Αφηρημένο

Ιστορικό

Η επιθηλιακών κυττάρων απόκριση στο στρες περιλαμβάνει τη μετάδοση των σημάτων μεταξύ των παρακείμενων κυττάρων που μπορεί να απεικονιστεί ως ένα κύμα ασβεστίου. Σε ορισμένους τύπους κυττάρων, αυτό το κύμα εξαρτάται από την απελευθέρωση εξωκυτταρικού τρινουκλεοτιδίων από τραυματισμένα κύτταρα. Ειδικότερα, εξωκυτταρικό ΑΤΡ έχει αναφερθεί να είναι κρίσιμη για το επιθηλιακό κύτταρο απόκριση στο στρες και έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι ρυθμίζεται προς τα πάνω σε όγκους

in vivo

.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

Εδώ, έχουμε εντοπίσει σταννιοκαλσίνης-1 (STC1), ένα που εκκρίνεται πλειοτροφικές πρωτεΐνη, ως κρίσιμο διαμεσολαβητή της διάδοσης κυμάτων ασβεστίου σε μονοστοιβάδες της πνευμονικής (Α549) και του προστάτη (PC3) επιθηλιακά κύτταρα. Προσθήκη STC1 ενισχυμένη και κλείδωμα STC1 μείωσε την απόσταση που διανύεται από ένα εξωκυτταρικό ΑΤΡ-εξαρτώμενη κύμα ασβεστίου. Τα ίδια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν όταν ασβεστίου διεγείρεται από την προσθήκη εξωγενούς ΑΤΡ. Έχουμε αποκαλύψει μια θετική βρόχος ανάδρασης στο οποίο STC1 προάγει την απελευθέρωση της ΑΤΡ από τα κύτταρα

in vitro

και

in vivo

.

Συμπεράσματα /Σημασία

Η τα αποτελέσματα έδειξαν ότι STC1 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην πρώιμη απόκριση σε μηχανικό τραυματισμό από επιθηλιακά κύτταρα με ρύθμιση της σηματοδότησης του εξωκυτταρικού ΑΤΡ. Αυτή είναι η πρώτη έκθεση για να περιγράψει STC1 ως διαμορφωτής ή πουρινεργικών σηματοδότησης των υποδοχέων

Παράθεση:. Block GJ, DiMattia GD, Prockop DJ (2010) σταννιοκαλσίνης-1 Ρυθμίζει Το εξωκυττάριο ΑΤΡ-Induced Κύματα ασβεστίου στα κύτταρα ανθρώπινων επιθηλιακών Καρκίνου με την τόνωση της ATP Απελευθέρωση από παρευρισκομένου κύτταρα. PLoS ONE 5 (4): e10237. doi: 10.1371 /journal.pone.0010237

Επιμέλεια: Neil A. Hotchin, Πανεπιστήμιο του Birmingham, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 16 Δεκέμβρη 2009? Αποδεκτές: 16, Μαρτίου 2010? Δημοσιεύθηκε: 20 Απρ 2010

Copyright: © 2010 Block et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Υποστηρίζεται από ΝΙΗ επιχορηγήσεις Ρ40 RR 17447 και P01 HL 075161. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνίζονται υπάρχουν συμφέροντα.

Εισαγωγή

σταννιοκαλσίνης-1 (STC1) είναι μια πρωτεΐνη 247 αμινοξέων η οποία εκκρίνεται από τα κύτταρα ως γλυκοζυλιωμένη ομοδιμερές. STC1 περιγράφηκε αρχικά ως μία ενδοκρινή ρυθμιστής ασβεστίου και φωσφόρου ομοιόστασης στα ψάρια [1], [2]. Στα σπονδυλωτά, STC1 μπορεί να ρυθμίζει τον μεταβολισμό μεταλλικών [3] μέσω διαμόρφωσης του φωσφορικού resorprtion στο νεφρό [4] και το έντερο [5]. STC1 επίσης εμπλακεί στην αποσύζευξη της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης [6], η αναστολή της μετανάστευσης των μακροφάγων

in vitro

[7] και

in vivo

[8], η πρόληψη της αγγειακής permeablization [9], και τα δύο θετικών και των αρνητικών αποπτωτικά αποτελέσματα [10], [11], [12]. Μέχρι σήμερα, ένας μηχανισμός με τον οποίο STC1 ασκεί πλειοτροπικές επιδράσεις του δεν έχει τεκμηριωθεί. Πιο πρόσφατα, έχει γίνει σαφές ότι STC1 είναι το άγχος ανταποκρίνεται παράγοντα (Chang et al., 2003), σύμφωνα με τις πρόσφατες παρατηρήσεις ότι η μεταγραφή STC1 ταχέως ρυθμίζεται προς τα πάνω μετά από ζημιογόνο σήματα [10], [13], [14] .

Ο ρόλος των STC1 στην ομοιόσταση του ασβεστίου και της ζημίας του ιστού δείχνει ότι μπορεί να εμπλέκεται στην μετακίνηση του ασβεστίου και σηματοδότησης που ενεργοποιούνται από μία ποικιλία μηχανικών και άλλων καταπονήσεις στα κύτταρα. Για παράδειγμα, η επισκευή των επιθηλιακών μονοστιβάδων εξής μηχανική διάσπαση εξαρτάται από ένα ενδοκυτταρικό ασβέστιο κύμα διαδίδεται από τη θέση της διακοπής σε παρακείμενα κύτταρα [15], [16], [17], [18], [19]. Η διάδοση του κύματος ασβεστίου έχει αποδοθεί είτε σε θέση διασταύρωση μεσολάβηση μεταφορά του ασβεστίου ή χαμηλού μοριακού βάρους δεύτερους αγγελιοφόρους, ή στην απελευθέρωση του ενδοκυτταρικού νουκλεοτιδίων από τα τραυματισμένα κύτταρα που στη συνέχεια συνδέονται με υποδοχείς σε γειτονικά κύτταρα [20], [ ,,,0],21], [22]. Πολλές εκθέσεις έδειξαν ότι εξωκυτταρικό τριφωσφορική αδενοσίνη (ATP) προωθείται επιδιόρθωσης στα διαταράσσεται καλλιέργειες διεγείροντας τη μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων [15], [18]. Πρόσφατα, τα αυξημένα επίπεδα εξωκυτταρικής ΑΤΡ απεικονίστηκαν στις αναπτυσσόμενες όγκους

in vivo

, και μπορεί να συμβάλει στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων [23].

εξωκυτταρικών νουκλεοτιδίων ρυθμίζουν το ενδοκυτταρικό ασβέστιο μέσω σύνδεσης με μία οικογένεια υποδοχέων ονομάζεται Ρ2 υποδοχείς πουρινεργικών, καθένα από τα οποία έχει διαφορετική χημική συγγένεια για συγκεκριμένες νουκλεοτίδια. Υπάρχουν δύο υποκατηγορίες υποδοχέα Ρ2: οι Ρ2Χ τριμερείς διαύλων ιόντων και Ρ2Υ G-πρωτεΐνη υποδοχείς (GPCRs). Η πρόσδεση σε ένα υποδοχέα Ρ2Χ οδηγεί σε μια διαμορφωτική αλλαγή στο κανάλι που επιτρέπει την εισροή του ασβεστίου και άλλων ιόντων, ενώ Ρ2Υ είναι ένα συζευγμένο υποδοχέα G-πρωτεΐνη που χρησιμοποιεί την ενέργεια της GTP υδρόλυσης να φωσφορυλιώνει Φωσφολιπάση C (PLC) μετά από δέσμευση συνδέτη . PLC μπορεί στη συνέχεια να διασπαστούν το λιπίδιο, φωσφατιδυλινοσιτόλη 4,5-διφωσφορικής (ΡΙΡ2), σε ινοσιτόλη 1,4,5-τριφωσφορικής ινοσιτόλης (ΙΡ3) και διακυλ γλυκερίνης (DAG). IP3 δεσμεύει συγκεκριμένα κανάλια ιόντων ασβεστίου επί του ενδοπλασμικού δικτύου για να απελευθερώσει ασβέστιο στο κυτταρόπλασμα. Από τις 12 υποδοχείς Ρ2Υι, μόνο Ρ2Υ

2 έχει αποδειχθεί τόσο δεσμεύουν ΑΤΡ και ζευγάρι με την G

q G-υπομονάδα πρωτεΐνης να ξεκινήσει την απελευθέρωση του ασβεστίου από ενδοκυτταρικά αποθέματα [24].

Εδώ αποδεικνύουμε ότι η προ-θεραπεία των επιθηλιακών κυττάρων σε καλλιέργεια μονοστοιβάδας με STC1 ενισχυθεί σημαντικά διάδοσης κυμάτων ασβεστίου μετά από μηχανική διάσπαση των καλλιεργειών. Το ίδιο εξάρτημα παρατηρήθηκε όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με STC1 και εκτέθηκαν σε εξωγενή ΑΤΡ. Παρέχουμε αποδείξεις ότι STC1 ευαισθητοποιημένα τα κύτταρα σε ATP ανάντη του PLC, και ότι η παρεμπόδιση της ενδογενούς STC1 χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα εξουδετέρωσης ανέστειλε την εξέλιξη του κύματος ασβεστίου. Το έργο αυτό παρέχει την πρώτη απόδειξη ότι STC1 μπορούν να διαμορφώσουν μια πρώιμη εκδήλωση σηματοδότησης μετά από μηχανική βλάβη, και εμπλέκει STC1 ως ρυθμιστής της πουρινεργικών σηματοδότησης των υποδοχέων.

Αποτελέσματα

STC1 Ενισχυμένη Ασβέστιο Κυματική Διάδοση Μετά Μηχανική η διέγερση των κυττάρων Α549

για να διερευνηθεί η επίδραση της STC1 σχετικά με τη ζημία που προκαλείται από τη διαφοροποίηση του ασβεστίου, συρρέουσες μονοστοιβάδες πνεύμονα επιθηλιακών κυττάρων (Α549) ήταν μηχανικά εξαναγκασμένη να ξεκινήσει ένα κύμα ασβεστίου. Διάδοση κυμάτων οπτικοποιήθηκε με προ-επώαση του μονοστιβάδα με μία διαπερατή μεμβράνη βαφής που φθορισμό μετά από δέσμευση του ασβεστίου (Fluo-4).

Σχήμα 1Α (Ταινία S1 και S2) δείχνει αντιπροσωπευτικό εικόνες της διάδοσης του κύματος ασβεστίου προέρχονται από την περιοχή απόξεσης σε γειτονικά κύτταρα πάνω από 30 δευτερόλεπτα. Η απόσταση ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση της απόστασης μεταξύ της θέσης κοπής και την αιχμή του κύματος ασβεστίου σε κάθε χρονικό σημείο. Προεπεξεργασία των μονοστιβάδων με STC1 οδήγησε σε 4-πλάσια αύξηση της διάδοσης κυμάτων ασβεστίου σε 40 δευτερόλεπτα μετά την απόξεσης (Εικόνα 1Β), που συνέχισαν να διαδίδουν το παρελθόν του 40 s χρονικό σημείο (Ταινία S2). Για να ελέγξετε αν το αποτέλεσμα ήταν τύπου κυττάρου ειδική, επαναλάβαμε τις μελέτες αυτές σε καρκίνο του προστάτη κυτταρική σειρά (PC3? Movie S3, S4). STC1 ενισχυμένη επίσης διάδοσης κυμάτων ασβεστίου στα κύτταρα PC3.

Α) Συρρέουσες μονοστιβάδες Α549 σημάνθηκαν με Fluo-4 και προ-επωάστηκαν με ή χωρίς 500 ng /mL STC1 για 10 λεπτά πριν από την μηχανική διάσπαση. Ορατή είναι εικόνες που λαμβάνονται -1, 0, 10, 20 και 30 s μετά την διάσπαση. Εικόνες σε κάθε ομάδα παραποιήθηκαν εξίσου χρησιμοποιώντας τη λειτουργία όριο στο Adobe Photoshop για να ψεύτικη χρώμα το κύμα για λόγους σαφήνειας (κόκκινο). Arrow σημεία σε αιχμή του κύματος. Β) Η μέση απόσταση που διανύει το κύμα ασβεστίου πάροδο του χρόνου σε έλεγχο και ομάδες θεραπείας STC1 από Μπαρ Α Error = SD. * = P Melville, Νέα Υόρκη? www.nikoninstruments.com). Κύτταρα και μικροσκοπίου ήταν συσκευασμένα σε ένα περιβαλλοντικό θάλαμο 37 ° C (in vivo Επιστημονική? St Louis, MO? Www.invivoscientific.com). Εικόνες ελήφθησαν σε 2 καρέ /δευτ για τουλάχιστον 1 λεπτό, χρησιμοποιώντας το λογισμικό ΝΑΚ Elements. Ένας στόχος 4X χρησιμοποιήθηκε (CFI Σχέδιο Fluor 4X /.13 17,1 χιλιοστά? Nikon Instruments). Fluo-4 ήταν ενθουσιασμένος χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο διέγερσης 488 nm, και ανιχνεύεται στα 520 nm εκπομπή

μηχανική διέγερση των κυττάρων Α549 εκτελέστηκε με το χέρι με τη δημιουργία ενός γραμμικού μηδέν με ένα ρύγχος πιπέτας λυγισμένο P200 (epTIP?. Eppendorf, Αμβούργο Γερμανία, www.eppendorf.com). Για να εμφανίσετε τα κύματα ασβεστίου σε κάθε σχήμα με μεγαλύτερη σαφήνεια, όλες οι εικόνες σε κάθε κατάσταση προσαρμόστηκαν ταυτόχρονα χρησιμοποιώντας τη λειτουργία όριο Adobe Photoshop έτσι ώστε pixels πάνω από ένα αυθαίρετα όριο γύρισε κόκκινο.

Φασματοσκοπία Φθορισμού

Fluo-4 επισημασμένα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 48 ή 96 φρεατίων πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C σε ένα φασματοφωτόμετρο φθορισμού εφοδιασμένο με δύο εγχυτήρες αντιδραστήριο (Fluostar Omega, BMG Labtech, Offenburg Γερμανία? www.bmglabtech.com). Το πρώτο μπεκ είχε προγραμματιστεί να παραδώσει αυξανόμενες δόσεις της ATP μετά από 4 δευτερόλεπτα βασική ανάγνωση. Το δεύτερο μπεκ είχε προγραμματιστεί να παραδώσει ρυθμιστικό αντιδραστήριο πριν από την ΑΤΡ, ώστε ο όγκος για κάθε ανάγνωση παρέμεινε σταθερή. Wells προσδιορίστηκαν στα 480 διεγέρσεως /520 εκπομπή. Τα δεδομένα από κάθε αρχική κατάσταση αφαιρείται. Φθορισμού μετρήσεις έντασης λήφθηκαν κάθε 0,5 sec σε 480 δραστηριότητας και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης δεδομένων BMG Omega Λογισμικού και το Microsoft Excel.

In Vitro

ATP Αναλύσεις

ATP αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα πρωτόκολλο που βασίζεται λουσιφεράσης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (CellTitre-Glo, Promega? www.promega.com). Προκειμένου να ποσοτικοποιηθεί έμμεσα ο αριθμός των κυττάρων, 20 ml αντιδραστηρίου λουσιφεράσης συμπληρώθηκε με 50 μι ενός χρώματος παρεμβολής DNA (CyQuant? Invitrogen). Ένα ενιαίο όγκο αντιδραστηρίου προστέθηκαν σε έναν ίσο όγκο ρυθμισμένο μέσο. Το μισό από το δείγμα στη συνέχεια αναλύθηκε για λουσιφεράση και το υπόλοιπο για φθορισμό (480/520 διεγέρσεως /emmision) χρησιμοποιώντας ένα αναγνώστη πλάκας ικανό να ανιχνεύει τόσο φθορισμού και η φωταύγεια (Fluostar Omega, BMG Labtech).

Δοκιμασία ΑΤΡ στο Plasma ποντίκι

το αίμα συλλέχθηκε από την ανθρώπινη STC1 διαγονιδιακά αρσενικά ποντίκια (γραμμή 2) [32] και τα αρσενικά άγριου τύπου (2-4 μηνών) από το ίδιο γενετικό υπόβαθρο (C57BL /6 χ CBA) χρησιμοποιώντας ηπαρίνη να πρόληψη της πήξης. Τυπικά, 300-400 μL συλλέγεται ανά ποντικό και αναμίχθηκε αμέσως με το διάλυμα τερματισμού σε θερμοκρασία δωματίου για να ελαχιστοποιηθεί απελευθέρωση ΑΤΡ από τα αιμοπετάλια και αποικοδόμηση ΑΤΡ από ΑΤΡ [45]. Το διάλυμα στάση ήταν 3 mM EDTA, 118 mM NaCl, 5 mM ΚΟΙ, 40 mM ρυθμιστικού διαλύματος τρικίνης, 5 ηΜ νιτροβενζύλιο thioinosine, 10 μΜ φορσκολίνη, 100 μΜ ισοβουτυλομεθυλοξανθίνη. Το αίμα φυγοκεντρήθηκε αμέσως στα 13000 χ g για 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και 50 μι πλάσματος χρησιμοποιήθηκε εις διπλούν για την εκτέλεση έμμεσες μετρήσεις ΑΤΡ χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Glo CellTiter-(Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το σήμα φωταύγειας μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο Berthold Lumat LB9507 και σχετικές μονάδες φωτός μετατράπηκαν σε συγκεντρώσεις ΑΤΡ χρησιμοποιώντας πρότυπη καμπύλη.

Εικόνα και Ανάλυση Ταινίας

Η ανάλυση εικόνας πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού της Nikon NIS Elements (Nikon) ή ImageJ (rsb.info.nih.gov/ij). Για να ποσοτικοποιηθεί η απόσταση του κύματος ασβεστίου, εικόνες αποκτήθηκαν 10, 20, 30 και 40 s μετά ξύνω. Για κάθε εικόνα, 5 γραμμές καταρτίστηκαν κάθετο προς το άκρο της απόξεσης προς την κορυφή του κύματος ασβεστίου. Αποστάσεις από τις γραμμές καταγράφηκαν και κατά μέσο όρο για πάνω από 5 ταινίες ανά συνθήκη.

Στατιστικές Αναλύσεις

Όταν δύο μέσα είχαν σχέση, ένα δύο-tailed t-test έγινε με τη χρήση του Microsoft Excel. Υπό συνθήκες όπου η σύγκριση περισσότερα από δύο μέσα, μηδενική υπόθεση απορρίπτεται χρησιμοποιώντας μια ανάλυση διακύμανσης. Μετρήσεις αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα πολυ-μεταβλητή πίνακα έκτακτης ανάγκης και chi-τετράγωνο τεστ χρησιμοποιώντας INSTAT στατιστικό λογισμικό.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

ασβέστιο διάδοσης κυμάτων ήταν ανεξάρτητη της Gap Junction διακυτταρικής επικοινωνίας. μονοστοιβάδες Α549 μηχανικά διεγέρθηκαν μετά από προεπώαση με με 10, 25, ή 50 μΜ γλυκυρροχητινικό οξύ και αναλύθηκε με μικροσκοπία ζωντανό κύτταρο. . Μεγέθυνση = 40 ×

doi: 10.1371 /journal.pone.0010237.s001

(0,30 MB ΔΕΘ)

Movie S1.