Αφηρημένο

Προηγουμένως, ανέφερε ότι τα καρκινικά αναστολέας της πρωτεϊνικής φωσφατάσης 2Α (CIP2A) διαμεσολαβεί την αποπτωτική επίδραση της βορτεζομίμπης στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC). Εδώ, αναφέρουμε ένα πρωτεασώματος-ανεξάρτητο μηχανισμό μέσω του οποίου η βορτεζομίμπη προκαλεί αυτοφαγία στο HCC. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η βορτεζομίμπη ενεργοποιηθεί αυτοφαγία σε μια δόση και χρονικά με τρόπο που εξαρτάται σε κυτταρικές σειρές HCC συμπεριλαμβανομένων Huh-7, SK-ΗΕΡ1 και Hep3B. Bortezomib μειωτικά CIP2A, φωσφο-Akt (Ρ-Akt) και φωσφο-4EBP1 (Ρ-4EBP1) σε ένα δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο σε όλες τις ελεγχόμενες κύτταρα HCC. Έκτοπη έκφραση CIP2A κατάργησε την επίδραση της βορτεζομίμπης στην αυτοφαγία. Συν-θεραπεία της βορτεζομίμπης και καλυκουλίνης Α, ένας αναστολέας ΡΡ2Α, μειώνεται η επίδραση της βορτεζομίμπης στην P-Akt, P-4EBP1 και αυτοφαγία. Η αυξημένη φωσφορυλίωση της Akt είτε ή 4EBP1 από έκτοπη υπερέκφραση προστατεύονται τα κύτταρα από βορτεζομίμπη που προκαλείται από αυτοφαγία. Επιπλέον, εξετάσαμε την επίδραση της ΔBtz, ένα παράγωγο bortezomib που μοιάζει πολύ με βορτεζομίμπη δομικά αλλά δεν έχει καμία δραστηριότητα πρωτεασώματος, σε HCC. Είναι ενδιαφέρον, ΔBtz έδειξε παρόμοια αποτελέσματα με βορτεζομίμπη σε αυτοφαγία, CIP2A, P-Akt και Ρ-4EBP1, γεγονός που υποδηλώνει ότι η επίδραση της βορτεζομίμπης στην αυτοφαγία είναι ανεξάρτητη της αναστολής πρωτεασώματος. Επιπλέον,

in vivo

δεδομένα μας έδειξαν ότι τόσο βορτεζομίμπης και ΔBtz ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου, μειωτικά CIP2A, P-Akt και προκαλείται από αυτοφαγία σε Huh-7 όγκων. Εν κατακλείδι, η βορτεζομίμπη προκαλεί αυτοφαγία στο HCC μέσω CIP2A-ΡΡ2Α-Akt-4EBP1 οδού

Παράθεση:. Yu H-C, Χου D-R, Liu C-Y, Lin C-S, Shiau C-W, Cheng Α-L, et al. (2013) Νεοπλασματικές αναστολέα της πρωτείνης φωσφατάσης 2Α Μεσολαβεί Bortezomib-Induced Autophagy στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα Ανεξάρτητα από Proteasome. PLoS ONE 8 (2): e55705. doi: 10.1371 /journal.pone.0055705

Επιμέλεια: Πέτρος Starkel, St. Luc Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο, το Βέλγιο

Ελήφθη: 25 Οκτωβρίου 2012? Αποδεκτές: 28, Δεκ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 1 του Φεβρουαρίου του 2013

Copyright: © 2013 Yu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίζεται από επιχορηγήσεις, NTUH 101P01 (KFC) από το Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν Νοσοκομείο? NSC99-2314-B-002-017-MY2 (KFC), και NSC100-2325-B-002-036 (KFC) από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο, την Ταϊβάν. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) είναι η πέμπτη πιο κοινή στερεών όγκων σε όλο τον κόσμο [1]. Σύνθετη HCC χαρακτηρίζεται από συχνές αντίσταση σε συμβατικούς χημειοθεραπευτικούς παράγοντες και ακτινοβολία. Υπάρχει συνεπώς σαφής ανάγκη να αναπτυχθούν νέες θεραπευτικούς στόχους και στρατηγικές για θεραπεία HCC. Πρόσφατα, η οδός αυτοφαγία έχει αναδειχθεί ως μια πολλά υποσχόμενη νέο στόχο στη θεραπεία του καρκίνου. Autophagy είναι γνωστό ως ένα ομοιοστατικό μηχανισμό για τη διατήρηση της κυτταρικής ακεραιότητας και είναι μια καταβολική διαδικασία που περιλαμβάνει την υποβάθμιση των κυτταροπλασματικών συστατικών μέσω της μηχανής λυσοσωματικής [2]. Autophagy παίζει πολλαπλούς ρόλους στον καρκίνο: μπορεί να προωθεί τον θάνατο των καρκινικών κυττάρων ή της επιβίωσης, ανάλογα με τις πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις μεταξύ μεταβολικό στρες, μονοπάτια της απόπτωσης και autophagy [3], [4], [5]? και διατάραξη της αυτοφαγία μπορεί επίσης να συμβάλει στην ογκογένεση [3], [6]. Μια καλύτερη κατανόηση της ρύθμισης αυτοφαγία μπορεί να διευκολύνει την ανακάλυψη νέων πιθανών θεραπευτικών στόχων στο HCC.

Η βορτεζομίμπη είναι η πρώτη διπεπτίδιο αναστολέας βορονικού πρωτεασώματος στην κατηγορία που ορίζονται ειδικά για τη στόχευση του πρωτεασώματος 26S [7], [8]. Bortezomib έχει εγκριθεί για τη θεραπεία του πολλαπλού μυελώματος και κυττάρων μανδύα μη Hodgkin λέμφωμα (NHL) και βρίσκεται υπό κλινική έρευνα για χρήση σε άλλους καρκίνους [9], [10]. Εκτός από τα αποτελέσματά του επί της διέγερσης απόπτωσης, αναστολή του κυτταρικού κύκλου (G2-M σύλληψη φάση) και πολλούς άλλους κυτταρικούς μηχανισμούς που σχετίζονται με την αναστολή πρωτεασώματος [10], [11], [12], bortezomib έχει πρόσφατα δειχθεί ότι επάγει αυτοφαγία σε υποξικά κύτταρα HeLa αυχενικού καρκινώματος σε απόκριση στην ενεργοποιημένη ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) στρες [13], σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη μέσω της ΕΤΕ-2α φωσφορυλίωσης [14], και ανθρώπινο καρκίνωμα κεφαλής και λαιμού πλακωδών κυττάρων κυττάρων σε συνδυασμό με πρωτεάσωμα εξαρτώμενη JNK ενεργοποίηση και φωσφορυλίωση Bcl-2 [15]. Παρά το γεγονός ότι αυτές οι μελέτες συχνά δείχνουν βορτεζομίμπη που προκαλείται από αυτοφαγία συσχετίζεται με την αναστολή πρωτεασώματος της [13], [14], [15], ο ακριβής μηχανισμός της βορτεζομίμπης που προκαλείται από αυτοφαγία δεν είναι πλήρως κατανοητός.

Είναι γνωστό ότι στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR) είναι ένας ρυθμιστής κλειδί της κυτταρικής ανάπτυξης και autophagy [16]. Επιπλέον, ενεργοποιημένου συμπλόκου mTOR 1 (mTORC1), ένα από τα δύο κύρια συστατικά του mTOR, ενεργοποιεί S6K και φωσφορυλιώνει 4ΕΒΡ-1 (απελευθερώνοντας έτσι 4ΕΒΡ-1 από eIF4E) προώθηση mRNA μετάφραση [17]. Επιπλέον, mTORC1 αλληλεπιδρά άμεσα με και αναστέλλει τη σύνθετη ULK1, ένα βασικό συστατικό στην έναρξη αυτοφαγία [18]. Η διαμεσολάβηση του σηματοδότηση αυξητικού παράγοντα από mTOR είναι κατά κύριο λόγο σε απόκριση της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) /Akt μονοπάτι [19]. Akt έχει κρίσιμο ρόλο στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και τη ρύθμιση της απόπτωσης, και οι πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η αναστολή της Akt προωθεί επίσης autophagy [20], [21], [22]. Στο HCC, η οδός Akt έχει δειχθεί ότι ενεργοποιείται ιδιοσυστατικά και συσχετίστηκε με μια χειρότερη πρόγνωση [23]. προηγούμενη μελέτη μας έδειξε επίσης ότι προς τα κάτω ρύθμιση του π-Akt είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας της μοριακής bortezomib απόπτωση σε κύτταρα HCC [24]. Είναι αξιοσημείωτο ότι η αρνητική ρύθμιση της Akt σηματοδότησης μπορεί να επιτευχθεί με φωσφατάσες, όπως φωσφατάση και tensin ομόλογο διαγράφονται στο χρωμόσωμα δέκα (ΡΤΕΝ) και πρωτεϊνικής φωσφατάσης 2Α (ΡΡ2Α). ΡΤΕΝ είναι μια διπλή πρωτεΐνη /λιπιδίου φωσφατάση που εξουδετερώνει ΡΙ3Κ /Ακί σηματοδότησης από αποφωσφορυλίωση φωσφατιδυλινοσιτόλη-3,4,5-τριςφωσφορικής (ΡΙΡ3) εις την 3-θέση [20]. Σε αντίθεση, ΡΡ2Α είναι μια σερίνη /θρεονίνη πρωτεΐνη φωσφατάσης που μπορεί άμεσα αποφωσφορυλίωση ρ-Ακί και ρ-ERK [25]. ΡΡ2Α αποτελείται από καταλυτική υπομονάδα C (PP2Ac), σκαλωσιές Μια υπομονάδα (PR65) και ρυθμιστικές υπομονάδες Β [26]. ΡΡ2Α έχει προταθεί να είναι ένας καταστολέας όγκων [27]. Για παράδειγμα, η αυξημένη δραστηριότητα ΡΡ2Α μπορεί να επάγει απόπτωση μέσω αδρανοποίησης των Bcl-2 ή την ενεργοποίηση του Bad [28]. ΡΡ2Α ρυθμίζει επίσης του κυτταρικού κύκλου, την κυτταρική επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό με είτε άμεσα είτε έμμεσα αναστέλλοντας cdc2, ΜΑΡΚ και κινάσες Akt [28]. Τα πρόσφατα δεδομένα μας έδειξαν επίσης ότι bortezomib ενισχύει δραστηριότητα ΡΡ2Α προς τα κάτω ρύθμιση με τον τρόπο αυτό ρ-Ακί και επάγουν απόπτωση σε κύτταρα HCC [29]. Επιπλέον, αρκετές κυτταρικές αναστολείς της ΡΡ2Α, όπως SET [30] και CIP2A έχουν εντοπιστεί [31]. CIP2A έχει αναδειχθεί ως ένα μυθιστόρημα ογκοπρωτεΐνη και έναν αυξανόμενο αριθμό των εκθέσεων δείχνουν ότι υπερεκφράζεται σε πολλές ανθρώπινες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του HCC [32], [33], [34], [35], [36], [37], [ ,,,0],38], [39]. CIP2A έχει δειχθεί να σταθεροποιήσει c-Myc ογκοπρωτεϊνης από την αναστολή της δραστικότητας ΡΡ2Α προς c-Myc, προωθώντας έτσι την ανάπτυξη των κυττάρων ανεξάρτητη από προσκόλληση και

in vivo

σχηματισμό όγκου [31]. Πρόσφατα, αποδείξαμε επίσης ότι CIP2A, μέσω της αναστολής της ΡΡ2Α που εξαρτώνται p-Akt αδρανοποίηση, διαμεσολαβεί την αποπτωτική επίδραση της βορτεζομίμπης στα κύτταρα HCC [40].

Στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε μια πρωτεασώματος-ανεξάρτητο μηχανισμό με που βορτεζομίμπη προκαλεί αυτοφαγία στο HCC. παρούσα εργασία μας δείχνει ότι η βορτεζομίμπη προκαλεί αυτοφαγία στο HCC μέσω CIP2A-ΡΡ2Α-Akt-4EBP1 οδού.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και αντισώματα

Bortezomib (Velcade®) παρασχέθηκε ευγενώς από τη Millennium Pharmaceuticals. Για

in vitro

μελέτες, η βορτεζομίμπη σε διάφορες συγκεντρώσεις διαλύθηκε σε DMSO και στη συνέχεια προστέθηκε στα κύτταρα σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ) που περιέχει 5% ορό εμβρύου βοός (FBS). Η τελική συγκέντρωση του DMSO ήταν 0,1% μετά την προσθήκη στο μέσο. Καλυκουλίνης Α και 3-μεθυλαδενίνη (3-ΜΑ) αγοράστηκαν από την Cayman Chemical (Αηη Arbor, ΜΙ). Αντισώματα για ανοσοκηλίδωση όπως αντι-Akt1, αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (San Diego, CA). Άλλα αντισώματα όπως αντι-LC3, -Ρ-Ακί (Ser473), -4EBP1, -Ρ-4EBP1, -Ρ-mTOR, -mTOR, -Ρ-S6K, -S6K, αντι-S6, -Ρ-S6, – NF-κΒ, -IκB-α, -ATG3, -ATG5, -ATG7 και -Beclin 1 ήταν από τη Cell Signaling (Danvers, ΜΑ).

Κυτταρική καλλιέργεια και Western blot ανάλυση

Οι κυτταρικές γραμμές Sk-ΗΕΡ1 και Hep3B ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Η Huh-7 HCC κυτταρική σειρά ελήφθη από το Science Research Τράπεζα Υγεία Πόρων (Οσάκα, Ιαπωνία? JCRB0403). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 μονάδες /mL, πενικιλλίνη G, 100 μg /mL θειική στρεπτομυκίνη, και 25 μg /mL αμφοτερικίνη Β σε ένα C υγροποιημένο επωαστή 37 ° C και σε ατμόσφαιρα 5% CO

2 στον αέρα. Ανάλυση κηλίδος Western έγινε όπως αναφέρθηκε προηγουμένως

Autophagy ανάλυση

Drug επαγόμενη autophagy εκτιμήθηκε με διάφορες δοκιμασίες που περιλαμβάνουν: (1). Η ανάλυση στυπώματος Western των μικροσωληνίσκους πρωτεΐνη που συνδέεται 1 ελαφριά αλυσίδα 3 ( LC3-ΙΙ) όπως περιγράφηκε προηγουμένως? (2) ανοσοφθορισμού της LC3-II. Εν συντομία, τα κύτταρα Huh7 σπάρθηκαν σε ένα δίσκο 6 cm. Αφού πλύθηκαν με PBS, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 800 ηΜ bortezomib για 16 ώρες, και μονιμοποιήθηκαν με παγωμένο 4% παραφορμαλδεΰδη. Τα σταθερά κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-LC3II πρωτογενές αντίσωμα κουνελιού (1:200, # 3868, Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ), σε διάλυμα αποκλεισμού (1% λευκωματίνη βόειου ορού σε TBST) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια χρωματίζονται με IgG αντι-κουνελιού (Η + L), F (ab ‘) 2 θραύσμα (Alexa Fluor® 488 Συζεύγματος, # 4412, Cell Signaling) και DAPI. Τα κύτταρα εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού LEICA DM2500? (3) Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του LC3-ΙΙ. Εν συντομία, Huh7 και Hep3B σπάρθηκαν σε ένα δίσκο 6 cm. Αφού πλύθηκαν με PBS, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 800 ηΜ bortezomib για 16 και 24 ώρες, σταθεροποιήθηκαν με παγωμένο 4% παραφορμαλδεΰδη, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με παγωμένο 100% μεθανόλη. Τα σταθερά κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-LC3II πρωτογενές αντίσωμα κουνελιού (1:100, # 3868, Cell Signaling) σε διάλυμα αποκλεισμού (1% λευκωματίνη βόειου ορού σε TBST) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με αντι- IgG κουνελιού (Η + L), F (ab ‘) 2 (Alexa Fluor® 488 Συζεύγματος, # 4412).

ανοσοφθορισμό της LC3-GFP και ακριδίνης πορτοκαλί

κύτταρα Huh7, που καλλιεργούνται σε καλυπτρίδες, επιμολύνθηκαν με πλασμίδιο EGFP-LC3, που ακολουθείται από 400 ηΜ θεραπεία bortezomib για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν ταχέως με PBS και σταθεροποιήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά με 4% παραφορμαλδεΰδη. Αφού πλύθηκαν δύο φορές με PBS, τα κύτταρα δεσμεύτηκαν με 1% αλβουμίνη βόειου ορού σε TTBS και κατόπιν τοποθετηθεί. Η υποκυτταρική κατανομή της EGFP-LC3 παρατηρήθηκε κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού (LEICA DM2500). Για τη χρώση πορτοκαλί ακριδίνης, τα κύτταρα SK ΗΕΡ1 σπάρθηκαν σε ένα δίσκο 6 cm. Αφού πλύθηκαν με PBS, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 800 ηΜ bortezomib για 16 ώρες, σταθεροποιήθηκαν με παγωμένο 4% παραφορμαλδεΰδη για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια βάφονται με πορτοκαλί της ακριδίνης (5 μg /ml) για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού LEICA DM2500

κύτταρα HCC με ουσιαστικά δραστική CIP2A

CIP2A cDNA (KIAA1524) αγοράστηκε από ΟηΟεηε (RC219918? Rockville, MD).. Εν συντομία, μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα επωάστηκαν με την παρουσία του G418 (0.78 mg /mL). Μετά από 8 εβδομάδες επιλογής, επιβιώνουν αποικίες, δηλαδή, εκείνες που προκύπτουν από σταθερώς επιμολυσμένα κύτταρα, επιλέχθηκαν και ενισχύονται ατομικώς. κύτταρα HCC με σταθερή έκφραση CIP2A-myc μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με φάρμακα, συλλέχθηκαν, και υποβάλλονται σε επεξεργασία για ανάλυση στυπώματος western.

Ξενομοσχεύματος ανάπτυξης όγκου

Αρσενικά NCr αθυμικά γυμνά ποντίκια (5-7 εβδομάδων ηλικίας) ελήφθησαν από το Εθνικό Εργαστήριο του Κέντρου ζώων (Ταϊπέι, Ταϊβάν). Οι ποντικοί στεγάστηκαν σε ομάδες και διατηρήθηκαν κάτω από πρότυπες εργαστηριακές συνθήκες σε έναν κύκλο φωτός-σκότους 12-h. Τους δόθηκε πρόσβαση σε αποστειρωμένο φαγητό και νερό

κατά βούληση

. Όλες οι πειραματικές διαδικασίες που χρησιμοποιούν αυτά τα ποντίκια διεξήχθησαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που εγκρίθηκε από το Θεσμικό Εργαστήριο Φροντίδα Ζώων και Χρήση επιτροπή του Εθνικού Πανεπιστημίου της Ταϊβάν (Αριθμός Άδειας: 20.080.205). Κάθε ποντικός εμβολιάσθηκε υποδορίως στο πλευρό ραχιαία με 1 × 10

6 Huh-7 κύτταρα αιωρούνται σε 0,1 ml μέσου χωρίς ορό που περιέχει 50% Matrigel (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ). Όταν οι όγκοι έφθασαν 200-300 mm

3, οι ποντικοί έλαβαν μια ενδοπεριτοναϊκή ένεση του bortezomib (1 mg /kg σωματικού βάρους) ή ΔBtz (1 mg /kg σωματικού βάρους) δύο φορές την εβδομάδα για τη διάρκεια της θεραπείας. Έλεγχοι έλαβε όχημα.

Στατιστική ανάλυση

σημεία δεδομένων Η ανάπτυξη του όγκου αναφέρθηκαν ως μέσο μέγεθος όγκου ± SE. Συγκρίσεις των μέσων τιμών διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τα ανεξάρτητα δείγματα

t

δοκιμή στο SPSS για Windows 11,5 λογισμικού (SPSS Inc., Chicago, IL).

Αποτελέσματα

Μπορτέζομιμπ επάγει αυτοφαγία στο HCC

για να διερευνηθεί η επίδραση της βορτεζομίμπης στην αυτοφαγία στο HCC, εξετάσαμε για πρώτη φορά την έκφραση της μικροσωληνίσκους πρωτεΐνης που συνδέεται με 1 ελαφριά αλυσίδα 3 (LC3-II), ένα συζυγές LC3-φωσφατιδυλο-αιθανολαμίνη, ότι είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της αυτοφαγία. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, επαγόμενη bortezomib αυτοφαγία σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο ξεκινώντας σε συγκέντρωση 200 ηΜ σε Huh-7, SK-ΗΕΡ1 και Hep3B κύτταρα, όπως αποδεικνύεται από την αύξηση της LC3-ΙΙ. Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε μια εξαρτώμενη από το χρόνο ανάλυση της βορτεζομίμπης που προκαλείται από αυτοφαγία. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η bortezomib ρυθμίζεται προς τα πάνω την έκφραση της LC3-ΙΙ σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 1Β). Στη συνέχεια, ανιχνεύσαμε την έκφραση της LC3-II με κυτταρομετρία ροής. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1C

αριστερά

, bortezomib αύξησε τα επίπεδα της LC3-ΙΙ σημαντικά μετά τη θεραπεία bortezomib 24 ωρών. Επιπλέον, η βορτεζομίμπη που προκαλείται από αυτοφαγία επιβεβαιώθηκε επίσης από LC3-ΙΙ χρώση ανοσοφθορισμού (Εικ. 1Γ

δεξιά

). Η διεγερτική επίδραση της βορτεζομίμπης επί autophagy επιβεβαιώθηκε από την αύξηση των κουκκίδων GFP-LC3 στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με το φάρμακο, όπως εξετάσθηκε με ανίχνευση GFP-LC3 (Εικ. 1 D

κορυφή

), καθώς επίσης και από ένα αύξηση της ακριδίνης χρώση πορτοκαλί για όξινες φυσαλιδώδη οργανίδια (Εικ. 1D

κάτω

). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η βορτεζομίμπη ενεργοποιεί σημαντικά αυτοφαγία στο HCC.

Α, δοσοεξαρτώμενη επίδραση της βορτεζομίμπης που προκαλείται από αυτοφαγία. κύτταρα HCC υποβλήθηκαν σε αγωγή με bortezomib στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 24 ώρες. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν για ανοσοαποτύπωση συνδεδεμένη με μικροσωληνίσκους πρωτεΐνη 1 ελαφρά αλυσίδα 3 (LC3). Β, εξαρτώμενη από τον χρόνο επίδραση της βορτεζομίμπης που προκαλείται από αυτοφαγία. Τα κύτταρα εκτέθηκαν στη βορτεζομίμπη στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 24 ή 48 ώρες. C, τα αποτελέσματα της βορτεζομίμπης σε LC3-II.

Αριστερά,

ανάλυση της χρώσης LC3-II με κυτταρομετρία ροής. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με bortezomib στα 800 nm για 16 ή 24 ώρες.

δεξιά,

ανάλυση ανοσοφθορισμού LC3-II. κύτταρα Hep3B υπέστησαν αγωγή με bortezomib στα 800 ηΜ για 24 ώρες. D,

κορυφή,

χρώση LC3-GFP.

Bottom,

ακριδίνης πορτοκαλί λεκέ.

Η

Η αναστολή της CIP2A-Akt-4EBP1 οδού σηματοδότησης συνδέεται με βορτεζομίμπη που προκαλείται από αυτοφαγία στο HCC

προηγούμενες εργασίες μας διαπίστωσε ότι αναστολή της CIP2A είναι ο κύριος καθοριστικός παράγοντας της βορτεζομίμπης απόπτωση στα κύτταρα HCC. Για να διερευνήσουν περαιτέρω το μηχανισμό με τον οποίο βορτεζομίμπης που προκαλείται από αυτοφαγία στο HCC, είμαστε δίπλα εξέτασε κατά πόσον CIP2A παίζει ρόλο στη βορτεζομίμπη που προκαλείται από αυτοφαγία στο HCC. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α και Β, bortezomib μειωτικά των επιπέδων της πρωτεΐνης του CIP2A, Ρ-Akt, P-4EBP1 και προκαλείται από αυτοφαγία σε όλες τις κυτταρικές σειρές HCC, συμπεριλαμβανομένων Huh-7, SK-ΗΕΡ1 και Hep3B, από τη συγκέντρωση και χρονικά εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, η βορτεζομίμπη δεν μετέβαλλε σημαντικά τα επίπεδα έκφρασης άλλων πρωτεϊνών αυτοφαγία που σχετίζονται συμπεριλαμβανομένων ATG7, ATG5, Beclin 1, ATG3, P-S6K και S6K (Σχ. 2C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αναστολή της CIP2A-Akt-4EBP1 συνδέεται με βορτεζομίμπη που προκαλείται από αυτοφαγία στα κύτταρα HCC.

Α, δοσο-εξαρτώμενη ανάλυση των CIP2A, Akt και 4EBP1 στα κύτταρα HCC. Τα κύτταρα εκτέθηκαν στη βορτεζομίμπη στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 24 ώρες. Β, εξαρτώμενη από τον χρόνο ανάλυση των CIP2A, Akt και 4EBP1 στα κύτταρα HCC. Τα κύτταρα εκτέθηκαν στη βορτεζομίμπη στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 24 ή 48 ώρες. C, εξαρτώμενη από τη δόση ανάλυση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με αυτοφαγία. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε βορτεζομίμπη στις ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 24 ώρες.

Η

Στόχος επικύρωση της CIP2A-ΡΡ2Α-Akt-4EBP1

Για να επικυρώσετε το ρόλο της CIP2A στη διαμεσολάβηση της επίδρασης της βορτεζομίμπης για αυτοφαγία στο HCC, υπερεκφράσαμε CIP2A στο HCC. Βρήκαμε ότι η έκτοπη έκφραση της CIP2A προστατεύονται κυττάρων από bortezomib επαγόμενη αυτοφαγία σε Huh-7 και τα κύτταρα Hep3B, υποδεικνύοντας ότι CIP2A παίζει ένα ρόλο κλειδί στη διαμεσολάβηση της αυτοφαγικά επίδραση της βορτεζομίμπης σε κύτταρα HCC (Εικ. 3Α). Επιπλέον, η προσθήκη καλυκουλίνης Α, έναν αναστολέα της ΡΡ2Α, μειώνεται η επίδραση της βορτεζομίμπης στην CIP2A, P-Akt, P-4EBP1 και αυτοφαγία σε Huh-7 (Σχ. 3Β

αριστερά

). υπερέκφραση του Akt1 καταργηθεί βορτεζομίμπης που προκαλείται από αυτοφαγία σημαντικά (Εικ. 3Β

μεσαία

). Έκτοπη έκφραση 4EBP1 μείωσε επίσης την επίδραση της βορτεζομίμπης στην αυτοφαγία σε Huh-7. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η οδός σηματοδότησης CIP2A-ΡΡ2Α-Akt-4EBP1 διαδραματίζει καίριο ρόλο στη διαμεσολάβηση επίδραση βορτεζομίμπη για αυτοφαγία στο HCC. Επιπλέον, εξετάσαμε την επίδραση ενός συνδυασμού βορτεζομίμπης και ραπαμυκίνη, έναν αναστολέα mTOR, για αυτοφαγία. Τα στοιχεία μας έδειξαν συν-θεραπεία με ραπαμυκίνη και bortezomib αύξησε αυτοφαγία σημαντικά (Εικ. 3C

αριστερά

). Επιπλέον, 3-ΜΑ, ένας αναστολέας αυτοφαγία, ανέτρεψε την αυτοφαγικά επίδραση της βορτεζομίμπης σε Huh-7 κύτταρα (Εικ. 3C

δεξιά

). Συγκεκριμένα, έχουμε εκτελούνται όλα τα πειράματα παραπάνω (σχήμα 3) σε κάθε κυτταρικές σειρές HCC και βρήκαν ότι δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ αυτών των κυτταρικών σειρών όσον αφορά την επίδραση της βορτεζομίμπης επί των επικυρωμένων στόχων. Μόνο μερικά από τα αντιπροσωπευτικά στοιχεία έχουν δείξει εδώ.

Α, έκτοπη έκφραση της CIP2A-myc καταργεί επιπτώσεις της βορτεζομίμπης στην αυτοφαγία σε Huh-7 και κύτταρα Hep3B. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με CIP2A-myc και επιλέχθηκαν για 8 εβδομάδες από την G-418. Ανάλυση autophagy εκτελέστηκε με στύπωμα Western (WB), μετά τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διαδοχικά DMSO ή bortezomib (200 ηΜ ή 400 ηΜ ή 800 ηΜ) για 24 ώρες. Β,

αριστερά,

συν-θεραπεία με καλυκουλίνης Α, ενός αναστολέα της ΡΡ2Α, αντιστρέφει την επίδραση της βορτεζομίμπης στην CIP2A, P-Akt, P-4EBP1 και αυτοφαγία. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με καλυκουλίνης Α (1 mM) ή bortezomib (800 ηΜ) για 24 ώρες.

Μέση,

έκτοπη έκφραση της Akt1 μείωσε τις επιπτώσεις της βορτεζομίμπης στην αυτοφαγία στα κύτταρα Huh-7.

δεξιά,

έκτοπη έκφραση της 4EBP1 μείωσε τις επιπτώσεις της βορτεζομίμπης στην αυτοφαγία στα κύτταρα Huh-7. C,

αριστερά,

συν-θεραπεία με ραπαμυκίνη, ένας αναστολέας της mTOR, ενισχυμένη bortezomib που προκαλείται από αυτοφαγία στα κύτταρα Huh-7. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με ραπαμυκίνη (100 ηΜ) ή /και bortezomib (400 ηΜ) για 24 ώρες.

δεξιά,

Co-αγωγή με αναστολέα αυτοφαγία 3-μεθυλαδενίνη (3-ΜΑ) μείωσε βορτεζομίμπη που προκαλείται από αυτοφαγία. κύτταρα Huh7 υποβλήθηκαν σε αγωγή με bortezomib (800 ηΜ) και /ή 3-ΜΑ (1 mM) για 16 ώρες.

Η

Η επίδραση της βορτεζομίμπης στην αυτοφαγία και CIP2A είναι ανεξάρτητη του πρωτεασώματος

για να εξεταστεί κατά πόσον η επίδραση της βορτεζομίμπης στην αυτοφαγία και CIP2A σχετίζεται με την δραστηριότητα της αναστολής πρωτεασώματος, συνθέσαμε ένα παράγωγο bortezomib (ΔBtz), το οποίο είναι παρόμοιο με βορτεζομίμπη δομικά εκτός από το ότι στερείται μιας λειτουργικής ομάδας βορικό οξύ, μια κρίσιμη συμβολή στην δραστηριότητα πρωτεασώματος (Εικ. 4Α

αριστερά

). Σε σύγκριση με βορτεζομίμπη, ΔBtz είχε μικρή επίδραση στην αναστολή του πρωτεασώματος (Εικ. 4Α

μεσαία

) ή NF-κΒ αναστολής (Εικ. 4Α

δεξιά

). ΝΡ-κΒ είναι ένας γνωστός στόχος πρωτεοσωμικού αναστολέα. Είναι ενδιαφέρον, ΔBtz έδειξε σημαντικές επιπτώσεις στο CIP2A, P-Akt και Ρ-4EBP1 σε μια συγκέντρωση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο στο HCC παρόμοιο με βορτεζομίμπη (Σχήμα 4Β

αριστερά

& amp?.

μεσαία

). Συν-θεραπεία με τον αναστολέα αυτοφαγία 3-ΜΑ μείωσε την αυτοφαγικά επίδραση της ΔBtz (Εικ. 4Β

δεξιά

). ΔBtz αύξησε την έκφραση του LC3-II (Εικ. 4C

αριστερά

), και επίσης αυξημένη χρώση πορτοκαλί ακριδίνης για όξινες φυσαλιδώδη οργανίδια (Εικ. 4C

Μέση

). Χρησιμοποιώντας μια τεχνική ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, οι αριθμοί των αυτοφαγικά κενοτόπια δείχθηκαν να να αυξηθεί σημαντικά σε κύτταρα SK-ΗΕΡ1 θεραπεία με 800 ηΜ bortezomib ή ΔBtz, αλλά όχι στον έλεγχο (Εικ. 4C

δεξιά

). Επιπλέον, εξετάσαμε τις επιδράσεις των άλλων αναστολέων MG132 και λακτακυστίνη πρωτεασώματος, για αυτοφαγία και CIP2A. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι ούτε MG132 ούτε λακτακυστίνη είχε σημαντικές επιπτώσεις στην αυτοφαγία ή CIP2A (Εικ. 4D

αριστερά

). Ωστόσο, όπως ήταν αναμενόμενο, αυτές οι δύο αναστολείς πρωτεασώματος παρουσίασαν σημαντική δραστηριότητα αναστολής πρωτεασώματος (Εικ. 4D

δεξιά

). Αυτά τα στοιχεία δείχνουν ότι η επίδραση της βορτεζομίμπης στην αυτοφαγία είναι ανεξάρτητη του πρωτεασώματος.

Α

αριστερά,

χημικές δομές της βορτεζομίμπης και ΔBtz.

Μέση,

επιπτώσεις της βορτεζομίμπης και ΔBtz στην αναστολή του πρωτεασώματος.

δεξιά,

επιπτώσεις της βορτεζομίμπης και ΔBtz για NF-κΒ. Β,

αριστερά,

δοσοεξαρτώμενη επιπτώσεις της ΔBtz για CIP2A, Akt και LC-3.

Μέση,

χρόνο-εξαρτώμενη επιπτώσεις της ΔBtz για CIP2A, Akt και LC-3.

δεξιά,

Co-αγωγή με αναστολέα αυτοφαγία 3-ΜΑ μειωμένη ΔBtz που προκαλείται από αυτοφαγία. C,

αριστερά

, οι επιπτώσεις της ΔBtz για ανοσοφθορισμό LC3-II.

Μέση

, οι επιπτώσεις της ΔBtz για χρώση ακριδίνης πορτοκαλί.

κύτταρα Δεξιά,

Sk-ΗΕΡ1 αγωγή με bortezomib (800 nM) ή ΔBtz (800 nM) ή όχημα συλλέχθηκαν, σταθερό και ενσωματωμένα σε ρητίνη κίνητρο. Εβδομήντα νανομέτρων λεπτές τομές κόπηκαν και εξετάστηκαν σε 120 Kv με JEM-1400 ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Τα βέλη δείχνουν αυτοφαγικά κενοτόπια. D, Άλλα αναστολείς πρωτεασώματος δεν προκάλεσε αυτοφαγία στο HCC.

Αριστερά

, επιδράσεις της MG-132 και λακτακυστίνη για CIP2A και LC-3.

Δεξιά

, τα αποτελέσματα της βορτεζομίμπης, MG-132 και λακτακυστίνη στην αναστολή του πρωτεασώματος.

Η

Επίδραση της βορτεζομίμπης και ΔBtz για HCC

ξενομόσχευμα όγκου

Για να επιβεβαιώσει εάν το αποτέλεσμα της βορτεζομίμπης στην αυτοφαγία έχει δυνητικά σχετικές κλινικές επιπτώσεις, εκτιμήσαμε την

in vivo

επίδραση της βορτεζομίμπης στην όγκων ξενομοσχεύματος HCC. ποντίκια που φέρουν όγκο υπέστησαν αγωγή με όχημα ή βορτεζομίμπης ή ΔBtz. Και τα δύο φάρμακα εγχύθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς σε 1,0 mg /kg δύο φορές την εβδομάδα για 2 εβδομάδες. Όλα τα ζώα ανεκτές τις θεραπείες καλά χωρίς παρατηρήσιμη σημάδια τοξικότητας και είχε σταθερή σωματικά βάρη καθ ‘όλη τη διάρκεια της μελέτης. Δεν ακαθάριστο παθολογικές ανωμαλίες παρατηρήθηκαν κατά την νεκροψία. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι η βορτεζομίμπη και ΔBtz έδειξαν παρόμοια αποτελέσματα σε Huh-7 την ανάπτυξη του όγκου. Το μέγεθος του όγκου μειώθηκε σημαντικά μετά από δύο εβδομάδες θεραπείας. Να συσχετίσει βιολογική απόκριση με το μηχανισμό δράσης προσδιορίζονται

in vitro

, εξετάστηκε η επίδραση της βορτεζομίμπης στην αυτοφαγία σε όγκους HCC. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Β και 5C, η θεραπεία της ΔBtz μείωσε τα επίπεδα της πρωτεΐνης του CIP2A και P-Akt και σημαντικά που προκαλείται LC3 σε Huh-7 κύτταρα παρόμοια με βορτεζομίμπη. Αυτά τα στοιχεία δείχνουν ότι ΔBtz είχε σημαντικές επιπτώσεις κατά του όγκου

in vivo

και, το σημαντικότερο, υποδεικνύουν ότι η βορτεζομίμπη προκαλεί αυτοφαγία στο HCC μέσω πρωτεασώματος-ανεξάρτητο μηχανισμό.

Ένα, καμπύλες αύξησης του όγκου των Huh -7. Σημεία, σημαίνει (n = 6)? μπαρ, SE. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01. Β, Ανάλυση κηλίδας Western των CIP2A, Ρ-Akt, Akt1 και LC-3 σε Huh-7 όγκων. C, ανοσοαποτυπώματα σαρώθηκαν από ένα σύστημα εικόνας UVP BioSpectrum AC και ποσοτικά με τη χρήση του λογισμικού VisionWork LS για να προσδιοριστεί η αναλογία του επιπέδου CIP2A προς ακτίνη.

Στήλες

, μέση?

μπαρ

, SD (n = 3, *

P

& lt? 0,05). Δ, περίληψη της λειτουργίας των δράσεων της βορτεζομίμπης.

Η

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη αποκαλύπτει ένα νέο μηχανισμό με τον οποίο η βορτεζομίμπη προκαλεί αυτοφαγία στα κύτταρα HCC (δηλαδή, το CIP2A-ΡΡ2Α-Akt -4EBP1 μονοπάτι), και αυξάνει την κατανόηση των ογκογόνων πρωτεϊνών όπως Ras, Akt και ERK που ρυθμίζουν autophagy [6], [41]. Είναι ενδιαφέρον ότι, με τη χρήση της ένωσης ΔBtz που μοιάζει πολύ με βορτεζομίμπη σε χημική δομή αλλά στερείται σημαντικά την ικανότητα του πρωτεασώματος ανασταλτικά, αποδείξαμε ότι αυτή η CIP2A-εξαρτώμενη ρύθμιση της βορτεζομίμπης που προκαλείται από αυτοφαγία δεν εξαρτάται κατ ‘ανάγκη από την αναστολή του πρωτεασώματος. Bortezomib θεωρείται ότι αναστέλλει τον πυρήνα σωματιδίου του πρωτεοσώματος 20S με το σχηματισμό ενός σταθερού τετραεδρικό βορονικό οξύ ενδιαμέσου με το Ν-τελικό κατάλοιπο θρεονίνης των δραστικών β-υπομονάδες του σωματιδίου πυρήνα 20S [7]. Με βάση τη σπουδαιότητα του βορικού οξέος λειτουργική ομάδα σε αποκλεισμό του πρωτεασώματος, αντικαταστήσαμε bortezomib με ΔBtz που διαφέρει από bortezomib σε βορονική ομάδα (Σχήμα 4Α) του. ΔBtz έδειξε πράγματι μικρή αναστολή του πρωτεασώματος, αλλά παρ ‘όλα αυτά Προκαλείται CIP2A εξαρτώμενη αυτοφαγία με παρόμοιο τρόπο με βορτεζομίμπη (Σχήμα 4). Αυτό πρωτεασώματος-ανεξάρτητη αναστολή CIP2A και αυτοφαγία διαμεσολαβείται από τη βορτεζομίμπη υποστηρίχθηκε περαιτέρω από το εύρημα ότι άλλοι αναστολείς πρωτεασώματος (MG132 και λακτακυστίνη), δεν επηρέασε σημαντικά την αυτοφαγία και CIP2A (Εικ. 4D

αριστερά

) παρά δείχνει σημαντική πρωτεασώματος δραστηριότητα αναστολής (Εικ. 4D

δεξιά

). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν σαφώς ότι η επίδραση της βορτεζομίμπης στην αυτοφαγία μπορεί να είναι ανεξάρτητη της αναστολής πρωτεασώματος. Αξίζει να σημειωθεί ότι η απόκριση της κάθε κυτταρικής σειράς για την επαγωγή της LC3-I /LC3II με bortezomib ήταν διαφορετική (Εικ. 1Α) και δεν ήταν πανομοιότυπες με τις αλλαγές στην σύμφωνα CIP2A και P-Akt (Εικ. 2Α). Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι αυτές οι διαφορές μπορεί να σχετίζεται με διακριτά γενετικά υπόβαθρα μεταξύ των κυτταρικών σειρών. Ωστόσο, εξακολουθεί να είναι πιθανό ότι νέοι στόχοι ή οδών (εκτός από CIP2A /Akt μονοπατιού) μπορεί επίσης να διαδραματίσει ένα ρόλο στη διαμεσολάβηση της επίδρασης της βορτεζομίμπης στην αυτοφαγία.

Η πρωτεασώματος και οι αυτοφαγία-λυσόσωμα οδοί θεωρούνται η δύο κύριες οδούς για ευκαρυωτικά ενδοκυτταρική εκκαθάριση των πρωτεϊνών και τη σύνδεσή τους και τις αλληλεπιδράσεις έχουν τα τελευταία θέματα ενδιαφέροντος [42], [43], [44]. Θεωρείται ότι αυτά τα δύο συστήματα κυτταρική υποβάθμιση λειτουργικά συνδεδεμένες και καταστολή της οδού πρωτεασώματος ενεργοποιεί αυτοφαγία μέσω προκαλείται από το στρες ER [43], [45]. Στο πλαίσιο αυτό, η ενεργοποίηση των λειτουργιών αυτοφαγία για να αντισταθμίσει την μειωμένη αποικοδόμηση της πρωτεΐνης ουβικουιτινωμένης που προκαλείται από τους αναστολείς πρωτεασώματος και ανακουφίζει ER στρες [14], [45]. Κατά συνέπεια, autophagy μπορεί να προστατεύσει τα κύτταρα από την τοξικότητα των αναστολέων πρωτεασώματος. Από την άλλη πλευρά, η αναστολή της αυτοφαγία μπορεί να θέσει σε κίνδυνο υποβάθμισης της ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος υποστρώματα μονοπάτι [46]. Αποδεικτικά στοιχεία έχουν δείξει ότι ο συνδυασμός των αναστολέων αυτοφαγία και αναστολέων πρωτεασώματος προάγουν κυτταρικό θάνατο μέσω τόσο απόπτωση και νέκρωση [14]. Με το μοντέλο μας HCC, έχουμε δείξει ότι η προκαλούμενη βορτεζομίμπη αυτοφαγία μέσω πρωτεασώματος-ανεξάρτητο μηχανισμό. Προηγουμένως επιβεβαίωσε ότι η βορτεζομίμπη μπορεί να προκαλέσει απόπτωση μέσω CIP2A-ΡΡ2Α-p-Akt μηχανισμό, ο οποίος είναι επίσης διαχωριστεί από την αναστολή του πρωτεασώματος από τη βορτεζομίμπη [40]. Αποδείξαμε ότι επάγεται bortezomib αυτοφαγία σε κυτταρικές σειρές HCC (δηλαδή, Sk-ΗΕΡ1, Hep3B και Huh-7) που είναι επίσης ευαίσθητα σε bortezomib επαγόμενη απόπτωση. Χρησιμοποιώντας το μοντέλο μας HCC είναι εμφανές ότι μέσω της αναστολής του CIP2A bortezomib προκαλεί τόσο την απόπτωση και αυτοφαγία, δύο από τα οποία είναι ανεξάρτητα της αναστολής πρωτεασώματος. Επιπλέον, η απόδειξη ότι CIP2A παίζει σημαντικό ρόλο στη διαμεσολάβηση bortezomib επαγόμενη απόπτωση και αυτοφαγία σε κύτταρα HCC υποδηλώνει ότι CIP2A μπορεί να είναι ένας πιθανός νέος στόχος φαρμάκου σε HCC και ότι οι ενώσεις /φάρμακα που δρουν ως αναστολείς CIP2A μπορεί να έχουν θεραπευτικό δυναμικό σε HCC. Είτε σήμερα γνωστούς αναστολείς αυτοφαγία, όπως βαφιλομυκίνης Α1, 3-ΜΑ ή chloraquine μπορεί να συνεργήσει με αυτούς τους παράγοντες CIP2A αναστολής για να σκοτώσει τα καρκινικά κύτταρα εντάλματα μελλοντικές μελέτες.

Εκτός από τη διαπίστωση ότι ογκογόνο CIP2A μεσολαβεί προκαλείται από βορτεζομίμπη αυτοφαγία, Αυτή η μελέτη εντόπισε π-4ΕΒΡ-1 ως συμμετέχων σε βορτεζομίμπης που προκαλείται από αυτοφαγία κατάντη της p-Akt. Ο ρόλος του ρ-4EBP1 ελέγχθηκε με έκτοπη έκφραση της 4EBP1, η οποία είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της ρ-4EBP1, και εν συνεχεία μείωσε την επίδραση του bortezomib επί αυτοφαγία (Σχήμα 3Β). 4ΕΒΡ-1 είναι γνωστό ως καθοδικός τελεστής του PI3K /Akt /mTOR επισημαίνοντας ότι σε μη-φωσφορυλιωμένη μορφή συνδέεται στενά με eIF4E και αναστέλλει ένα βασικό βήμα για την έναρξη της μετάφρασης [47], [48]. EIF4E είναι ένας βασικός παράγοντας στην έναρξη της μετάφρασης πώμα-εξαρτώμενο (συμπεριλαμβανομένων πολλών σημαντικών ογκοπρωτεϊνών όπως c-myc, κυκλίνη D1, παράγοντας υποξία 1, και Mcl-1) που ελέγχει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η βορτεζομίμπη μειωτικά CIP2A-ΡΡ2Α-p-Akt συνδέεται π-4EBP1. Είναι πιθανό ότι προς τα κάτω ρύθμιση του π-4EBP1 κατέστειλε eIF4E εξαρτώμενη μετάφραση προωθώντας έτσι bortezomib επαγόμενη αυτοφαγία. Αυτή η υπόθεση υποστηρίζεται από μία πρόσφατη μελέτη που δείχνει ότι η καταστολή της έκφρασης 4EBP1 οδήγησε σε περαιτέρω ευαισθητοποίηση του MYC εκφράζουν κύτταρα καρκίνου προστάτη με την ραπαμυκίνη που προκαλείται από αυτοφαγία [49]. Πράγματι, έχουμε παρατηρήσει επίσης ότι bortezomib κατέστειλε επίσης την έκφραση του 4ΕΒΡ-1 σε Sk-ΗΕΡ1 και κύτταρα Hep3B (Σχήμα 2Α), η οποία μπορεί επίσης να συμβάλει στην επαγόμενη από βορτεζομίμπη αυτοφαγία. Εναλλακτικά, μπορεί να ΡΡ2Α αποφωσφορυλιώνει άμεσα eIF4E και συμβάλλουν στη βορτεζομίμπη επαγόμενη autophagy [50]. Παρ ‘όλα αυτά, ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο το ρ-4EBP1 συμμετέχει στην αυτοφαγία ενεργοποίηση σε HCC μένει να διευκρινιστεί και περαιτέρω μελέτη είναι απαραίτητη. Παρά τα τρέχοντα αποτελέσματα, η λεπτομερής μηχανισμός με τον οποίο η βορτεζομίμπη αναστέλλει CIP2A παραμένει είναι άγνωστη και περαιτέρω μηχανιστικών μελετών που απαιτούνται. Οι πιθανοί μηχανισμοί μέσω των οποίων η βορτεζομίμπη μπορεί να επηρεάσει τη μεταγραφή του CIP2A περιλαμβάνουν άμεση ή έμμεση ρύθμιση υποστηρικτής της CIP2A mRNA, επιγενετική ρύθμιση του

CIP2A

γονιδίων μέσω μεθυλίωσης του DNA ή μηχανήματα μικρο-RNA, ή να επηρεάζουν άλλα ακόμη άγνωστα μόρια ότι μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση CIP2A

Εν κατακλείδι, η βορτεζομίμπη προκαλεί αυτοφαγία στα κύτταρα HCC μέσα από ένα μυθιστόρημα πρωτεασώματος-ανεξάρτητο μηχανισμό:. CIP2A-εξαρτώμενη π-4ΕΒΡ-1 αρνητική ρύθμιση. Αυτή η μελέτη προσδιορίζει το μυθιστόρημα ογκοπρωτεϊνης CIP2A ως ένα σημαντικό μεσολαβητή των κυττάρων HCC στη βορτεζομίμπη που προκαλείται από αυτοφαγία και προτείνει ότι CIP2A μπορεί να είναι ένας πιθανός νέος στόχος των ναρκωτικών στην HCC. Επιπλέον, η ανακάλυψη των ενώσεων /φάρμακα που δρουν ως αναστολείς CIP2A μπορεί να έχει θεραπευτικές δυνατότητες στη θεραπεία HCC.