Abstract

ΡΚΟα (πρωτεϊνική κινάση C άλφα, PRKCA) είναι μια σημαντική πρωτεΐνη που εμπλέκεται σε διάφορα στάδια της μονοπατιών σηματοδότησης στον καρκίνο του πνεύμονα, και microRNAs (miRNAs) έχουν επίσης αποδειχθεί ότι συμμετέχουν σε πνεύμονα καρκινογένεση. Ωστόσο, δεν είναι σαφές πώς ΡΚΟα και miRNAs συσχετίζονται στη νόσο. Στην έκθεση αυτή, έχουμε ως στόχο να προσδιορίσει νέες miRNAs που στοχεύουν ΡΚΟα και να μελετήσει βιολογική λειτουργία τους. Χρησιμοποιώντας την ανάλυση βιοπληροφορικής, είχαμε προβλέψει ένα νέο υποψήφιο, miR-203, και βρήκε διαφορική πρότυπα έκφρασης του miR-203 και ΡΚΟα σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του πνεύμονα. Επιπλέον, έχουμε πειραματικά επικυρωμένη miR-203 ως άμεσο ρυθμιστή των ΡΚΟα. Τέλος, αποδείξαμε ότι η στόχευση των ΡΚΟα με miR-203 έπαιξε έναν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της απόπτωσης και τη μετανάστευση σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Εν ολίγοις, η μελέτη αυτή εντοπίζει ένα μυθιστόρημα miRNA που στοχεύει ΡΚΟα και δείχνει ότι η καταστολή των ΡΚΟα από miR-203, ρυθμίζει τις βιολογικές διαδικασίες στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων

Παράθεση:. Wang C, Wang Χ, Liang Η, Wang Τ , Γιαν X, Cao Μ, et al. (2013) miR-203 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και τη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα από Στόχευση ΡΚΟα. PLoS ONE 8 (9): e73985. doi: 10.1371 /journal.pone.0073985

Επιμέλεια: Jun Li, η Sun Yat-sen University Medical School, Κίνα

Ελήφθη: 8 Απριλίου, 2013? Αποδεκτές: 24 Ιούλη 2013? Δημοσιεύθηκε: 10 Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (αρ. 81101330, 31271378, 81250044 και J1103512) και το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Jiangsu (αριθ. BK2011013 και BK2012014). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο, και μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) αντιπροσωπεύει περίπου το 80% όλων των περιπτώσεων [1]. Η πλειονότητα των καρκίνων του πνεύμονα (56%) διαγιγνώσκονται σε ένα μακρινό στάδιο επειδή πρώιμο στάδιο της νόσου είναι συνήθως ασυμπτωματική? μόνο το 15% των περιπτώσεων διαγιγνώσκονται σε ένα τοπικό στάδιο [2]. Πράγματι, οι ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα παρουσιάζουν συχνά εισβολή των καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση πριν από τη διάγνωση η οποία καθιστά τρέχουσες θεραπείες, συμπεριλαμβανομένης της χειρουργικής επέμβασης, της ακτινοθεραπείας και χημειοθεραπείας αναποτελεσματική. Το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών για μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα είναι πολύ χαμηλή (17,1%). Ως εκ τούτου, μελετώντας την μοριακή βάση του καρκίνου του πνεύμονα είναι ζωτικής σημασίας για τον σχεδιασμό νέων θεραπευτικών παραγόντων που θα βελτιώσει το ποσοστό επιβίωσης.

Ο πρωτεϊνική κινάση (PKC) είναι μία κινάση σερίνης /θρεονίνης που παίζει καθοριστικό ρόλο σε αρκετές μεταγωγή σήματος οδούς, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που εμπλέκονται σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση, και την απόπτωση [3-5]. Η οικογένεια PKC περιέχει 10 συναφείς ισομορφές με διαφορετικές απαιτήσεις συμπαράγοντα, ο ιστός και υποκυτταρική κατανομή και εξειδίκευση υποστρώματος [6]. Η οικογένεια χωρίζεται σε συμβατικά (cPKCs: α, βΙ, βΙΙ, και γ), μυθιστόρημα (nPKCs: δ, ε, η και θ), και τα άτυπα (aPKCs: ζ και ι /λ) υποκατηγορίες. PKC, συμπεριλαμβανομένων ΡΚΟα (PRKCA), παίζει ρόλο στον καρκίνο του πνεύμονα. Το επίπεδο της ΡΚΟα πρωτεΐνης είναι σημαντικά υψηλότερη σε κυτταρικές σειρές NSCLC (H1355, Α549, H1703, Η157, και H1155) συγκριτικά με τα πρωτογενή κύτταρα ανθρώπινου πνεύμονα επιθηλιακά (ΝΗΒΕ)? Ως εκ τούτου, η αυξημένη έκφραση ΡΚΟα μπορεί να είναι ένα γενικό χαρακτηριστικό των κυττάρων NSCLC [7]. Υπήρξαν πολλές αναφορές σχετικά με το ρόλο των ΡΚΟα στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την απόπτωση και την μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. ΡΚΟα έχει αποδειχθεί ότι δεσμεύουν και φωσφορυλιώνει τις πρωτεΐνες ικρίωμα δίσκους μεγάλο ομόλογο 1 (DLG1) και προάγουν την κυτταρική μετανάστευση σε κύτταρα NSCLC [8]. Επιπλέον, η καταστολή της ΡΚΟα ενισχύει την κυτταροτοξικότητα και μεταλλαξιγένεση του οξικού μολύβδου (Pb) κατεργασμένα ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα CL3 [9]. Η σταυροσπορίνη, ένας ισχυρός αναστολέας PKC, ελέγχει την κυτταρική προσκόλληση, την κινητικότητα και την εισβολή των κυττάρων Α549 [10]? IL1-β επάγει την έκφραση του ενεργοποιητή πλασμινογόνου ουροκινάσης (υΡΑ) μέσω ΡΚΟα, η οποία οδηγεί στη μετανάστευση των κυττάρων Α549 NSCLC [11].

microRNAs (miRNAs) είναι κρίσιμοι ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης [12,13] . Ώριμη miRNAs mRNAs δεσμεύονται στόχο σε συμπληρωματικές θέσεις στο 3′-αμετάφραστες περιοχές (3′-UTRs) ή στις αλληλουχίες κωδικοποίησης, με τον τρόπο αυτό καταστέλλοντας την έκφραση του γονιδίου στόχου [14,15]. Τα miRNAs απορυθμισμένη στον ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα και παίζουν σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση [16]. Για παράδειγμα, η χαμηλή έκφραση του let-7α και υψηλή έκφραση του συμπλέγματος miR-17-92 συνδέονται με κακή κλινική έκβαση σε καρκίνο του πνεύμονα [17,18]. Η οικογένεια miR-34 είναι επίσης καταστέλλεται στον καρκίνο και εμπλέκεται στην καταστολή όγκου ρ53 που σχετίζεται σε πολλούς καρκίνους [19-23], συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του πνεύμονα [24]. Τα ευρήματα αυτά υπογραμμίζουν την ανάγκη για μια σε βάθος έρευνα για miRNAs έκτροπα που εκφράζονται κατά τη διάρκεια των πνευμόνων καρκινογένεσης που μπορεί να διαδραματίσει κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της ανάπτυξης του καρκίνου του πνεύμονα ή ογκογένεση.

Αν και η απορρύθμιση των miRNAs και ΡΚΟα διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση του πνεύμονα , δεν υπάρχει συσχετισμός μεταξύ ΡΚΟα και miRNAs έχει αναφερθεί. Σε αυτή τη μελέτη, ψάχνουμε για miRNAs που θα μπορούσαν να στοχεύουν ΡΚΟα και την επιρροή της κυτταρικής λειτουργίας.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Ο καρκίνος του πνεύμονα και συμφωνημένα φυσιολογικό γειτονικό δείγματα ιστού που προέρχονται από ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση στο Nanjing Drum Tower Νοσοκομείο (Nanjing, Κίνα). Όλοι οι ασθενείς ή οι κηδεμόνες τους, εφόσον έγγραφη συγκατάθεση και η Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Nanjing και Nanjing, Drum Tower Νοσοκομείο ενέκρινε όλες τις πτυχές αυτής της μελέτης. θραύσματα ιστού καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο κατά τη στιγμή της επέμβασης και αποθηκεύεται στους -80 ° C. Κατεψυγμένα ιστοί ομογενοποιήθηκαν και το συνολικό RNA εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών αναφέρονται στον Πίνακα 1.

Η Εποχή

Φύλο

Παθολογική Στάδιο

όγκου Hystotype

148MIIIA (T2b, Ν2, κοα) πλακωδών κυττάρων Carcinoma270FIA (T1b, Όχι, κοα) Adenocarcinoma362FIIB (Τ3, όχι, κοα) Adenocarcinoma455FIIIA (Τ3, Ν2, Μο) Adenocarcinoma567MIB (Τ1, όχι, Μο) Adenocarcinoma649MIV (Τ4, Ν2, M1a) AdenocarcinomaTable 1. Τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα.

CSV Λήψη CSV

Cells, αντιδραστήρια, και τα αντισώματα

Ανθρώπινα κύτταρα Α549 αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα αγοράστηκαν από την Κίνα Cell Culture Center (Σαγκάη, Κίνα). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε Μέσο Eagle Τροποποιημένο Μέσο (DMEM? Gibco, CA, USA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS? Gibco) και αναπτύχθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2. Συνθετικά μόρια RNA, συμπεριλαμβανομένων των προ-miR-203, και το ανακατωμένο μη κωδικοποιητικού RNA (ncRNA) αγοράστηκαν από την Ambion (Austin, TX, USA). Anti-ΡΚΟα (H-7) και αντι-GAPDH (6C5) αντισώματα λήφθηκαν από Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 αγοράστηκε από την Dojindo (Ιαπωνία). Το κιτ FITC-Annexin V Ανίχνευσης Απόπτωσης Ι ελήφθη από την BD Biosciences (CA, USA).

miRNA και siRNA διαμόλυνση

miR-203 υπερέκφραση επιτεύχθηκε με επιμόλυνση κυττάρων με προ-ΜΙΚ 203, ένα συνθετικό ολιγονουκλεοτίδιο RNA που μιμείται τον πρόδρομο miR-203, και ένα ncRNA χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. Τρεις σειρές siRNA που στοχεύει διαφορετικές περιοχές του ανθρώπινου cDNA ΡΚΟα (si-ΡΚΟα) σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν από την Invitrogen. Ένα κωδικοποιημένα siRNA που δεν στοχεύουν ανθρώπινη ΡΚΟα cDNA συμπεριλήφθηκε ως αρνητικός έλεγχος. αλληλουχίες siRNA ήταν ως εξής: SI-ΡΚΟα # 1: 5′-GGAUGUGGUGAUUCAGGAU-3 ‘(νοηματικό)? SI-ΡΚΟα # 2: 5’-GCAAAGGACUGAUGACCAA-3 ‘(νοηματικό)? SI-ΡΚΟα # 3: 5’-AAGCUCCAUGUCACAGUACGA-3 ‘(νοηματικό)

Α549 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και επιμολύνθηκαν την επόμενη ημέρα χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. . Για κάθε καλά, ίσες δόσεις (100 pmol) του κωδικοποιημένα ncRNA, προ-miR-203, ομελέτα προστέθηκαν siRNA, ή si-ΡΚΟα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Το επίπεδο έκφρασης του miR-203 αναλύθηκε με ποσοτική RT-PCR, ενώ το επίπεδο της πρωτεΐνης ΡΚΟα αξιολογήθηκε με στύπωμα Western χρησιμοποιώντας αντίσωμα εναντίον ΡΚΟα. Αυτά τα δείγματα ομαλοποιήθηκαν με κηλίδωση με ένα αντίσωμα έναντι GAPDH. Το λογισμικό ImageJ χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση των επιπέδων της πρωτεΐνης. Η αλληλουχία siRNA με το καλύτερο αποτέλεσμα παρεμβολής (SI-ΡΚΟα # 3) επιλέχθηκε και χρησιμοποιήθηκε σε περαιτέρω μελέτες.

Η υπερέκφραση του ΡΚΟα

Ένα πλασμίδιο έκφρασης θηλαστικού που κωδικοποιεί την ανθρώπινη ΡΚΟα ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης χωρίς 3′-UTR αγοράστηκε από την Invitrogen. Ένα άδειο πλασμίδιο χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. Το πλασμίδιο υπερέκφραση ΡΚΟα διαμολύνθηκε σε κύτταρα Α549 χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

απομόνωση του RNA και ποσοτική RT-PCR

Το συνολικό RNA εκχυλίστηκε από τα καλλιεργημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ Αντιδραστήριο (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για την ποσοτική ανάλυση RT-PCR του ΡΚΟα και β-ακτίνη μεταγραφές, 1 μα συνολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας ένα oligdT και Thermoscript Αντίστροφη Μεταγραφάση (Takara, Dalian, Κίνα). Real-time PCR για την ΡΚΟα και β-ακτίνη μεταγραφές πραγματοποιήθηκε σε ένα Applied Biosystems 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) χρησιμοποιώντας SYBR πράσινο χρώμα (Invitrogen). Οι αντιδράσεις PCR εκτελέστηκαν σε μία αντίδραση 20 μλ συμπεριλαμβανομένων 1 μλ cDNA, 1 × QuantiTect SYBR πράσινο PCR Master Mix, και 0,5 μΜ και αντιπληροφοριακοί εκκινητές. Οι αντιδράσεις επωάστηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων στους 95 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενο από 40 κύκλους των 95 ° C για 30 s, 60 ° C για 30 s, και 72 ° C για 30 s. Ολες οι αντιδράσεις έτρεξαν εις τριπλούν. Μετά έτρεξαν οι αντιδράσεις, οι κύκλοι όριο (C

T) προσδιορίσθηκαν με τη χρήση των ρυθμίσεων σταθερό όριο. Οι αλληλουχίες των με νόημα και αντινόημα εναρκτήρες χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση του ΡΚΟα και β-ακτίνη ήταν ως εξής: ΡΚΟα (με νόημα): 5′-GTGGCAAAGGAGCAGAGAAC-3 ‘? ΡΚΟα (αντιπληροφοριακό): 5’-TGTAAGATGGGGTGCACAAA-3 ‘? β-ακτίνης (με νόημα): 5’-AGTACTTCCTC TGCCCTGCTGCAG-3 ‘? β-ακτίνης (αντιπληροφοριακό):. 5’-AGGGCAGGCAGCGTATATACAGGA-3 ‘

Δοκιμασίες για την ποσοτικοποίηση ώριμη miR-203 διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Taqman ανιχνευτές microRNA (Applied Biosystems) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 1 μg ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφάση ΑΜν (Takara) και ενός εκκινητή stem-loop RT (Applied Biosystems). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ TaqMan PCR σε ένα Applied Biosystems 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Όλες οι αντιδράσεις, συμπεριλαμβανομένου του ελέγχου χωρίς πρότυπο, έτρεξαν εις τριπλούν. Μετά τις αντιδράσεις, η C

τιμές Τ προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμίσεις σταθερού κατωφλίου. Στα πειράματα που παρουσιάζονται εδώ, η έκφραση miRNA στα κύτταρα κανονικοποιήθηκε προς την έκφραση του U6 snRNA. Η σχετική ποσότητα του miR-203 για τον εσωτερικό έλεγχο U6 υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση 2

-ΔCT, όπου ΔΟ

T = C

T miR-203-C

T U6.

miRNA πρόβλεψη στόχο

Τα miRNAs που μπορούν να στοχεύουν ΡΚΟα προσδιορίστηκαν με τη χρήση αλγορίθμων από TargetScan (https://genes.mit.edu/targetscan/) [25], PicTar (http: //pictar .bio.nyu.edu /) [26], και η Μιράντα (https://cbio.mskcc.org/cgi-bin/mirnaviewer/mirnaviewer.pl) [27].

δοκιμασία

κατασκευή πλασμίδιο και λουσιφεράση

μια μερική αλληλουχία της ανθρώπινης ΡΚΟα 3′-UTR, το οποίο περιλαμβάνει την προβλεπόμενη θέσεις δέσμευσης miR-203, συνετέθη από την Invitrogen, με μια επιπρόσθετη τροποποίηση 3′-φωσφορυλίωσης. Η αλληλουχία ήταν ως ακολούθως: ΡΚΟα 3′-UTR (με νόημα): 5′-CTAGTTCTAAGGACGTTGCTGAACAAGCGTGTGAAATCATTTCAGATCAAGGATAAGCCAGTGTGTACATATGTA-3 ‘? ΡΚΟα 3′-UTR (αντιπληροφοριακό): 5’-AGCTTACATATGTACACACTGGCTTATCCTTGATCTGAAATGATTTCACACGCTTGTTCAGCAACGTCCTTAGAA-3 ‘. Ένα έλικος μόριο διπλής σχηματίστηκε με ανασύνδεση των δύο αυτών απλές αλυσίδες στους 60 ° C, και αυτή η duplex εισήχθη εντός του πλασμιδίου ρ-MIR-έκθεσης (Ambion). Αποτελεσματική εισαγωγή επιβεβαιώθηκε με αλληλούχιση. Για τις ανιχνεύσεις αναφοράς της λουσιφεράσης, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων, και κάθε φρεάτιο διαμολύνθηκε με 2 μg λουσιφεράση πυγολαμπίδας πλασμίδιο αναφοράς, 2 μg φορέα έκφρασης β-γαλακτοσιδάσης (Ambion), και ίσες ποσότητες κωδικοποιημένα ncRNA ή προ-ΜΙΚ 203 χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen). Ο φορέας β-γαλακτοσιδάσης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος επιμόλυνσης. Τα κύτταρα αναλύθηκαν με τη χρήση των κιτ δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI, USA) 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα αναφερόμενα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων Α549 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την μέτρηση των κυττάρων Kit-8 (Dojindo), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε 5,0 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96-φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύκτα σε ϋΜΕΜ μέσο συμπληρωμένο με 10% FBS. Μετά την επιμόλυνση, 10 μΐ CCK-8 υγρό προστέθηκε στο φρεάτιο δοκιμής και επωάστηκαν για 3 h. Απορρόφηση (

Α

) μετά μετρήθηκε σε μήκος κύματος 450 nm.

Η μετανάστευση των κυττάρων δοκιμασία

Η ικανότητα της μετανάστευσης των κυττάρων Α549 εξετάστηκε χρησιμοποιώντας ένα Transwell Boyden Επιμελητήριο (6,5 mm, Costar, Cambridge, ΜΑ). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ncRNA, προ-miR-203, ή siRNAs για 6 ώρες και εναιωρήθηκαν σε μέσο DMEM ελεύθερο ορού σε συγκέντρωση 4 Χ 10

5 κύτταρα /mL? τότε, 4 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο προστέθηκαν στον άνω θάλαμο. Ταυτόχρονα, 0.5 mL ϋΜΕΜ συμπληρωμένου με 10% FBS προστέθηκε στο κάτω διαμέρισμα, και οι πλάκες Transwell που περιέχει επωάστηκαν για 18 ώρες σε ένα 5% CO

2 ατμόσφαιρα κορεσμένη με H

2O. Στο τέλος της επώασης, τα κύτταρα που είχαν εισέλθει στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης φίλτρου (κύτταρα διακινούμενοι) σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου? τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με αποσταγμένο νερό και χρωματίστηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες επί 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα που παραμένουν στην άνω επιφάνεια της μεμβράνης φίλτρου (μη διακινούμενο) ήπια ξύνεται με μια μπατονέτα. Εικόνες των μεταναστών κυττάρων συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φωτομικροσκόπιο (BX51, Όλυμπος, Ιαπωνία). Η μετανάστευση των κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε με τυφλή καταμέτρηση των κυττάρων μετανάστευσαν στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης? πέντε πεδία μετρήθηκαν ανά θάλαμο.

κυτταρικής απόπτωσης

δοκιμασία

Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση με ncRNA, προ-miR-203, ή siRNA, κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υπεροξείδιο του υδρογόνου 200 μΜ ( H

2O

2) επί 30 λεπτά για να επάγει απόπτωση. Σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή του FITC-αννεξίνης V Apoptosis Detection Kit Ι (BD Biosciences), τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS και επαναιωρήθηκαν σε 1 χ ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης σε συγκέντρωση 1 × 10

6 κύτταρα /mL . Κύτταρα (1 χ 10

5 κύτταρα) μεταφέρθηκαν σε ένα σωλήνα καλλιέργειας mL 5, και προστέθηκαν FITC-Annexin V και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ). Τα κύτταρα επωάστηκαν για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (BD Biosciences) μέσα σε 1 ώρα της χρώσης.

Στατιστική ανάλυση

Όλες οι φωτογραφίες των Western blots, κύτταρο δοκιμασίες απόπτωσης, και προσδιορισμούς μετανάστευσης ήταν αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Τα δεδομένα δείχνονται παρουσιάζονται ως η μέση τιμή τυπικής απόκλισης ± (S.D.).

t

δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για συγκρίσεις, και

σ

αξία των **

σ

*,

σ

**

σ

& lt? 0,01). Β, αντιπροσωπευτικών εικόνων από Transwell ανάλυση των κυττάρων Α549 που διαμολύνθηκαν με ncRNA, προ-miR-203, προ-miR-203 συν το πλασμίδιο ΡΚΟα υπερέκφραση, ή ΡΚΟα πλασμίδιο υπερέκφραση μόνο, δείχνονται στο άνω πάνελ, και μια στατιστική ανάλυση είναι εμφανίζεται στο κάτω πίνακα (μέση τιμή ± SD? **

σ

& lt? 0,01).

η

Συζήτηση

Εκτός από τον καρκίνο του πνεύμονα, ΡΚΟα είναι επίσης ένα κρίσιμος παράγοντας σε πολλές άλλες μορφές καρκίνου. Έχει βρεθεί ότι ΡΚΟα, δ, και ι ήταν σημαντικά πιο πλούσια σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) ιστούς σε σύγκριση με τους ιστούς του ήπατος μη-όγκου [32]. ανάλυση Η ανοσοϊστοχημεία επιβεβαίωσε ότι πάνω από το κανονικό επίπεδα ΡΚΟα μπορεί να βρεθεί στο ανθρώπινο HCC [33,34]. Όταν ΡΚΟα εισήχθη εντός του MCF-7 κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού, κυτταρική μετανάστευση και εισβολή αυξημένη [35]. Έχει αναφερθεί ότι η θεραπεία SK-Hep-1 HCC με αντιπληροφοριακό ΡΚΟα κατέστειλε σημαντικά την κυτταρική ανάπτυξη, μετανάστευση κυττάρου και εισβολή [36]. Τα ίδια αποτελέσματα αναπαράγεται χρησιμοποιώντας το Go6976 αναστολέα ΡΚΟα /β, το οποίο ήταν σε θέση να αναστέλλει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή στα φτωχά διαφοροποιημένα κύτταρα HCC. Αυτά τα πειράματα πρότειναν ότι ΡΚΟα είναι μια πρακτική κατεύθυνση έρευνας για την κατανόηση της ανάπτυξης του καρκίνου.

miR-203 αναφέρθηκε για να ενεργεί ως ένας όγκος-κατασταλτική microRNA, και η έκφρασή του ρυθμίζεται προς τα κάτω σε κύτταρα καρκινώματος του λάρυγγα [37]. Μελέτες από μια άλλη ομάδα έδειξε ότι η έκφραση του miR-203 ήταν μειωτικά στο LNCaP, Du145, PC3, vcap, και ο καρκίνος του MDA-PCA-2b προστάτη κυτταρικές γραμμές [38]. Βρήκαμε ότι η έκφραση του miR-203 σε καρκινικούς ιστούς πνεύμονα ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη των γειτονικών φυσιολογικών ιστών. Έχει επίσης δειχθεί ότι οι λειτουργίες miR-203 σε διάφορους καρκίνους. Η έκτοπη έκφραση του miR-203 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη θα μπορούσε να επηρεάσει τον πολλαπλασιασμό, απόπτωση, και τη μετανάστευση [38,39], ενώ η υπερέκφραση του miR-203 σε κύτταρα καρκινώματος του λάρυγγα μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων και οδήγησε σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε φάση G1 [37].