Αφηρημένο

Ιστορικό

θλίψη μηχανικές καταπονήσεις που παράγονται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης σε μια μήτρα περιορισμού περιορίζει το μέγεθος των σφαιριδίων του όγκου, αλλά λίγα είναι γνωστά για τη δυναμική της συσσώρευσης του στρες, πώς το στρες επηρεάζει φαινότυπος των καρκινικών κυττάρων ή των μοριακών οδών που εμπλέκονται.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Έχουμε συνεργαστεί -embedded μόνο τα καρκινικά κύτταρα με φθορίζοντα μικρο-σφαιρίδια σε πηκτώματα αγαρόζης και, χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία, καταγράφεται η κατανομή 3D μικρο-σφαιρίδια που περιβάλλει αυξάνεται σφαιροειδή. Η αλλαγή στην πυκνότητα μικρο-σφαιρίδιο στη συνέχεια μετατρέπονται σε στέλεχος στην γέλη, από την οποία υπολογίστηκε η χωρική κατανομή των θλιπτική τάση γύρω από τα σφαιροειδή. Βρήκαμε μια ισχυρή συσχέτιση μεταξύ του περι-σφαιροειδές στερεό κατανομή των τάσεων και σφαιροειδές σχήμα, λόγω της καταστολής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και επαγωγή αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου σε περιοχές υψηλής μηχανικής καταπόνησης. Με τη συμπίεση σφαιροειδή που αποτελείται από καρκινικά κύτταρα που υπερεκφράζουν αντι-αποπτωτικών γονιδίων, που αποδεικνύουν ότι η μηχανική καταπόνηση που προκαλείται απόπτωση συμβαίνει μέσω της μιτοχονδριακής οδού.

Συμπεράσματα /Σημασία

Τα αποτελέσματά μας παρέχουν λεπτομερείς, ποσοτική εικόνα ο ρόλος των μικρο-περιβαλλοντικών μηχανική καταπόνηση στη δυναμική ανάπτυξη σφαιροειδές όγκου, και να προτείνει πώς οι όγκοι μεγαλώνουν σε κλειστούς χώρους όπου τα επίπεδα των στερεών στρες γίνεται υψηλή. Μια σημαντική συνέπεια είναι ότι η απόπτωση μέσω της μιτοχονδριακής οδού, που προκαλείται από την τάση συμπίεσης, μπορεί να εμπλέκονται σε λήθαργο όγκου, στην οποία η ανάπτυξη του όγκου κρατείται υπό έλεγχο από την ισορροπία της απόπτωσης και πολλαπλασιασμού

Παράθεση:. Cheng G, Τσε J, Jain RK, Munn LL (2009) Micro-Περιβαλλοντική μηχανική καταπόνηση Έλεγχοι όγκων σφαιροειδές μέγεθος και μορφολογία με την καταστολή της διάδοσης και της επαγωγής απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 4 (2): e4632. doi: 10.1371 /journal.pone.0004632

Επιμέλεια: Μιχαήλ Β Blagosklonny, Ordway Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 Δεκεμβρίου του 2008? Δεκτές: 2, Ιαν 2009? Δημοσιεύθηκε: 27 Φεβρουαρίου 2009

Copyright: © 2009 Cheng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ΝΙΗ επιχορηγήσεις P01CA80124, R01CA085140 και R01CA126642. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η ανάπτυξη των συμπαγών όγκων είναι έντονα επηρεασμένη από το μικροπεριβάλλον της. Εκτός καλά μελετηθεί μικροπεριβάλλοντος παραμέτρους, όπως η υποξία [1], [2] και την αγγειογένεση [3] – [5], μηχανικές καταπονήσεις παίζουν επίσης σημαντικό ρόλο. Για μια συμπαγής όγκος να αναπτυχθεί σε ένα περιορισμένο χώρο που ορίζεται από τον περιβάλλοντα ιστό, θα πρέπει να ξεπεράσει τις προκύπτουσες δυνάμεις συμπιέσεως. Έχει δειχθεί ότι οι όγκοι και τα συναφή στρώμα τους είναι μηχανικά πιο σκληρή από το αντίστοιχο κανονικό ιστό ξενιστή [6], και ότι η μηχανική συμπίεση σε ένα τέτοιο περιβάλλον μπορεί να καταρρεύσει το αίμα και τα λεμφικά αγγεία [7]. Όμως, η κατανόηση του πώς αυτή η συμπίεση επηρεάζει άμεσα την ανάπτυξη του όγκου είναι περιορισμένο. Διάφορες υποθέσεις έχουν προταθεί όσον αφορά τη συμμετοχή των μηχανικών τάσεων στην ανάπτυξη του όγκου [8] – [11], και Helmlinger et al. [12] πραγματοποίησε την πρώτη ποσοτικοποίηση του σφαιροειδούς αναστολής της ανάπτυξης σε πηκτές αγαρόζης. Βρήκαν ότι σφαιροειδή ανθρώπινου καρκινώματος του παχέος εντέρου μπορεί να αυξηθεί σε ένα μέγιστο μέγεθος 400 μm (διάμετρος) σε 0.5% (w /v) αγαρόζη, αλλά μόνο 50 μm σε 1.0% αγαρόζη (η οποία είναι λιγότερο συμβατό). Αυτό σχετίστηκε με μια αύξηση στην συσκευασία των κυττάρων και μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Έδειξαν επίσης ότι μία τέτοια αναστολή της αύξησης του όγκου μπορεί να αντιστραφεί με την απελευθέρωση των σφαιροειδών από το πήκτωμα. Ωστόσο, πολλά βασικά ερωτήματα παραμένουν αναπάντητα, όπως: (1) Ποια είναι η φύση του πεδίου των τάσεων γύρω αυξανόμενη σφαιροειδή όγκου; (2) Μπορεί τοπική διανομής στερεών στρες επηρεάζει το σχήμα του σφαιροειδή όγκου; (3) Έχει σταθερή διανομή στρες επηρεάζει επίσης το φαινότυπο των κυττάρων σε διάφορες περιοχές της ατομικής σφαιροειδή; (4) Ποια είναι η ενδοκυτταρική οδός που ρυθμίζει το στρες που προκαλείται από την αλλαγή του στερεού φαινοτυπική (ες); Αυτές οι ερωτήσεις είναι κρίσιμης σημασίας για μια βασική κατανόηση των στερεών δυναμικής ανάπτυξης του όγκου.

Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι η συσσώρευση στερεών στρες σε πηκτές αγαρόζης γύρω αυξανόμενη σφαιροειδή όγκου (μη μεταστατικό μαστικό καρκίνωμα ποντικού κύτταρα 67NR εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά ) μπορεί να μετρηθεί χρησιμοποιώντας συν-ενσωματωμένο φθορισμού μικρο-σφαιριδίων (διάμετρος = 1 μm) ως δείκτες για το στέλεχος στη γέλη: πηκτώματα αγαρόζης είναι ανθεκτικά στην αποδόμηση από καρκινικό κύτταρο πρωτεϊνάσες [13], και έτσι επιτρέπουν μελέτες των στερεών συσσώρευση στρες ανεξάρτητη από κελί εισβολή. Έχουμε αποδείξει ότι το σχήμα του πεδίου στερεού στρες υπαγορεύει το σχήμα των σφαιροειδών όγκου και ότι το αποτέλεσμα αυτό οφείλεται στην καταστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και επαγωγή της κυτταρικής απόπτωσης σε περιοχές υψηλής στερεού στρες. Τέλος, στη μελέτη του μοριακού μηχανισμού για τη στερεά στρες που προκαλείται από την απόπτωση.

Αποτελέσματα

Growing σφαιροειδή όγκου συμπιέζει προοδευτικά η περιβάλλουσα μήτρα

Εικ. 1

Μια

δείχνει την ανάπτυξη ενός σφαιροειδούς τυπικού όγκου (πράσινο) συν-ενσωματωμένο με μικρο-σφαιρίδια (κόκκινο) σε 0.5% πηκτή αγαρόζης για 30 ημέρες (βλ πειραματική διάταξη στο συμπληρωματικό σχήμα. S1

Α

). Ανάλυση μέσω 3D συνεστιακή μικροσκοπία αποκάλυψε ότι η γέλη αγαρόζης προοδευτικά συμπιέζεται από την αυξανόμενη σφαιροειδές (Εικ. 1

B

). Κατά πρώιμα χρονικά σημεία, υπήρχε πολύ διακύμανση στην πυκνότητα μικρο-σφαιριδίων (

ρ

σφαιρίδια), κυρίως επειδή η σφαιροειδές ήταν ακόμα αρκετά μικρό και, ως αποτέλεσμα, ο όγκος των δειγμάτων για τη μέτρηση

ρ

χάντρες ήταν περιορισμένη. Σημαντικές αυξήσεις στο

ρ

χάντρες άρχισαν να εμφανίζονται κατά την ημέρα 17, όταν το σφαιροειδές διαμέτρου (

D

sphd) ήταν μόνο -150 μm. Μέχρι την ημέρα 30,

D

sphd είχε φτάσει -250 μm και

ρ

χάντρες στο πρώτο 10 μm πάχους του κελύφους των πηκτή αγαρόζης (

ρ

χάντρες, 1) ήταν ~1.6 φορές εκείνης της unstressed γελών, που αντιστοιχεί σε ένα στέλεχος 37,5% (

ε

gel, 1). Σημαντική στέλεχος περιορίζεται στην άμεση γειτονία του σφαιροειδούς:

ρ

χάντρες μειώθηκε στο επίπεδο του ελέγχου της εντός περίπου 50 μm από το σφαιροειδές επιφάνεια (Σχήμα 1

Β

, ημέρα 30. καμπύλη). Η σχέση μεταξύ σφαιροειδές ανάπτυξης και την προκύπτουσα στέλεχος στην πηκτή αγαρόζης είναι γραμμική στο εύρος

D

sphd μετράται στη μελέτη μας (Εικ. 1

C

). Από δημοσιεύθηκε μηχανικές ιδιότητες του πηκτώματος αγαρόζης 0,5% [14], εκτιμήσαμε ότι το σφαιροειδές στο Σχ. 1

A

επιβάλλονται ~ 28 mmHg στερεών στρες στον αμέσως γειτονικό μήτρα κατά την ημέρα 30, παρόμοια με την τιμή εκτιμάται θεωρητικά από Helmlinger et al. [12]. Για σφαιροειδή αναπτύχθηκαν σε 1.0% γέλη, ο όγκος των δειγμάτων για την ποσοτικοποίηση της πυκνότητας μικρο-σφαιριδίων ήταν πολύ μικρή, επειδή οι περισσότεροι σφαιροειδή δεν θα μπορούσε να αυξηθεί μεγαλύτερο από 50 μm σε διάμετρο.

(

A

) Ένας αυξανόμενος σφαιροειδές (πράσινο) και η γύρω μικρο-σφαιρίδια της (κόκκινο). Κλίμακα bar = 100 μm. (

Β

) Ποσοτικοποίηση της σχετικής πυκνότητας μικρο-σφαιριδίων (

ρ

χάντρα) σε 10 μm πάχους κελύφη πηκτή αγαρόζης γύρω από την αυξανόμενη σφαιροειδές φαίνεται στο

A

ως συνάρτηση της απόστασης του κελύφους από σφαιροειδές κέντρο (

dist

). (

C

) Συσχέτιση μεταξύ σφαιροειδές διαμέτρου (

D

sphd

) και το στέλεχος στο πρώτο 10-μm παχύ κέλυφος γέλης αγαρόζης (

ε

gel, 1) γύρω σφαιροειδή.

R

είναι ο συντελεστής γραμμικής παλινδρόμησης? κλίση της γραμμής παλινδρόμησης είναι σημαντικά μεγαλύτερη από το μηδέν (

σ

& lt? 0.0001).

Η

σχήμα του όγκου σφαιροειδές συσχετίζεται έντονα με το σχήμα των τοπικών στερεών πεδίου των τάσεων

στην περιοχή μερικών σφαιροειδή, η γέλη απέτυχε εξαιτίας της τάσης που παράγεται από την ανάπτυξη σφαιροειδές. Αυτό οδήγησε σε μικρο-κλίμακα επίπεδες ρωγμές στη γέλη (Εικ. 2

Μια

, αιχμές βελών). Αν και τα σφαιροειδή που επιλέγονται για ανάλυση στο Σχ. 1 δεν κατοικούν εντός των εν λόγω ρωγμές και ήταν όλα σχεδόν σφαιρικό σχήμα, σφαιροειδή που υπήρχε μέσα σε ρωγμές που εγκρίθηκε πεπλατυσμένο σχήμα (δηλαδή, ισοπέδωσε σφαίρες, Σχήμα 2

Μια

?., Επίσης, να δείτε ταινία S1 για 3D rendering). Ποσοτικοποίηση της πυκνότητας μικρο-σφαιριδίων γύρω τυπικά σφαιρικά και πεπλατυσμένο σφαιροειδή αποκάλυψε μια ισχυρή συσχέτιση μεταξύ σφαιροειδές σχήμα και το σχήμα του τοπικού μηχανικού πεδίο στρες (Εικ. 2

B, 2C

). Αυτό επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από τα αποτελέσματα από παρόμοια ανάλυση για περίπου 25 σφαιροειδή διάφορα σχήματα (Σχ. 2

D

). Helmlinger et al. παρατηρήθηκε ένα παρόμοιο φαινόμενο με αυξανόμενη σφαιροειδή σε τριχοειδή γυάλινα σωληνάρια 1-mm:. τα σφαιροειδή επιμηκύνονται κατά μήκος του άξονα του σωλήνα, πιθανώς σε απάντηση στην τοπική πεδίο στρες [12]

(

A

) γέλης αγαρόζης μπορεί να αποτύχει υπό τάση από την αυξανόμενη σφαιροειδή όγκου (πράσινο). Κόκκινο βέλη δείχνουν την άκρη του επίπεδου ρωγμές στην πηκτή αγαρόζης (BF: φωτεινού πεδίου της εικόνας που λαμβάνονται σε λειτουργία Nomarski). μπαρ κλίμακας = 50 μm. (

Β

) σφαιροειδή (πράσινο) διαφόρων σχημάτων και γύρω χωράφια άγχος τους ορατή με μικρο-σφαιρίδια (κόκκινο). Κλίμακα bar = 150 μm. (

C

) Σχέση μεταξύ των τοπικών στέλεχος σε πηκτή αγαρόζης (

ε

gel, 1, τοπικό) και τοπική παραμόρφωση σφαιροειδές (

λ

sphd, τοπική) για τα σφαιροειδή (πράσινο, ένθετο) φαίνεται στο

A

.

dist

SEG είναι η απόσταση των τμημάτων σφαιροειδούς από κέντρο σφαιροειδές κανονικοποιημένο σε όλο το μήκος του κύριου άξονα. (

D

) Συσχέτιση μεταξύ της ασυμμετρίας στην σφαιροειδές σχήμα και στο αντίστοιχο στέλεχος στον περιβάλλοντα πηκτή αγαρόζης, δείχνοντας ότι σφαιροειδή είναι περισσότερο παραμορφώνονται κατά μήκος της κατεύθυνσης του υψηλότερη πίεση. Κάθε σημείο δεδομένων είναι για ένα σφαιροειδές.

R

είναι ο συντελεστής γραμμικής παλινδρόμησης? κλίση της γραμμής παλινδρόμησης είναι σημαντικά μεγαλύτερη από το μηδέν (

σ

& lt? 0,0001). Μέθοδοι για την ανάλυση της εικόνας σε

C

και

D

περιγράφονται στη συμπληρωματική μεθόδους S1, συμπληρωματικό σχήμα. S2, Movie S2 και S3 ταινία.

Η

Υψηλή στερεά στρες καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και επάγει αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε σφαιροειδή όγκου

Για να διερευνήσει πιθανές φαινοτυπικές αλλαγές που στερεό το άγχος προκαλεί σε καρκινικά κύτταρα, αξιολογήσαμε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την απόπτωση στα σφαιροειδή. Η κυτταρική διαίρεση κοντά περιοχές υψηλότερης στρες (δηλαδή, προς την κατεύθυνση του μικρού άξονα του πεπλατυσμένο σφαιροειδή) ήταν μειωμένη σε σύγκριση με τις περιοχές του κάτω στρες (Εικ. 3). Για να ελέγξει πώς τάση συμπίεσης επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων, εξετάσαμε την απόπτωση και νέκρωση σε ζώντα σφαιροειδή καλλιεργήθηκαν σε 0,5% (Εικ. 4) ή πήγματα 1,0% αγαρόζης (Συμπληρωματική εικ. S3). Στην γέλη 0,5%, απόπτωση και νέκρωση εμφανίστηκε όταν τα σφαιροειδή ήταν μόνο ~ 50 μm σε διάμετρο (Εικ. 4

A

, ημέρα 12) και συνέχισε να αυξάνεται, όλο και εκτεταμένη από την ημέρα 28. Στη συνέχεια, το αποπτωτικό περιοχές αντικαταστάθηκαν σταδιακά από νέκρωση μέχρι, μέχρι την ημέρα 45, νέκρωση είχε φτάσει σχεδόν στην επιφάνεια του σφαιροειδούς. Σε 1,0% πηκτή αγαρόζης, το σφαιροειδές δεν θα μπορούσε να αυξηθεί μεγαλύτερα από ~ 30 μm σε διάμετρο, και την απόπτωση και νέκρωση ανιχνεύθηκαν ακόμη και σε αυτές τις μικρές σφαιροειδή (Συμπληρωματικές Εικ. S3). Αυτές οι παρατηρήσεις σε ζώντα σφαιροειδή επιβεβαιώθηκαν με ανοσοϊστοχημική χρώση των σταθερών δειγμάτων (σχ. 4

B

). Επιπλέον, υπήρχε μια ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της τοπικής κλάσμα κυτταρικού θανάτου σε σφαιροειδή και την τοπική στέλεχος στην πηκτή αγαρόζης (Εικ. 5).

Αιχμές βελών υποδεικνύουν τις περιοχές με περισσότερο τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. μπαρ κλίμακας = 50 μm.

Η

(

A

) Η ανάπτυξη της απόπτωσης (πράσινο) και δευτεροβάθμιας νέκρωση (κόκκινο) σε μια αναπτυσσόμενη σφαιροειδές ενσωματωμένο στο 0,5% πηκτή αγαρόζης. Κλίμακα bar = 100 μm. (

Β

) Ανοσοϊστοχημική χρώση (TUNEL και αιματοξυλίνη) επιβεβαιώνει τα αποτελέσματα στο

A

. Εικόνα στην κάτω πάνελ δείχνει λεπτομέρεια της περιοχής εντός της διακεκομμένης γραμμής στην εικόνα στο άνω φύλλο. μπαρ κλίμακας = 50 μm.

Η

(

Α

) Ζωντανή σφαιροειδή (πράσινο) διαφόρων σχημάτων, εσωτερική κυτταρικό θάνατο τους (κόκκινο), και γύρω χωράφια άγχος τους ορατά με μικρο- χάντρες (γκρι). Η πράσινη γραμμή στη δεξιά στήλη δείχνει την άκρη του σφαιροειδή. Κλίμακα bar = 100 μm. (

Β

) Σχέση μεταξύ των τοπικών στέλεχος σε πηκτή αγαρόζης (

ε

gel, 1, τοπικό) και τις τοπικές νεκρωτικές κλάσμα σε σφαιροειδή (

δ

sphd, τοπικό) για τις δύο σφαιροειδή φαίνεται στο

A

. (

C

) Συσχέτιση μεταξύ της ασυμμετρίας στην σφαιροειδές νεκρωτικό τμήμα και το αντίστοιχο στέλεχος στη γύρω πηκτή αγαρόζης, που δείχνει ότι υπάρχει περισσότερο κυτταρικό θάνατο κατά μήκος της κατεύθυνσης της τριτοβάθμιας τάση συμπίεσης. Κάθε σημείο δεδομένων είναι για ένα σφαιροειδές.

R

είναι ο συντελεστής γραμμικής παλινδρόμησης? κλίση της γραμμής παλινδρόμησης είναι σημαντικά μεγαλύτερη από το μηδέν (

σ

& lt? 0,0001). Μέθοδοι για την ανάλυση της εικόνας σε

Β

και

C

περιγράφονται στη συμπληρωματική μεθόδους, συμπληρωματικό σχήμα. S2, S3 ταινία και ταινία S4.

Η

Για να βεβαιωθείτε ότι οι περιορισμοί των θρεπτικών ουσιών, αυξητικούς παράγοντες ή οξυγόνου δεν ήταν υπεύθυνη για το αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο στο Σχ. 4, αξιολογήσαμε την απόπτωση σε σφαιροειδή αυξηθεί σε παρόμοια μεγέθη σε ελεύθερη ανάρτησης (κρέμεται σταγονίδια). Οι ελεύθερες καλλιέργειες αναστολή δεν είχε καμία εξωτερική μήτρα περιοριστική και μικρή απόπτωση (Εικ. 6

Μια

, Κατάσταση 1). Για να ελέγξετε αν κυττάρου-αγαρόζης αλληλεπιδράσεις συνέβαλαν σε κυτταρικό θάνατο, θα μεταφερθούν δωρεάν σφαιροειδή αναστολή σε πηκτές αγαρόζης 0,5%, όπου επετράπη να εγκλιματιστούν για 3 ημέρες. Σε αντίθεση με τα σφαιρίδια που προέρχονται από μεμονωμένα κύτταρα σε πηκτή αγαρόζης (Εικ. 6

Μια

, Κατάσταση 3), οι μεταφέρθηκε σφαιροειδή δεν έχουν χρόνο να συσσωρεύονται σημαντικά επίπεδα των στερεών άγχους και είχαν πολύ λιγότερο κυτταρικό θάνατο ( Εικ. 6

Μια

, Κατάσταση 2). Έτσι, είναι απίθανο ότι η τοξικότητα γέλη ή περιορισμούς θρεπτικών ουσιών, αυξητικών παραγόντων ή οξυγόνο ήταν υπεύθυνα για την απόπτωση παρατηρείται στις τόνισε σφαιροειδή.

(

A

) Κασπάση-3 δραστικότητα (πράσινο) σε σφαιροειδή όγκου (κόκκινο) καλλιεργήθηκαν σε ελεύθερο εναιώρημα (Κατάσταση 1), μεταφέρονται σε 0.5% πηκτή αγαρόζης για 3 ημέρες μετά την επίτευξη οροπέδιο φάσης σε ελεύθερη εναιώρημα (Condition 2), ή από καλλιέργεια από μεμονωμένα κύτταρα σε 0.5% πηκτή αγαρόζης (Κατάσταση 3 ). Κλίμακα bar = 100 μm. (

Β

) Ποσοτικοποίηση του κλάσματος των αποπτωτικών κυττάρων σε σφαιροειδή όγκου καλλιεργήθηκαν κάτω από τις 3 συνθήκες στο

Μια

.

Η

Εξωτερικά-εφαρμόζεται μιμείται τη συμπίεση της ανάπτυξης που προκαλείται στρες

Αν θλίψη στρες προκαλεί αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε σφαιροειδή όγκου, δεν θα πρέπει να έχει σημασία αν είναι ανάπτυξη που προκαλείται ή εξωτερικά-εφαρμόζεται. Επομένως, για να προσδιοριστεί ποσοτικά η επίδραση των στερεών στρες στην κυτταρική απόπτωση υπό ελεγχόμενες συνθήκες, πρέπει πρώτα συμπιέζεται μονοστιβάδες των καρκινικών κυττάρων για 17 ώρες με πιέσεις που κυμαίνονται από 0 mmHg έως 60 mmHg (βλ πειραματική διάταξη σε συμπληρωματικό Σχ. S1

B

) και παρατηρείται αυξημένη απόπτωση με αυξημένο επίπεδο στρες (Εικ. 7

Α

). Εμείς στη συνέχεια μεταφέρθηκε σφαιροειδή περίπου 300 μm σε διάμετρο από το ελεύθερο αιώρημα σε 1% πηκτή αγαρόζης και τους καλλιεργήθηκαν υπό τρεις προϋποθέσεις: κανονικό μέσο χωρίς εξωτερική συμπίεση, μέσο λιμοκτονίας (χωρίς γλυκόζη, χωρίς ορό και 1% οξυγόνο) χωρίς συμπίεση ή κανονικό μέσο με εξωτερικές συμπίεσης (βλέπε πειραματική διάταξη στο συμπληρωματικό σχήμα. S1

C

). Caspase-3 δραστικότητα αξιολογήθηκε σε 1 ώρα, 3 ώρες, 5 ώρες και 7 ώρες (Εικόνα 7

Β, 7C

?. Οι σχετικά βραχείς χρόνους συμπίεσης επιλέχθηκαν για να ελαχιστοποιηθεί η πιθανή επιπλοκή του θρεπτικού /αυξητικού παράγοντα /οξυγόνο περιορισμούς στην καλλιέργεια 3D). Συμπίεση αυξηθεί δραματικά δραστικότητα κασπάσης-3, η οποία σταθεροποιήθηκε μετά από 5 ώρες. Τα σφαιροειδή που στερήθηκαν τροφής αλλά un-τόνισε είχε πολύ μικρότερη από εκείνες της απόπτωσης στα συμπιεσμένα δείγματα, υποδεικνύοντας και πάλι ότι οι περιορισμοί της γλυκόζης, του ορού και το οξυγόνο από μόνες τους δεν αντιπροσωπεύουν τα επίπεδα του κυτταρικού θανάτου καταδεικνύεται στο Σχ. 4.

(

Α

) αυξήσεις δράση της κασπάσης-3 σε μονοστιβάδες των καρκινικών κυττάρων ως απάντηση σε υψηλότερες εξωτερικές στρες. Τα κύτταρα συμπιέζονται επί 17 ώρες. (

Β

) κασπάσης-3 σε σφαιροειδή κατασκευασμένο από δύο διαφορετικές κυτταρικές γραμμές καρκίνου σε απόκριση σε διάφορες εξωτερικές στρες (0 mmHg ή 15 mmHg) και τις συνθήκες θρεπτικών ουσιών (Κανονικό: κανονικό μέσο? Ο λιμός: όχι γλυκόζη, δεν ορό και 1% οξυγόνο). (

C

) Τυπικό δράση της κασπάσης-3 (πράσινο) σε σφαιροειδή (κόκκινο) καλλιεργήθηκαν σε 3 από τις συνθήκες υπό τις

Β

. Κλίμακα bar = 100 um. (

D

) Bcl-2 υπερ-έκφραση αναστέλλει επαγόμενη από στρες απόπτωση, αλλά crmA μεταγωγή δεν το κάνει. Τα σφαιροειδή συμπιέσθηκαν με 15 mmHg για 7 ώρες, ενώ τροφοδοτείται με κανονικό μέσο.

Η

Το μιτοχονδριακό μονοπάτι ρυθμίζει μηχανικό στρες που προκαλείται από την κυτταρική απόπτωση σε σφαιροειδή όγκου

Τέλος, διερευνήσαμε την οποία του τα δύο κύρια αποπτωτικά μονοπάτια [15] ρυθμίζει το στερεό στρες που προκαλείται από την κυτταρική απόπτωση. Εμείς μεταδιηγερμένα καρκινικά κύτταρα να υπερεκφράζουν crmA που αναστέλλουν κασπάσες έναρξης συμπεριλαμβανομένης της κασπάσης-1 και κασπάσης-8 στην οδό θανάτου υποδοχέα [16], ή Bcl-2, ένα γνωστό αναστολέα των πολλαπλών κασπάσες στο μιτοχονδριακό μονοπάτι [17]. Ελεύθερη σφαιροειδή εναιώρημα του άγριου τύπου ή μεταδιηγερμένα κύτταρα αναπτύσσονται προς ~ 300 μm σε διάμετρο μεταφέρθηκαν σε 1% γέλη αγαρόζης και συμπιέστηκε όπως περιγράφεται προηγουμένως. Σύκο. 7

D

δείχνει ότι Bcl-2 υπερέκφραση μειώνει σημαντικά συμπίεση που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο στα σφαιροειδή ενώ crmA υπερ-έκφραση έχει μικρή επίδραση. Ομοίως, η υπερέκφραση του crmA σε ένα εξαιρετικά μεταστατικό κύτταρο καρκινώματος του μαστού σε ποντικούς γραμμή ΕΜΤ6, η οποία έχει ένα υψηλό επίπεδο έκφρασης ενδογενούς Bcl-2 [18], δεν προστατεύει περαιτέρω από δραστηριότητα συμπίεση που προκαλείται κασπάσης-3 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), υποδεικνύοντας ότι το μιτοχονδριακό μονοπάτι ρυθμίζει στερεά στρες που προκαλείται από την απόπτωση.

Συζήτηση

η παρούσα μελέτη εξετάζονται διάφορα υπόλοιπα ερωτήματα σχετικά με την επίδραση της θλιπτικής τάσης στη δυναμική ανάπτυξη των συμπαγών όγκων. Αν και εμπειρικά μαθηματικά μοντέλα, όπως το γνωστό καμπύλη Gompertzian ανάπτυξη [19] και το πιο πρόσφατο «καθολική νόμο της ανάπτυξης» [20] – [22] μπορεί να προβλέψει τη διεύρυνση των πολλών συμπαγών όγκων με καλή ακρίβεια, δεν θεωρούν ρητά κυττάρων δυναμική στο εσωτερικό των όγκων. Ειδικότερα, η αμετάβλητη εμφάνιση μιας φάση σταθεροποίησης μετά την όγκοι έχουν φτάσει σε ένα ορισμένο μέγεθος δεν έχει εξηγηθεί ικανοποιητικά. Δεδομένου ότι οι περισσότεροι συμπαγείς όγκους μεγαλύτερο από 1 mm σε διάμετρο επάγουν αγγειογένεση [3], θρεπτική ή μείωση του οξυγόνου δεν πρέπει να περιορίζει την ανάπτυξη του όγκου. Η μελέτη μας δείχνει ότι η ανάπτυξη που προκαλείται από στερεά στρες μπορεί να επηρεάσει κυτταρικό φαινότυπο, και προτείνει ότι μπορεί να υπάρχει μια «δυναμική ισορροπία» του πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης που διατηρεί το μέγεθος του όγκου κατά τη φάση οροπεδίου, όπως προτείνεται από Holmgren et al [23].

Ο θάνατος αποπτωτικών κυττάρων που προκαλείται από τέτοια πίεση έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Η απόπτωση κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης γενικά πιστεύεται ότι προκαλείται από αυξητικούς παράγοντες και άλλες περιβαλλοντικές νύξεις [24], [25], και ο ρόλος των μηχανικών στρες σε αυτή τη διαδικασία έχει μόλις πρόσφατα θεωρηθεί [26], [27]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ανομοιογένειες στις μηχανικές ιδιότητες του ιστού περιορισμού μπορεί να καθοδηγήσει μορφολογικές αλλαγές στην ανάπτυξη του όγκου, ανεξάρτητα της κυτταρικής μετανάστευσης, με την επαγωγή της απόπτωσης σε περιοχές υψηλής τάσης συμπίεσης και επιτρέποντας τον πολλαπλασιασμό σε περιοχές με χαμηλή πίεση. Επιπλέον, η απόπτωση συμπίεση που προκαλείται συμβαίνει μέσω της μιτοχονδριακής οδού, ενός ρυθμιστικού μηχανισμού ελέγχου που τα καρκινικά κύτταρα με αυξημένη δραστικότητα Bcl-2 μπορεί να ξεφύγει για να παράγουν πιο κακοήθεις όγκους.

Υλικά και Μέθοδοι

τηλέφωνα κύτταρα καρκινώματος μαστού καλλιέργεια

μη μεταστατικό ποντικού 67NR ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) και χρησιμοποιήθηκαν για τα περισσότερα από τα πειράματα σε αυτή τη μελέτη. Μεταστατικά κύτταρα ποντικού καρκινώματος του μαστού EMT6 ήταν γενναιόδωρα παρέχει ο Δρ Τζέιμς Freyer (Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM). 67NR κύτταρα διατηρήθηκαν σε υψηλής γλυκόζης (4,5 mg /ml) του Dulbecco Τροποποιημένο Μέσο Eagle (DMEM, Sigma, St. Louis, ΜΟ) συμπληρωμένο με 1% μη απαραίτητα αμινοξέα (Invitrogen, Carlsbad, CA) και 10% βόειο εμβρυϊκό ορού (FBS). κύτταρα ΕΜΤ6 διατηρήθηκαν σε α-ελάχιστο βασικό μέσο (Mediatech, Manassas, VA) συμπληρωμένο με 10% FBS. Για πειράματα που απαιτούν χωρίς γλυκόζη, χωρίς ορό και υποξικό περιβάλλον (συμβολίζεται το «μέσο λιμοκτονίας»), σφαιροειδή καλλιεργήθηκαν σε ελεύθερο γλυκόζης ϋΜΕΜ (Invitrogen) δεν έχει συμπληρωθεί με FBS και 5% CO

2-1% O

2-Ν

2 βιοϊατρικής αέρα (Airgas Ανατολή, Salem, ΝΗ).

Αντι-αποπτωτική μεταγωγή με Bcl-2 και crmA

Ένα εκατομμύριο καρκινικά κύτταρα σπάρθηκαν σε 10 cm διαμέτρου δίσκου Petri και επιμολύνονται μέσω προσθήκης Lipofectamine 2000 (Invitrogen) και το πλασμίδιο DNA που περιέχει το πλήρους μήκους μυϊκό Bcl-2 (ATCC) ή κυτοκίνη τροποποιητή απόκρισης Α (crmA, γενναιόδωρη προσφορά από τον Dr. Brian Seed στη Μασαχουσέτη Γενικό Νοσοκομείο, Boston, ΜΑ) cDNA και η πουρομυκίνη επιλέξιμο δείκτη. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν και προστέθηκε μέσο επιλογής που περιείχε 20,0 μg /ml πουρομυκίνη. Μετά από 7-10 ημέρες καλλιέργειας σε αυτό το μέσο, ​​μόνο μερικές αποικίες παρέμειναν? αυτοί ομαδοποιήθηκαν μαζί και πολλαπλασιάζονται σε παρουσία επιλογής επιπέδου πουρομυκίνης. Η έκφραση του Bcl-2 και crmA στα επιμολυσμένα κύτταρα προσδιορίστηκε με ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (Bcl-2) ή PCR (crmA) με κατάλληλους εκκινητές. Μόλις καθιερώθηκε μια σταθερή επιμολυσμένη κυτταρική γραμμή, τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε παρουσία επιλογής επιπέδου πουρομυκίνης.

PCR δοκιμασίες

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (ΑΒΙ Prism 7300, Applied Biosystems, Foster City, CA) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί το επίπεδο του mRNA του Bcl-2 γονίδιο μορφομετατρέπονται σε καρκινικά κύτταρα. Οι συνθήκες θερμικού κύκλου αποτελούνταν από 35 κύκλους ενίσχυσης PCR (μετουσίωση: 95 ° C 30 δευτερόλεπτα, ανόπτηση /επέκταση: 68 ° C, 1 min). Το επίπεδο του mRNA του γονιδίου crmA αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας συμβατική δοκιμασία PCR. Οι παρακάτω και αντιπληροφοριακοί εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Primer2 (Applied Biosystems): Bcl-2: 5′-GGGATGCCTTTGTGGAACTATATG και CTGAGCAGGGTCTTCAGAGACA-3 ‘? crmA: 5’-AAGCTTATGGATATCTTCAG και GCCTGCCGCTTAATTAGTTGT-3 ‘? και GAPDH:. 5’-ACAGCCGCATCTTCTTGTGCAGTG και GGCCTTGACTGTGCCGTTGAATTT-3 ‘

Πολιτισμού σφαιροειδή όγκου συν-ενσωματωμένο με μικρο-σφαιρίδια σε πηκτές αγαρόζης

Για την παρακολούθηση της ανάπτυξης σφαιροειδές και τη συσσώρευση στρες, κατάλληλες ποσότητες GFP- ή μονά καρκινικά κύτταρα RFP-επισημασμένο, 1 μm (διάμετρος) καρβοξυλικό-τροποποιημένα φθορίζοντα σφαιρίδια (Molecular Probes, Eugene, OR), 2,0% (w /v) αγαρόζη (Τύπος VII, χαμηλής θερμοκρασίας σχηματισμού γέλης, Sigma, St. Louis , ΜΟ διάλυμα) υλικού (1Χ PBS) και μέσο κυτταρικής καλλιέργειας αναμείχθηκαν έτσι ώστε οι τελικές συγκεντρώσεις των κυττάρων, μικρο-σφαιρίδια και αγαρόζη ήταν 3.5 × 10

3 κύτταρα /ml, 4,5 × 10

5 χάντρες /ml και 0,5% ή 1,0%, αντίστοιχα. Ο πυθμένας ενός 10 mm × 2 mm (διάμετρος χ βάθος) κυλινδρικό φρεάτιο σε 5 χιλιοστά πάχος γυάλινο πλακίδιο (ειδική παραγγελία) αρχικά επικαλύπτονται με 50 μΙ πηκτής αγαρόζης 1,0% ελεύθερο κυττάρων για την πρόληψη της προσκόλλησης των κυττάρων. 300 μΙ του μίγματος κυττάρου /μικρο-σφαιρίδια /αγαρόζης στη συνέχεια προστέθηκε στο φρεάτιο και αφέθηκε να πολυμεριστεί για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το γυάλινο πλακίδιο στη συνέχεια τοποθετήθηκε σε 100 mm × 25 mm δίσκου Petri γεμίζεται με 40 ml μέσου κυτταρικής καλλιέργειας (βλέπε πειραματική διάταξη σε συμπληρωματικό Σχ. S1

A

). Το μέσο ανανεώνεται κάθε 5 ημέρες.

απεικόνισης και ποσοτικοποίηση της συμπίεσης της μήτρας γύρω αυξανόμενη σφαιροειδή

Εμείς μετριέται ο όγκος της καλλιέργειας σφαιροειδή και τη διανομή 3D της γύρω από μικρο-σφαιρίδια τους κάθε 5-7 ημέρες χρησιμοποιώντας ένα Olympus FlouView 500 ομοεστιακό σύστημα μικροσκόπιο (Olympus, Κέντρο Valley, PA). Σε κάθε χρονικό σημείο, ένας όγκος 638 μm × 638 μm χ 250 μm απεικονίσθηκε έτσι ώστε το ισημερινό του σφαιροειδούς ήταν επικεντρωμένη στο κάτω μέρος της επιφάνειας του τόμου? το μέγεθος βήματος στο Z ήταν 1 μm. Τρεις στοίβες ελέγχου εικόνας του μικρο-σφαιρίδια μετά αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας την ίδια διαδικασία, αλλά σε κοντινές περιοχές σφαιροειδή χωρίς τουλάχιστον 500 μm μακριά από οποιαδήποτε σφαιροειδές (έτσι ώστε η πυκνότητα σφαιρίδιο δεν επηρεάστηκε από τη συμπίεση της ανάπτυξης επαγόμενης). Για να προσδιοριστεί η τοπική πυκνότητα μικρο-σφαιριδίων ως μία συνάρτηση της απόστασης από το σφαιροειδές, μια Matlab (Mathworks, Natick, ΜΑ) ρουτίνα υπολογίζεται η ελάχιστη απόσταση ο ένας από τον μικρο-σφαιριδίων στην επιφάνεια σφαιροειδές και, στη συνέχεια, η σχετική πυκνότητα του μικρο- χάντρες σε 10 μm πάχους «κοχύλια» σε όλο το σφαιροειδές (

ρ

χάντρες, κανονικοποιημένη με την πυκνότητα μικρο-σφαιριδίων στις στοίβες ελέγχου εικόνας). Το στέλεχος της γέλης αγαρόζης σε αυτά τα κελύφη τότε υπολογίζεται ως

ε

τζελ = 1-1 /

ρ

χάντρες. Η διαδικασία αυτή διατήρησε την επίδραση των μικροσκοπικών μεταβολή στο σφαιροειδές σχήμα της επιφάνειας για την παραμόρφωση της μήτρας.

Πολιτισμού σφαιροειδή όγκου σε κρέμεται σταγονίδια

Για να δημιουργήσετε σφαιροειδή όγκου για τα εξωτερικά-εφαρμόζεται πειράματα συμπίεσης, χρησιμοποιήσαμε το κρέμονται μέθοδο σταγονιδίων. Εν συντομία, 20 μΐ σταγονίδια εναιώρημα καρκινικών κυττάρων (3.0 χ 10

5 κύτταρα /ml για 67NR και 2,0 × 10

5 κύτταρα /ml για ΕΜΤ6) προστέθηκαν στο εσωτερικό 10 cm διαμέτρου Petri κάλυμμα πιάτο . Μετά την τοποθέτηση του καλύμματος πίσω στο πιάτο συμπληρώθηκε με 10 ml μέσου καλλιέργειας, το πιάτο τοποθετήθηκε στον επωαστήρα (5% CO

2, 37 ° C) για να επιτραπεί ανάπτυξη σφαιροειδής μέσα σε κάθε σταγονίδιο. Τα σφαιροειδή συνήθως έφθασε περίπου 300 μm σε διάμετρο μετά από 3 ημέρες καλλιέργειας.

Συμπίεση των μονοστοιβάδων των καρκινικών κυττάρων και σφαιροειδή όγκου

Για συμπίεση του μονοστιβάδες των καρκινικών κυττάρων, τα κύτταρα σπάρθηκαν επί της μεμβράνης από 6 φρεατίων transwell ένθετο με 0.4 μm πόρους (Corning, Lowell, ΜΑ). 1.5 ml και 2.5 ml μέσου καλλιέργειας κυττάρων προστέθηκαν στα άνω και κάτω θαλάμους της καλά, αντίστοιχα. Μετά από ολονύκτια επώαση (για κυτταρική προσκόλληση στη μεμβράνη), ένα στρώμα 2 mm πάχους 1% πηκτή αγαρόζης τοποθετήθηκε στην κορυφή των κυττάρων και τα έμβολα του επιθυμητού βάρους στη συνέχεια εφαρμόστηκαν πάνω στην πηκτή αγαρόζης για συμπίεση (βλ πειραματική διάταξη σε συμπληρωματικό Εικ. S1

Β

). Κατά τη διάρκεια της συμπίεσης, οι πόροι στην transwell ένθετο μεμβράνη αφέθηκε συναγωγή του υγρού από το πήκτωμα και επίσης διάχυση των θρεπτικών ουσιών, αυξητικών παραγόντων και οξυγόνο στα σφαιροειδή. Για τη συμπίεση του σφαιροειδή όγκου, τα σφαιροειδή που καλλιεργούνται σε κρεμαστά σταγονίδια συλλέχθηκαν και επανα-εναιωρήθηκαν σε διάλυμα αγαρόζης 1,0%. 1 ml του διαλύματος στη συνέχεια προστέθηκε σε ένα 6-φρεατίων transwell ένθετο με 0.4 μm πόρους σε μεμβράνη του, καθιστώντας το πάχος γέλης ~ 2 mm. Το μίγμα σφαιροειδή-αγαρόζη αφέθηκε να πήξει για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, μετά την οποία 1,5 ml και 2,5 ml μέσου καλλιέργειας κυττάρων προστέθηκαν στα άνω και κάτω θαλάμους της καλά, αντίστοιχα. Το κατασκεύασμα σφαιροειδή-gel στη συνέχεια συμπιέστηκε με ένα έμβολο του επιθυμητού βάρους (βλ πειραματική διάταξη σε συμπληρωματικό Σχ. S1

C

).

χρώσης και απεικόνισης του πολλαπλασιασμού, της κασπάσης-3 και δραστικότητα νέκρωση σε σφαιροειδή όγκου

τα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα σε σφαιροειδή ανιχνεύθηκαν με φθορισμό κυτταρικού πολλαπλασιασμού Kit (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, σφαιροειδή σημάνθηκαν με ένα αντιδραστήριο σήμανσης BrdU, σταθερός (1% φορμαλίνη, 0,1% Triton σε PBS), επωάστηκαν με αντι-BrdU /αντιδραστήριο Nuclease και τέλος επωάστηκαν με Cy5 επισημασμένα κατσίκας αντι IgG ποντικού. Caspase-3 δραστικότητα και νέκρωση των καρκινικών κυττάρων ή σφαιροειδή ανιχνεύθηκαν με Nucview 488 Caspase-3 Assay Kit για τα ζώντα κύτταρα (Biotium, Hayward, CA) και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ, Molecular Probes, Eugene, OR), αντίστοιχα. Μονοστιβάδες κυττάρων βάφτηκαν για 15 λεπτά και σφαιροειδή-gel κατασκευάσματα βάφτηκαν για 45 λεπτά στους 4 ° C και ξεπλύθηκαν δύο φορές με φρέσκο ​​μέσο. Τα σημασμένα κύτταρα απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα Olympus FlouView 500 ομοεστιακό σύστημα μικροσκόπιο (Olympus, Κέντρο Valley, PA). Τα αποτελέσματα προσδιορίστηκαν ποσοτικά ως το ποσοστό της κασπάσης-3 /ΡΙ θετικών κυττάρων στον πληθυσμό.

Ανοσοϊστοχημική δοκιμασίες για αποπτωτική σε σφαιροειδή όγκου

Τα σφαιροειδή μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη επί 4 ώρες και, στη συνέχεια, ενσωματωμένο σε παραφίνη. 5 μm τομές κόπηκαν από τα τεμάχια παραφίνης και τα καρκινικά κύτταρα χρωματίστηκαν για απόπτωση με ApopTag® (Chemicon International, Temecula, CA). Τα κύτταρα αντι-χρώση με αιματοξυλίνη.

Στατιστικά

Οι τιμές χαρακτηρίζονται από αριθμητικός μέσος όρος και το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM). Σημαντικές διαφορές μεταξύ των διαφορετικών πληθυσμών των δεδομένων ελέγχθηκαν με Student

t-test

για αταίριαστο παρατηρήσεις.

Υποστήριξη Πληροφορίες

συμπληρωματικές μέθοδοι S1.

doi: 10.1371 /journal.pone.0004632.s001

(0,05 MB DOC)

Εικόνα S1.

Πειραματική ρυθμίσεις. σφαιροειδή (α) καλλιέργεια του όγκου συν-ενσωματωμένο με μικρο-σφαιρίδια σε γέλη αγαρόζης. (Β) εφαρμογή εξωγενούς, καλά καθορισμένες τάση συμπίεσης σε μια μονοστοιβάδα των καρκινικών κυττάρων. (Γ) στην εφαρμογή εξωγενούς, καλά καθορισμένη τάση συμπίεσης σε σφαιροειδή όγκου καλλιεργούνται σε ένα επιθυμητό μέγεθος κρέμεται σταγονίδια

doi:. 10.1371 /journal.pone.0004632.s002

(14,63 MB ΔΕΘ)

Εικόνα S2 .

ανάλυση των εικόνων 2D. (Α-G) Ποσοτικοποίηση τοπική παραμόρφωση σε ένα σφαιροειδές όγκου (πράσινο, μεταγωγή GFP) και το αντίστοιχο τοπικό στέλεχος στη γέλη αγαρόζης χρησιμοποιώντας μικρο-σφαιρίδια (κόκκινο). (Η-Κ) Ποσοτικοποίηση των τοπικών κλάσμα νεκρωτική περιοχή (κόκκινο, χρώση με ιωδιούχο προπίδιο) σε ένα σφαιροειδές (πράσινο, μεταγωγή GFP). (L) Συσχετίζοντας τις ασυμμετρίες στο σφαιροειδές σχήμα και στο στέλεχος τζελ. (Μ) Συσχετίζοντας τις ασυμμετρίες στο σφαιροειδές νέκρωση και στο στέλεχος τζελ

doi:. 10.1371 /journal.pone.0004632.s003

(5,25 MB ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

Η ανάπτυξη της δραστηριότητας της κασπάσης-3 (πράσινο, αριστερή στήλη) και νέκρωση (κόκκινο, κεντρική στήλη) στην καλλιέργεια σφαιροειδή όγκου (μεταδιδόμενη εικόνα επάνω με τις κασπάσης-3 και νέκρωση εικόνες, δεξιά στήλη) σε 1% αγαρόζης. μπαρ κλίμακας = 20 μm

doi:. 10.1371 /journal.pone.0004632.s004

(7,48 MB ΔΕΘ)

Movie S1.

3D rendering ενός πεπλατυσμένο σφαιροειδές όγκου καλλιεργούνται σε 0,5% πηκτή αγαρόζης

doi:. 10.1371 /journal.pone.0004632.s005

(3,13 MB MOV)

Movie S2.

ανάλυση εικόνας για την ποσοτικοποίηση των τοπικών σφαιροειδές όγκου παραμόρφωσης

doi: 10.1371 /journal.pone.0004632.s006

(0,45 MB MOV)

Movie S3.

ανάλυση εικόνας για την ποσοτικοποίηση των τοπικών στέλεχος σε πηκτή αγαρόζης που προκαλείται από την αύξηση του όγκου σφαιροειδές

doi:. 10.1371 /journal.pone.0004632.s007

(0,56 MB MOV)

Movie S4.

ανάλυση εικόνας για την ποσοτικοποίηση των τοπικών κυτταρικό θάνατο σε σφαιροειδές όγκου

doi:. 10.1371 /journal.pone.0004632.s008

(0,31 MB MOV)

Ευχαριστίες

ευχαριστώ Δρ. Patrick Au, Yves Boucher, Emmanuelle di Tomaso, Ιγκόρ Garkavtsev, Shan Liao, Tim Padera, και Lei Xu (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) για τη συμβολή εμπειρογνωμοσύνη για αυτή τη μελέτη, ο Δρ Brian Seed (Massachusetts General Hospital, Boston, MA ) για τα πλασμίδια crmA και ο Δρ Τζέιμς Freyer (Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM) για τα κύτταρα EMT6.