Αφηρημένο

Η ιντερλευκίνη (IL) -20 είναι ένα προφλεγμονωδών κυτοκινών στην IL-10 οικογένεια. IL-20 συνδέεται με την προαγωγή όγκων στην παθογένεση του στόματος, της ουροδόχου κύστης, και του καρκίνου του μαστού. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με το ρόλο της IL-20 στον καρκίνο του προστάτη. Υποθέτουμε ότι η IL-20 προάγει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Ανοσοϊστοχημική χρώση έδειξαν ότι η IL-20 και των υποδοχέων του εκφράστηκαν σε ανθρώπινο PC-3 και LNCaP καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές και σε ιστό όγκου του προστάτη από 40 ασθενείς.

In vitro

, IL-20 προς τα πάνω ρυθμισμένη Ν-cadherin, STAT3, βιμεντίνη, ινονεκτίνη, RANKL, καθεψίνη G, και καθεψίνη Κ, και αύξησε την μετανάστευση και την αποικία σχηματισμό των καρκινικών κυττάρων του προστάτη μέσω ενεργοποιημένων ρ38, ERK1 /2 , τα σήματα ΑΚΤ, και ΝΡ-κΒ σε κύτταρα PC-3. Ερευνήσαμε τις επιδράσεις της αντι IL-20-αντίσωμα 7Ε μονοκλωνικού στην ανάπτυξη του όγκου του προστάτη

in vivo

χρησιμοποιώντας SCID υποδόριας ποντίκι και intratibial μοντέλα ξενομοσχεύματος όγκου.

In vivo

, 7Ε μειωμένη ανάπτυξη του όγκου, καταστέλλεται όγκου με τη μεσολάβηση οστεόλυση, και προστατεύεται οστική πυκνότητα μετά intratibial έγχυση καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η IL-20 εμπλέκεται στην κυτταρική μετανάστευση, σχηματισμό αποικιών, και οστεόλυση του καρκίνου του προστάτη. Ως εκ τούτου, η IL-20 μπορεί να είναι ένα μυθιστόρημα στόχο για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη

Παράθεση:. Hsu YH, Wu CY, Hsing CH, Lai WT, Wu LW, Chang MS (2015) Αντι-IL-20 μονοκλωνικό αντίσωμα καταστέλλει τον καρκίνο του προστάτη Ανάπτυξης και οστεόλυση των οστών σε μοντέλα ποντικών. PLoS ONE 10 (10): e0139871. doi: 10.1371 /journal.pone.0139871

Επιμέλεια: Dominique Heymann, Faculté de Ιατρικής de Nantes, Γαλλία

Ελήφθη: May 12, 2015? Αποδεκτές: 16 του Σεπτέμβρη του 2015? Δημοσιεύθηκε: 6 Οκτωβρίου, 2015

Copyright: © 2015 Hsu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας της Ταϊβάν (MOST 103 – 2.311-B-006-002 και οι περισσότεροι 104-2311-B-006-007 -MY2)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η δεύτερη πιο καρκίνο του περιστατικού και η έκτη αιτία του καρκίνου. θανάτου στους άνδρες σε όλο τον κόσμο [1]. Η πλειοψηφία των ανδρών με προχωρημένο καρκίνο του προστάτη έχουν αρτηριοσκληρωτική οστικές μεταστάσεις, οι οποίες προκαλούν έντονο πόνο και παθολογικά κατάγματα των οστών [2, 3]. Εισβολή του διαμερίσματος του οστού από τα καρκινικά κύτταρα προκαλεί μια ανισορροπία σε οστεοκλαστών και οστεοβλαστών δραστηριότητα που με τη σειρά της διακόπτει την ομοιόσταση των οστών [4]. Αυτά τα καρκινικά επαγόμενη αποκρίσεις των οστών δεν ευνοεί την επιβίωση και την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων στο νέο τους περιβάλλον. Αν και οστικές μεταστάσεις του καρκίνου του προστάτη είναι κυρίως οστεοβλαστική στη φύση, υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι οστεοκλαστών οστεόλυση συμβάλλει επίσης στην οστική νοσηρότητα σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη με οστικές μεταστάσεις [5, 6].

Άλλοι αναφέρουν ότι μαστού και του προστάτη καρκίνοι επάγει ενεργοποίηση οστεοκλαστών απελευθερώνοντας διαλυτούς παράγοντες όπως IL-1, IL-6, και μακροφάγων παράγοντα διέγερσης αποικιών (Μ-CSF). Οι περισσότεροι από αυτούς τους μεσολαβητές δρουν επί των οστεοβλαστών και στρωματικά κύτταρα, και να συμβάλλει στην οστεολυτικές βλάβες με προς τα πάνω ρύθμιση ενεργοποιητή υποδοχέα του ΝΡ-κΒ προσδέτη (ΚΑΝΚΕ), η οποία παρέχει ένα πιθανό μηχανισμό για να εξηγήσει την αυξημένη επαναρρόφηση οστού σε οστό μετάσταση [6, 7]. RANKL προσδένεται στον υποδοχέα του (RANK) σχετικά με την κυτταρική μεμβράνη των οστεοκλαστών, η οποία οδηγεί στην διαφοροποίηση και ωρίμανση των οστεοκλαστών [8]. Η καθεψίνη Κ, μία κυστεΐνη πρωτεάση που εκκρίνεται από τους οστεοκλάστες και τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη, υποβαθμίζει εξωκυττάριας μήτρας κατά την διάρκεια επαναρρόφησης οστού [9]. Η καθεψίνη G, μια χημειοελκτικό για προδρόμους οστεοκλαστών, είναι ικανό να επεξεργάζεται RANKL σε διαλυτή μορφή (sRANKL) που προάγει την ενεργοποίηση των οστεοκλαστών [10, 11]. Αποκλεισμός καθεψίνη G και η καθεψίνη Κ μειώνει σημαντικά οστεόλυση, γεγονός που υποδηλώνει ότι η καθεψίνη Κ και καθεψίνη είναι ζωτικής σημασίας στο μικροπεριβάλλον του καρκίνου που προκαλείται από οστεολυτικές βλάβες [10, 12].

Η φλεγμονή κριτικά σχετίζεται με όγκο προχώρηση. Επηρεάζει ογκογένεση στο μοριακό επίπεδο διαμορφώνοντας την μικροπεριβάλλον του όγκου και για τη ρύθμιση της ισορροπίας κυτοκινών, χημειοκινών και μεταγραφικοί παράγοντες [13, 14]. Η επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) είναι κρίσιμη για την μετάσταση του καρκίνου. EMT αλλάζει τη συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων και τους αναγκάζει να εισβάλουν στη γύρω στρώμα, οδηγεί σε ενδαγγείωση τους, τη διάδοση και τον αποικισμό των μακρινών τόπων [15, 16]. Κατά τη διάρκεια της ΕΜΤ, καρκινικά κύτταρα, τα οποία είναι τα επιθηλιακά κύτταρα που μοιάζουν, αποκτούν χαρακτηριστικά μεσεγχυματικά, και η απώλεια της επιθηλιακής δείκτη Ε-καδερίνης οδηγεί σε αύξηση των δεικτών μεσεγχυματικά Ν-cadherin, ινωδονεκτίνη, και βιμεντίνη [17]. Αρκετές επαγωγείς EMT, όπως σαλιγκάρι και Twist, είναι μεταγραφικοί παράγοντες που καταστέλλουν την έκφραση Ε-cadherin [16, 18]. Άλλες μελέτες [19, 20] έχουν αναφέρει ότι τα καρκινικά κύτταρα που προωθούνται ΕΜΤ με την ενεργοποίηση της STAT3 μονοπάτι σηματοδότησης.

IL-20 είναι ένα μέλος της οικογένειας IL-10, η οποία περιλαμβάνει IL-10, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24 και IL-26 [21, 22]. Σηματοδοτεί μέσω δύο τύπων συμπλόκου υποδοχέα ετεροδιμερούς: IL-20R1 /IL-20R2 και IL-22R1 /IL-20R2 [23]. IL-20 εμπλέκεται σε πολλές φλεγμονώδεις νόσους, όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα [24], η αρτηριοσκλήρωση [25], η ψωρίαση [26, 27], οστεοπόρωση [28], ο καρκίνος του στόματος [29], και του καρκίνου του μαστού [30].

Ο καρκίνος του προστάτη είναι μια πολύπλοκη ασθένεια στην οποία μετάσταση στο οστό είναι ένα αίτιο νοσηρότητας και μπορεί να προηγείται μετάσταση σε άλλα ζωτικά όργανα. Έχουμε προηγουμένως [28, 30] έδειξε ότι η IL-20 όχι μόνο προάγει τον πολλαπλασιασμό των όγκων του μαστού και τη μετανάστευση, αλλά ρυθμίζει επίσης τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών από την προς τα πάνω ρύθμιση RANKL και RANK. Αντι-IL-20 μονοκλωνικό αντίσωμα (mAb) 7Ε μειώθηκε οστεολυτικές αλλοιώσεις των οστών σε μοντέλα ποντικών με καρκίνο του μαστού και των προστατευόμενων υποστεί ωοθηκεκτομή ποντικούς έναντι οστεοπορωτικό απώλειας οστού, αμφότερα τα οποία υποστηρίζουν την ιδέα ότι η IL-20 είναι κρίσιμης σημασίας για τη ρύθμιση του όγκου με τη μεσολάβηση οστεόλυσης. Υποθέτουμε ότι η IL-20 προάγει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε την έκφραση της IL-20 και η βιολογική λειτουργία της σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη και αξιολογείται το θεραπευτικό δυναμικό 7E σε μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού καρκίνου του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Ανοσοϊστοχημεία

εγκλεισμένα σε παραφίνη τμήματα ιστών από 40 δείγματα ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη ελήφθησαν από μία συστοιχία ιστών εμπορική καρκίνου του προστάτη (SuperBioChips Laboratories, Σεούλ, Κορέα), και χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοϊστοχημική (IHC) χρώση με αντι-IL-20 (7Ε ), αντι-IL-20R1, αντι-IL-20R2, ή αντι-IL-22R1 mAb (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31]. Επωάζοντας παραφίνη τομές ιστού με IgG1 ποντικού ισοτύπου (κλώνος 11711? Κ &? D Systems) αντί του πρωτογενούς αντισώματος ήταν ο αρνητικός μάρτυρας. Χρησιμοποιήσαμε 3 μg /ml ως η συγκέντρωση εργασίας για κάθε πρωτογενές αντίσωμα και για την IgG1 ποντικού ελέγχου. Δύο παθολόγοι εκπαιδεύονται στην παθολογία του προστάτη και τυφλωθεί στο δείγμα πηγές ανέλυσε την ιστολογία και τα επίπεδα έκφρασης της IL-20 και των υποδοχέων της από κάθε ασθενή. Η βαθμολόγηση των ανοσοϊστοχημικών λεκέδων σε κάθε δείγμα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ιστολογική βαθμολογία (H) [32] που υπολογίστηκε με την ακόλουθη εξίσωση: Η = ΣPi (i + 1), όπου i είναι η ένταση χρώσης των χρωματισμένων κυττάρων όγκου (0 -4+), και Pi είναι το ποσοστό (εύρος: 0-100%) των προετοιμασμένα κύτταρα του όγκου για κάθε ένταση. Η IL-20, IL-20R1, IL-20R2, και IL-22R1 ανοσοχρώση σημάνθηκαν χαμηλής έκφρασης (Η & lt? 200) ή υψηλής έκφρασης (H ≥ 200). Ανοσοκυτταροχημική χρώση των IL-20 και των υποδοχέων του στο PC-3 κύτταρα έγινε χρησιμοποιώντας το ίδιο πρωτόκολλο όπως περιγράφηκε παραπάνω.

Κυτταροκαλλιέργεια

κυτταρικές γραμμές καρκίνος του προστάτη αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές, PC-3 και LNCaP, διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Life Technologies, Rockville, MD), 100 μg /ml στρεπτομυκίνης και 100 U /ml πενικιλλίνης . Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

PC-3 κύτταρα (3 χ 10

4) καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα και στη συνέχεια εκτίθενται σε άνθρωπο (h) IL-20 (200 ng /ml) για 72 ώρες σε μέσο που περιείχε 1% FBS. Για να επιβεβαιωθεί η ειδική δραστικότητα της IL-20, 7Ε (2 μg /ml) προστέθηκε στο σύστημα καλλιέργειας, είτε μόνο του ή μαζί με IL-20 σε 10: 1 (7Ε: IL-20) αναλογία συγκέντρωσης. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με 1 mg /ml του μεθυλοθειαζολο τετραζολίου (ΜΤΤ) (Sigma-Aldrich) για 3 ώρες και οι ΜΤΤ-φορμαζάνης κρύσταλλοι διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) (Sigma-Aldrich). Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 550 nm.

Η μετανάστευση των κυττάρων δοκιμασία

Η μετανάστευση των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας έναν τροποποιημένο θάλαμο Boyden με ένα φίλτρο από πολυανθρακικό με 8-μm πόρους (Nucleopore, Cabin John, MD). Οι άνω φρεάτια φορτώθηκαν με PC-3 κύτταρα (5 × 10

4). Τα χαμηλότερα θάλαμοι πληρώθηκαν με hIL-20 (200 ng /ml), 7Ε (2 μg /ml), mIgG (2 μg /ml), hIL-20 συν 7Ε, ή hIL-20 συν mIgG σε RPMI-1640 που περιείχε 1 % FBS. RPMI-1640 με 1% FBS χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 8 ώρες, και στη συνέχεια χρωματίστηκαν και μετρήθηκαν. Το πείραμα έγινε για τρεις φορές χρησιμοποιώντας τετραπλούν φρεάτια.

σε πραγματικό χρόνο

δοκιμασία μετανάστευσης

κύτταρα PC-3 σπάρθηκαν στα 5 χ 10

4 κύτταρα /ml σε 6-φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 18 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια εκτέθηκαν σε μέσο που περιέχει hIL-20 (200 ng /ml), 7Ε (2 μg /ml), mIgG (2 μg /ml), hIL-20 συν 7Ε, ή hIL-20 συν mIgG. κινητική μετανάστευση των κυττάρων καταγράφηκε χρησιμοποιώντας ένα φθορίζον αναλυτή κυττάρων (Juli Smart? Μόντρεαλ Biotechnologies Inc. (MBI), Dorval, Μόντρεαλ, Καναδάς) για 18 ώρες και στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ImageJ Λογισμικού (https://rsbweb.nih.gov/ij/)

μαλακό άγαρ σχηματισμού αποικίας δοκιμασία

Cells εμφανίζουν εκθετική αύξηση αιωρήθηκαν σε πλήρες μέσο ανάπτυξης το οποίο περιείχε 0,35% Bacto-agar (Α-6013 τύπου 1 Low ΕΕΤ?. Sigma-Aldrich) και επικαλύπτει 0,5% γέλη αγαρόζης σε δίσκους 30-mm (1 × 10

4 κύτταρα /δίσκο). Μέσο που περιέχει IL-20 (200 ng /mL), 7Ε (2 μg /ml), mIgG (2 μg /ml), hIL-20 συν 7Ε, ή hIL-20 plus mIgG προστέθηκε πάνω από το άγαρ κορυφής. Τα τριβλία διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή (5% CO

2, 95% O

2) για τρεις εβδομάδες. Κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου, το μέσο αλλάχθηκε κάθε 2 ημέρες. Ο αριθμός των ορατών αποικιών (& gt? 50 μm) μετρήθηκε κάτω από μικροσκόπιο. Όλα τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν.

σε πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ποσοτική (RT-qPCR)

Για να αναλυθεί η έκφραση του IL-20 και των υποδοχέων του, ολικό RNA από PC-3 και LNCaP κύτταρα εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας ένα αντιδραστήριο (ΤπζοΙ? Invitrogen, Carlsbad, CA), και στη συνέχεια το ολικό RNA υποβλήθηκε σε αντίστροφη μεταγραφή (Clontech, Palo Alto, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το ενισχυμένο πρότυπο ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας SYBR Green με ένα σύστημα PCR πραγματικού χρόνου (StepOnePlus? Applied Biosystems) με το γονίδιο-ειδικούς εκκινητές. φωσφορική γλυκεραλδεΰδη αφυδρογονάσης (GAPDH) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Για να εξεταστεί η έκφραση της Ε-καδερίνης, Ν-cadherin, STAT3, βιμεντίνη, ινονεκτίνη, RANKL, καθεψίνη G, και η καθεψίνη Κ, PC-3 κύτταρα επωάστηκαν με hIL-20 (200 ng /ml) για 2 έως 6 ώρες. Τα επίπεδα έκφρασης αυτών των γονιδίων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας SYBR Green (Applied Biosystems) ως τον παράγοντα αλληλεπίδρασης. ποσοτική ανάλυση του mRNA ομαλοποιήθηκε με ανθρώπινο GAPDH ως γονίδιο καθαριότητας. Σχετική πολλαπλάσια της αλλαγής στην έκφραση του mRNA προσδιορίστηκε με υπολογισμό 2

-ΔΔCt.

κηλίδωση Western

PC-3 κύτταρα (2 χ 10

5) διεγέρθηκαν με hIL- 20 (200 ng /ml) (R &? D Systems) για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Σύνολο κυτταρικής λύσης συλλέχτηκε με προσθήκη 1 χ ρυθμιστικό διάλυμα ΚΙΡΑ που περιέχει φθοριούχο φαινυλμεθανιοσουλφονύλιο (PSMF) (ΚΙΡΑ: PSMF = 10: 1) και φυγοκεντρήθηκε στις 13.000 rpm στους 4 ° C για να συλλεχθεί το υπερκείμενο. Κηλίδωση Western με αντίσωμα ειδικό για φωσφόρου ρ38, φωσφόρου εξωκυτταρικό σήμα ρυθμιζόμενη κινάση (ERK1 /2), φωσφόρου ΑΚΤ, και φώσφορο-πυρηνικό παράγοντα-κάππα Β (NF-κΒ) (Cell Signaling Technology) χρησιμοποιήθηκε παρακάτω από τον κατασκευαστή οδηγίες. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος (Cell Signaling Technology). Ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνών στη δυτική ζώνες έγινε χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ.

Ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA)

κύτταρα PC-3 επωάστηκαν με hIL-20 (100, 200, ή 400 ng /ml) και τα μέσα καλλιέργειας συλλέχθηκαν και προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ ELISA sRANKL (Peprotech, Rocky Hill, NJ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η καθεψίνη G-ειδικός αναστολέας, Ν-τοζυλ-L-φαινυλαλανίνη χλωρομεθυλ κετόνη (TPCK? Sigma-Aldrich) χρησιμοποιήθηκε για να εμποδίσει τη δραστηριότητα της πρωτεάσης της καθεψίνης G. κυττάρων PC-3 προεπωάστηκαν με 1 μΜ TPCK για 1 ώρα και στη συνέχεια κατεργάζεται με hIL-20 για άλλες 72 ώρες. TPCK διαλύθηκε σε 100% αιθανόλη (EtOH), και στη συνέχεια αραιώνονται σε μέσο καλλιέργειας. Ο έλεγχος του οχήματος ήταν 0,0175% EtOH σε μέσο καλλιέργειας. Το επίπεδο της sRANKL στο τελικό καλλιεργημένο μέσο αναλύθηκε με ELISA.

Ο καρκίνος του προστάτη μοντέλο όγκου PC-3 που φέρει

Όλα τα ζωικά πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που βασίζονται στις Ταϊβάν Εθνικά Ινστιτούτα προτύπων και κατευθυντηρίων γραμμών για τη φροντίδα και τη χρήση των πειραματόζωων Υγείας (Ταϊπέι, Ταϊβάν). Οι διαδικασίες έρευνας εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας Ζώων της Εθνική Cheng Kung University. Όλες οι προσπάθειες έγιναν για την ελαχιστοποίηση ταλαιπωρία των ζώων και να μειωθεί ο αριθμός των ζώων που χρησιμοποιούνται. Οκτώ-εβδομάδων αρσενικών σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID) ποντικών χρησιμοποιήθηκαν σε όλα τα πειράματα. Εν συντομία, οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μία ενδοπεριτοναϊκή (ί.ρ.) ένεση πεντοβαρβιτάλης (50 mg /kg) και στη συνέχεια εγχύθηκαν με βουπρενορφίνη (2 mg /kg? Ε.π.) για χειρουργική αναλγησία. Το αριστερό μαστικό λιπώδες στρώμα του κάθε ποντικού εγχύθηκε υποδόρια με PC-3 κύτταρα (1 χ 10

6). Το ποσοστό επιτυχίας για εμφύτευση υποδόρια (s.c.) του όγκου ήταν 100%. Οι ποντικοί στη συνέχεια χωρίζονται τυχαία σε 3 ομάδες (η = 4 σε κάθε ομάδα), και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS), 7Ε (10 mg /kg? Sc), ή ανοσοσφαιρίνη ποντικού G (mIgG? 10 mg /kg ? sc) τρεις φορές την εβδομάδα για τη διάρκεια της αγωγής θεραπείας. Το αντίσωμα εγχύθηκε (s.c.) στην περιφέρεια του αναπτυσσόμενου όγκου σε ποντίκια που φέρουν όγκους SCID. Υγιείς έλεγχοι δεν ενέθηκαν με καρκινικά κύτταρα. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο σε τρεις κάθετες διαστάσεις και υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: το μέγεθος του όγκου = 0.5 × (μήκος Χ πλάτος Χ βάθος). Σαράντα ημέρες μετά τα κύτταρα όγκου είχαν εγχυθεί, τα ποντίκια θανατώθηκαν χρησιμοποιώντας CO

2, και ο ιστός του όγκου συλλέχθηκε και ζυγίστηκε. Για την ανάλυση των επιπέδων έκφρασης της IL-20 και καθεψίνη G, ο ιστός του όγκου που απομονώνονται από τα 4 ποντίκια σε κάθε ομάδα συλλέχθηκε, και το ολικό RNA εκχυλίστηκε για περαιτέρω ανάλυση.

Intratibial ένεση PC-3 σε SCID ποντίκια

Οκτώ εβδομάδων αρσενικούς SCID ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μια ένεση πεντοβαρβιτάλης (50 mg /kg) και, στη συνέχεια, της βουπρενορφίνης (2 mg /kg? ip) για χειρουργική αναλγησία. Κάθε δόθηκε ένα διάμεσο παραεπιγονατιδική τομή και μια βελόνα τοποθετήθηκε στο ενδομυελικό κανάλι της κνήμης. PC-3 κύτταρα, σε συγκέντρωση 2 × 10

5/100 μΙ, ενέθηκαν αργά στην κνήμη και η τομή κλείστηκε με 5-0 χρωμικό ράμματα. Για μετεγχειρητική αναλγησία, βουπρενορφίνη (2 mg /kg? Ί.ρ.) εγχύθηκε μία φορά την ημέρα για 3 ημέρες μετά τη χειρουργική επέμβαση. Το ποσοστό επιτυχίας για intratibial εμφύτευση όγκου ήταν 100%. Οι ποντικοί στη συνέχεια χωρίζονται τυχαία σε τρεις ομάδες (η = 5 σε κάθε ομάδα) και ενέθηκαν με όχημα (PBS? Ip), mIgG (10 mg /kg? Ip), ή 7Ε (10 mg /kg? ΙΡ) τρεις φορές ανά εβδομάδα. Επτά εβδομάδες μετά την έναρξη θεραπείας, τα ποντίκια θανατώθηκαν με τη χρήση CO

2, και μεταφύσεων κνημιαίου τους αναλύθηκαν

in vivo

χρήση μικρο-υπολογιστική τομογραφία (micro-CT) με ένα υψηλής ανάλυσης, χαμηλής δόσης σαρωτή ακτίνων Χ. Οστική πυκνότητα (BMD) αναλύθηκε σε 50 διαδοχικές φέτες. Τα αποτελέσματα υπολογίζονται ως ποσοστό έναντι τιμές από ένα υγιές δείγμα αναφοράς.

Στατιστική ανάλυση

Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA) χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση. Μία μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA) μη παραμετρικό τεστ Kruskal-Wallis χρησιμοποιήθηκε για την σύγκριση των δεδομένων μεταξύ των ομάδων. Δημοσίευση συγκρίσεις hoc έγιναν χρησιμοποιώντας το τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Dunn. Τα δεδομένα είναι μέσα ± τυπική απόκλιση (SD). Σημαντικότητας ορίστηκε στο

P

& lt? 0.05

Αποτελέσματα

Η έκφραση της IL-20 και των υποδοχέων της σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη

δείγματα αδενοκαρκινώματος ιστού Σαράντα προστάτη (στάδιο ΙΙ, n = 8?. Σταδίου ΙΙΙ, n = 32) είχαν IHC χρωματίστηκαν με αντι-IL-20 mAbs. Ένταση χρώσης ήταν υψηλής έκφρασης σε 22 δείγματα (Σχήμα 1Α) και χαμηλής έκφρασης σε 18 δείγματα. Για να διερευνηθεί αν ο καρκίνος του προστάτη κύτταρο είναι το κύτταρο-στόχος για την IL-20, χρησιμοποιήσαμε χρώση IHC για την ανάλυση των επιπέδων έκφρασης των υποδοχέων IL-20 (IL-20R1, IL-20R2, και IL-22R1) σε δείγματα αδενοκαρκινώματος προστατικό ιστό από 40 ασθενείς. Τα κύτταρα καρκινώματος του προστάτη ήταν όλα θετικά χρωματίστηκαν με αντι-IL-20R1, αντι-IL-20R2, και αντι-IL-22R1 mAbs (Σχήμα 1Β, 1C και 1D). Η ένταση της χρώσης IHC ιστών καρκινώματος προστάτη ήταν ετερογενής (Σχήμα 1 F). Αντι-IL-20 και αντι-IL-20R1 mAbs είναι εξαιρετικά χρώση στα κύτταρα του όγκου, ωστόσο ο αντι-IL-20R2 και αντι-IL-22R1 mAbs δεν είναι (Σχήμα 1Α, 1Β, 1C και 1D, βέλη) στο αντιπροσωπευτικό καρκίνωμα ιστούς. Η έκφραση της IL-20R1, IL-20R2, και IL-22R1 ήταν υψηλή σε 37, 7, και 10 δείγματα, αντίστοιχα.

(ΑΕ) χειρουργικού βιοψία δείγματα αδενοκαρκινώματος ιστό προστάτη (στάδιο II, η = 8 ? στάδιο III, η = 32) από 40 ασθενείς ελήφθησαν από ένα εμπορικό συστοιχία ιστών καρκίνου του προστάτη. IHC χρώση με αντι-IL-20, αντι-IL-20R1, αντι-IL-20R2, και αντι-IL-22R1 mAbs έδειξαν ότι η IL-20 και των υποδοχέων του (IL-20R1, IL-20R2, και IL-22R1) βάφτηκαν. Mouse IgG1 (mIgG1) ισότυπου ήταν ο αρνητικός μάρτυρας. Τα βέλη δείχνουν κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Μεγέθυνση: 200 ×. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά του 2 ανεξάρτητα πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα. (F) Ποσοτικοποίηση χρώσης ένταση του αντι-IL-20, αντι-IL-20R1, αντι-IL-20R2, και αντι-IL-22R1 mAbs από 40 δείγματα ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη. IHC, ανοσοϊστοχημική χρώση? mAb, μονοκλωνικό αντίσωμα? mIgG, ανοσοσφαιρίνη ποντικού.

Η

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων αναστάλθηκε σε 7Ε που έλαβαν κύτταρα PC-3

Για να αποσαφηνιστεί ο ρόλος της IL-20 στην παθογένεση του καρκίνου του προστάτη, εξετάσαμε πρώτα αν το IL-20 και των υποδοχέων του (IL-20R1, IL-20R2, και IL-22R1) εκφράστηκαν σε καρκινικές κυτταρικές σειρές προστάτη. RT-qPCR και χρώση IHC έδειξαν ότι η IL-20 και των υποδοχέων του ήταν όλα εκφράζονται σε PC-3 κύτταρα (Σχ 2Α και 2Β), και σε κύτταρα LNCaP (Σχήμα 2Α). Το πρώτο βήμα στην πρόοδο του όγκου πιστεύεται ότι είναι το αποτέλεσμα μιας γενετικής αλλοίωσης που οδηγεί στην μη κανονικό πολλαπλασιασμό ενός μόνο κυττάρου. Για να καθοριστεί εάν η IL-20 προωθείται πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC-3, χρησιμοποιήσαμε μία δοκιμασία ΜΤΤ, η οποία έδειξε ότι η IL-20 δεν προήγαγε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC-3 κύτταρα, αλλά ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων με δοσοεξαρτώμενο τρόπο ανέστειλε σε 7Ε επεξεργασμένο PC-3 κύτταρα (Σχ 2C και 2D). Η πρόοδος του όγκου που εμπλέκονται μετανάστευση κυττάρων και τη μετάσταση σε απομακρυσμένα όργανα. Μια δοκιμασία μετανάστευσης σε πραγματικό χρόνο έδειξαν ότι η μετανάστευση των κυττάρων αυξήθηκε σε IL-20-αγωγή κύτταρα PC-3 σε σύγκριση με μη κατεργασμένους μάρτυρες, η δραστηριότητα των οποίων μετριάζει 7Ε (σχήμα 3Α και 3Β). Επιπλέον, μία δοκιμασία θαλάμου Boyden έδειξαν παρόμοια αποτελέσματα (Σχήμα 3C και 3D).

(Α) RT-qPCR έδειξαν ότι η IL-20 και των υποδοχέων του εκφράστηκαν σε καρκίνο του προστάτη PC-3 και LNCaP κύτταρα. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά του 2 ανεξάρτητα πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα. (Β) IHC έδειξαν ότι η IL-20 και των υποδοχέων του εκφράστηκαν σε καρκίνο του προστάτη PC-3 κύτταρα. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά του 2 ανεξάρτητα πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα. (C) Μία δοκιμασία ΜΤΤ έδειξαν ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ανεστάλη σε 7Ε επεξεργασμένα κύτταρα PC-3. Μέσο μόνο χρησιμοποιήθηκε σαν αρνητικός έλεγχος. 7Ε χρησιμοποιήθηκε για να αναστέλλουν τη δράση της hIL-20. * P & lt? 0,05 έναντι μη επεξεργασμένους μάρτυρες, #p & lt? 0,05 έναντι της ομάδας hIL-20. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. (Δ) Μία δοκιμασία ΜΤΤ έδειξαν ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων με δοσοεξαρτώμενο τρόπο ανέστειλε σε 7Ε επεξεργασμένα κύτταρα PC-3. * P & lt? 0.05, ** p & lt? 0.01 έναντι των ελέγχων mIgG. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. RT-qPCR, σε πραγματικό χρόνο αλυσίδας ποσοτική αντίδραση πολυμεράσης? ΜΤΤ, μεθυλοθιαζολ τετραζολίου? 7Ε, αντι-IL-20 μονοκλωνικό αντίσωμα? hIL-20, ανθρώπινη ιντερλευκίνη-20.

Η

(Α-Β) μετανάστευση κυττάρων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία μετανάστευσης σε πραγματικό χρόνο. κύτταρα PC-3 επωάστηκαν με μέσο που περιέχει hIL-20 (200 ng /ml), 7Ε (2 μg /ml), mIgG (2 μg /ml), hIL-20 συν 7Ε, ή hIL-20 συν mIgG. κινητική μετανάστευση κυττάρων καταγράφηκε χρησιμοποιώντας ένα αναλυτή έξυπνη φθορισμού τηλέφωνο για 18 ώρες. Τα (Α) Εκπρόσωπος time-lapse εικόνες για την παρακολούθηση εξ αποστάσεως κίνηση κύτταρα PC-3 παρουσιάζονται για κάθε ομάδα. Η απόσταση κίνησης του κάθε κυττάρου παρουσιάζεται με διαφορετικά χρώματα (μετράνε = 7 κύτταρα). (Β) Quantization της απόστασης κίνησης (σε μm) από PC-3 κύτταρα (μετράνε = 7 κύτταρα). IgG ποντικού ήταν ο αρνητικός μάρτυρας του 7Ε. * P & lt? 0,05 έναντι μη επεξεργασμένους μάρτυρες, #p & lt? 0,05 έναντι της ομάδας hIL-20. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων, κάθε ένα έγινε εις τετραπλούν. (C-D) Η μετανάστευση των κυττάρων αξιολογήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας μια τροποποιημένη δοκιμασία θαλάμου Boyden. Οι άνω φρεάτια φορτώθηκαν με 5 × 10

4 PC-3 κύτταρα. Τα χαμηλότερα θάλαμοι πληρώθηκαν με hIL-20 (200 ng /ml), 7Ε (2 μg /ml), mIgG (2 μg /ml), hIL-20 συν 7Ε, ή hIL-20 συν mIgG σε RPMI-1640 που περιείχε 1 % FBS. RPMI-1640 με 1% FBS χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 8 ώρες. (γ) Εκπρόσωπος Giemsa φωτογραφίες χρώση παρουσιάζονται για κάθε ομάδα. (Δ) Ο ποσοτικός προσδιορισμός της μετανάστευσαν κύτταρα ανά φρεάτιο. ** P & lt? 0.01 έναντι μη κατεργασμένους ελέγχους. ## P & lt? 0,01 έναντι της ομάδας hIL-20. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων, κάθε ένα έγινε εις τετραπλούν.

Η

σχηματισμός αποικιών προήχθη σε IL-20-επεξεργασμένα κύτταρα PC-3

Το αρχικό στάδιο της τοπική εισβολή του καρκίνου του προστάτη είναι μια αύξηση στον σχηματισμό αποικίας των καρκινικών κυττάρων. Ένα προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας μαλακού agar έδειξε ότι ο σχηματισμός αποικίας ανεξάρτητη από προσκόλληση ήταν σημαντικά υψηλότερη στην PC-3 κύτταρα IL-20-θεραπεία σε σχέση με δείγματα αναφοράς άνευ αγωγής, η δραστηριότητα των οποίων μετριάζει 7Ε (Σχήμα 4Α και 4Β).

PC-3 κύτταρα (1 χ 10

4 /φρεάτιο) επωάστηκαν με hIL-20 (200 ng /ml), 7Ε (2 μg /ml), mIgG (2 μg /ml), hIL-20 plus 7Ε, ή hIL-20 συν mIgG για 3 εβδομάδες. Το μέσο καλλιέργειας άλλαζε κάθε 2 ημέρες. Τα (Α) Εκπρόσωπος φωτογραφίες που παρουσιάζονται για κάθε ομάδα. σχηματισμός (Β) Colony ήταν σημαντικά υψηλότερη στην IL-20 που έλαβαν κύτταρα PC-3. 7Ε (2 μg /ml) χρησιμοποιήθηκε για να αναστέλλουν τη δράση της IL-20. * P & lt? 0.05, ** p & lt? 0.01 έναντι μη επεξεργασμένους μάρτυρες, ## ρ & lt? 0,01 έναντι της ομάδας hIL-20. Οι τιμές είναι οι μέσες ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων, το καθένα εις τριπλούν.

Η

Μεταγωγή σήματος προκλήθηκε σε IL-20-αγωγή κύτταρα PC-3

επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβασης ( EMT) είναι θεμελιώδους σημασίας για την εξέλιξη του όγκου και των μεταστάσεων. Για να διερευνηθεί κατά πόσο η IL-20 εμπλέκεται σε προστάτη μετάσταση όγκου μέσω EMT, RT-qPCR χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθεί η έκφραση της επιθηλιακής δείκτη Ε-καδερίνης, Ν-cadherin, STAT3, βιμεντίνη, και ο μεσεγχυματικά ινωδονεκτίνης δείκτη σε κύτταρα PC-3 επωάστηκαν με IL-20. Έδειξε ότι Ε-καδερίνης είχε μειωτικά (Σχήμα 5Α), και Ν-cadherin, STAT3, βιμεντίνη, και φιμπρονεκτίνη είχαν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω (Σχήμα 5Β, 5C, 5D και 5Ε), ενώ στην 7Ε-επεξεργασμένα κύτταρα, αυτή η προς τα πάνω ρύθμιση ήταν εξασθενημένο. Για να αποσαφηνιστεί ο πιθανός μηχανισμός μεταξύ της IL-20 και την εξέλιξη του όγκου, τα μόρια σήματος του ERK1 /2, ΑΚΤ, ΝΡ-κΒ, και ρ38 αξιολογήθηκαν και βρέθηκαν να φωσφορυλιώνεται σε IL-20-αγωγή PC-3 κύτταρα (Σχ 5F) .

κύτταρα (ΑΕ) PC-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με hIL-20 (200 ng /ml) για τους υποδεικνυόμενους χρόνους, και τα επίπεδα έκφρασης Ε-καδερίνης, Ν-cadherin, STAT3, βιμεντίνη και φιμπρονεκτίνη αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας RT-qPCR με ειδικούς εκκινητές. * P & lt? 0.05, ** p & lt? 0.01 έναντι των ελέγχων 0 ωρών. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων, το καθένα εις τριπλούν. PC-3 κύτταρα (F) (2 × 10

5) επωάστηκαν με hIL-20 (200 ng /ml) για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα, και στη συνέχεια κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ανοσοστύπωση με ειδικά αντισώματα έναντι φωσφο- p38, φώσφορο-ERK1 /2, φώσφορο-ΑΚΤ, και φώσφορο-NF-κΒ. β-ακτίνης αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Η ποσοτικοποίηση των ζωνών έγινε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ. * P & lt? 0,05 έναντι 0-min ελέγχους. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων.

Η

RANKL, καθεψίνη G, και μεταγραφές καθεψίνης Κ και πρωτεΐνης sRANKL παραγωγή προκλήθηκαν σε IL-20-αγωγή κύτταρα PC-3

για να ελεγχθεί αν το IL-20 ρυθμίζει καθεψίνες και RANKL στον καρκίνο του προστάτη, PC-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με IL-20 για 6 ώρες. Ένα RT-qPCR ανάλυση μεταγραφής γονιδίου έδειξε ρυθμίζεται προς τα πάνω RANKL, καθεψίνη G και η έκφραση καθεψίνης Κ σε IL-20-αγωγή κύτταρα PC-3, η δράση του οποίου εξουδετερώθηκε με 7Ε (Σχήμα 6Α, 6Β και 6C). Επιπλέον, ένας προσδιορισμός ELISA έδειξε σημαντική (ρ & lt? 0,05) αύξηση στην sRANKL έκφραση σε IL-20-αγωγή PC-3 κύτταρα (Σχ 6D). Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι η IL-20-επεξεργασμένα κύτταρα PC-3 παράγουν καθεψίνης G και στη συνέχεια διασπά RANKL να δημιουργήσει sRANKL, το οποίο προωθεί περαιτέρω ενεργοποίηση οστεοκλαστών στα οστά μικροπεριβάλλον. Για να επιβεβαιωθεί ότι η διάσπαση του RANKL ήταν καθεψίνη-εξαρτώμενη, χρησιμοποιήσαμε έναν αναστολέα ειδικού καθεψίνης G (TPCK, 1 μΜ) για να εμποδίσει την δραστικότητα πρωτεάσης της καθεψίνης G. Το αποτέλεσμα επιβεβαίωσε υπόθεση μας (Σχήμα 6Ε).

(AC) PC-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με hIL-20 (200 ng /ml), 7Ε (2 μg /ml), mIgG (2 μg /ml), hIL-20 συν 7Ε, ή hIL-20 plus mIgG για 6 ώρες, και τα επίπεδα έκφρασης του RANKL, καθεψίνη G, και καθεψίνη Κ αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας RT-qPCR με ειδικούς εκκινητές. * P & lt? 0.05, ** p & lt? 0.01 έναντι μη επεξεργασμένο έλεγχο, #p & lt? 0,05 έναντι της ομάδας hIL-20. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων, το καθένα εις τριπλούν. (D) κύτταρα PC-3 επωάστηκαν με hIL-20 (100, 200, ή 400 ng /ml) για 48 ώρες, το μέσο καλλιέργειας συλλέχθηκε και στη συνέχεια η συγκέντρωση του sRANKL προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ELISA. * P & lt? 0,05 έναντι μη κατεργασμένους ελέγχους. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων, το καθένα εις τριπλούν. (Ε) PC-3 κύτταρα προεπωάστηκαν με 1 μΜ καθεψίνης αναστολέα G-ειδική (TPCK) για 1 ώρα και στη συνέχεια κατεργάζεται με hIL-20 (400 ng /ml) για 72 ώρες. Ο έλεγχος του οχήματος ήταν 0,0175% EtOH σε μέσο καλλιέργειας. Η συγκέντρωση του sRANKL προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ELISA. * P & lt? 0,05 έναντι μη επεξεργασμένους μάρτυρες, #p & lt? 0,05 έναντι των ελέγχων hIL-20 συν EtOH όχημα. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων, το καθένα εις τριπλούν. RT-qPCR, σε πραγματικό χρόνο αλυσίδας ποσοτική αντίδραση πολυμεράσης? sRANKL, διαλυτό RANKL? EtOH, αιθανόλη.

Η

Η ανάπτυξη του όγκου αναστέλλεται σε 7Ε επεξεργασμένα PC-3 ξενομοσχεύματα καρκίνου του προστάτη

Με βάση μας

in vitro

αποτελέσματα, ερευνήσαμε περαιτέρω η επιδράσεις των 7Ε στην ανάπτυξη του όγκου του προστάτη

in vivo

στο μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού μας. PC-3 κύτταρα εγχύθηκαν (sc) σε ποντίκια SCID, τα οποία στη συνέχεια κατεργάζεται με PBS, mIgG (10 mg /kg, sc), ή 7Ε (10 mg /kg, sc) ενέσεις 3 φορές την εβδομάδα, και η ανάπτυξη του όγκου ήταν μετράται για 40 ημέρες. Υπήρξε μικρότερη ανάπτυξη στην ομάδα 7Ε αγωγή από ό, τι στην mIgG- και PBS-αγωγή ομάδες ελέγχου (Εικόνα 7Α). Μετά από 40 ημέρες, τα ποντίκια θανατώθηκαν και οι όγκοι τους ζυγίστηκαν. Οι όγκοι στην ομάδα 7Ε αγωγή ζύγιζε λιγότερο από την mIgG- και PBS-αγωγή ομάδων (Εικ 7Β). Ιστός όγκου από κάθε ομάδα στη συνέχεια απομονώθηκε για την εξαγωγή RNA. RT-qPCR έδειξαν ότι η έκφραση της IL-20 στην ομάδα 7Ε αγωγή ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι στην mIgG- και PBS-αγωγή ομάδες ελέγχου (Σχήμα 7C). Επιπλέον, η έκφραση καθεψίνης G ήταν μειωτικά στην ομάδα 7Ε-αγωγή (Σχήμα 7D).

(Α-Δ) κύτταρα PC-3 ενέθηκαν (s.c.) σε μαστικά λιπώδη σώματα ποντικών SCID. Μία ημέρα αργότερα, τα ποντίκια ενέθηκαν (s.c.) με PBS, 7Ε (10 mg /kg), ή mIgG (10 mg /kg? Η = 4 ανά ομάδα) τρεις φορές την εβδομάδα. (Α) Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα παχύμετρο. (Β) Τα ποντίκια θανατώθηκαν 40 ημέρες μετά την είχαν ενεθεί με κύτταρα PC-3, και οι όγκοι τους συλλέχθηκαν και ζυγίστηκαν. (C-D) δείγματα όγκων ιστού από κάθε ομάδα (η = 4) απομονώθηκαν στο τέλος του πειράματος. Η έκφραση της IL-20 και καθεψίνη στον ιστό του όγκου αναλύθηκε χρησιμοποιώντας RT-qPCR με ειδικούς εκκινητές. * P & lt? 0.05, ** p & lt? 0.01 έναντι των ελέγχων mIgG. Τα δεδομένα είναι μέσα ± SD. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα. (Ε-ΣΤ) θεραπεία 7Ε προστατεύονται από την απώλεια οστικής μάζας και ελαττώνεται μείωση της οστικής πυκνότητας σε intratibial PC-3-ένεση οστεολυτική ποντίκια. PC-3 κύτταρα (2 χ 10

5/100 μΐ) ενέθηκαν αργά μέσα στην κοιλότητα του μυελού των οστών της κνήμης. Τα ποντίκια ενέθηκαν ί.ρ. με PBS, 7Ε (10 mg /kg), ή mIgG (10 mg /kg) (η = 5 σε κάθε ομάδα) τρεις φορές την εβδομάδα. Υγιείς έλεγχοι δεν έλαβαν ένεση με τα καρκινικά κύτταρα. (Ε) Η κνημιαία μετάφυση είχε ληφθεί από υγιή ποντίκια ελέγχου και ποντίκια με PC-3 οστεόλυση. Αντιπροσωπευτικά μικρο-αξονική τομογραφία εμφανίζεται για κάθε ομάδα. (F) το Κνημιαίο BMD μετρήθηκε και τα αποτελέσματα εκφράζονται σε ποσοστά σε σχέση με υγιείς τιμές ελέγχου. * P & lt? 0.05 έναντι των ελέγχων mIgG. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα. BMD, οστική πυκνότητα? μικρο-CT, μικρο-υπολογιστική τομογραφία.

Η

7Ε ανέστειλε οστεόλυση σε PC-3 ξενομοσχεύματα καρκίνου του προστάτη

στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη, πολλοί ασθενείς τελικά αναπτύσσουν μετάσταση στα οστά . Με βάση μας

in vitro

δεδομένων, εικάζεται ότι η IL-20 μπορεί να προωθήσει την οστεοκλαστογένεση ρυθμίζοντας sRANKL και έκφραση G καθεψίνης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Ως εκ τούτου, έχουμε αναρωτηθεί κατά πόσο αναστολή της IL-20 θα μειώσει τον καρκίνο του προστάτη οστεόλυση

in vivo

. PC-3 κύτταρα ενέθηκαν μέσα στην κοιλότητα του μυελού των οστών των κνημών σε SCID ποντίκια, τα οποία στη συνέχεια με ένεση (ί.ρ.) με PBS, mIgG, ή 7Ε τρεις φορές την εβδομάδα για τις επόμενες 7 εβδομάδες. Μικρο-αξονικές τομογραφίες, που χρησιμοποιείται για να εξετάσει την επίδραση της 7Ε επί του καρκίνου του προστάτη οστεόλυση, έδειξε ότι η PC-3 καρκίνου του οστεόλυση αναστάλθηκε στην ομάδα που 7Ε αγωγή σε σχέση με τους mIgG- και PBS-αγωγή ομάδων (Εικ 7Ε) . BMD ήταν σημαντικά μικρότερη στις ομάδες ελέγχου mIgG- και PBS αγωγή σε σχέση με την υγιή ομάδα ελέγχου?