Αφηρημένο

Ιστορικό

με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία είναι μια τυπική στρατηγική για μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), ενώ χημειοαντίσταση παραμένει μια σημαντική θεραπευτική πρόκληση στην τρέχουσα κλινική πρακτική. παρούσας μελέτης μας είχε ως στόχο να προσδιορίσει αν η αναστολή του μονοπατιού NF-κΒ /miR-21 /PTEN θα μπορούσε να αυξήσει την ευαισθησία των NSCLC με σισπλατίνη.

Μέθοδοι

Η έκφραση του miR-21 στο NSCLC ιστούς προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας in situ υβριδισμό. Στη συνέχεια, η επίδραση του miR-21 επί της ευαισθησίας των κυττάρων Α549 στη σισπλατίνη προσδιορίστηκε in vitro. Είτε miR-21 έκφρασης ρυθμιζόμενη ΡΤΕΝ εκτιμήθηκε με δοκιμασία λουσιφεράσης. Επιπλέον, αν ΝΡ-κΒ στοχευμένη δεσμευτικά στοιχεία του στον υποκινητή του γονιδίου miR-21 προσδιορίστηκε με δοκιμασία λουσιφεράσης και το chip. Τέλος, μετρήθηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων και την απόπτωση υπό θεραπεία με σισπλατίνη, όταν NF-κΒ ανεστάλη.

Αποτελέσματα

παρατηρήθηκε Ένα αυξημένο επίπεδο των miR-21 σε NSCLC ιστούς των πνευμόνων και είχε σχέση με μια σύντομο χρόνο επιβίωσης. Εξωγενείς miR-21 προωθείται η επιβίωση των κυττάρων όταν εκτίθεται σε σισπλατίνη, ενώ η αναστολή miR-21 θα μπορούσε να αναστρέψει τη διαδικασία αυτή. Τα επίπεδα του RNA και της πρωτεΐνης του ΡΤΕΝ ήταν σημαντικά μειωμένη από εξωγενές miR-21, και η 3′-αμετάφραστη περιοχή του ΡΤΕΝ δείχθηκε να είναι ένας στόχος του miR-21. Η έκφραση του miR-21 ρυθμίζεται από το ΝΡ-κΒ σύνδεση προς το στοιχείο του στον προαγωγό, ένα εύρημα που επιβεβαιώθηκε με δοκιμασία λουσιφεράσης και το chip. Ως εκ τούτου, η αναστολή του NF-κΒ από την RNA σίγηση προστατεύει τα κύτταρα από σισπλατίνη μέσω μείωσης miR-21 έκφρασης.

Συμπέρασμα

Η διαμόρφωση του NF-κΒ /miR-21 /ΡΤΕΝ σε NSCLC έδειξε ότι η αναστολή αυτού του μονοπατιού μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία σισπλατίνη

Παράθεση:. Yang Z, Fang S, Di Υ, Ying W, Tan Υ, Gu W (2015) Διαμόρφωση του NF-κΒ /miR-21 /ΡΤΕΝ ευαισθητοποιεί μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα σε σισπλατίνη. PLoS ONE 10 (3): e0121547. doi: 10.1371 /journal.pone.0121547

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Bernard Μαρί, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, Γαλλία

Ελήφθη: 14η Οκτωβρίου 2014? Αποδεκτές: 2 του Φεβρουαρίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 23 Μαρτίου, 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Πρόγραμμα του Τμήματος Jiangsu Υγείας (H201341). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC), που περιλαμβάνει καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, αδενοκαρκίνωμα και μεγάλων κυττάρων αδιαφοροποίητο καρκίνωμα, είναι ο πιο κοινός τύπος καρκίνου του πνεύμονα [1,2]. Γενετική διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην παθοφυσιολογική μηχανισμό NSCLC [3,4], και αυτό οδηγεί σε μη ευαισθησία του NSCLC να με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία [5], με αποτέλεσμα να NSCLC είναι η πιο κοινή αιτία θνησιμότητας σχετίζεται με τον καρκίνο παγκοσμίως [ ,,,0],1]. έχουν Ετσι, είναι αναγκαίο να αναπτυχθούν νέες φαρμακευτικών στόχων βασίζεται στην μοριακή γενετική.

Τα microRNAs (miRNA) έχουν ενοχοποιηθεί ως ρυθμιστές κλειδιά πολλών γονιδίων στόχων μέσω του μηχανισμού ενδογενούς παρεμβολή RNA [6]. Μπορούν να συμβάλουν στην βιολογία του καρκίνου, μεταβάλλοντας την έκφραση των γονιδίων στόχων τους [7]. miR-21 είναι ένας τύπος miRNA που λειτουργεί ως ένας ισχυρός ρυθμιστής της συμπεριφοράς των καρκινικών κυττάρων και κακοήθη μετασχηματισμό [8]. Εχει βρεθεί ότι αυξάνει την ανάπτυξη των κυττάρων σε καρκίνο του ήπατος και έχει αποδείξει αντι-αποπτωτικό ιδιότητες σε γλοιοβλάστωμα [9]. Στο NSCLC, miR-21 παίζει επίσης βασικό ρόλο στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την εισβολή και την απόπτωση [10]. Προηγούμενες μελέτες έχουν αποδείξει ότι miR-21 ρυθμίζει την έκφραση φωσφατάση και tensin ομόλογο (

ΡΤΕΝ

) μέσω απ ‘ευθείας στόχευση 3’ μη μεταφραζόμενη περιοχή του (3’UTR) [8].

ΡΤΕΝ

, ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο, παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση και ο σχηματισμός πολλών τύπων στερεών όγκων, συμπεριλαμβανομένων των NSCLC [10]. Ρυθμίζει αρνητικά τα ενδοκυτταρικά επίπεδα του φωσφατιδυλινοσιτόλης-3,4,5-τριςφωσφορικής (ΡΙ3Κ) σε κύτταρα και λειτουργεί ως ογκοκατασταλτικά ρυθμίζοντας αρνητικά την οδό σηματοδότησης Akt [11]. Υπό κανονικές συνθήκες, η έκφραση και ενεργοποίηση των

PTEN

ελέγχεται αυστηρά, ενώ οι εκφράσεις των miRNAs απορυθμίζεται σε NSCLC. Αλλοίωση του

miR-21 /PTEN

βρέθηκε σε ασθενείς με NSCLC με αντίσταση gefitinib [12].

Με δεδομένο το σημαντικό ρόλο του μονοπατιού miR-21 /PTEN σε NSCLC, εξακολουθεί να υπάρχει ένα ερώτημα σχετικά με τους οποίους η έκφραση του

miR-21

αυξάνεται σε NSCLC. Πραγματοποιήσαμε μια αναζήτηση βιοπληροφορική (https://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promo.cgi) και βρέθηκαν τέσσερα δεσμευτικά στοιχεία του NF-κΒ στον προαγωγό του

miR-21

γονίδιο. Επιπλέον, ένας ερευνητική ομάδα απέδειξαν ότι η βλάβη του DNA που προκαλείται

miR-21

αυξητική ρύθμιση και προωθείται μαστού εισβολή των καρκινικών κυττάρων σε ένα ΝΡ-κΒ-εξαρτώμενο τρόπο [13]. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι NF-κΒ αυξάνεται το επίπεδο του

miR-21

, η οποία μείωσε

PTEN

έκφραση μετα-μεταγραφικά να προωθήσει την επιβίωση των κυττάρων υπό θεραπεία με σισπλατίνη σε NSCLC? Ως εκ τούτου, η αναστολή του μονοπατιού ΝΡ-κΒ /miR-21 /ΡΤΕΝ θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός στόχος φαρμάκου για NSCLC.

Μέθοδοι

Tissue μικροσυστοιχιών

Tissue μικροσυστοιχία (TMA) παρασκευάστηκε από ιστούς που προέρχονται από 34 ασθενείς με NSCLC και 10 ασθενείς χωρίς NSCLC μεταξύ Ιανουαρίου 1999 και Αυγούστου 2007. Η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με την Διακήρυξη του Ελσίνκι (1989) και εγκρίθηκε από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας (Nanjing Πρώτη Νοσοκομείο, Ναντζίνγκ Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Nanjing, Κίνα). Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή. Ο εκπρόσωπος περιοχή επελέγη προσεκτικά από αιματοξυλίνη και ηωσίνη (ΗΕ) -stained τμήμα, και στη συνέχεια ένας πυρήνας ιστού 1,5 πιπί ληφθούν από τις αντίστοιχες μπλοκ παραφίνης. Στη συνέχεια, εγκλεισμένα σε παραφίνη υλικό κόπηκε σε τομές 5 μm και τοποθετήθηκαν επάνω σε μια διαφάνεια, που ακολουθείται από χρώση με ΗΕ ή in situ υβριδισμού (ISH). Τομές παρατηρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός (Olympus, Ιαπωνία). NSCLC διαγνώστηκε από δύο ανεξάρτητους παθολόγους, σύμφωνα με την Ένωση Διεθνών σύστημα ταξινόμησης Ελέγχου του Καρκίνου (UICC), 7η έκδοση. Η ένταση χρώσης βαθμολογήθηκε ως εξής: 0, καμία χρώση των κυττάρων? 1, ασθενής χρώση? και 2, η ισχυρή χρώση. Το ποσοστό των κυττάρων που χρωματίζονται κατετάγη χρησιμοποιώντας μια κλίμακα 3 βαθμού: 0, υπάρχουν θετικά κύτταρα? 1, & lt? 50% θετικά κύτταρα? και 2, & gt?. 50% θετικά κύτταρα

ISH

ISH του

miR-21

διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (MK10013, Boster, Κίνα). Εν συντομία, μετά αποπαραφινώσεως των διαφανειών σε ξυλόλιο και αιθανόλη, slides επωάστηκαν με 3% Η

2O

2 για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια υπέστη πέψη με πεψίνη για 10 λεπτά στους 37 ° C. Μετά το ξέπλυμα με νερό, τα πλακίδια σταθεροποιήθηκαν με 1% PFA σε DEPC (Generay, Κίνα) για 10 λεπτά. Οι τομές μετά πλύθηκαν με νερό τρεις φορές και επωάστηκαν με ρυθμιστικό προϋβριδισμού για 4 ώρες στους 42 ° C και ρυθμιστικό υβριδισμού όλη την νύχτα στους 42 ° C με miR-21 ανιχνευτής (5′-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3 ‘). Τα πλακίδια πλύθηκαν ως εξής: 2 χ SSC για 5 λεπτά στους 37 ° C, δύο φορές? 0.5 χ SSC για 15 λεπτά στους 37 ° C, μία φορά? και 0.2 χ SSC για 15 λεπτά στους 37 ° C, μία φορά. Ο ιστός επωάστηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα μπλοκαρίσματος στους 37 ° C για 30 λεπτά και κατόπιν επωάστηκε με στρεπταβιδίνη-βιοτίνη σύμπλοκο (SABC). Μετά από πλύση τρεις φορές με PBS, τα πλακίδια επωάστηκαν με συζυγές υπεροξειδάσης κοχλιαρίας πολυμερές για επιπλέον 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθως, βάφτηκαν με 3,3-διαμινοβενζιδίνη και αντίθετα με αιματοξυλίνη (Sigma-Aldrich, ΗΠΑ).

Κυτταρική καλλιέργεια

ΗΕΚ293 κύτταρα και τα κύτταρα Α549 αναπτύχθηκαν και διατηρήθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο Eagle που μέσο (ϋΜΕΜ, Invitrogen, ΗΠΑ) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS, Gibco, US), πενικιλλίνη 100 U /ml και στρεπτομυκίνη 100 μg /ml (Gibco).

Κατασκευή του πλασμιδίου και ανασυνδυασμένων φακοϊό

το ανθρώπινο

ΝΡ-κΒ

θραύσμα (ρ65) γονίδιο ενισχύθηκε με PCR κλωνοποιήθηκε σε pcDNA3 και η εισαγωγή επιβεβαιώθηκε με αλληλούχιση. Στη συνέχεια, το πλασμίδιο pcDNA-NF-κΒ υπέστη πέψη με EcoRI /XbaI. Τα πέψη προϊόντα υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Η

ΝΡ-κΒ

θραύσμα γονιδίου καθαρίστηκε με εκχύλιση πήγματος και ακολούθως κλωνοποιήθηκε εντός pLVX-IRWS-ZsGreen1. Ένα κατασκεύασμα shRNA στόχευσης ΝΡ-κΒ κλωνοποιήθηκε επίσης σε pLVX-IRWS-ZsGreen1. Ανασυνδυασμένη φακοϊούς Lenti-shNF-κΒ και Lenti-NF-κΒ παρήχθησαν και τιτλοποιείται σύμφωνα με μια προηγούμενη έκθεση [14]. Ολόκληρο το ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης του

ΡΤΕΝ

με ή χωρίς το

miR-21

αλληλουχία στόχευσης στο 3’UTR κλωνοποιήθηκε εντός του φορέα pcCS2 με μια ετικέτα Myc να κατασκευάσει pcCS2-ΡΤΕΝ-3 ‘UTR και pcCS2-ΡΤΕΝ, αντίστοιχα.

Η επιμόλυνση του

miR-21

μιμείται και ο αναστολέας

Οι FAM-τροποποιημένα 2′-Ο-Me-ολιγονουκλεοτίδια συντέθηκαν χημικά και καθαρίστηκε με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (GenePharma, Κίνα). Η 2′-Ο-Me-miR-21 μιμητικό αποτελούνταν από διπλά RNA με την ακόλουθη αλληλουχία: 5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3 ‘? οι αλληλουχίες των 2′-Ο-me-miR-21 αναστολέα και 2′-Ο-me-περιπλεγμένο ολιγονουκλεοτίδια ήταν ως εξής: 5’-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3 ‘? και 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3 ‘. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 24 φρεατίων σε πυκνότητα 5 χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο και αναπτύχθηκαν σε 80% συρροή. Ο αναστολέας miR-21 ή miR-21 μιμείται σε συγκέντρωση 50 ηΜ κάθε διαμολύνθηκε σε κύτταρα χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) με επώαση σε μέσα Opti-ΜΕΜ Ι (Invitrogen) για 4 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας. Μετά από επώαση για 24 ώρες, το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε και φθορίζουσες εικόνες ελήφθησαν για την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της επιμόλυνσης. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για ανάλυση.

Real-time PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen) ακολουθώντας τις συστάσεις του κατασκευαστή. Για

miR-21

qRT-PCR, ολικό RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας ένα miRNA-ειδικό εναρκτήρα και το κιτ miScript Αντίστροφη Μεταγραφή (Qiagen, Germany). Stem-loop qRT-PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του SYBR πράσινο PCR Master Mix (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Σχετική έκφραση αξιολογήθηκε με τη συγκριτική μέθοδο Ct και ομαλοποιήθηκε ως προς την έκφραση της U6 μικρού πυρηνικού RNA. Για την ανίχνευση του

ΡΤΕΝ

, αντίστροφη μεταγραφή διεξήχθη με τη χρήση του κιτ πρώτου κλώνου σύνθεση cDNA (Promega, ΗΠΑ) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. qRT-PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του QuantiFast SYBR Green PCR Kit (Qiagen). Η

GAPDH

επίπεδο mRNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι αντιδράσεις χωρίς cDNA χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος μη-πρότυπο, και μη-RT έλεγχοι επίσης συσταθεί για να αποκλείσει γενωμικού DNA μόλυνση. Η σχετική ποσοτικοποίηση της έκφρασης mRNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη συγκριτική μέθοδο Ct.

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (Cell Signaling Tech-., ΗΠΑ). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ BCA (Beyotime, Κίνα). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε SDS-PAGE και μετά μεταφέρθηκαν σε 0,45 μπι μεμβράνες PVDF (Bio-Rad, ΗΠΑ). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 5% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) σε ρυθμισμένο με Tris αλατούχο διάλυμα με Tween 20 ρυθμιστικό διάλυμα (TBST) επί 2 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: αντι-ΡΤΕΝ (1: 1000, Tech. κυττάρων σηματοδότηση), αντι-ολική Akt (1: 1000, Abcam), αντι-φωσφόρου Ser473 Akt (1: 1000, Abcam) και αντι-GAPDH (1: 1000, Tech κυττάρων-σηματοδότηση), η οποία χρησίμευσε ως. ένας έλεγχος φόρτωσης. Στη συνέχεια, οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές με TBST και επωάστηκαν με συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου δευτερεύον αντίσωμα (IgG αίγας αντι-κουνελιού (1: 5000) ή αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG (1:. 5000)? Tech κυττάρων σηματοδότηση) για 2 h σε θερμοκρασία δωματίου. Οι κηλίδες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ χημειοφωταύγειας (Millipore, ΗΠΑ) και εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ. Οι ζώνες για την ταινία σαρώθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Image J.

φορέα λουσιφεράσης κατασκευή

Το ανθρώπινο

PTEN

3’UTR που περιέχει την ακολουθία σπόρο του

miR -21

θέσεις σύνδεσης ενισχύθηκε με PCR και κλωνοποιήθηκε εντός του φορέα pMIR-REPORT (Ambion, USA) μεταξύ των θέσεων HindIII και Spel για την ανάπτυξη του φορέα λουσιφεράσης pMIR-ΡΤΕΝ-3′-UTR. αλληλουχίες Seed μεταλλάχθηκαν με επέκταση επικάλυψης PCR. Το μεταλλαγμένο θραύσμα ΡΤΕΝ-3′-UTR κλωνοποιήθηκε εντός του φορέα pMIR-REPORT για την ανάπτυξη της pMIR-ΡΤΕΝ-mut-3′-UTR φορέα. Μια σειρά κατασκευασμάτων ρεπόρτερ με το ίδιο 3 ‘άκρο, αλλά διαφορετικό 5’ άκρο του υποκινητή miR-21 ενισχύθηκαν με PCR. Όλα τα προϊόντα PCR κλωνοποιήθηκαν στο πλασμίδιο pGL4-Minimal (Promega) για να δημιουργήσει pGL4-miR-21. Η μεταλλαγμένη θέση εισήχθη στο πλασμίδιο με επέκταση επικάλυψης PCR. Η επακόλουθη PCR προϊόν κλωνοποιήθηκε για να δημιουργήσει pGL4-mut-miR-21. Όλα τα κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση DNA.

δραστικότητα λουσιφεράσης

Τα κύτταρα σε πυκνότητα 2 × 10

5 ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα. Για τον προσδιορισμό

miR-21

, τα κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν με 0,8 μg του pMIR-PTEN-3′-UTR ή pMIR-PTEN-mut-3′-UTR, 50 nM miR-21 μιμούνται ή αναστολέα ή ομελέτα ολιγονουκλεοτίδιο μαζί με 50 ng του φορέα ρΚί-ΤΚ ως ένας εσωτερικός έλεγχος χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Για τη δοκιμασία προαγωγού, τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με 1 μα pcNF-κΒ ή pcDNA, 20 ng ενός πλασμιδίου αναφοράς λουσιφεράσης και 10 ng του πλασμιδίου αναφοράς λουσιφεράσης Renilla (Promega). Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μία διπλή δοκιμασία λουσιφεράσης (Promega, USA). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [15]. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές εις τριπλούν.

δοκιμασία ChIP

Η δοκιμασία ChIP πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Magna ChIP A /G (Millipore) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα Α549 ήταν διασυνδεδεμένη με 1% φορμαλδεΰδη (Sigma-Aldrich) για 10 λεπτά και αποσβέστηκε με γλυκίνη. Τα εγκάρσια συνδεδεμένα κύτταρα συλλέχθηκαν σε ψυχρό PBS και κατεργασία με υπερήχους για έξι 15-s παλμούς σε 50 s διαστήματα για να μειωθεί το συνολικό μέγεθος του DNA προς 200-1000 bp. Η ψαλιδισμένα χρωματίνη και μαγνητικά σφαιρίδια ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-ΝΡ-κΒ (ab7970? Abcam, USA) ή κανονικό IgG κουνελιού όλη τη νύκτα στους 4 ° C σε περιστροφέα. Μαγνητική χάντρα-αντισώματος-χρωματίνης σύμπλοκα πλύθηκαν άπαξ με ρυθμιστικό χαμηλής περιεκτικότητας σε αλάτι, που ακολουθείται διαδοχικά από υψηλή συγκέντρωση άλατος, LiCl και ΤΕ ρυθμιστικά. Τα σύμπλοκα χρωματίνη εκλούσθηκαν και επωάστηκαν στους 62 ° C για 2 ώρες. Τα δείγματα DNA ανακτήθηκαν χρησιμοποιώντας στήλες περιστροφής. Για δείγματα ChIP, σε πραγματικό χρόνο PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας την μέθοδο SYBR όπως περιγράφηκε παραπάνω.

3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλτετραζόλιο βρωμίδιο (ΜΤΤ)

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 5000 κυττάρων ανά φρεάτιο. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 100 ηΜ miR-21 μιμούνται, miR-21 αναστολέα ή ομελέτα ολιγονουκλεοτίδιο. Για πειράματα συνδυασμό με το miR-21 μιμούνται και ροϋΝΑ-ΡΤΕΝ, τα κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν με pcDNA-ΡΤΕΝ (0,2 μg). Το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​πλήρες μέσο με ή χωρίς σισπλατίνη (5 μΜ) σε 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση σύμφωνα με μια προηγούμενη έκθεση [16]. Μετά επιπλέον 24 ώρες, 20 μΙ 5 mg /mL ΜΤΤ (θειαζολυλο διμεθυλο διφαινυλο τετραζόλιο? Sigma-Aldrich) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 4 ώρες σε υγροποιημένο επωαστή. Το υπερκείμενο στη συνέχεια απορρίφθηκε, και 200 ​​μι DMSO προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο για να διαλυθεί το φορμαζάνιο. Η οπτική πυκνότητα (OD) μετρήθηκε στα 490 nm. Η βιωσιμότητα των κυττάρων χωρίς καμία θεραπεία ορίστηκε ως 100%, και η βιωσιμότητα των άλλων ομάδων υπολογίστηκε χωριστά από εκείνη των κυττάρων ψευδο.

Στατιστικά

Οι συνεχείς μεταβλητές παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD και προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) που ακολουθείται από μια post-hoc

t-test

χρησιμοποιώντας SPSS 13.0 λογισμικού. Η συσχέτιση μεταξύ του ποσοστού επιβίωσης και

miR-21

έκφραση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση πολλαπλής λογιστικής παλινδρόμησης, συμπεριλαμβανομένων των εξής παράγοντες: την ηλικία, το φύλο, καπνιστής και ιστολογία. Η ανάλυση Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει το ρυθμό ελεύθερη συμβαμάτων επιβίωση και την πρωτογενή βατότητα. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε ως

P

αξία μικρότερη από 0,05.

Αποτελέσματα

miR-21

υπερεκφράζεται σε NSCLC ιστούς των πνευμόνων

πνεύμονα ιστών από 34 ασθενείς με NSCLC και 10 ασθενείς χωρίς NSCLC χρησιμοποιήθηκαν για να κάνουν την TMA. Τα κλινικά χαρακτηριστικά των ατόμων φαίνονται στον Πίνακα 1. Η έκφραση του

miR-21

ανιχνεύθηκε με ISH. Η ένταση του

miR-21

χρώσης ήταν σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα NSCLC. Το σκορ ήταν σημαντικά αυξημένη σε ασθενείς με ΜΜΚΠ (Σχήμα 1Α και Β?.

P

& lt? 0,05). Επιπλέον, ο χρόνος επιβίωσης ήταν μειωμένη σε ασθενείς με ΜΜΚΠ που είχαν ένα υψηλό επίπεδο

miR-21

σε σύγκριση με εκείνους που είχαν χαμηλό επίπεδο του

miR-21

(Σχήμα 1Γ?.

P

& lt?. 0.05)

(Α) ISH χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του miR-21 σε ένα TMA με 34 NSCLC και 10 δείγματα φυσιολογικού πνεύμονα. Αριστερό πάνελ ήταν ISH και το δεξί πάνελ ήταν χρώση HE. (Β) Η βαθμολογία ένταση χρώσης ήταν υψηλότερη σε ασθενείς με NSCLC σε σύγκριση με τα φυσιολογικά άτομα. (Γ) Ο χρόνος επιβίωσης των ασθενών με υψηλό επίπεδο miR-21 ήταν μικρότερη από ό, τι ο οποίος με το χαμηλό επίπεδο των miR-21. *

P

& lt? 0.05 ως σημαντική διαφορά

Η

miR-21

ρυθμίζει την επιβίωση των κυττάρων Α549

Το

miR-21

μιμείται χρησιμοποιήθηκαν για να αντιπροσωπεύουν εξωγενείς

miR-21

, και το

miR-21

αναστολέα χρησιμοποιήθηκε για την αναστολή της ενδογενούς

miR-21

. Το επίπεδο του

miR-21

στα κύτταρα Α549 ανιχνεύθηκε με PCR πραγματικού χρόνου (Εικ. 2Β). Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία ΜΤΤ για να αξιολογηθεί η κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων Α549 όταν εκτίθενται σε σισπλατίνη θεραπεία. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2C, η κυτταρική βιωσιμότητα ήταν σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα που θεραπεύονται με

miR-21

μιμείται σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Αναστολή της

miR-21 από

αναστολέα του μείωσε την βιωσιμότητα των κυττάρων σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου.

Τα κύτταρα στον έλεγχο, miR-21 μιμείται και miR-21 αναστολέα επιμολύνθηκαν με 100 ηΜ περιπλεγμένο ολιγονουκλεοτιδίων, miR-21 μιμούνται και ο αναστολέας miR-21, αντίστοιχα. (Α) Χρονικός άξονας του πειράματος. Η κωδικοποιημένα ολιγονουκλεοτίδιο, miR-21 μιμητικό ή αναστολέα δόθηκε 4h πριν από τη θεραπεία cisplatin (5 μΜ). Και 48 ώρες μετά τη θεραπεία σισπλατίνη, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. (Β) Η έκφραση του mRNA του ΡΤΕΝ ήταν αντιστρόφως ανάλογη με το miR-21. (C) miR-21 μιμείται αυξηθεί η βιωσιμότητα των κυττάρων, ενώ αναστολέας miR-21 μειώθηκε όταν τα κύτταρα εκτίθενται σε σισπλατίνη θεραπεία. (D) κηλίδωση Western του ΡΤΕΝ, ολική Akt (t-Akt) και φωσφόρου Ser473 Akt. (Ε) Γραφική αναπαράσταση του ΡΤΕΝ, t-Ακί και φωσφόρου Akt. miR-21 μείωσε την έκφραση της ΡΤΕΝ και αύξησε την αναλογία φωσφόρου-Akt. * Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, # σε σύγκριση με το miR-21 μιμούνται ομάδα.

P

& lt?. 0.05 ως σημαντική διαφορά

Η

miR-21

ρυθμίζει

PTEN

έκφραση μέσω σύνδεσης με 3′-UTR της

βιοπληροφορική μια αναζήτηση έδειξαν ότι το

PTEN

, ένα γονίδιο καταστολής όγκων, ήταν ένας πιθανός στόχος για

miR-21

επειδή υπήρχε ένα υποθετικό

miR-21

-σύνδεση ακολουθία σπόρων εντός της 3’UTR του

ΡΤΕΝ

mRNA (Εικ. 3Α). Μετρήσαμε το mRNA (σχ. 2Β) και τα επίπεδα πρωτεΐνης του ΡΤΕΝ (Εικ. 2D) στα κύτταρα Α549 με ένα υψηλό ή χαμηλό επίπεδο miR-21. Αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του

miR-21

έκφρασης και

εντοπίστηκε ΡΤΕΝ

έκφραση του mRNA.

Akt

είναι κατάντη του

PTEN

, και επηρέασε επίσης την ενεργοποίηση του

Akt

(Εικ. 2D και Ε). Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου,

miR-21

μιμείται μείωσε τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης, ενώ το

miR-21

αναστολέας παρουσίασαν σημαντική αύξηση της σχετικής δραστηριότητας λουσιφεράσης. Όταν η ακολουθία σπόρος του

miR-21

θέσεις δέσμευσης μεταλλάχθηκε, η επίδραση του

miR-21

σχετικά με τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης δεν ανιχνεύθηκε (Σχ. 3Β). Στη συνέχεια, ολόκληρο το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης του

ΡΤΕΝ

με ή χωρίς το

miR-21

αλληλουχία στόχευσης στο 3’UTR κλωνοποιήθηκε σε pcCS2. Η

Myc

επίπεδο, το οποίο αντιπροσώπευε εξωγενείς

PTEN

, μειώθηκε από το

miR-21

μιμείται στα κύτταρα επιμολυσμένα με pcCS2-PTEN-3’UTR, ενώ υπάρχει δεν ήταν σημαντική μείωση

Myc

έκφρασης με

miR-21

μιμείται στα κύτταρα επιμολυσμένα με pcCS2-ΡΤΕΝ (Εικ. 3C και D). Τα αποτελέσματα αυτά συνεπάγεται ότι

miR-21

ρυθμίζεται η έκφραση του

PTEN

σε κύτταρα Α549 μέσω στοχεύουν την αλληλουχία του PTEN 3’ΙΙΤΡ.

(Α) Κατασκευή 3 ‘UTR και μεταλλαγμένα 3’UTR του PTEN σε φορέα pMIR-ΕΚΘΕΣΗ. (Β) Στα κύτταρα επιμολυσμένα με pMIR-ΕΚΘΕΣΗ-PTEN-3’UTR, η δράση της λουσιφεράσης αυξήθηκε κατά miR-21 και μειώθηκαν κατά αναστολέας miR-21. Στα κύτταρα επιμολυσμένα με pMIR-REPORT-ΡΤΕΝ-mut-3’UTR, η δραστικότητα της λουσιφεράσης παρέμεινε καμία σημαντική διαφορά μεταξύ των τριών ομάδων. (Γ) Το ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης του ΡΤΕΝ, με ή χωρίς 3’UTR κλωνοποιήθηκε σε φορέα pCS2. Μια ετικέτα Myc συνδέθηκε προς ΡΤΕΝ να διακρίνουν την ενδογενή ή εξωγενή ΡΤΕΝ. (D) Γραφική αναπαράσταση της Myc έδειξε ότι η υπερέκφραση του miR-21 μειωμένη έκφραση Myc ενώ αναστολέας miR-21 αυξημένη έκφραση του. Ενώ η PTEN 3’ΙΙΤΡ ήταν νοκ άουτ, η έκφραση της ΡΤΕΝ δεν επηρεάστηκε από miR-21. * Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, # σε σύγκριση με το miR-21 μιμούνται ομάδα.

P

& lt?. 0.05 ως σημαντική διαφορά

Η

NF-κΒ ρυθμίζει την έκφραση του miR-21 μέσω της δέσμευσης του υποκινητή

Δεδομένου του ρόλου του

miR-21

στο NSCLC, έχουμε ως στόχο να διερευνήσει τον μηχανισμό της υπερέκφραση του

miR-21

σε NSCLC. Η ανάλυση βιοπληροφορικής πρότεινε τέσσερις πιθανές δεσμευτικές στοιχεία του ΝΡ-κΒ στην περιοχή προαγωγέα του

miR-21

γονιδίου (Σχ. 4Α). Η δοκιμασία ChIP σε πραγματικό χρόνο έδειξαν ότι το επίπεδο του NF-κΒ αντίσωμα που συνδέεται με το

miR-21

υποστηρικτής ήταν περισσότερο από ό, τι εκείνη της IgG (Σχήμα 4C,

P

& lt?. 0.05) , υποδεικνύοντας ότι ΝΡ-κΒ θα μπορούσε να συνδεθεί άμεσα με τα τέσσερα στοιχεία της περιοχής προαγωγέα του

miR-21

γονίδιο. Στη συνέχεια, υποκλωνοποιήθηκε διαφορετικά μήκη του

miR-21

υποκινητή και μετάλλαξη του σε pGL4 και συνδιαμολύνονται τα κατασκευάσματα με Renilla με ή χωρίς pcNF-κΒ σε κύτταρα Α549. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Β, pcNF-κΒ αύξησε σημαντικά τη δραστικότητα της λουσιφεράσης σε σχέση με pcDNA. Όταν το πρώτο στοιχείο πρόσδεσης (-2837) διαγράφηκε ή μεταλλαγμένες, δεν υπήρχε μείωση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης σε σχέση με τον υποκινητή πλήρους μήκους. Όταν το δεύτερο στοιχείο (-1211) διαγράφηκε ή μεταλλαγμένες, υπήρχε σημαντική μείωση στην δραστικότητα λουσιφεράσης. Όταν το τρίτο στοιχείο έχει διαγραφεί ή μεταλλαχθεί, δεν υπήρχε σημαντική μείωση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης σε σύγκριση με όταν απομακρύνθηκε το δεύτερο στοιχείο. Ωστόσο, όταν οι δεσμευτικές αλληλουχίες του ΝΡ-κΒ ήταν όλα διαγραφεί ή μεταλλαχθεί, υπήρχε επίσης σημαντική μείωση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης σε σύγκριση με όταν το δεύτερο στοιχείο έχει διαγραφεί ή μεταλλαχθεί. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το δεύτερο και το τέταρτο δεσμευτικά στοιχεία μπορεί να συμβάλει στη ρύθμιση της

miR-21

μεταγραφή από NF-κΒ.

(Α) Το πλήρες μήκος του miR-21 έχει τέσσερις NF -κB δεσμευτικά στοιχεία. Διαφορετικές μήκη miR-21 υποκινητή κλωνοποιήθηκαν σε φορέα pGL4. Τα τέσσερα στοιχεία μεταλλάχθηκαν ξεχωριστά και οι μεταλλαγμένες υποκινητές κλωνοποιήθηκαν επίσης στο διάνυσμα pGL4. (Β) Η σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης σε κύτταρα Α549 συνεπιμολύνθηκαν με pcNF-κΒ και pGL4 εκθέσεων φορέα. (C) Δοκιμασία ChIP πραγματικό χρόνο έδειξαν ότι το ΝΡ-κΒ αντίσωμα δεσμεύει περισσότερο DNA από το κανονικό IgG. Primer 1 έως 4 σημαίνει ότι το αστάρι περιείχε τα τέσσερα στοιχεία δέσμευσης NF-κΒ από ανάντη προς κατάντη. *

P

& lt?. 0.05 ως σημαντική διαφορά

Η

Το μονοπάτι ΝΡ-κΒ /miR-21 /PTEN ρυθμίζει την ευαισθησία των κυττάρων Α549 με σισπλατίνη

Η επίπεδο του

miR-21

προκλήθηκε με υπερέκφραση του NF-κΒ και αναστέλλεται από Lenti-shNF-κΒ, η οποία μείωσε την έκφραση του NF-κΒ (Εικ. 5Α).

ΡΤΕΝ

έκφραση ήταν αντιστρόφως συσχετίζεται με την έκφραση ΝΡ-κΒ (Εικ. 5Α). Η κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων Α549 αυξήθηκε σημαντικά από την Lenti-NF-κΒ όταν εκτίθεται σε σισπλατίνη θεραπεία (Εικ. 5Β). Στα κύτταρα επιμολυσμένα με pcCS2-ΡΤΕΝ να υπερεκφράζουν

ΡΤΕΝ

, τα αποτελέσματα της υπερέκφρασης του ΝΡ-κΒ ή

miR-21

στην κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων Α549 αναστάλθηκε (Εικ. 5C) .

(Α) εκφράσεις mRNA του ΝΡ-κΒ, miR-21 και ΡΤΕΝ στα κύτταρα μεταδιεγείρονται με Lenti-ελέγχου, Lenti-NF-κΒ και Lenti-shNF-κΒ. Το επίπεδο miR-21 ήταν σημαντικά αυξημένη ενώ η ΡΤΕΝ μειώθηκε στα κύτταρα μεταδιεγείρονται με Lenti-NF-κΒ σε σύγκριση με τον φορέα ελέγχου. Το επίπεδο miR-21 μειώθηκε σημαντικά, ενώ η ΡΤΕΝ μειώθηκε στα κύτταρα μεταδιεγείρονται με Lenti-NF-κΒ. βιωσιμότητας (Β) Cell αυξήθηκε κατά Lenti-NF-κΒ, ενώ μειώθηκε κατά Lenti-shNF-κΒ. (Γ) Η υπερέκφραση του ΡΤΕΝ αποκατέστησε την ευαισθησία των κυττάρων Α549 σε θεραπεία cisplatin σε σύγκριση με υπερέκφραση του NF-κΒ ή miR-21. * Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, # σύγκριση με την ομάδα Lenti-NF-κΒ.

P

& lt?. 0.05 ως σημαντική διαφορά

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι

miR-21

ρυθμίζεται αυξητικά σε ασθενείς με NSCLC, υποδεικνύοντας μία κακή πρόγνωση. Επιπλέον, βρέθηκε ότι

miR-21

προκάλεσε την αντίσταση της κυτταρικής γραμμής NSCLC στη σισπλατίνη μέσω στόχευση του 3’UTR του

ΡΤΕΝ

να μειώσει την έκφραση της μετα-μεταγραφικά. Επιπλέον, ΝΡ-κΒ μετατίθεται στον πυρήνα και συνδέεται σε συγκεκριμένα στοιχεία του στο

miR-21

προαγωγό γονιδίου για την επαγωγή

miR-21

έκφρασης. Τέλος, η διαμόρφωση του μονοπατιού /miR-21 /ΡΤΕΝ ΝΡ-κΒ αύξησε την ευαισθησία των κυττάρων NSCLC σε θεραπεία cisplatin. Τα στοιχεία μας μπορεί να παρέχει νέες γνώσεις σχετικά με την παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς του NSCLC και προτείνει ένα νέο στόχο φάρμακο για NSCLC.

miR-21

έχει βρεθεί ότι υπερεκφράζεται σε πολλούς τύπους συμπαγών όγκων, συμπεριλαμβανομένων καρκίνο του ήπατος, καρκίνο του προστάτη και του παχέος εντέρου. Στην παρούσα μελέτη μας, εξάγαμε ιστών από ασθενείς με NSCLC και την ομάδα ελέγχου για την εκτέλεση TMA. Το αποτέλεσμα ISH ανίχνευσε ένα υψηλότερο επίπεδο

miR-21

σε ασθενείς με NSCLC σε σύγκριση με τον έλεγχο υποκείμενα. Επιπλέον, το υψηλό επίπεδο των

miR-21

έδειξε μια κακή πρόγνωση για τους ασθενείς με NSCLC. Αυτό υποστηρίζεται από πολλές προηγούμενες μελέτες. Στην Μάρκου et al. μελέτη, 48 NSCLC δείγματα φρέσκου-κατεψυγμένου ιστού συλλέχθηκαν για την ανίχνευση

miR-21

έκφραση με πραγματικού χρόνου PCR, και διαπιστώθηκε ότι

miR-21

ρυθμίζεται αυξητικά σε 16 από 29 ( 55,2%) υποτροπίασαν ασθενείς και 15 από 23 (65,2% ασθενών που απεβίωσαν [17]). Επιπροσθέτως, σε μη-καπνιστές, το παρεκκλίνοντα αυξημένη έκφραση του

miR-21

βρέθηκε να συμβάλει στην καρκινογένεση του πνεύμονα [18]. Δύο μετα-αναλύσεις συνοψίζονται τα δεδομένα από διάφορες μελέτες και κατέληξε στο συμπέρασμα ότι η υπερέκφραση του

miR-21

ήταν ένα ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα για NSCLC [19], ιδιαίτερα στις ασιατικές άτομα [20].

Για να κατανοήσουν την επίδραση του

miR-21

για NSCLC,

χρησιμοποιήθηκαν miR-21

μιμείται και ο αναστολέας της, αντίστοιχα, να ενισχύσει και να αναστέλλουν βιολογική λειτουργία της στην Α549 κυτταρική σειρά NSCLC. Διαπιστώθηκε ότι η εξωγενής

miR-21

προωθείται επιβίωση κυττάρου όταν εκτίθεται σε θεραπεία σισπλατίνη, ενώ

miR-21

αναστολή οδήγησε στο αντίθετο λειτουργία. Τα ευρήματα αυτά έχουν επικυρωθεί από μια μελέτη, η οποία έδειξε ότι τα αυξημένα

miR-21

αύξησε την αντίσταση των κυττάρων Α549 σε πλατίνα, ενώ μειώνεται

miR-21

μειωθεί αυτή η αντίσταση [21]. Με βάση τις ανωτέρω διαπιστώσεις,

miR-21

θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος για NSCLC. Ο υποκείμενος μηχανισμός της σισπλατίνης αντίσταση του NSCLC είναι περίπλοκη, και

miR-21

έχει επίσης πολλαπλούς στόχους, σύμφωνα με την ανάλυση της βιοπληροφορικής. Να διερευνήσει την επίδραση της Ι σχετικά με NSCLC πριν προχωρεί περαιτέρω στο στάδιο της κλινικής εφαρμογής, δύο βασικά ερωτήματα παραμένουν:. Πώς επηρεάζει το αποτέλεσμα των NSCLC, και πώς ρυθμίζεται αυξητικά στον NSCLC

μελέτες

Βιοπληροφορική συνιστούν στόχο ιστοσελίδα του

miR-21

στην 3’UTR του

PTEN

mRNA. Ι είναι ένα πανταχού παρόν ογκοκατασταλτικού γονιδίου, και η απορρύθμιση τα αποτελέσματά της σε πολλούς συμπαγείς όγκους. Στο NSCLC, μου έχει ενοχοποιηθεί ως βασικός παράγοντας για την παθογένεια και την ανάπτυξη του όγκου [22].

PTEN

απώλεια έχει αναγνωριστεί ως ο μηχανισμός gefitinib αντίστασης σε NSCLC [23]. Στοχευμένη διαγραφή του

PTEN

οδηγεί στην ανάπτυξη των NSCLC [24]. Ως εκ τούτου, θεωρήθηκε ότι

miR-21

, η οποία αναστέλλει

PTEN

στοχεύοντας 3’ΙΙΤΡ της, θα μπορούσε να επηρεάσει την παθολογική διαδικασία NSCLC. Εμείς εντοπίστηκαν αρχικά μια αντίστροφη σχέση μεταξύ του

miR-21

και

PTEN

σε κύτταρα Α549. Στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε το 3’UTR του

PTEN

στον ανταποκριτή λουσιφεράσης pMIR-REPORT και διαπίστωσε ότι

miR-21 μειώθηκαν

μιμείται σημαντικά δραστηριότητα λουσιφεράσης όταν συνεπιμολύνθηκαν με pMIR-ΕΚΘΕΣΗ-PTEN-3 ‘ UTR, ενώ καμία αλλαγή στη δραστηριότητα λουσιφεράσης σημειώθηκε όταν

miR-21

μιμείται συνεπιμολύνθηκαν με pMIR-ΕΚΘΕΣΗ-PTEN χωρίς την 3’UTR. Προηγούμενες μελέτες έχουν επίσης υποστηρίξει αυτή τη διαπίστωση [25,26]

Από τη μια πλευρά,

miR-21

ρυθμίζεται η έκφραση του

PTEN

.? Από την άλλη πλευρά, ήταν ρυθμίζονται από άλλους παράγοντες. Μερικά miRNAs έχουν τη δική τους υποκινητές, ενώ άλλοι μοιράζονται ένα προαγωγό με άλλα miRNAs για το γονίδιο miRNA που βρίσκεται στο ιντρόνιο του γονιδίου ξενιστή. Είτε miRNAs έχουν το δικό τους προαγωγούς ή προαγωγούς μετοχή, η έκφρασή τους μπορεί να ρυθμιστεί από ορισμένους παράγοντες μεταγραφής, συμπεριλαμβανομένων των ρ53 και NF-κΒ, που στοχεύουν υποκινητές τους. Υπάρχουν τέσσερις δεσμευτικές στοιχεία του NF-κΒ στο

miR-21

γονίδιο υποκινητή [27]. Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι

miR-21

θα μπορούσε να ρυθμιστεί με NF-κΒ στοχεύουν τα στοιχεία σύνδεσής του. δοκιμασία ChIP μας επιβεβαίωσαν ότι ΝΡ-κΒ θα μπορούσε να συνδεθεί άμεσα με τα τέσσερα στοιχεία στον προαγωγό του

miR-21

γονίδιο. Ωστόσο, μόνο τα στοιχεία που βρίσκονται στο -1211 και -404 του

miR-21

γονίδιο υποκινητή είχε βιολογική λειτουργία σύμφωνα με την δοκιμασία δραστικότητας λουσιφεράσης. Τα δεδομένα μας υποστηρίχθηκαν εν μέρει από εκείνα άλλων μελετών. Σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη, η ιντερφερόνη προκαλούμενη

miR-21

έκφραση απαιτείται NF-κΒ πρόσληψης /p65 για το

miR-21

υποκινητή [27]. Στο ανθρώπινο μητρικό MDA-MB-231 και του παχέος κυτταρικές σειρές HCT116 όγκου, NF-κΒ βρέθηκε επίσης να συνδεθούν με το

miR-21

γονίδιο υποκινητή [28]. Στο NSCLC, NF-κΒ εντοπίστηκε για πρώτη φορά για τη ρύθμιση της έκφρασης του

miR-21

με σύνδεση προς στοιχεία του στο

miR-21

γονίδιο υποκινητή.