Αφηρημένο

Εμείς προηγουμένως ορίζεται μακροφάγα που συγκομίζονται από την περιτοναϊκή κοιλότητα των άτριχων ποντικών με υποδόρια ανθρώπινων παγκρεατικών όγκων ως «όγκο μορφωμένοι-μακροφάγων» (EDU) και μακροφάγα που συλλέγονται από ποντίκια χωρίς όγκους ως «αφελή-μακροφάγα «(παρθένα), και απέδειξαν ότι Edu-μακροφάγα προωθείται ανάπτυξη και μετάσταση όγκου. Σε αυτή τη μελέτη, Εκπαί- και αφελής-μακροφάγα συγκρίθηκαν για την ικανότητά τους να ενισχύουν παγκρεατικό καρκίνο κακοήθειας σε κυτταρικό επίπεδο in vitro και in vivo. Η ανασταλτική αποτελεσματικότητα του zoledronic acid (ZA) για Edu-μακροφάγων-ενισχυμένη μετάσταση προσδιορίστηκε επίσης. XPA1 ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε Gelfoam συν-καλλιεργήθηκαν με Edu-μακροφάγα πολλαπλασιάστηκαν σε μεγαλύτερο βαθμό σε σύγκριση με κύτταρα που καλλιεργήθηκαν XPA1 με Naïve-μακροφάγα (

P

= 0,014). κύτταρα XPA1 εκτίθενται σε θρεπτικό μέσο που συλλέγεται από Edu πολιτισμού σημαντικά αυξημένο πολλαπλασιασμό (

P

= 0,016) και είχε περισσότερες δυνατότητες μετανάστευσης διέγερση (

P

& lt? 0.001) σε σύγκριση με καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με το προσαρμοσμένο μέσο από αφελής. Ο μιτωτικός δείκτης των κυττάρων XPA1, εκφράζουν GFP στον πυρήνα και RFP στο κυτταρόπλασμα, αυξήθηκε σημαντικά σε βιολογικό περιβάλλον με την παρουσία Εκπαί- συγκριτικά με τους απλοϊκούς-μακροφάγα (

P

= 0,001). Το zoledronic acid (ZA) σκοτώθηκαν δύο Edu και αφελής in vitro. Edu προωθείται ανάπτυξη και μετάσταση όγκου σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού της ανθρώπινης XPA1 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικής γραμμής. ΖΑ μειωμένη πρωτογενή ανάπτυξη του όγκου (

P

= 0.006) και εμπόδισε μετάσταση (

P

= 0.025) που προωθείται από Edu-μακροφάγα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ZA αναστέλλει ενισχυμένη πρωτογενή ανάπτυξη του όγκου και των μεταστάσεων του ανθρώπινου καρκίνου του παγκρέατος που προκαλείται από Edu-μακροφάγα

Παράθεση:. Χιροσίμα Υ, Maawy Α, Hassanein ΜΚ, Menen R, Momiyama Μ, Murakami T, et al . (2014) ο όγκος-μορφωμένοι-μακροφάγων Αύξηση της κακοήθειας του Ανθρώπου καρκίνο του παγκρέατος παρεμποδίζεται από το zoledronic acid. PLoS ONE 9 (8): e103382. doi: 10.1371 /journal.pone.0103382

Επιμέλεια: Keping Xie, Το Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Cancer Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 17, 2014? Δεκτές: 1, Ιουλίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 12 Αυγούστου 2014

Copyright: © 2014 Χιροσίμα et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου CA132971 επιχορήγησης και Αριθμοί JSPs KAKENHI Επιχορήγηση 26.830.081 σε Υ.Η., 26462070 για την Ι.Ε. και 24592009 για την Κ.Τ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Yukihiko Χιροσίμα, Shinji Miwa, Mako Yamamoto, Shuya Yano είναι θυγατρικές των αντικαρκινικών Inc. Mohamed K. Hassanein, Rhiana Menen, Masashi Momiyama, Fuminari Uehara και Takashi Chishima ήταν πρώην συνεργάτες των αντικαρκινικών Inc. Robert M. Hoffman είναι ένας μη μισθωτών θυγατρική αντικαρκινικών Inc. AntiCancer Inc. εμπορεύεται ζωικά μοντέλα καρκίνου. Δεν υπάρχουν άλλα ανταγωνιστικά συμφέροντα. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Το μικροπεριβάλλον του όγκου (TME) παίζει σημαντικό ρόλο στον καθορισμό της συμπεριφοράς του όγκου. Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι τα στρωματικά κύτταρα είναι απαραίτητα για μετάσταση να συμβεί [1]. Μια άλλη ένδειξη του ρόλου της ΤΜΕ σε επηρεάζουν τη συμπεριφορά του όγκου είναι ορθοτοπική εμφύτευση σε μοντέλα ποντικών του άθικτου ιστού του όγκου, συμπεριλαμβανομένης ολόκληρης στρώματος του όγκου, η οποία οδηγεί σε ένα πολύ υψηλότερο μεταστατικό ποσοστό σε σύγκριση με ορθοτοπική ένεση των καρκινικών κυττάρων και μόνο, όπου η μετάσταση είναι σπάνια [2], [3].

Tumor-σχετίζεται μακροφάγα έχουν δειχθεί ότι συσχετίζεται με κακή πρόγνωση σε διάφορες μελέτες [4], [5]. Τα μακροφάγα μπορεί να προωθήσει την εξέλιξη του όγκου μέσω χρόνιας φλεγμονής, αναδιαμόρφωση μήτρας, προαγωγή της καρκινικών κυττάρων εισβολής, ενδαγγείωση, αγγειογένεση, και σπορά σε απομακρυσμένες θέσεις [6]. Προσφύσεως αγγειακών κυττάρων μόριο-1 (VCAM-1) προάγει μετάσταση στους πνεύμονες στον καρκίνο του μαστού είναι δεμένα τα καρκινικά κύτταρα να μετάσταση στους πνεύμονες που συνδέονται με μακροφάγα [7], [8].

Το εργαστήριο μας προηγουμένως σύγκριση πρωτογενών και μεταστατικών ανάπτυξης του όγκου μετά την προσθήκη είτε του όγκου-αφελή-μακροφάγων (naïve) ή μακροφάγα προηγουμένως εκτεθεί σε καρκίνο του παγκρέατος σε ένα μοντέλο ποντικού, που ονομάζεται όγκο μορφωμένοι-μακροφάγων (EDU) [8].

προηγούμενα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι τα μακροφάγα επιρροή όγκους και όγκους επηρεάζουν μακροφάγα, και ότι Edu-μακροφάγα προωθούν την εξέλιξη του όγκου [8].

στην παρούσα μελέτη, Εκπαί- και αφελής-μακροφάγα συγκρίθηκαν για την ικανότητά τους να προάγουν κακοήθεια σε κυτταρικό επίπεδο in vitro και in vivo. Η αποτελεσματικότητα του ζολεδρονικού οξέος (ZA) να αναστέλλει Edu-μακροφάγων-ενισχυμένη κακοήθεια προσδιορίζεται επίσης.

Υλικά και Μέθοδοι

γραμμή κυττάρων και τον πολιτισμό τους όρους

Η XPA1 ανθρώπινου παγκρέατος καρκινική κυτταρική γραμμή χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη η οποία ήταν ένα είδος δώρο από τον Dr. Anirban Maitra στο Πανεπιστήμιο Johns Hopkins [6] – [16]. Η κυτταρική γραμμή XPA1 μετασχηματίστηκε να εκφράζουν σταθερά GFP στον πυρήνα και RFP στο κυτταρόπλασμα [9], [17], [18]. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 μέσο συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) και 2 mM γλουταμίνη (Gibco-BRL, Life Technologies Inc., Grand Island, ΝΥ). Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη (Gibco-BRL). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2 [19].

Ζώα

NOD /SCID ποντίκια και αθυμικά γυμνά ποντίκια (

ηυ /ηυ

), χρησιμοποιήθηκαν 4-6 εβδομάδες, (AntiCancer Inc., San Diego, CA). Τα διαγονιδιακά nude C57 /Β6-GFP ποντίκια (AntiCancer, Inc., San Diego, CA). που εκφράζουν πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) υπό τον έλεγχο του ενισχυτή προαγωγέα και του κυτταρομεγαλοϊού κοτόπουλο β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκαν επίσης [20] – [23]. Οι ποντικοί κρατήθηκαν σε μία εγκατάσταση φράγματος υπό διήθηση HEPA. Οι ποντικοί τράφηκαν με δίαιτα ΚΥΨΕΛΩΤΟ εργαστήριο τρωκτικών. Όλες οι χειρουργικές διαδικασίες και απεικόνισης πραγματοποιήθηκαν με τα ζώα αναισθητοποιούνται με ενδομυϊκή ένεση 0,02 ml από ένα διάλυμα 50% κεταμίνης, ξυλαζίνης 38%, και 12% ακεπρομαζίνης μηλεϊνικό. Όλες οι μελέτες σε ζώα έχουν διεξαχθεί με ένα Φροντίδα Ζώων και Χρήση Επιτροπή AntiCancer Θεσμικών (IACUC) -Πρωτόκολλο ειδικά εγκεκριμένο για αυτή τη μελέτη και σύμφωνα με τις αρχές και τις διαδικασίες που περιγράφονται στο Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων με αριθμό Διασφάλισης A3873-1.

η υποδόρια εμφύτευση των κυττάρων του όγκου

Ανθρώπινο XPA1 dual-χρώμα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και πλύθηκαν δύο φορές με μέσο χωρίς ορό. Τα κύτταρα (2 χ 10

6 σε 100 μΙ μέσα χωρίς ορό) ενέθηκαν υποδορίως, εντός 30 λεπτών από τη συγκομιδή, με την πάροδο των πλευρών σε διαγονιδιακά ποντίκια C57 γυμνούς /Β6-GFP ή μη διαγονιδιακά

ηυ /ηυ

ποντίκια μεταξύ 4 και 6 εβδομάδων. Υποδόρια όγκοι αφέθηκαν να αναπτυχθούν επί 2-4 εβδομάδες μέχρις ότου αρκετά μεγάλο για περαιτέρω πειράματα ή μετέπειτα ορθοτοπική εμφύτευση.

σε πραγματικό χρόνο απεικόνιση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των μακροφάγων ξενιστή και τα καρκινικά κύτταρα σε ζώντα ποντίκια

Αφού οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε ανωτέρω, ένα τόξο σχήματος τομή έγινε στο κοιλιακό δέρμα και, στη συνέχεια υποδόριο συνδετικό ιστό διαχωρίστηκε να ελευθερώσει το πτερύγιο του δέρματος χωρίς να τραυματίσει τον επιγαστρικό κρανιακή αρτηρία και φλέβα [24]. Το δέρμα-πτερύγιο διαδόθηκε και σταθερά σε μια επίπεδη βάση. κύτταρα XPA1-GFP-RFP (1 × 10

6 σε 100 μΙ μέσου) ψεκάστηκαν πάνω από την επιφάνεια του δέρματος-πτερύγιο ποντικών (Σχ. 1Α) [25]. Εικοσιτέσσερις ώρες αργότερα, η εσωτερική επιφάνεια του δέρματος πτερύγιο άμεσα παρατηρήθηκε με το FV1000 ομοεστιακό μικροσκόπιο (Olympus, Tokyo, Japan) με διέγερση από λέιζερ ημιαγωγού στα 473 nm για GFP και 559 nm για διέγερση RFP. εικόνες φθορισμού ελήφθησαν με τη χρήση του 20 × /1.0 XLUMPLFLN στόχου [26]. Ο αριθμός των φαγοκυτταρωθέντων και μιτωτικών καρκίνος κύτταρα μετρήθηκαν, και η μέση αριθμός υπολογίστηκε από πέντε οπτικά πεδία σε 20 × μεγέθυνση.

(Α) Διάγραμμα της απεικόνισης των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των μακροφάγων ξενιστή και τα καρκινικά κύτταρα σε ζώντα ποντίκια. GFP γυμνά ποντίκια με dual-χρώμα XPA1 υποδόρια όγκοι ήταν η πηγή της Edu-μακροφάγων. GFP άτριχων ποντικών χωρίς όγκους ήταν η πηγή της Naïve-μακροφάγων. Ένα δέρμα-πτερύγιο διαδόθηκε και σταθερά σε μια επίπεδη βάση. κύτταρα XPA1-GFP-RFP (1 × 10

6 σε 100 μΙ μέσου) ψεκάστηκαν πάνω από την επιφάνεια του δέρματος-πτερύγιο ποντικών. Εικοσιτέσσερις ώρες αργότερα, η εσωτερική επιφάνεια του δέρματος πτερύγιο άμεσα παρατηρήθηκε με το συνεστιακό μικροσκόπιο FV1000 (Olympus). Ράβδοι κλίμακας: 10 mm. GFP μακροφάγα υποδοχής και dual-χρώμα καρκίνος XPA1 κύτταρα παρατηρήθηκαν σε Naïve-μακροφάγων ποντικών (Β) και Edu-μακροφάγων ποντικών (C). Φαγοκυτταρώνονται καρκινικά κύτταρα (λευκό αιχμές βελών) και μιτωτική καρκινικά κύτταρα (κίτρινο αιχμές βελών) ανιχνεύθηκαν στις δύο ομάδες. Οι μέσες τιμές των phagocytosized και μιτωτικά κύτταρα καρκίνου υπολογίστηκαν από τέσσερα πεδία με στόχο μεγέθυνση 20 Χ (D και Ε). Μίτωση αυξήθηκε σημαντικά σε καρκινικά κύτταρα σε ποντίκια με Edu-μακροφάγα σε σύγκριση με καρκινικά κύτταρα σε ποντίκια με Naïve-μακροφάγα (

P

= 0,001). Πιο φαγοκυττάρωση των καρκινικών κυττάρων έτεινε να ανιχνεύονται σε ποντικούς με Naïve-μακροφάγα, (

P

= 0,061). Ράβδοι κλίμακας:. Των 20 μm

Η

μακροφάγων συγκομιδή

Τα διαγονιδιακά γυμνό C57 /Β6-GFP ποντίκια με τα dual-χρώμα XPA1-GFP-RFP υποδόρια όγκοι ήταν η πηγή για EDU-μακροφάγα . Διαγονιδιακά άτριχων ποντικών C57 /Β6-GFP χωρίς όγκους ήταν η πηγή για Naïve-μακροφάγα. Αφού οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε ανωτέρω, 6 ml RPMI ενέθηκε στο ενδοπεριτοναϊκή χώρο του κάθε ποντικού χρησιμοποιώντας μία σύριγγα 10 ml και οι ποντικοί αναδεύεται ήπια επί 5 λεπτά. Η σύριγγα στη συνέχεια επανεισαχθεί και όλα RPMI μέσο απομακρύνθηκε και τοποθετήθηκε σε ένα πλαστικό τρυβλίο petri. Τα πιάτα στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C για 4 ώρες. RPMI μέσο στη συνέχεια απομακρύνθηκε και κάθε πλάκα πλύθηκε 10-15 φορές με 10 ml PBS, ή μέχρις ότου όλα τα ερυθρά αιμοσφαίρια, ινοβλάστες, και άλλων κυτταρικών υπολειμμάτων αφαιρέθηκαν. Οι πλάκες οπτικοποιήθηκαν υπό μικροσκόπιο φθορισμού IX71 (Olympus, Tokyo, Japan), προκειμένου να επιβεβαιώσει την παρουσία μακροφάγων GFP που εκφράζουν. Τα μακροφάγα ξύστηκαν από το τριβλίο Petri, χρησιμοποιώντας μια λαστιχένια σπάτουλα, συλλέγονται με μια πλύση 10 ml PBS, και φυγοκεντρήθηκαν στις 850 rpm για 10 λεπτά. PBS στη συνέχεια απομακρύνθηκε και τα μακροφάγα επαναιωρήθηκαν σε RPMI.

δοκιμασίας πολλαπλασιασμού χρησιμοποιώντας 3D καλλιέργεια

Naïve- ή Edu-μακροφάγων συν-καλλιεργήθηκαν με dual-χρώμα καρκίνος XPA1-GFP-RFP κύτταρα, αλλά ήταν διαχωρισμένες μεταξύ τους με Gelfoam (Pharmacia & amp? Upjohn Company, ΜΙ, USA) (σχήμα 2Α).. Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα, οι εικόνες ελήφθησαν από την επιφάνεια προς το βάθος 200 μm, κάθε 1 μm, με το συνεστιακό μικροσκόπιο FV1000. Οι εικόνες στοιβάζονται κατά μήκος του άξονα Ζ, και ο μέσος αριθμός των καρκινικών κυττάρων υπολογίστηκε από τρία οπτικά πεδία σε 20 × μεγέθυνση.

(Α) Ένα σχήμα του διαχωρισμένου συστήματος συν-καλλιέργειας με τη χρήση Gelfoam. Naïve- ή Edu-μακροφάγων συν-καλλιεργήθηκαν με dual-χρώμα καρκίνος XPA1 GFP-RFP κύτταρα, αλλά ήταν διαχωρισμένες μεταξύ τους με Gelfoam. Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα, οι εικόνες ελήφθησαν από την επιφάνεια προς το βάθος 200 μm, κάθε 1 μm, και ήταν στοιβάζονται κατά μήκος του άξονα Ζ. (Β) Εκπρόσωπος Z-stack εικόνα χρησιμοποιώντας μια αντικειμενική μεγέθυνση 20 ×. (Γ) Ο μέσος αριθμός των καρκινικών κυττάρων υπολογίστηκε από τρία πεδία των εικόνων Z-stack με μεγέθυνση του αντικειμενικού φακού 20 ×. Ο αριθμός των καρκινικών κυττάρων σε επεξεργασία με Edu-μακροφάγα αυξημένη σε σύγκριση με τον αριθμό των καρκινικών κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με Naïve-μακροφάγα (

P

= 0,014). (D) MTS δοκιμασία πολλαπλασιασμού. Ρυθμισμένο μέσο συλλέχθηκε από κάθε τύπο μακροφάγων καλλιεργήθηκαν σε RPMI χωρίς ορό για 72 ώρες. Το μέσο καλλιέργειας από τα καρκινικά κύτταρα αφαιρέθηκε από τα φρεάτια και προστέθηκε το ρυθμισμένο μέσο. Βιώσιμα αριθμοί των καρκινικών κυττάρων υποδεικνύεται με τον προσδιορισμό MTS σε διάφορα χρονικά σημεία. Η γραφική παράσταση γραμμή υποδεικνύει την σχετική ρυθμό πολλαπλασιασμού της κάθε ομάδας. Ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των Edu-μακροφάγων-condition-μέσο-θεραπεία καρκινικών κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερη από τον έλεγχο ή Naïve-μακροφάγων-Fi-μέσο-θεραπεία καρκινικών κυττάρων. Μαύρα διαμάντια: Αφελής? λευκό τετράγωνο: Edu, λευκό τρίγωνο: ομάδα ελέγχου. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01 (vs. ομάδα ελέγχου). (Ε) Τραυματίστηκαν περιοχές μετρήθηκαν για 72 ώρες μετά από ξύσιμο του μονοστιβάδα των κυττάρων του καρκίνου και της θεραπείας με το ρυθμισμένο μέσο από κάθε τύπο μακροφάγων. (F) Edu-μακροφάγων-ρυθμισμένο μέσο κατεργασμένα κύτταρα καλύπτονται σημαντικά μεγαλύτερη περιοχή του τραύματος από ό, τι σε άλλες ομάδες σε κάθε χρονικό σημείο. Διαγράμματα είναι γραφικές παραστάσεις των τραυματιών περιοχές της κάθε ομάδας μετριέται με το ImageJ από τρία τυχαία σημεία σε 3 ημέρες. Τα δεδομένα από τρία πειράματα επανάληψης παρουσιάζονται ως μέση ± SD (η = 5). *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01 (vs. ομάδα ελέγχου)

Η

MTS πολλαπλασιασμό δοκιμασία

XPA1 -ΟΡΡ-RFP κύτταρα στην εκθετική φάση ανάπτυξης θρυψινοποιήθηκαν για να αποδώσει ένα κυτταρικό εναιώρημα και σπάρθηκαν πάνω σε πλάκες 96 φρεατίων (1 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) εις τριπλούν. Ρυθμισμένο μέσο συλλέχθηκε από κάθε είδος των μακροφάγων καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 με 10% FBS για 72 ώρες. Το μέσο καλλιέργειας απομακρύνθηκε από τα φρεάτια με τα κύτταρα XPAI-GFP-RFP, και προστέθηκε το ρυθμισμένο μέσο μετά τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες. Μετά οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2, η δοκιμασία MTS διεξήχθη σε διάφορα χρονικά σημεία (0-72 h) χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό κυττάρων Titer 96 (Promega, Madison, WI, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

πληγών επούλωσης δοκιμασία

τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε 500 μλ μέσου ανά φρέαρ μέχρις ότου επιτεύχθηκε συρροή. Ένα τραύμα έγινε με ξύσιμο των κυττάρων με ένα ρύγχος πιπέτας 10 μl σε PBS, που ακολουθείται από αντικατάσταση με ρυθμισμένο μέσο που συλλέχθηκε από κάθε τύπο μακροφάγων καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 με 10% FBS για 72 ώρες. Η ομάδα ελέγχου έλαβε τον ίδιο όγκο φρέσκου μέσου καλλιέργειας χωρίς ορό. Οι τραυματίες μονοστιβάδα μικροφωτογραφηθεί με το μικροσκόπιο φθορισμού IX71 σε διαφορετικά χρονικά σημεία (0-72 ώρες) μετά γρατσουνιές. μετανάστευση των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη μέτρηση των μεγεθών κενό σε πολλαπλά πεδία χρησιμοποιώντας Image J (Εθνικό Ινστιτούτο Ψυχικής Υγείας, Bethesda, MD).

Η κυτταροτοξικότητα

δοκιμασία

Naïve- ή Edu-μακροφάγα σπάρθηκαν σε 6 -Καλά πλάκες (2 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο). Το ζολεδρονικό οξύ (ZA) (Novartis Pharmaceuticals Corporation, NJ, USA) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο μετά τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες. Οι τελικές συγκεντρώσεις του ΖΑ έχουν ως εξής: 0, 10, 50 και 100 μΜ. Μετά από 48 ώρες, το μέσο ΖΑ-περιέχον απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με μέσο ανάπτυξης για 24 ώρες. Μετά από κάθε φρεάτιο πλύθηκε 5 φορές με 3 ml PBS, ο αριθμός των μακροφάγων που εκφράζουν GFP μετρήθηκε με μικροσκόπιο φθορισμού IX71. Ο μέσος αριθμός μακροφάγων υπολογίστηκε από πέντε οπτικά πεδία σε μεγέθυνση 10x. Όλες οι μετρήσεις διεξήχθησαν εις τριπλούν.

ορθοτοπική εμφύτευση όγκου

Ένα μικρό 6 έως 10 mm εγκάρσια τομή έγινε στο αριστερό πλευρό του ποντικού μέσω του δέρματος και του περιτοναίου του. Η ουρά του παγκρέατος εκτέθηκε μέσω αυτής της τομής και ένα μοναδικό θραύσμα όγκου (3-mm

3) από ένα XPA1 dual-χρώμα υποδόριου όγκου ράφτηκε στην ουρά του παγκρέατος χρησιμοποιώντας 8-0 νάιλον χειρουργικών ραμμάτων (Ethilon? Ethicon Inc., NJ, USA). Μετά την ολοκλήρωση, η ουρά του παγκρέατος επεστράφη στην κοιλιά, και η τομή έκλεισε σε μία στρώση χρησιμοποιώντας 6-0 νάιλον χειρουργικών ραμμάτων (Ethilon) [2], [27] – [29].

θεραπεία ΖΑ του XPA1 ορθοτοπικό μοντέλο γυμνού ποντικού

nude ποντίκια ορθοτοπικά εμφυτευμένων με κύτταρα XPA1-GFP-RFP όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία στις ακόλουθες ομάδες: (1) φυσιολογικού ορού (όχημα /ελέγχου), (2) Naïve- μακροφάγα (3) Edu-μακροφάγα, (4) Edu-μακροφάγα + ZA. Τα μακροφάγα (1 × 10

6 κύτταρα σε 200 μΙ PBS) εγχύθηκαν εβδομαδιαία ΠΕ, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8]. ZA εγχύθηκε υποδόρια καθημερινά από την ημέρα 21 μετά την εμφύτευση του όγκου για 4 εβδομάδες. Κάθε βραχίονας θεραπεία εμπλέκονται 8 ποντικούς που φέρουν όγκο. Δεν υπάρχουν σημαντικές επιπτώσεις στο σωματικό βάρος, τη νοσηρότητα, ή σοβαρή τοξικότητα παρατηρήθηκαν σε κάθε σκέλος θεραπείας. Τα ζώα υποβλήθηκαν σε λαπαροτομία στις 7 εβδομάδες, και οι δύο πρωτογενών όγκων και μεταστάσεων απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας το OV100 μεταβλητή μεγέθυνση μικρό σύστημα των ζώων Imaging (Olympus, Tokyo, Japan) [24] και ζυγίζονται και συλλέχθηκαν για ανάλυση.

Επεξεργασία δεδομένων και στατιστική ανάλυση

PASW Στατιστικά 18.0 (SPSS, Inc) χρησιμοποιήθηκε για όλες τις στατιστικές αναλύσεις. t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τις συνεχείς μεταβλητές μεταξύ των δύο ομάδων. Ανάλυση των μοντέλων διακύμανσης χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση πολλαπλών ομάδων. Μια τιμή ρ 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική για όλες τις συγκρίσεις.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Edu-μακροφάγα διεγείρουν τον καρκίνο κυττάρων μίτωσης in vivo

Dual-χρώμα XPA1-GFP -RFP κύτταρα (1 χ 10

6) ψεκάστηκαν πάνω από την επιφάνεια του δέρματος-πτερύγιο ποντικού. Εικοσιτέσσερις ώρες αργότερα, η εσωτερική επιφάνεια του δέρματος πτερύγιο άμεσα παρατηρήθηκε με το FV1000 ομοεστιακό μικροσκόπιο (Olympus) (Σχ. 1Α). GFP που εκφράζουν μακροφάγων ξενιστή και dual-χρώμα καρκίνος XPA1 κύτταρα παρατηρήθηκαν σε Naïve-μακροφάγων ποντικών (Σχ. 1Β) και Edu-μακροφάγων ποντικών (Σχ. 1 C). Καρκίνος-κυτταρική μίτωση ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε καρκινικά κύτταρα σε Edu-μακροφάγων ποντικών σε σύγκριση με τα καρκινικά κύτταρα σε Naïve-μακροφάγων ποντικών (

P

= 0,001) (Σχ. 1Ε). Φαγοκυττάρωση των καρκινικών κυττάρων έτεινε να είναι μεγαλύτερη σε Naïve-μακροφάγων ποντίκια σε σύγκριση με Edu-μακροφάγων ποντίκια (

P

= 0,061) (Εικ. 1D).

Edu-μακροφάγα διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων

in vitro

η

Naïve- ή Edu-μακροφάγων καλλιεργήθηκαν με dual-χρώμα καρκίνος XPA1 κύτταρα διαχωρίζονται μεταξύ τους από Gelfoam (Εικ. 2Α). Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα, συνεστιακή μικροσκοπία εικόνες ελήφθησαν από την επιφάνεια προς το βάθος 200 μm κάθε 1 μm και ήταν στοιβάζονται κατά μήκος του άξονα Ζ (Σχ. 2Β). Edu-μακροφάγων-αγωγή καρκινικά κύτταρα πολλαπλασιάστηκαν σε μεγαλύτερο βαθμό συγκριτικά με τους απλοϊκούς-μακροφάγων-αγωγή καρκινικά κύτταρα (

P

= 0,014) (Σχ. 2C). Ρυθμισμένο μέσο από Edu-μακροφάγα διέγειρε τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο χωρίς θεραπεία καρκινικών κυττάρων (24 ώρες?

P

= 0.001, 48 ώρες?

P

= 0.003, 72 ώρες?

P

= 0,012, αντίστοιχα). Σε αντίθεση, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ ρυθμισμένο μέσο από παρθένα-μακροφάγα και φρέσκο ​​μέσο επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων XPA1 (Εικ. 2D).

Edu-μακροφάγων-ρυθμισμένο-μέσης-αγωγή καρκινικών κυττάρων που καλύπτονται σημαντικά μεγαλύτερη περιοχή του τραύματος από μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου σε κάθε χρονικό σημείο (24 ώρες?

P

= 0,008, 48 ώρες?

P

= 0,002, 72 ώρες?

P

& lt? 0.001 , αντίστοιχα) (Σχ. 2Ε και 2F).

ZA αναστέλλει XPA1 εξέλιξη του παγκρέατος όγκου που προκαλείται από Edu-μακροφάγα

Edu-μακροφάγα προωθείται πρωτογενή ανάπτυξη του όγκου σε σύγκριση με τον έλεγχο και Naïve- μακροφάγων (έλεγχος ?

P

= 0.026, αφελής?

P

= 0,03). Edu-μακροφάγα προωθείται επίσης μετάσταση σε σύγκριση με τον έλεγχο και αφελής-μακροφάγων (έλεγχος?

P

= 0,012, αφελής?

P

= 0,015) (Σχήμα 3C-Ε.). ZA έχει αποδειχθεί για να σκοτώσει τα μακροφάγα και την πρόληψη της μετάστασης [30], [31]. Ο αριθμός των δύο Naïve- και Edu-μακροφάγα ήταν σημαντικά μειωμένες με ΖΑ σε κάθε δόση in vitro (Σχ. 3Α και 3Β). Σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού του καρκίνου του παγκρέατος, ΖΑ κατέστειλε σημαντικά Edu-μακροφάγων, διεγείρεται η ανάπτυξη του όγκου, και εμπόδισε μετάσταση σε σύγκριση με τους ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με μόνο Edu-μακροφάγα (πρωτογενής όγκος?

P

= 0.006, μετάσταση?

P

= 0,025) (Εικ. 3C-Ε).

(Α) Εκπρόσωπος εικόνες φθορισμού της Edu-μακροφάγων μετά τη θεραπεία ZA. Ράβδοι κλίμακας: 10 μm. (Β) Μπαρ γραφικές παραστάσεις του αριθμού των Naïve- ή Edu-μακροφάγα μετά τη θεραπεία ΖΑ in vitro. Οι αριθμοί των δύο Naïve- και Edu-μακροφάγα αντιμετωπίζονται με ZA μειώθηκαν σημαντικά σε κάθε δόση. ΖΑ σκότωσε τόσο απλοϊκός, Edu σε μια δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. **

P

& lt? 0,01 (vs. ομάδα ελέγχου). (Γ) ενδοζωικής απεικόνιση των ποντικών που φέρουν όγκο XPA1-RFP στον τερματισμό του πειράματος. Ράβδοι κλίμακας: 10 mm. (Δ) Η κύρια βάρος του όγκου των ποντικών Edu-μακροφάγων που έλαβαν ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με τον έλεγχο ή την Naïve-μακροφάγων-ποντίκια με αγωγή (έλεγχος:

P

= 0,026? Naïve:

P

= 0,03, αντίστοιχα). Ο πρωταρχικός βάρος του όγκου του Edu-μακροφάγων + ποντίκια ΖΑ-αγωγή ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με Edu-μακροφάγων-ποντίκια με αγωγή (

P

= 0,006). *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01. (Ε) Το βάρος μετάσταση των ποντικών Edu-μακροφάγων που έλαβαν ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με τον έλεγχο ή την Naïve-μακροφάγων-ποντίκια με αγωγή (έλεγχος?

P

= 0,012, αφελής?

P

= 0.015 , αντίστοιχα). Δεν μετάσταση ανιχνεύθηκε σε ποντίκια Edu + ΖΑ-θεραπεία. Υπήρξε μια σημαντική διαφορά μεταξύ των Edu και Edu + ZA-ποντίκια με αγωγή (

P

= 0,025). *

P

& lt?. 0.05

Η

Στην προηγούμενη μελέτη μας, GFP που εκφράζουν GFP μακροφάγα από διαγονιδιακά γυμνούς ποντικούς με υποδόρια BxPC3-RFP ανθρώπινου παγκρεατικού όγκου χρησιμοποιήθηκαν ως πηγή Edu-μακροφάγα και σε σύγκριση με το Naïve-μακροφάγων από το διαγονιδιακό GFP άτριχων ποντικών χωρίς όγκους. Όταν η Εκπαί- ή Naïve-μακροφάγα στη συνέχεια εμφυτεύτηκαν σε γυμνά ποντίκια με BxPC-3-RFP αυξανόμενη ορθοτοπικώς, οι Edu-μακροφάγα διεγείρεται ανάπτυξη και μετάσταση όγκου σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, Naïve-μακροφάγα [8].

σε μια άλλη προηγούμενη μελέτη, τα ανθρώπινα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος εκτέθηκαν σε ρυθμισμένο μέσο από BxPC-3 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος, σε φυσιολογικά ή υψηλά επίπεδα γλυκόζης. Τα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα εκπαιδεύονται τα μακροφάγα να είναι περισσότερο επεμβατικές in vitro, η οποία ενισχύεται περαιτέρω από την υπεργλυκαιμία [32].

Σε μια άλλη προηγούμενη μελέτη, ΖΑ μείωσε την επαγόμενη από μακροφάγο διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων του μαστού. ZA επηρεάζονται μακροφάγα αλλά όχι τα καρκινικά κύτταρα [33].

Μια άλλη προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι και οι δύο περιτοναϊκή και του μαστού των όγκων που σχετίζονται μακροφάγα ταχέως ανέλαβε ΖΑ in vivo, υποδηλώνοντας περαιτέρω μακροφάγα αποτελούν ένα στόχο της αποτελεσματικότητας κατά του όγκου της ΖΑ [34].

σε μια άλλη προηγούμενη μελέτη, ZA προκαλείται άμεσα απόπτωση στα κύτταρα του παγκρέατος καρκίνωμα και ανέστειλε εισβολής τους και καθώς επίσης και κάνοντας τα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα πιο ευάλωτα σε Τ-κυττάρων επίθεση [35].

Η παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε υποκυτταρικών απεικονιστικές τεχνικές που έχουμε αναπτύξει στο παρελθόν [36] για την άμεση εικόνα που Edu-μακροφάγα έχουν μειωμένη ικανότητα φαγοκυττάρωσης και μπορεί να μιμηθεί άμεσα μίτωση των καρκινικών κυττάρων, όπως απεικονίζονται σε πραγματικό χρόνο. Σε αντίθεση με προηγούμενες μελέτες, η αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας του ZA, η παρούσα έκθεση χρησιμοποιήθηκε ένα ορθοτοπικό μοντέλο μεταστατικού ποντικού για να αποδειχθεί η επίδραση του ΖΑ στην διέγερση του Edu-μακροφάγων για μετάσταση, καθώς και για τον πρωτογενή όγκο. Στην παρούσα μελέτη, τα μακροφάγα απομονώθηκαν από την περιτοναϊκή κοιλότητα από φέροντα όγκο ή ελέγχου ποντικών, μακριά από τον όγκο και χορηγούνται συστηματικά. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι όγκοι είχαν μακρινό επηρεάζουν σε μακροφάγα και αντίστροφα και ότι ZA μπορούσε συστηματικά αναστέλλουν τέτοια αποτελέσματα.

ZA μειωμένη Edu-διεγείρονται πρωτογενή ανάπτυξη και μετάσταση όγκου περίπου στις τιμές αναφοράς που υποδηλώνει τη σημαντική επίδραση ZA ήταν η Edu-μακροφάγων, αν και μια σχετικά μικρή άμεση ανασταλτική επίδραση στην ίδια τη όγκου από ZA δεν μπορεί να αποκλειστεί, όπως περιγράφεται σε μια προηγούμενη μελέτη [35]. ΖΑ έχει αναφερθεί προηγουμένως να έχουν μεγαλύτερη μακροφάγων σκοτώνοντας αποτελεσματικότητα από ό, τι άλλα διφωσφονικά και ως εκ τούτου, επιλέχθηκε για την παρούσα μελέτη [37].

Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι Edu-μακροφάγα προωθούν κακοήθεια. Αυτό φαίνεται από τη διεγερτική δράση του Edu-μακροφάγων για τον καρκίνο-κυτταρική μίτωση και επακόλουθο πολλαπλασιασμό καθώς και για μετάσταση. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [8], οι όγκοι μπορούν να επηρεάσουν τα μακροφάγα τα οποία με τη σειρά της μπορεί να επηρεάσει όγκους. Η πρόοδος του όγκου που προκαλείται από Edu-μακροφάγα ανεστάλη με ΖΑ, που ανέστειλε Edu-μακροφάγων-ενισχυμένη πρωτογενή ανάπτυξη του όγκου και εμπόδισε τη μετάσταση. Οι μηχανισμοί με τους οποίους Edu-μακροφάγα διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό και την εξέλιξη του καρκίνου κυττάρων θα αποτελέσει το αντικείμενο μιας μελλοντικής μελέτης.

Ευχαριστίες

αφοσίωση. Η εργασία αυτή είναι αφιερωμένη στη μνήμη του Α R. Moossa, M.D.