των επιπέδων έκφρασης των υπόλοιπων δειγμάτων από τις καλές και φτωχών ασθενών, αντιστοίχως. Η ακρίβεια βελτιώνεται έως ότου επιτεύχθηκε ο βέλτιστος αριθμός των γονιδίων δεικτών. Ως εκ τούτου, 74 γονίδια προσδιορίστηκαν να είναι ο ελάχιστος αριθμός των γονιδίων που θα μπορούσαν να χαρακτηρισθούν ως δύο υπο-ομάδες διαφορετική πρόγνωση (Σχήμα 4). Με μια τιμή AUC του 0,565 (95% CI 0,305 έως 0,825) που υποδεικνύει μια τέλεια δοκιμή, η ευαισθησία και η ειδικότητα της διάγνωσης από την καμπύλη ROC ήταν υπολογίζεται να είναι 70% και 80%, αντίστοιχα (Εικόνα 5).

Κάθε στήλη αντιπροσωπεύει έναν όγκο και κάθε γραμμή ένα γονίδιο.

Η

Με βάση την ταξινόμηση της λειτουργίας των γονιδίων οντολογίας (GO), η λειτουργική σχολιασμός για τα γονίδια που εμπλέκονται στην κυτταρικού κύκλου, την εισβολή και τη μετάσταση, αγγειογένεση, και μεταγωγής σήματος που απορυθμίζεται σημαντικά στην κακή πρόγνωση υπογραφής (σχολιασμός των γονιδίων που περιλαμβάνονται στον πίνακα S1). Τα γονίδια αυτά περιλαμβάνουν διάφορες ομάδες για τις οποίες ο σχολιασμός λειτουργία προσφέρει μια εικόνα για την υποκείμενη βιολογικός μηχανισμός που οδηγεί σε βασικές λειτουργίες που εμπλέκονται στην ογκογένεση και την εξέλιξη. Τα γονίδια που εμπλέκονται στον κυτταρικό κύκλο, εισβολή και μετάσταση, η αγγειογένεση, και την μεταγωγή σήματος ήταν σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενο μεταξύ δύο υπογραφές (για παράδειγμα, GKN1, INHBA, SPP1 και THBS4). Εν τω μεταξύ, χωρίς επίβλεψη ανάλυση συστάδων διακρίνει μεταξύ των διαφόρων προγνωστικών όγκους. Με την αξιολόγηση όλων των 74 προγνωστικών γονιδίων αναφοράς, περισσότερα γονίδια που ανήκουν σε αυτές τις λειτουργικές κατηγορίες γίνει φανερό (για παράδειγμα, GKN1, GKN2, GIF, PSCA και LipF).

Οι ασθενείς και στις δύο ομάδες κατατάσσονται από τα 74 γονίδια και το σύνολο ανιχνευτές είναι σχεδόν η ίδια, εκτός από το LCM δείγμα, το οποίο ταξινομείται στην καλή ομάδα πρόγνωση σε ολόκληρη ανιχνευτές μικροσυστοιχιών και στην φτωχή πρόγνωση ομάδα στην κατάταξη 74-γονιδίου. Το δείγμα LCM συλλέχθηκε από την κακοήθη ιστό ενός ασθενούς που πάσχει από βλεννώδες αδενοκαρκίνωμα σε στάδιο IV με βραχύτερη διάρκεια ζωής από ό, τι τα άλλα ασθενείς στις τυπικές ομάδες. Ως εκ τούτου, η 74-γονίδιο μικροσυστοιχιών ταξινόμησης θα μπορούσε να είναι πιο αξιόπιστη.

Επαλήθευση της 74 γονιδίων έθιμο σειρά και συσχέτιση των δεδομένων μικροσυστοιχιών με την προγνωστική προφίλ

Για τους ασθενείς 11 GC που περιλαμβάνονται στο προηγούμενη μελέτη [12], υπολογίσαμε το συντελεστή συσχέτισης του επιπέδου της έκφρασης των γονιδίων 74 με το προσδιορισμένο μέσο προφίλ αυτών των γονιδίων σε όγκους από ασθενείς με καλή πρόγνωση (CI). Ένας ασθενής με συντελεστή συσχέτισης πάνω από -0.007 (το κατώφλι οδήγησε σε ποσοστό 13 τοις εκατό των εσφαλμένων αρνητικών αποτελεσμάτων) στη συνέχεια εκχωρηθεί στην ομάδα με την υπογραφή καλή πρόγνωση, και όλοι οι άλλοι ασθενείς εκχωρήθηκαν στην ομάδα με τους φτωχούς υπογραφή -prognosis (Σχήμα 6). Επιπλέον, η καμπύλη επιβίωσης των δύο ομάδων διαφέρει σημαντικά (ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 7). Έτσι, ο ταξινομητής έδειξε συγκρίσιμη απόδοση σχετικά με την επικύρωση της 11ης ανεξάρτητη σποραδικών όγκων και επιβεβαίωσε την προφητική δύναμη και την ευρωστία της ταξινόμησης πρόγνωση του εθίμου σειρά 74-γονιδίου.

Η κίτρινη γραμμή σηματοδοτεί την υποδιαίρεση σε δύο κυρίαρχα συστάδες από δισδιάστατη ανάλυση διασποράς. Η λευκή γραμμή σηματοδοτεί την υποδιαίρεση σε δύο κυρίαρχα συστάδες με βελτιστοποιημένη ευαισθησία.

Η

Ο x-άξονα αναφέρονται οι μήνες κατά τους οποίους οι ασθενείς ακόμα ζωντανός. Ο άξονας y αναφέρεται ότι το ποσοστό των εν ζωή ασθενών (συμπεριλαμβανομένων εκείνων με μετάσταση ή υποτροπή).

Η

επαναληψιμότητα των εξατομικευμένων μίνι-σειρά

Για να επικυρώσετε τα δεδομένα της γονιδιακής έκφρασης από τα δεδομένα μικροσυστοιχίας, επιλέξαμε ένα γονίδιο διαφοροποιημένη-έκφραση, INHBA, και εξετάστηκαν έκφραση της με ποσοτική ανάλυση RT-PCR. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι το γονίδιο άλλαξε σημαντικά την έκφραση σε κακοήθεις ιστούς σε σύγκριση με προκακοήθων ιστούς σε 11 δείγματα ζεύγος αντιστοίχιση, σύμφωνα με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από την ανάλυση μικροσυστοιχιών (Σχήμα 8).

Οι κατακόρυφες αριθμούς με log

2 μετασχηματισμού είναι ο λόγος ζεύγος αντιστοίχιση των κακοήθων αλλοιώσεων σε προκαρκινικές αλλοιώσεις. A. Οι στήλες αντιπροσωπεύουν τις αναλογίες που προκύπτουν από ποσοτική πείραμα QRT- PCR. B. Η σύγκριση των δεικτών μεταξύ των μικροσυστοιχιών και ποσοτική QRT-PCR αναλύσεις.

Η

Μια υποομάδα της αναπαραγωγής που σχετίζονται με τα γονίδια του καρκίνου του στομάχου

Στο 74-γονιδίου λίστα προσαρμοσμένων μικροσυστοιχιών, εμείς βρήκε μια ομάδα γονιδίων με την ταξινόμηση GO αναπαραγωγής (Πίνακας 2), στο οποίο 5 γονίδια για τους υποδοχείς και τα μονοπάτια των ορμονών του φύλου (ESRRG, DMRT3, DMRTA1, AMHR2 και FOXL2), δεν θα μπορούσε αποτελεσματικά μόνο ξεχωριστό κακοήθη από προκαρκινικές δείγματα, αλλά και την ταξινόμηση φτωχή και καλή πρόγνωση με την ιεραρχική ομαδοποίηση και SVM (Σχήμα 9). Επιπλέον, δύο γονίδια ορμονών του φύλου είχαν σημαντικές differentiated- έκφραση καλή πρόγνωση για την κακή πρόγνωση της GC (ESRRG 8.83, AR 0,37, p & lt? 0,01).

Σύμβολο

Διπλώστε αλλαγή

Σύμβολο

Διπλώστε change

AMHR20.442DMRT34.8637INHBA11.2072DMRTA10.366MMP142.009SFRP413.0683NOTCH12.2898FOXL23.291PGF2.9307SPP19.4141Table . 2. Γονίδια με GO κατάταξη της αναπαραγωγής σε 74 γονίδια ομάδα μικροσυστοιχιών

CSV Λήψη CSV

Οι εκφράσεις των γονιδίων μεταξύ των δύο ομάδων έχουν σημαντικές διαφορές, διπλώστε την αλλαγή του ημερολογίου

2 & gt? = 1 ή & lt? = – 1, Ρ & lt?. 0.01

η

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε για πρώτη φορά ότι το έθιμο των μικροσυστοιχιών θα μπορούσε να είναι μια αποτελεσματική μέθοδος για τη διάγνωση και την πρόβλεψη της πρόγνωσης σε GC κλινικά. Η έλλειψη κλινικής βιοδείκτες για την πρόωρη γαστρικού καρκίνου χωρίς ειδικά πρώιμα συμπτώματα οδηγεί σε καθυστερημένη διάγνωση και συνεισφέρει στην υψηλή θνησιμότητα γαστρικού καρκίνου [23]. Σε ορισμένες περιπτώσεις, οι αλλαγές συμβαίνουν μόνο στο επίπεδο του γονιδίου, χωρίς παθολογική αλλαγή. Αλλαγές στην έκφραση γονιδίων θα μπορούσε να βοηθήσει στην έγκαιρη διάγνωση, την πρόγνωση και την καθοδήγηση της θεραπείας για την μετεγχειρητική ακτινοβολία και χημειοθεραπεία. Η ανάπτυξη των τεχνολογιών των μικροσυστοιχιών επιτρέπει τη μελέτη της δυνατότητας των παθολογικών αντιστροφή και την αξιολόγηση και την καθοδήγηση της θεραπείας. Επιπλέον, η δημιουργία στοχευμένων εξοπλισμός μικροσυστοιχία μπορεί να κάνει την τεχνική πιο χρήσιμα. Λόγω της κακής ιδιαιτερότητα και η ανεπάρκεια των ώριμων κοινή διάγνωση, το έθιμο των μικροσυστοιχιών δεν έχει εφαρμοστεί στην κλινική χρήση για καρκίνο του στομάχου ακόμα, αν και υπάρχουν μελέτες σε γονιδιακή διάγνωση.

ανάλυση μικροσυστοιχιών είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνολογία για τη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης σε παγκόσμια κλίμακα. Αρκετές μοριακές δοκιμασίες που χρησιμοποιούνται σήμερα στην κλινική εκτίμηση των καρκίνων που προέρχονται από προφίλ γονιδιακής έκφρασης που βασίζεται σε μικροδιάταξη. Ένα παράδειγμα μιας δοκιμασίας που βασίζεται σε μικροδιάταξη είναι MammaPrint, μια προσαρμοσμένη μικροσυστοιχία 70 γονιδίων που σχετίζονται με τον κίνδυνο της πρώιμης ανάπτυξης των μακρινών μεταστάσεων σε νεαρούς ασθενείς με λεμφαδένες καρκίνου του μαστού με. MammaPrint έχει επικυρωθεί από το FDA. Η ικανότητα να χρησιμοποιούν αυτό το προφίλ σε μια υψηλής απόδοσης διαγνωστική ρύθμιση θα μπορούσε να είναι ένα μεγάλο πλεονέκτημα στην πρόγνωση και θεραπεία του καρκίνου του μαστού [17-19]. Ωστόσο, η τεχνολογία σήμερα δεν χρησιμοποιείται ως ρουτίνα διαγνωστικό εργαλείο σε γαστρικό καρκίνο, και δεν έχει υπάρξει μελέτη των προσαρμοσμένων μικροσυστοιχίες χρησιμοποιούνται στη διάγνωση ή πρόβλεψη της πρόγνωσης. Στην παρούσα έκθεση, δείχνουμε για πρώτη φορά ότι η προσαρμοσμένη mini-συστοιχία μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένα αξιόπιστο διαγνωστικό εργαλείο σε γαστρικό καρκίνο.

Σε αυτή την εργασία, περιγράφουμε την ανάπτυξη ενός ειδικού διαγνωστικού γαστρικό καρκίνο μίνι-σειρά και να περιγράψει αξιόπιστη χρήση του σε ένα διαγνωστικό περιβάλλον. Πολλές κλινικές μελέτες έχουν συσχετίσει μεταβολές στην έκφραση των μεμονωμένων γονιδίων με γαστρικό καρκίνο αποτέλεσμα, συχνά με αντιφατικά αποτελέσματα. Παραδείγματα περιλαμβάνουν CXCL1, HOXA10, και μεθυλίωση του PCDH10 [24-26]. Ωστόσο, αυτά τα γονίδια δεν περιελήφθησαν σε μίνι-σειρά μας. Είναι πιθανό ότι οι άλλες μελέτες δοθεί περισσότερη προσοχή στις λειτουργίες αυτών των γονιδίων, ενώ εμείς επικεντρώθηκε στις εκφράσεις του mRNA. Το έθιμο συστοιχία 74-γονίδιο μπορεί να είναι ένα δυνατό εργαλείο πρόβλεψης για καρκίνο του στομάχου. Τα δεδομένα καταδεικνύουν σαφώς την επαναληψιμότητα και την ευρωστία του μικρού custom-made μικροσυστοιχιών. Η χρήση μιας προσαρμοσμένης μικροσυστοιχιών θα μπορούσε να παράσχει αρκετά πλεονεκτήματα, όπως ακριβείς πληροφορίες για τον κίνδυνο υποτροπής σε σύγκριση με τα συμβατικά κλινικά κριτήρια, και έτσι θα βελτιώσει την καθοδήγηση για την απαίτηση της επικουρικής θεραπείας.

Εν τω μεταξύ, λόγω της ένα 2-φορές μεγαλύτερη συχνότητα στους άνδρες από ό, τι στις γυναίκες με GC [1], αρκετά μεγαλύτερες επιδημιολογικές έρευνες δείχνουν ότι το φύλο ήταν ένας σημαντικός ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για τη συνολική επιβίωση σε ασθενείς με GC [27,28 ] και αρσενικό επικράτηση του γαστρικού καρκίνου συσχετίζεται με καθυστέρηση 10-15 χρόνων στην έναρξη της εντερικής τύπου γαστρικού καρκίνου στις γυναίκες σε σύγκριση με τους άνδρες [29]. Σε αυτό το προφίλ του 74 γονιδίου έθιμο μίνι-συστοιχία, 5 γονίδια εκφράζονται διαφορικά μεταξύ κακοήθεις αλλοιώσεις και προκαρκινικές αλλοιώσεις του GC (ESRRG, DMRT3, DMRTA1, AMHR2 και FOXL2). Αυτή η ομάδα του φύλου που σχετίζονται γονίδια με πιθανούς ρόλους σε GC προτάθηκε για πρώτη φορά, και υπάρχουν λίγες μελέτες σχετικά με αυτή την ομάδα γονιδίων που σχετίζονται με καρκίνους. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η τελευταία μελέτη που αναφέρθηκαν από Matson και οι συνεργάτες του έδειξαν μια πιθανή συσχέτιση και οδό DMRT1, FOXL2 και της ορμόνης του φύλου [30]. DMRT1, DMRT3, και DMRTA1 περιλαμβάνονται όλα σε ένα σύμπλεγμα της οικογένειας γονιδίων που έχουν ένα δάκτυλο ψευδαργύρου σαν δέσμευσης DNA μοτίβο (τομέας DM) από κοινού, η οποία είναι επίσης ένας ρυθμιστής κλειδί της ανδρικής ανάπτυξης στις μύγες και νηματώδεις. Επιπλέον, τα κύρια γονίδια σε αυτό το μονοπάτι είναι όλα περιλαμβάνονται στα δεδομένα μας. Τα δεδομένα μπορεί να μας δώσει μια ερευνητική κατεύθυνση για τα γονίδια του φύλου που σχετίζονται με GC και αποκαλύπτουν μια πιθανή οδό και μηχανισμό καρκινογένεση GC.

Ως εκ τούτου, η διάταξη θα μπορούσε να είναι ένα εξαιρετικό εργαλείο για την ταξινόμηση και την πρόβλεψη της έκβασης της νόσου σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου. Ωστόσο, υπάρχουν ορισμένοι περιορισμοί στο προφίλ μας. Τα δείγματα θα πρέπει να επεκταθεί για να επαληθεύσει την κλινική εγκυρότητα και επαναληψιμότητα.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και δείγματα

Σαράντα χειρουργικά γαστρική δείγματα καρκίνου και των παρακείμενων δείγματα μη-όγκου ήταν λαμβάνεται από τον Sir Run Run Shaw Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου Zhejiang και χρησιμοποιήθηκαν κατά το μήνα Ιούνιο 2007 έως τον Μάιο του 2011. Εμείς συλλέγονται κακοήθεις και προκαρκινικές ιστών από διαφορετικές περιοχές της εκτομή του στομάχου από κάθε ασθενή ο οποίος υποβλήθηκε σε χειρουργική επέμβαση. Σαράντα ομαδοποιούνται δείγματα ιστών από είκοσι ασθενείς με πρωτογενή καρκίνο του στομάχου που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση (είκοσι κακοήθεις αλλοιώσεις, είκοσι προκαρκινικές αλλοιώσεις) επιλέχθηκαν για ανάλυση ολιγονουκλεοτιδίου μικροσυστοιχιών (Πίνακας 1, λεπτομερή δεδομένα στον πίνακα S2). Όλα τα συλλέχθηκαν δείγματα μονιμοποιήθηκαν, ενσωματωμένο, χρωματίστηκαν με Η & amp? Ε, και διαγνώστηκαν με Lauren και WHO ταξινόμηση ανεξάρτητα από τρεις επαγγελματικές παθολόγους. Δώδεκα ζευγαρωμένα δείγματα με κακοήθεις και προκακοήθεις αλλοιώσεις από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση επιλέχθηκαν για ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ (ποσοτική RT-PCR). Τα αποτελέσματα από την ποσοτική RT-PCR συγκρίθηκαν με τις παθολογικές εγγραφές από το όργανο που συμβάλλουν. Τελική παθολογική ανάλυση προσδιορίστηκε με συναίνεση και αναθεωρούνται, εάν είναι απαραίτητο. «Κακοήθης» αναφέρεται σε διάφορους τύπους των γαστρικών καρκίνων. «Προκακοήθεις» υποδεικνύει ατροφική γαστρίτιδα, εντερική μεταπλασία ή /και δυσπλασία. Τα δείγματα καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι την περαιτέρω επεξεργασία. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε πριν από τη συλλογή του δείγματος, και το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Κλινική Επιτροπή Ερευνητικής Δεοντολογίας του Sir Run Run Shaw νοσοκομείο.

Προσαρμοσμένη Mini-Array

Η αρχική προσαρμοσμένες 8 * 15k mini-συστοιχίας περιείχε 1042 καρκινογένεση και την πρόγνωση σχετιζόμενα γονίδια όμοια με τους ιχνηλάτες για την αρχική παράταξη [12]. Η μίνι-σειρά περιλαμβάνονται 696 διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων μεταξύ κακοήθεις αλλοιώσεις και προκαρκινικές αλλοιώσεις των ασθενών GC που βρήκαμε στο προηγούμενο 38, 500 γονίδιο μάρκες, 44 γονίδια που σχετίζονται με κολλαγόνο, 54 γονίδια για τους υποδοχείς ορμονών του φύλου και μονοπάτια, και τα γονίδια διαφοροποιημένη έκφραση που βρέθηκαν στο άλλες μελέτες που είχαν εντοπισθεί στο τριπλούν. Κάθε σειρά περιλαμβάνει επίσης 1042 ανιχνευτές για υβριδισμό και τον έλεγχο της ποιότητας εκτύπωσης, καθώς και 915 γονίδια κανονικοποίηση (αναλυτικά στοιχεία στον πίνακα S1). Οκτώ πανομοιότυπα μίνι-σειρές είναι παρούσες σε μία μόνο 1 «× 3» διαφάνεια, επιτρέποντας για οκτώ επιμέρους υβριδισμοί να πραγματοποιούνται ταυτόχρονα (προσαρμοσμένη στη Σαγκάη βιοτσίπ & ΣΙΑ ΕΠΕ, Agilent Technologies).

Oligonucleotide μικροσυστοιχιών

Το συνολικό RNA εκχυλίστηκε και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, USA) και RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany) μέσω προτύπων διαδικασιών που συνιστώνται από τους κατασκευαστές. Τα επίπεδα και ποιότητες cRNA μετρήθηκαν με ένα Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, USA), και η ποιότητα του RNA ελέγχθηκε με το πρότυπο 2100 RIN & gt? = 7,0 και 28S /18S & gt? = 0,7. Το cRNA ήταν κατακερματισμένη με το δείγμα Εκκαθάριση Ενότητα Gene Chip (Affymetrix, USA) και επισημαίνονται με ένα μόνο χρώμα χρησιμοποιώντας το Agilent μεγέθυνση μέθοδο σημειογραφία. Ο υβριδισμός, χρώση, οι διαδικασίες πλύσης και σάρωσης διεξήχθησαν όπως περιγράφεται στο Gene Expression Chip Ανάλυση τεχνικό εγχειρίδιο (Affymetrix, USA).

Ανάλυση των στοιχείων ολιγονουκλεοτιδικών μικροσυστοιχιών

Τα αποτελέσματα της μικροσυστοιχίας είχαν σαρωθεί από ένα σαρωτή Agilent. Τα δεδομένα ομαλοποιούνται και συζήτησε μετά την απόκτηση εικόνας και ποσοτικοποίηση για τον εντοπισμό των γονιδίων με σημαντική διαφορά εκφράσεις χρησιμοποιώντας το λογισμικό Feature Extraction. Μια ανοικτή πηγή ερμηνεύεται γλώσσα υπολογιστών (R) χρησιμοποιήθηκε για στατιστικούς υπολογισμούς και γραφικά [12]. Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα των προσαρμοσμένων μικροσυστοιχιών έχει αναρτηθεί στο ArrayExpress τον αριθμό ένταξη Α-Μπειραμ-2338.

Σχεδιασμός μελέτης

Χρησιμοποιήσαμε μια μέθοδο που βασίζεται στα προφίλ γονιδιακής έκφρασης για την ταξινόμηση των γαστρικών καρκίνων σε προγνωστική ή διαγνωστικές κατηγορίες. Η μέθοδος περιλάμβανε τα ακόλουθα βήματα: (1) το σχεδιασμό μιας προσαρμοσμένης μίνι-σειρά με μια ομάδα γονιδίων που πιθανώς σχετίζονται με καρκινογένεση GC και την πρόοδο που βασίζονται σε προηγούμενες μελέτες, (2) την επιλογή των γονιδίων διαφοροποιημένων έκφρασης μεταξύ των κακοήθεις και προκαρκινικές αλλοιώσεις (πάσο αλλαγής & gt? 2 φορές και η p & lt? 0,05) (3), χωρίς επίβλεψη δισδιάστατη ανάλυση σύμπλεγμα των γονιδίων ομαδοποίησης και ομαδοποίηση GC εκτελούνται ανεξάρτητα χρησιμοποιώντας ένα agglomerative ιεραρχική αλγορίθμου ομαδοποίησης (4), επιλογή διακρίσεις υποψήφια γονίδια από γονίδια που επιλέξατε στο βήμα 2, σύμφωνα να συσχετισμός τους με την κατηγορία (καλή ή κακή πρόγνωση) (5), ο προσδιορισμός του βέλτιστου συνόλου γονιδίων ρεπόρτερ χρησιμοποιώντας ένα σταυρό διαδικασία επικύρωσης άδειας-one-out (6), προγνωστική ή διαγνωστική πρόβλεψη με βάση την έκφραση γονιδίου της βέλτιστης σύνολο των γονιδίων ρεπόρτερ [18,19], (7) GO σχολιασμός των γονιδίων ρεπόρτερ, και (8) ανάλυση της συσχέτισης των δεδομένων μικροσυστοιχιών με την προγνωστική προφίλ

η ποσοτική ανάλυση RT-PCR

το συνολικό RNA που εκχυλίζεται από δείγματα αντίστροφα μεταγράφηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας την προνομιακή σενάριο TM RT κιτ αντιδραστηρίου (Takara, Japan) στους 37 ° C για 15 λεπτά και στους 85 ° C για 15 sec. Αντιδράσεις PCR χρησιμοποιώντας κιτ SYBR® premis ΕΧ Taq ΤΜ διεξήχθησαν στους 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα που ακολουθείται από 40 κύκλους στους 95 ° C για 15 sec, 60 ° C για 10 δευτερόλεπτα, και 72 ° C για 40 sec με το 7500 Σε πραγματικό χρόνος Σύστημα PCR (Applied Biosystems, USA). Το γονίδιο housekeeping β-ακτίνης χρησίμευσε ως εσωτερικός μάρτυρας. Η ακολουθία προώθησης αλφαβητάρι της INHBA είναι GTGATGGCAAGGTCAACATCT, και το αντίστροφο ένα είναι GCGGTAGTGGTTGATGACTGT.

Η στατιστική ανάλυση

Χρησιμοποιήσαμε αναλογικών κινδύνων ανάλυση παλινδρόμησης για να ρυθμίσετε τη σχέση μεταξύ του συντελεστή συσχέτισης (CI) και μεταστάσεις για άλλες μεταβλητές. Οι p-τιμές που σχετίζονται με τις αναλογίες πιθανοτήτων υπολογίζεται χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

Οι πληροφορίες των γονιδίων σε βήματα των μεθόδων για το σχεδιασμό του μίνι-σειρά και τα τελικά 74 γονίδια μίνι-σειρά.

doi: 10.1371 /journal.pone.0081561.s001

(XLS)

Πίνακας S2.

Οι λεπτομέρειες των πληροφοριών των βλαβών για μικροσυστοιχιών.

doi: 10.1371 /journal.pone.0081561.s002

(DOC)