Αφηρημένο

Η επιφάνεια των κυττάρων πρωτεϊνών CD133, CD24 και CD44 είναι υποθετικό δείκτες για τους πληθυσμούς των κυττάρων του καρκίνου βλαστικών στον καρκίνο του παχέος εντέρου, που συνδέονται με την επιθετική τους τύπους καρκίνου και κακή πρόγνωση. Είναι σημαντικό να κατανοήσουμε πώς αυτοί οι δείκτες μπορεί να προβλέψει τα αποτελέσματα της θεραπείας, που καθορίζεται από παράγοντες όπως ραδιοαντοχή. Το πεδίο εφαρμογής της παρούσας μελέτης ήταν να αξιολογηθεί η σχέση μεταξύ του EGFR, CD133, CD24 και CD44 (συμπεριλαμβανομένων των ισομορφών) επίπεδα έκφρασης και την ευαισθησία ακτινοβολίας, και, επιπλέον, να αναλύσει την επίδραση των ισομορφών AKT σχετικά με τα πρότυπα έκφρασης αυτών των δεικτών, για την καλύτερη κατανόηση της υποκείμενης μοριακών μηχανισμών στο κύτταρο. Τρεις καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν, ΗΤ-29, DLD-1, και HCT116, μαζί με DLD-1 ισογονιδιακές

ΑΚΤ

knock-out κυτταρικές σειρές. Και οι τρεις κυτταρικές σειρές (ΗΤ-29, HCT116 και DLD-1) που εκφράζονται ποικίλες ποσότητες CD133, CD24 και CD44 και την κορυφή δέκα τοις εκατό του CD133 και CD44 κυττάρων που εκφράζουν (CD133

υψηλή /CD44

υψηλή) ήταν πιο ανθεκτικά στην ακτινοβολία γάμμα από το δέκα τοις εκατό με χαμηλότερη έκφραση (CD133

χαμηλή /CD44

χαμηλή). Η έκφραση AKT ήταν χαμηλότερη στο κλάσμα των κυττάρων με χαμηλή CD133 /CD44. Εξάντληση των ΑΚΤ1 ή ΑΚΤ2 χρησιμοποιώντας νοκ άουτ κύτταρα έδειξαν για πρώτη φορά ότι η έκφραση CD133 συσχετίστηκε με ΑΚΤ1 αλλά όχι ΑΚΤ2, ενώ η έκφραση CD44 επηρεάστηκε από την παρουσία είτε ΑΚΤ1 ή ΑΚΤ2. Υπήρχαν πολλά γονίδια στο μονοπάτι κυτταρικής προσκόλλησης που είχαν σημαντικά υψηλότερη έκφραση στο

ΑΚΤ

2 KO κυτταρική γραμμή σε σύγκριση με το

ΑΚΤ

1 KO κυτταρική γραμμή? Ωστόσο, σημαντικά γονίδια στο επιθηλιακά να μεσεγχυματικά μετάβαση οδό (

Cdh1

,

VIM, TWIST1, SNAI1, SNAI2, ZEB1, ZEB2, FN1, FOXC2

και

CDH2)

έκανε δεν διαφέρουν. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι CD133

υψηλή /CD44

υψηλής έκφρασης τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου συνδέονται με ΑΚΤ και αυξημένη αντίσταση ακτινοβολίας, και ότι διαφορετικές ΑΚΤ ισομορφές έχουν ποικίλες επιπτώσεις στην έκφραση των δεικτών του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων, η οποία είναι ένα σημαντικό στοιχείο κατά τη στόχευση ΑΚΤ σε ένα κλινικό περιβάλλον

Παράθεση:. Sahlberg SH, Spiegelberg D, Glimelius Β, Stenerlöw Β, Νέστωρ Μ (2014) Αξιολόγηση του καρκίνου Stem Cell Μαρκαδόροι CD133, CD44, CD24: σύνδεσης με την ΑΚΤ ισομορφές και Αντίσταση ακτινοβολίας στον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. PLoS ONE 9 (4): e94621. doi: 10.1371 /journal.pone.0094621

Συντάκτης: Andrew Yeudall, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15 Σεπτεμβρίου 2013? Αποδεκτές: 19 Μάρτη 2014? Δημοσιεύθηκε: 23, Απρ, 2014

Copyright: © 2014 Sahlberg et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο έχει χρηματοδοτηθεί από επιχορηγήσεις από τη σουηδική Εταιρεία Καρκίνου, www.cancerfonden.se. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθειες διαγνωστεί στον κόσμο. Αρκετές μελέτες έχουν εντοπίσει υποπληθυσμών του ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα που είναι πιο ανθεκτικά σε θεραπείες καρκίνου, όπως χημειοθεραπευτικά και ακτινοβολία [1], [2]. Η επιτυχής θεραπεία εξαρτάται από την εξάλειψη αυτών των ιδιαίτερα ανθεκτικά υποπληθυσμών, και όχι μόνο η κύρια μάζα του όγκου. Αυτά τα κύτταρα συχνά αναφέρονται ως καρκινικά βλαστικά κύτταρα ή ογκογενή κύτταρα, και αρκετούς δείκτες κυτταρικής επιφάνειας έχει δειχθεί ότι εκφράζεται σε αυτούς τους πληθυσμούς κυττάρων [3]. CD133, CD44 και CD24 είναι τρεις δείκτες προτεινόμενη βλαστικών κυττάρων σε καρκίνο του παχέος εντέρου, αλλά αποθαρρυντικά η κατανομή διαφέρει μεταξύ των ασθενών και κυτταρικές γραμμές όγκου [4]. Ως εκ τούτου, έχει μεγάλο ενδιαφέρον για την κατανόηση της λειτουργίας τους και το πώς οι βιοδείκτες αλληλεπιδρούν μεταξύ τους.

CD24 είναι μια πρωτεΐνη κυτταρικής επιφάνειας, το οποίο είναι αγκυροβολημένο στην εξωτερική πλευρά της μεμβράνης πλάσματος. Θεωρείται ότι έχει έναν ουσιαστικό ρόλο στην κυτταρική διαφοροποίηση, και εκφράζεται επίσης σε κύτταρα που εμπλέκονται στο ανοσοποιητικό σύστημα, όπως Β-λεμφοκύτταρα, όπου ρυθμίζει θετικά τον πολλαπλασιασμό των ενεργοποιημένων Τ κυττάρων. έκφραση CD24 περιγράφεται επίσης στο κεντρικό νευρικό σύστημα [5]. Η κατανομή σε καρκίνο του παχέος εντέρου είναι υπό αμφισβήτηση, αν και προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι μεταξύ 50 και 68% των ασθενών που υποφέρουν από ορθοκολικό καρκίνους εξέφρασε CD24 σε υψηλό βαθμό [5], [6], και περαιτέρω ότι CD24 θετικά υποπληθυσμών από καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρο -lines κατέχουν βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με ιδιότητες [7]. Σε αντίθεση, καρκινικά κύτταρα έναρξης από τον καρκίνο του μαστού κεφαλής και του λαιμού και έχουν δειχθεί ότι είναι CD24 αρνητικός [8], [9].

CD133 (ονομάζεται επίσης προμινίνη-1) πιστεύεται ότι σχετίζεται με ογκογονικότητα και εξέλιξη της νόσου. Η αυξητική ρύθμιση του CD133 σε καρκίνο του παχέος εντέρου συσχετίζεται έντονα με κακή πρόγνωση και μετάσταση στο ήπαρ σύγχρονη [10], αν και ο ακριβής ρόλος και η λειτουργία του CD133 είναι άγνωστη.

CD44 έχει ένα ρόλο στην διευκόλυνση της κύτταρο σε κύτταρο και κυττάρου-μήτρας μέσω συγγένειά του για το υαλουρονικό οξύ και εμπλέκεται στη κύτταρο-πρόσφυση και τη συναρμολόγηση των αυξητικών παραγόντων στην κυτταρική επιφάνεια. CD44 κωδικοποιείται από ένα μόνο γονίδιο, συμπεριλαμβανομένων 20 εξόνια. Το τυποποιημένο έντυπο (που αναφέρεται ως CD44s) αποτελείται από το εξόνιο 1-5 και 15-20. Οι μεταβλητές εξόνια προσδιορίζονται ως v1-v10, αντίστοιχα. Η διαφορική χρησιμοποίηση της παραλλαγής εξώνια 10 παράγει πολλαπλές παραλλαγές CD44 (CD44v) με διαφορετικούς συνδυασμούς προϊόντων παραλλαγής εξονίου. Διάφορες ισομορφές του CD44 προκύπτουν με ένθεση ενός ή περισσοτέρων από τα εξώνια παραλλαγής στην κοινή ραχοκοκαλιά μοιράζονται όλες τις μορφές της CD44. Ο ρόλος αυτών των ισομορφών παραλλαγής δεν είναι πλήρως κατανοητός, αν και μερικοί πιστεύεται ότι μεσολαβεί ένα κρίσιμο βήμα στην μετάσταση καρκίνου κόλον [8], [11], [12]. CD44 μπορεί να συν-ανοσοκαταβυθίζεται με την οικογένεια των κινασών τυροσίνης υποδοχέα ErbB όπως ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και αλληλεπιδρά επίσης με HER2, HER3 και HER4 [8], [13]. EGFR πιστεύεται ότι παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση και τη διατήρηση των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου, κυρίως μέσω κατάντη σηματοδότηση μέσω του Phospho-ινοσιτόλη 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) /ΑΚΤ οδός [14], [15].

ΑΚΤ είναι μια κινάση σερίνης /θρεονίνης με τρεις διαφορετικές ισομορφές, ΑΚΤ1, ΑΚΤ2 και ΑΚΤ3, που εκφράζεται από τρία ξεχωριστά γονίδια και ενεργοποιούνται από πολλά ερεθίσματα, όπως διάφοροι υποδοχείς του αυξητικού παράγοντα (για παράδειγμα EGFR), υποδοχείς κυττάρων Β και Τ. Έχει ένα κεντρικό ρόλο σε πολλές κυτταρικές λειτουργίες υπεύθυνο για τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, την ανάπτυξη, αντι-απόπτωση, πρόσληψη γλυκόζης, του μεταβολισμού, της αγγειογένεσης και ραδιοαντοχή [16]. ΑΚΤ πιστεύεται επίσης ότι εμπλέκεται στην επιθηλιακή προς μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) μονοπάτι το οποίο οδηγεί σε αυξημένη κινητικότητα, μειωμένη διακυτταρική προσκόλληση, την εξέλιξη του όγκου και κακοήθη μετασχηματισμό. Η οδός ΕΜΤ είναι επομένως εμπλέκονται σε καρκινικές κυτταρικές εισβολή και τη μετάσταση [17]. Επαγωγείς του EMT, όπως συνδετήρες υποδοχέα τυροσίνης κινάσης ή τον αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού βήτα (ΤΟΡβ), Wnt και Notch, πυροδοτεί μια σειρά κυττάρου-σηματοδότηση η οποία οδηγεί στην καταστολή της κυτταρικής πρόσφυσης πρωτεΐνη Ε-καδερίνης. Η διαδικασία περιλαμβάνει τα πάνω ρύθμιση της άμεσης δράσης μεταγραφικοί καταστολείς όπως σαλιγκάρι, Slug, Forkhead κουτί C2 και Zeb1, Zeb2 καθώς Twist και Ε47 που καταστέλλουν έμμεσα Ε-καδερίνης. Άλλοι δείκτες του ΕΜΤ είναι Ν cadherin, βιμεντίνη και φιμπρονεκτίνη-1 τα οποία εκφράζονται σε μεσεγχυματικά κύτταρα [18]. EMT έχει επίσης αποδειχθεί ότι εμπλέκεται σε καρκινικά βλαστικά κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, όπου κύτταρα με υψηλή έκφραση του CD133 /CD44 έδειξε ΕΜΤ μετά από μακροχρόνια καλλιέργεια [18], [19].

ΑΚΤ έχει προταθεί για να συν-εκφράζεται με CD133, παρέχοντας την έκφραση κυτταρικού πληθυσμού CD133 με υψηλότερη αντίσταση σε χημειοθεραπευτικά, αλλά οι λεπτομέρειες σχετικά με αυτή την αλληλεπίδραση δεν είναι γνωστές [20], [21]. CD44 πιστεύεται ότι συσχετίζονται αρνητικά με ΑΚΤ [22]. Ωστόσο, αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η ΑΚΤ είναι αντί φωσφορυλιωμένη όταν διέγερσης CD44 με συνδέτη, προκαλώντας ένα αποτέλεσμα κυτταρικής επιβίωσης [23] – [25], και είναι πιθανό ότι CD44 ισομορφές έχουν ένα ρυθμιστικό ρόλο είναι σε θέση τόσο την ενεργοποίηση και την καταστολή της ενεργοποίησης της ΑΚΤ. ίδια Ακτινοβολία έχει επίσης δειχθεί ότι αυξάνει την έκφραση του ΑΚΤ, CD133, και να μειώσει την έκφραση του CD44 σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα [26]. Ωστόσο, η σημασία των διαφόρων ισομορφών ΑΚΤ στην CD133 ή έκφραση CD44 δεν έχει προηγουμένως μελετηθεί.

Πρόσφατα δείξαμε ότι τόσο ΑΚΤ1 και ΑΚΤ2 είναι σημαντικοί στην απόκριση σε ακτινοβολία [27]. Χτύπημα-out είτε

ΑΚΤ

1 ή

ΑΚΤ

2, ή και τα δύο ταυτόχρονα, αύξησε την ευαισθησία ακτινοβολίας και του ρυθμού επανασύνδεση διπλή έλικα του DNA ήταν μειωμένη στο

AKT

1 /2 KO κυτταρική σειρά. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε τις διαφορές στα πρότυπα έκφρασης του CD133, CD24, CD44 και EGFR σε τρεις καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές? ΗΤ-29, HCT116 και DLD-1. Έχουμε αναλύσει επίσης την ευαισθησία ακτινοβολίας των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου ταξινομηθεί για CD133

υψηλή /CD44

υψηλή και CD133

χαμηλή /CD44

χαμηλή έκφραση, και διερευνήθηκε περαιτέρω την επιρροή των δύο ισομορφών ΑΚΤ (ΑΚΤ1 , ΑΚΤ2) για CD133 και την έκφραση CD44, συμπεριλαμβανομένων των ισομορφών παραλλαγή CD44 ματίσματος. ΑΚΤ3 δεν εκφράζεται στις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν, και ως εκ τούτου αποκλείεται. Επιπλέον, θα επικυρωθεί η επίδραση της ΑΚΤ στη γονιδιακή έκφραση σε μια μεγάλης κλίμακας transcriptomic ανάλυση των πολλαπλών μονοπατιών.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Η σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου γραμμές ΗΤ-29 και HCT116 αποκτήθηκαν από το The American Tissue Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA), αριθμοί καταλόγου ATCC CCL-221 και ATCC CCL-247, αντίστοιχα. DLD-1 X-MAN ισογονιδιακές κυτταρικές σειρές ελήφθησαν από Horizon Discovery Ltd με τις διαφορετικές ισομορφές ΑΚΤ γενετικά νοκ-out, αριθμός καταλόγου HD-R00-001, HD-R00-002 και HD-R00-003. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 75 cm

2 φιάλες καλλιέργειας (Nunclon επιφάνεια, Roskilde, Denmark) σε μέσο McCoy 5Α (Flow Irvine, UK) με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Sigma Aldrich, St. Louis, USA), 2 mM L-γλουταμίνη, 100IU /ml πενικιλίνη και 10 μg /ml στρεπτομυκίνη (Biochrom Kg, Βερολίνο, Γερμανία). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2 στους 37 ° C και επεξεργασία με θρυψίνη με θρυψίνη-ΕϋΤΑ, 0,25% θρυψίνη, 0,02% EDTA (Biochrom Kg, Βερολίνο, Γερμανία).

Κυττάρων Ταξινόμηση με κυτταρομετρία ροής

Για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής οι κυτταρικές σειρές συλλέχθηκαν με τη χρήση μη-ενζυματική λύση των κυττάρων διαστάσεως (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) ή 0,25% θρυψίνη, 0,02% EDTA, (Biochrom Kg , Βερολίνο, Γερμανία). Μετά την επαναιώρηση των κυττάρων σε μέσο κυτταρικής καλλιέργειας, τα κύτταρα μετρήθηκαν και πλύθηκαν σε PBS με 0.5% BSA και συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 10 έως 30 λεπτά με τα επισημασμένα αντισώματα, βλέπε Πίνακα 1. Μετά το αντίσωμα επισήμανσης τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS με 0.5% BSA, πριν διεξήχθη ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε επί Sorp BD LSRII (Becton Dickinson Biosciences, San Jose, ΗΠΑ). Πεθαίνοντας και τα νεκρά κύτταρα βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο και αποκλείστηκαν από την ανάλυση. Αντίγραφα και τα νεκρά κύτταρα αποκλείστηκαν επίσης από gating με FSC και SSC. Για κυττάρων-ταξινόμησης για κλωνογόνο δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε η ντίβα FACSVantage SE ή FACSAriaIII διαλογέα κυττάρων (Becton Dickinson Biosciences, San Jose, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής).

Ήταν προσκολλημένοι

κυτταρικού κύκλου Ανάλυση

Cells με 70% αιθανόλη, 30% PBS και φυλάσσονται σε -20 ° C για τουλάχιστον 24 ώρες. Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά, 2000G σε 4 ° C και πλύθηκε δύο φορές με PBS πριν από την επώαση με 5 μg προπίδιο ιωδίου /0.1% ΝΡ-40 (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) σε PBS μαζί με 5 μg RNase (Sigma Aldrich , St. Louis, USA) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η ανάλυση έγινε με κυτταρομετρία ροής (BD LSRII Biosciences).

κλωνογονική δοκιμασία

Η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του CD133 και CD44 και την ευαισθησία ακτινοβολίας αξιολογήθηκε από τη διαλογή και τη συλλογή CD133

υψηλή /CD44

υψηλή και CD133

χαμηλή /CD44

εκφράζουν χαμηλά κύτταρα. Ο αριθμός των κυττάρων μετά από διαλογή προσδιορίσθηκε με ένα μετρητή κυττάρων (μετρητής κύτταρο TC20 Αυτοματοποιημένη, επιστήμη Ζωή Biorad, Hercules, CA, USA)), και ένα ορισμένο ποσό των κυττάρων ήταν προ-επιστρώνονται σε 25 cm

2 φιάλες καλλιέργειας ιστού. Την επόμενη ημέρα τα κύτταρα εκτίθενται σε εξωτερικά εφαρμοζόμενη ακτινοβολία χρησιμοποιώντας ένα

πηγή 137Cs (Best Theratronics Gammacell 40 exactor, Springfield, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Μετά από μία περίοδο χρόνο επώασης 8-14 ημερών τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS και σταθεροποιήθηκαν με 99.5% αιθανόλη για 5-10 λεπτά. Οι αποικίες βάφτηκαν με Αιματοξυλίνη Mayer του (Histolab Products AB, Västra Frölunda, Σουηδία) για 20-30 λεπτά και στην συνέχεια ξεπλένονται με νερό. Αποικίες με περισσότερα από 50 κύτταρα ανά αποικία μετρήθηκαν και η αποτελεσματικότητα επιμετάλλωση (ΡΕ = αριθμός των αποικιών σε μη κατεργασμένα κύτταρα /αριθμός κυττάρων σπάρθηκε) και το κλάσμα επιβίωσης (SF = αριθμός αποικιών σε κατεργασμένα κύτταρα /αριθμός κυττάρων σπάρθηκε × ΡΕ) υπολογίστηκαν και σχεδιάστηκαν.

Στατιστικές αναλύσεις

Η κυτταρομετρία ροής αναλύσεις αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας BD λογισμικού FACSDiva 7.0 (BD Biosciences). Η κλωνογονικού δεδομένων δοκιμασία υποβλήθηκε σε επεξεργασία με το Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft, Redmond) και γραφήματα χαράχθηκαν και αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA σε GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, USA). Χρησιμοποιήθηκε επίπεδο σημαντικότητας 95%. Αυτή η ανάλυση αξιολογήθηκε το εάν τα κλάσματα επιβίωσης των ακτινοβολούμενων CD133 και CD44 ταξινομημένα κύτταρα ήταν σημαντικά διαφορετικές η μία από την άλλη για κάθε δόση ακτινοβολίας.

Western Blot

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 3 cm δίσκους Petri επί τουλάχιστον τρεις φορές πριν διπλασιασμού lysation ή τρεις χωριστές κύτταρο-καλλιέργειες DLD-1 διαχωρίστηκαν με κυτταρομετρία ροής (βλέπε παραπάνω) και ο όγκος του ρυθμιστικού διαλύματος λύσης ρυθμίζεται με τον αριθμό των κυττάρων που συλλέγονται σε κάθε φιαλίδιο. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν μετά την αγωγή με έκπλυση των κυττάρων με παγωμένο PBS που ακολουθείται από προσθήκη 10 000 000 κύτταρα /ml ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 1% Tween-20, 20 mM Tris (ρΗ 8,0), 137 mMNaCl, 10% γλυκερόλη, 2 πιΜ EDTA, 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο ενεργοποιημένα (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) και το κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (P8340, Sigma Aldrich, St. Louis, USA) και επώαση σε πάγο για 30 λεπτά. Τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση για 10 λεπτά σε 4 ° C. Το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε νέους σωλήνες και το σφαιρίδιο απορρίφθηκε. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης του προϊόντος λύσης προσδιορίστηκε με δοκιμασία BCA πρωτείνης (Pierce). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης φορτώθηκαν σε Tris-Acetate 3-8% SDS PAGE γέλη (Life Technologies, Carlsbad, CA) και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε μία μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Millipore) με υγρή blotting. Η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης μπλοκαρίστηκε για 1 ώρα σε 5% BSA, PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C. ειδικά για CD133 /1 (W6B3C1) αντίσωμα ήταν από τη Miltenyi βιοτεχνολογίας (Χαϊδελβέργη, Γερμανία) και CD44 (103.014) από Biolegend (San Diego, CA, USA). Αντισώματα έναντι FOXO3a (2497), φωσφο-FOXO (2599) και GSK-3β (9315) και φωσφο-GSK3B (9323) ήταν όλα από την Cell Signaling Technology (Beverly, MS, USA). ΑΚΤ1 (sc55523 και ΑΚΤ2 (sc5270) ήταν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Το αντίσωμα έναντι β-ακτίνης (A5441) ήταν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, USA). Μετά την πλύση σε PBS με 1% Tween-20, η μεμβράνη επωάστηκε με δευτερογενές αντίσωμα σημασμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (626520 και 656120) (Invitrogen, Camarillo, CA, USA) ή (405405) (Biolegend, San Diego, CA, USA) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. ανοσο-αντιδραστικά ζώνες οπτικοποιήθηκαν σε μια κάμερα CCD (SuperCCD HR, Fujifilm, Japan) μετά από θεραπεία με Immobilon ηλεκτρο-χημιφωταύγειας διάλυμα (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) για 5 λεπτά.

Έκφραση Microarray Analysis

Δύο ξεχωριστές περάσματα του DLD-1 γονικής,

ΑΚΤ

1 KO,

ΑΚΤ

2 KO και

ΑΚΤ

1/2 κύτταρα ΚΟ καλλιεργήθηκαν στο 70% συρροή και RNA εκχυλίστηκε (RNeasy μίνι-prep, Qiagen, Valencia, CA, USA) συγκέντρωση RNA μετρήθηκε με ND-1000 φασματοφωτόμετρο (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) και την ποιότητα του RNA εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc, Ραίο Alto, CA). 250 νανογραμμάρια ολικού RNA από κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία ενισχυμένων και βιοτινυλιωμένο αίσθηση κλώνου cDNA από ολόκληρο το γονιδίωμα εκφράζεται σύμφωνα με την GeneChip αντιδραστηρίου PLUS WT Εγχειρίδιο Kit χρήστη (P /N 703174 Rev 1 Affymetrix Inc., Santa Clara, CA) . GeneChip ΗΤΑ Arrays (GeneChip Human μεταγραφικό Array 2.0) υβριδοποιήθηκαν για 16 ώρες σε επωαστή 45 ° C, περιστράφηκε στις 60 rpm. Σύμφωνα με την GeneChip Expression Wash, Stain και σάρωση Manual (PN 702731 Rev 3, Affymetrix Inc., Santa Clara, CA) οι συστοιχίες στη συνέχεια πλύθηκαν και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας το Σταθμό ρευστονικής 450 και τελικά σαρώνονται χρησιμοποιώντας το GeneChip Scanner 3000 7G.

Microarray Ανάλυση δεδομένων

Η ανεπεξέργαστα δεδομένα ομαλοποιήθηκε στο ελεύθερο λογισμικό Console Έκφραση παρέχονται από Affymetrix (https://www.affymetrix.com) χρησιμοποιώντας το ισχυρό μέσο multi-array μέθοδο (RMA) πρώτη προτείνεται από τον Li και Wong, το 2001 [28], [29]. Μετέπειτα ανάλυση των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης διεξήχθη στη ελεύθερα διαθέσιμα στατιστικά γλώσσα υπολογιστών R (https://www.r-project.org) χρησιμοποιώντας πακέτα που είναι διαθέσιμα από το έργο Bioconductor (www.bioconductor.org). Για να αναζητήσετε τα διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων μεταξύ των γονέων και το

ομάδες ΑΚΤ

ΚΟ μια εμπειρική Bayes μετριάστηκε t-test εφαρμόστηκε στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας το πακέτο «limma» [30]. Για την αντιμετώπιση του προβλήματος με πολλαπλές δοκιμές, οι ρ-τιμές ρυθμίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο των Benjamini και Hochberg [31]. Τα κανονικοποιημένα δεδομένα αξιολογήθηκαν περαιτέρω χρησιμοποιώντας DAVID Bioinformatic πόρων 6,7 έως μαζί με εγκυκλοπαίδεια του Κιότο γονιδίων και γονιδιωμάτων (KEGG) βάση δεδομένων οδός (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html) σε λειτουργικά ταξινόμηση και συμπλέγματος τα γονίδια που σχετίζονται σε επιθηλιακό σε μονοπάτια μεσεγχυματικά μετάβαση [32], [33].

Επιβεβαίωση

ΑΚΤ

1 και

ΑΚΤ

2 Knock-out με PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε από DLD-1 γονικής,

ΑΚΤ

1 KO,

ΑΚΤ

2 KO και

ΑΚΤ

1/2 κύτταρα KO με RNeasy μίνι κιτ (Qiagen, Valencia , CA, USA). cDNA συντέθηκε από 0.1 μg ολικού RNA με χρήση RevertAid Η Minus First Strand cDNA Synthesis Kit με τυχαίων εξαμερών εκκινητών (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ, USA) και PCR πραγματοποιήθηκε με Taq DNA Polymarese (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ, USA) με εκκινητών κατά ΑΚΤ1 (FWD: AGGCTCCCCTCAACAACTTC, rev: CTCCTCCTCCTCCTGCTTCT) ή ΑΚΤ2 (FWD: GGTGCCTCCTGCATGTCC, rev: CCTCTCGGTCTTCATCAGC)

Η επιμόλυνση με siRNA εναντίον ΑΚΤ1 στο DLD-1 γονικά κύτταρα

Τα κύτταρα. επιμολυσμένα με siAKT1 σιγαστήρα (Ambion από Life Technologies, Carlsbad, CA) με Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) (έννοια: 5 ‘GCGUGACCAUGAACGAUUtt και αντινόημα: 5’AACUCGUUCAUGGUCACGCGG). Τα επιμολυσμένα κύτταρα επωάστηκαν σε 37 ° C σε CO

2 επωαστή για 48 ώρες πριν από την ανάλυση της έκφρασης CD133, CD44 και CD24 για κυτταρομετρία ροής, βλέπε ανωτέρω.

επαναδραστηριοποίηση ΑΚΤ1 ή ΑΚΤ2 σε DLD-1

ΑΚΤ

1/2 ΚΟ κύτταρα

DLD-1

ΑΚΤ

1/2 κύτταρα ΚΟ καλλιεργούνται σε συρροή 30-50% σε αντιβιοτικά χωρίς McCoys μέσα κυττάρων (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) για 24 ώρες πριν από την επιμόλυνση. Τα κύτταρα επιμολυσμένα με pcDNA3 MYR ΗΑ ΑΚΤ1 και pcDNA3 MYR ΗΑ ΑΚΤ2 πλασμίδια ευγενώς από τον William Πωλητές (Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA) μέσω Addgene (Cambridge, ΜΑ). Lipofectamine 2000 και ΟρΙίΜΕΜ ήταν από τις τεχνολογίες Ζωής (Carlsbad, CA). Τα επιμολυσμένα κύτταρα επωάστηκαν σε 37 ° C σε CO

2 επωαστήρα για 72 ώρες πριν την περαιτέρω ανάλυση του CD133, CD44 και CD24 έκφραση με κυτταρομετρία ροής, βλέπε ανωτέρω.

Αποτελέσματα

CD133, CD44, CD24 και έκφραση EGFR στον καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές

Το CD133, CD44, CD24 και της έκφρασης EGFR σε τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής, βλέπε σχήμα 1Α. Υπήρχε μια διαφορά στην έκφραση του CD133, CD44, CD24 και EGFR ανάμεσα στις κυτταρικές σειρές. CD44 εμφανίστηκε ως ένας πληθυσμός που εκτείνεται από χαμηλή σε υψηλή έκφραση σε όλους τους τρεις κυτταρικές σειρές. Η ανίχνευση της έκφρασης CD24 εξαρτιόταν από αντι-CD24 αντίσωμα. Η υψηλότερη έκφραση του CD24 παρατηρήθηκε στις ΗΤ-29 κυττάρων με θετικά κύτταρα 95% χρησιμοποιώντας το αντίσωμα CD24 από MACS), βλέπε σχήμα 1Β. CD133 εκφράστηκε στην πλειοψηφία των HCT116 και ΗΤ-29 κύτταρα, ενώ μόνο το 14% των κυττάρων DLD-1 ήταν θετικά για CD133. Και οι τρεις κυτταρικές σειρές που εκφράζονται EGFR. Περίπου το 80% των ΗΤ-29 και HCT116 εφόσον είναι θετική για EGFR, ενώ το 40% ήταν θετικές σε DLD-1.

Α) ΗΤ-29, HCT116 και DLD-1. Τα πρότυπα έκφρασης των dotplots είναι από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα κυτταρόμετρο ροής. Το πλέγμα καταδεικνύει το περιθώριο μεταξύ υψηλών και χαμηλών έκφραση της πρωτεΐνης που ορίζεται από τους ελέγχους ισοτύπου. Β) Η έκφραση των CD24 θετικών κυττάρων στη ροή εξαρτάται κυτταρομετρία για την αντι-CD24 αντίσωμα. Ο πίνακας δείχνει το ποσοστό των CD24 θετικών κυττάρων χρησιμοποιώντας τρία διαφορετικά αντισώματα CD24.

Η

ραδιοευαισθησία του CD133

υψηλή /CD44

υψηλή και CD133

χαμηλή /CD44

χαμηλή Εκφράζοντας κύτταρα

Η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του CD133, CD44 και την ευαισθησία ακτινοβολίας αξιολογήθηκε από τη διαλογή και τη συλλογή CD133

υψηλή /CD44

υψηλή και CD133

χαμηλή /CD44

χαμηλή κύτταρα που εκφράζουν , που ακολουθείται από έκθεση σε εξωτερικά εφαρμοζόμενη ακτινοβολία γάμμα, και αναλύονται περαιτέρω με κλωνογενείς δοκιμασίες, βλέπε Εικόνα 2. Μια υψηλότερη αντίσταση στην ακτινοβολία στο CD133

υψηλή /CD44

υψηλή πληθυσμού σε σύγκριση με το CD133

χαμηλή /CD44

χαμηλή πληθυσμού παρατηρήθηκε για όλες τις κυτταρικές σειρές. Αυτές οι διαφορές ήταν στατιστικώς σημαντικές σε όλες τις δόσεις της ακτινοβολίας (2, 4 και 6 Gy) για DLD-1 κύτταρα, βλέπε Σχήμα 2C, σε 4 και 6 Gy για κύτταρα HCT116, και σε 4 Gy για κύτταρα ΗΤ-29, βλέπε Σχήμα 2Α και Β, με τιμή Ρ & lt? 0,05 (μονόδρομη ΑΝΟνΑ). Δεν υπήρχε ή μια μικρή διαφορά στην έκφραση του CD24 στην CD133

υψηλή /CD44

υψηλή και CD133

χαμηλή /CD44

χαμηλό πληθυσμό, εκτός από HCT116 όπου υπήρχαν λιγότερα θετικά κύτταρα CD24 στην το CD133

χαμηλή /CD44

χαμηλό κλάσμα. Οι αριθμοί του EGFR θετικών κυττάρων στα ταξινομημένα κλάσματα ήταν σχεδόν το διπλάσιο του CD133

υψηλή /CD44

υψηλή σε σύγκριση με το CD133

χαμηλή /CD44

χαμηλό κλάσμα σε ΗΤ-29 και DLD-1 κύτταρα ενώ σε HCT116 υπήρχε μόνο μια μικρή διαφορά στην έκφραση EGFR μεταξύ των κλασμάτων. Η ευαισθησία ακτινοβολίας για μη ταξινομημένα κύτταρα φαίνεται στο Σχήμα S1.

κλωνογονική δοκιμασία του Α) ΗΤ-29, Β) HCT116 και Γ) DLD-1 κύτταρα. Το πάνω και το κάτω μέρος 10 τοις εκατό του CD133 και CD44 κύτταρα που εκφράζουν κατατάσσονται σύμφωνα με κυτταρομετρία ροής (CD133

υψηλή /CD44

υψηλή ή CD133

χαμηλή /CD44

χαμηλή) και η ακτινοβολία ευαισθησία αναλύθηκε χρησιμοποιώντας κλωνογονική δοκιμασίες. Οι έλεγχοι των δύο κλάσματα ομαλοποιηθεί και στο 100% επιβίωση. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου από τουλάχιστον δύο ξεχωριστά πειράματα με δείγματα εις τριπλούν. Μια υψηλότερη αντίσταση στην ακτινοβολία στην CD133

υψηλή /υψηλή πληθυσμιακή CD44

σε σύγκριση με το CD133

χαμηλή /CD44

χαμηλή πληθυσμού παρατηρήθηκε για όλες τις κυτταρικές σειρές. Αυτές οι διαφορές ήταν στατιστικώς σημαντικές σε όλες τις δόσεις της ακτινοβολίας (2, 4 και 6 Gy) για DLD-1 κύτταρα (Σχήμα 2C), σε 4 και 6 Gy για κύτταρα HCT116, και σε 4 Gy για κύτταρα ΗΤ-29 (Σχήμα 2Α και Β ) με μια τιμή Ρ & lt? 0,05 (μονόδρομη ΑΝΟνΑ). Το ποσοστό των κυττάρων που είναι θετικά για EGFR, CD24 με το αντίσωμα βιοεπιστημών BD ή CD24 με Miltenyi βιοτεχνολογίας /MACS αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

Η

Η έκφραση της ΑΚΤ στην CD133

θετική /CD44

θετική και CD133

αρνητική /CDD44

αρνητικού πληθυσμού στο DLD-1

Οι διαφορετικοί πληθυσμοί του CD133

θετική /CD44

θετική, CD133

αρνητική /CD44

θετική και CD133

αρνητική /CD44

αρνητικά στα κύτταρα DLD-1 ταξινομήθηκαν, συλλέγονται και αναλύονται περαιτέρω για την έκφραση της ΑΚΤ με κηλίδα western, βλέπε Εικόνα 3Α και Β Η έκφραση της συνολικής AKT ήταν χαμηλότερη στην CD133

αρνητική /CD44

αρνητικού πληθυσμού, σε σύγκριση με τον πληθυσμό θετικό για CD44 και /ή CD133. Παρόμοιο μοτίβο παρατηρήθηκε για ΑΚΤ1 και ΑΚΤ2, βλέπε Εικόνα 3Β.

Α) DLD-1 κύτταρα διαχωρίστηκαν με κυτταρομετρία ροής και διαφορετικούς πληθυσμούς με CD44

θετική /CD133

αρνητικό (Q1), CD44

θετική /CD133

θετικό (Q2), CD44

negativeCD133

αρνητικό (Q3), συλλέχθηκαν. Β) Τα ταξινομημένα κύτταρα αναλύθηκαν περαιτέρω με Western Blot για τη συνολική ΑΚΤ, ΑΚΤ1 ή ΑΚΤ2 και betaactin έκφρασης.

Η

Επίδραση της ΑΚΤ Ισομορφών στην έκφραση του CD24, CD133 και CD44

δεδομένου ότι η έκφραση της ΑΚΤ ήταν διαφορετική στην ταξινομημένη CD133

θετική /CD44

positiveand CD133

αρνητική /CD44

αρνητικών πληθυσμών, η επιρροή των ισομορφών ΑΚΤ αξιολογήθηκε με τη χρήση του καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή DLD-1 και η

ΑΚΤ

1,

ΑΚΤ

2 και

ΑΚΤ

1/2 ισογονιδιακές knock-out κυτταρικές γραμμές, βλέπε Εικόνα 3AB, και την επιβεβαίωση των νοκ-άουτ στην εικόνα S2. Η μέση ένταση φθορισμού (MFI) της έκφρασης CD44 αυξήθηκε από 100% σε γονική στο 150% το

ΑΚΤ

1 KO και

ΑΚΤ

2 KO και 250% σε

ΑΚΤ

1/2 KO κυτταρική σειρά, βλέπε Εικόνα 4Α και Β Επιπλέον, η έκφραση CD133 μειώθηκε κατά ΑΚΤ1 χτυπήθηκε-out, όπως φαίνεται στο

ΑΚΤ

1 KO, καθώς και στο

AKT

1/2 KO κυτταρική σειρά. Ωστόσο, μόνο νοκ-άουτ του

ΑΚΤ

2 όπως φαίνεται στο

ΑΚΤ

2 KO κυτταρική σειρά δεν μειώνει το επίπεδο της CD133, βλέπε Εικόνα 4Α. Η έκφραση CD24 καταργήθηκε πλήρως στο

ΑΚΤ

1/2 ΚΟ, αλλά αυξήθηκε στην ενιαία

ΑΚΤ

1 ή

ΑΚΤ

2 KO κυτταρικές γραμμές βλέπε Εικόνα 4C. Η επίδραση των ισομορφών ΑΚΤ στην έκφραση του CD24, CD133 και CD24 περαιτέρω επαληθεύονται με siRNA κατά ΑΚΤ1 και με επανεισαγωγή ΑΚΤ1 ή ΑΚΤ2 στο DLD-1

ΑΚΤ

1/2 KO κυτταρική γραμμή, βλέπε σχήματα S3 και S4. Επιπλέον, επιβεβαιώσαμε ότι δεν υπήρχε διαφορά στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου μεταξύ των κυτταρικών γραμμών, βλέπε Σχήμα 4D.

α) σε γονικά κύτταρα, περίπου το 10% των κυττάρων ήταν θετικά κύτταρα CD133. Ωστόσο, η

ΑΚΤ

1 και

ΑΚΤ

1/2 νοκ-άουτ, τα θετικά κύτταρα CD133 μειώθηκαν σε 0,3 και 0,1% αντίστοιχα. Αυτό δεν παρατηρήθηκε σε

ΑΚΤ

2 knock-out κυτταρική γραμμή, όπου το 33% των κυττάρων ήταν θετικά για CD133. Β) Η μέση ένταση φθορισμού των CD44 ομαλοποιούνται στη DLD-1 γονική κυτταρική σειρά αυξήθηκε σε 150% το

ΑΚΤ

1 KO, 160% στο

ΑΚΤ

2 KO και 300% σε

ΑΚΤ

1/2 KO κυτταρική σειρά. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση (SD) από τουλάχιστον δύο πειράματα. Γ) Το ποσοστό των CD24 θετικών κυττάρων που αναλύθηκαν με δύο διαφορετικά αντισώματα CD24 από την BD Biosciences και Miltenyi /MACS στην κυτταρομετρία ροής. Οι τυπικές αποκλίσεις είναι από την επαναλαμβανόμενη πειράματα. Δ) κατανομή του κυτταρικού κύκλου σε DLD 1-γονική,

ΑΚΤ

1 KO,

ΑΚΤ

2 KO και

ΑΚΤ

1/2 κύτταρα ΚΟ.

Επίδραση της ΑΚΤ Ισομορφές στην έκφραση του CD44 Variant Ισομορφές

Η πλειοψηφία (98-100%), από DLD-1, HCT116 και ΗΤ-29 κύτταρα ήταν θετικά για CD44, που ανιχνεύεται με ένα αντίσωμα το οποίο ανιχνεύει όλες τις παραλλαγές της CD44. Το πρότυπο έκφρασης του CD44 παραλλαγή ισομορφών V3, V4 /5, v6, V7 και V7 /8 ερευνήθηκαν περαιτέρω στο DLD-1 γονικής και

ΑΚΤ

1/2 KO κυτταρικές γραμμές βλέπε Πίνακα 2. Μόνο τα μικρά ποσότητες (~1-6%) των κυττάρων ήταν θετικά για τις ισομορφές CD44 παραλλαγής (έκφραση σε ένα ενιαίο, ζωντανά κύτταρα), και χωρίς σημαντικές αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης μεταξύ ΑΚΤ καλά και με ανεπάρκεια κυτταρικές σειρές DLD-1. Στην περίπτωση της CD44v7, η οποία είχε ένα υψηλότερο ανιχνεύσιμο επίπεδο, η έκφραση ήταν ελαφρώς μειωμένη σε το

ΑΚΤ

1/2 κύτταρα ΚΟ σε σύγκριση με τη γονική.

Η

Βιοχημικές Αναλύσεις DLD- ανάλυση 1

ΑΚΤ

Knock Out κυτταρικές γραμμές

Western blot αξιολογηθεί περαιτέρω η πρωτεΐνη έκφραση CD133 και CD44 καθώς και Fox0 και ΟδΚ3β και την επιρροή τους από ισομορφές ΑΚΤ. Η έκφραση του CD44 ήταν ρυθμισμένη στο

ΑΚΤ

1 KO,

ΑΚΤ

2 KO και

ΑΚΤ

1/2 KO κυτταρικές γραμμές σε σύγκριση με τη γονική και την CD133 έκφραση μειώθηκε στο

ΑΚΤ

1 KO και

ΑΚΤ

1/2 KO κυτταρικές γραμμές, αλλά όχι στο

ΑΚΤ

2 KO κυτταρική σειρά, όπως φαίνεται στη ροή ανάλυση κυτταρομετρίας. Η

ΑΚΤ

1, Α

KT

2 και

ΑΚΤ

1/2 KO κυτταρικές σειρές είχαν μειωμένη έκφραση των φωσφορυλιωμένη Fox01 και FOX03a καθώς και μειωμένη έκφραση στην συνολικής FOX03a στο

ΑΚΤ

1/2 KO κυτταρική σειρά. Ωστόσο, δεν υπήρχαν διαφορές στην έκφραση των φωσφορυλιωμένη (S9) ή ολική ΟδΚ3β μεταξύ του

ΑΚΤ

KO κυτταρικές γραμμές, βλέπε Εικόνα 5Α.

Α) Πρωτεΐνη έκφραση του CD44, CD133, φωσφο-FOXO, ολική FOX03a, φωσφο-ΟδΚ3β και συνολική ΟδΚ3β από την ανάλυση κηλίδος western. Β) Η γονιδιακή έκφραση, προς τα πάνω ρύθμιση (+), ρύθμιση προς τα κάτω (-) ή δεν έχει αλλάξει (NC), του CD44, CD24, CD133, FOX01, FOX03, FOX04, ΟδΚ3β και LYN στο DLD-1

ΑΚΤ

1 KO,

ΑΚΤ

2 KO ή

ΑΚΤ

1/2 κύτταρα ΚΟ σε σύγκριση με DLD-1 γονικών κυττάρων.

Η

Οι διαφορές στην έκφραση γονιδίων σε οι DLD-1 ΑΚΤ ισομορφές Knock-out κυτταρικές σειρές

ανάλυση γονιδιακής έκφρασης διεξήχθη για να διερευνήσει περαιτέρω τις διαφορές μεταξύ των ισογενετικών

ΑΚΤ

ισομορφή knock-out κυτταρικές σειρές βλέπε Εικόνα 5Β. Γονίδια θεωρήθηκαν σημαντικά άνω ή κάτω ρυθμίζονται με αναλογίες ≥ 1,5 φορές και με p & lt? 0,05. Το νοκ-άουτ από το

ΑΚΤ

1 και

ΑΚΤ

2 ισομορφές επιβεβαιώθηκε στις κυτταρικές σειρές DLD-1 και η έκφραση του γονιδίου του CD44 και CD133 επιβεβαιωμένα αποτελέσματα από την κυτταρομετρία ροής και τη δυτική ανάλυση κηλίδος. CD44 ήταν ρυθμισμένη στο

ΑΚΤ

1,

ΑΚΤ

2 και

ΑΚΤ

1/2 KO κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με γονική κυτταρική γραμμή και CD133 ήταν ανάντη ρυθμίζεται σε

ΑΚΤ

2 KO αλλά κάτω-ρυθμίζονται σε

ΑΚΤ

1 και

ΑΚΤ

1/2 KO κυτταρικών σειρών. Η έκφραση CD24 ήταν χαμηλότερη στο

ΑΚΤ

1/2 KO κυτταρική γραμμή σε σχέση με τη γονική όμως? δεν υπήρχε διαφορά στα

ΑΚΤ

1 ή

ΑΚΤ

2 KO κυτταρικών σειρών. FOXO1 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω στο

ΑΚΤ

1 KO και

ΑΚΤ

1/2 KO κυτταρική γραμμή, ενώ FOXO3 ήταν μόνο up-ρυθμίζεται ενιαία

ΑΚΤ

1 KO και

ΑΚΤ

2 KO κυτταρικών σειρών. Δεν υπήρχε διαφορά σε έκφραση FOXO4 ανάμεσα στις κυτταρικές σειρές. LYN ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω μόνο στο

ΑΚΤ

1/2 KO ωστόσο, δεν υπήρχε διαφορά στην έκφραση των ΟδΚ3β μεταξύ των κυτταρικών γραμμών, βλέπε Εικόνα 5Β.

Αξιολόγηση των διαφορών σε επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά, Notch, Wnt και κυτταρικής προσκόλλησης Διάδρομοι επικοινωνίας μεταξύ

ΑΚΤ

2 KO και

ΑΚΤ

1 KO κυτταρικές γραμμές

Ένας δείκτης για επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT ) είναι η μείωση της κυτταρικής συγκόλλησης. Υπήρχαν πολλά γονίδια στο μονοπάτι κυτταρικής προσκόλλησης (

CLDN1, ITGB8, NEO1

και

PVRL3

) που είχαν σημαντικά υψηλότερη έκφραση στο

ΑΚΤ

2 KO κυτταρική σειρά σύγκριση στο

ΑΚΤ

1 KO κυτταρική σειρά. Επιπλέον, η επαγωγή του ΕΜΤ περιλαμβάνει Notch και Wnt και κινάσης τυροσίνης υποδοχέων.