Abstract

Τα περισσότερα ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα είναι ανθεκτικά σε παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF)-σχετικές συνδέτη που επάγει απόπτωση (TRAIL) – απόπτωση. Πάντως, οι μηχανισμοί με τους οποίους παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιούν μόρια εξωκυτταρικής τους για την εξουδετέρωση της προαποπτωτικά σηματοδότηση που διαμεσολαβείται από την οικογένεια TNF είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε για πρώτη φορά ότι DcR3, ένα εκκρινόμενο υποδοχέα δόλωμα που κακοήθη καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος εκφράζουν σε υψηλό επίπεδο, δρα ως ένα εξωκυτταρικό αντιαποπτωτικών μόριο με πρόσδεση σε TRAIL και την αντιμετώπιση λειτουργία θάνατος προαγωγής της. Η μείωση του DcR3 με siRNA εκδηλωθεί TRAIL και πολύ βελτιωμένη TRAIL-επαγώμενη απόπτωση. Η γεμσιταβίνη, μια πρώτη γραμμή φάρμακο για τον καρκίνο του παγκρέατος, μείωσε επίσης το επίπεδο του DcR3. Η προσθήκη του DcR3 siRNA ενισχυθεί περαιτέρω gemcitabine επαγόμενη απόπτωση. Αξιοσημείωτα, μας

in vivo

μελέτη έδειξε ότι η θεραπευτική επίδραση της γεμσιταβίνης θα μπορούσε να ενισχυθεί μέσω περαιτέρω μείωση του DcR3, υποδηλώνοντας ότι η ρύθμιση προς τα κάτω του DcR3 σε καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να ανατρέψει την ισορροπία των παγκρεατικών κυττάρων προς απόπτωση και ενδεχομένως να χρησιμεύσει ως ένα νέα στρατηγική για παγκρέατος θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Wang W, Zhang Μ, Sun W, Yang S, Su Υ, Zhang H, et al. (2013) Μείωση δολωμάτων Receptor 3 βελτιώνει TRAIL απόπτωση που διαμεσολαβείται από τον καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 8 (10): e74272. doi: 10.1371 /journal.pone.0074272

Επιμέλεια: Surinder Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8 Μαρτίου 2013? Αποδεκτές: 29 του Ιούλη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 25 Οκτωβρίου 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Φυσικό Ταμείο Επιστημών της Κίνας Επιχορηγήσεις (81071968) για να WW και το Πρόγραμμα Βασικά Επιστημονικών Ερευνών της Fujian Ιατρικό Πανεπιστήμιο (09ZD014) για να WW. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν τα εξής ενδιαφέροντα: συν-συγγραφέας Sunghee Kim απασχολείται από BioPowerTech. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η ισορροπία μεταξύ των προ-αποπτωτικών και αντι- αποπτωτικών παραγόντων αποτελεί καθοριστικό παράγοντα για την τύχη των καρκινικών κυττάρων . Αυτά τα κύτταρα καταφέρνουν να γείρει την πλάστιγγα προς την επιβίωση από υπερεκφράζουν αντιαποπτωτικού μόρια σε ενδοκυτταρική και μεσοκυττάρια χώρους. Ένα σώμα μελετών έχει αποδείξει ότι ενδοκυττάρια Β-κυττάρου λέμφωμα 2 (Bcl-2) προάγει την κακοήθεια σε διάφορους τύπους όγκων, ενώ το κλείδωμα του λειτουργία ενισχύει το αποτέλεσμα των αντικαρκινικών θεραπειών [1], [2], [3]. Bcl-2 σταθεροποιεί την μιτοχονδριακή μεμβράνη και εμποδίζει την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια και το σχηματισμό apoptosomes στο κυτταρόπλασμα [4], [5], μειώνοντας έτσι κυττάρου όγκου απόπτωση και ενισχύοντας την ικανότητα των όγκων να αναπτύσσονται και να κάνουν μετάσταση.

Ωστόσο, η πλειονότητα των αποπτωτικών σηματοδότηση ενεργοποιείται εξωκυτταρικώς μέσω της πρόσδεσης του προαποπτωτικών συνδετήρων από το ένα κύτταρο στο υποδοχέων θανάτου στην επιφάνεια ενός άλλου κυττάρου [6], [7]. Για παράδειγμα, οι συνδέτες του παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF) οικογένεια δεσμεύονται με τους υποδοχείς τους (π.χ., TNF να TNFR, FasL προς Fas, LIGHT να ΗνΕΜ /TR2) και στη συνέχεια ενεργοποιούν αποπτωτική σηματοδότηση σε απάντηση των δυσμενών γεγονότων [8], [ ,,,0],9]. Το εξωκυτταρικό μηχανισμός με τον οποίο τα κύτταρα προστατευθούν πριν συνδέτες θάνατος δεσμεύονται με τους υποδοχείς τους έχει προσελκύσει μεγάλη προσοχή [10], [11]. Αν και η ανακάλυψη των δολωμάτων υποδοχείς (π.χ., DcR1, DcR2, και DcR3) έχει ρίξει λίγο φως σε αυτό το φαινόμενο [8], [12], είναι απαραίτητη μια πιο λεπτομερή κατανόηση των μηχανισμών αυτών.

Τα καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιούν 2 στρώματα προστασίας: (1) ένα ενεργό σύστημα άμυνας στο οποίο υποδοχείς δολώματα μπλοκάρουν τον συνδέτη θάνατο πριν φθάσουν οι υποδοχείς της οικογένειας TNF στην κυτταρική επιφάνεια και να αποτρέψει την έναρξη της σηματοδότησης θανάτου? και (2) ένα σύστημα παθητικής άμυνας στο οποίο αντιαποπτωτικών μηχανήματα παίζει ένα ρόλο μόλις το σήμα θανάτου ενεργοποιείται μέσα στα κύτταρα. Επειδή τμήματα των μορίων των υποδοχέων κυτταρικού θανάτου τύπου Ι (π.χ., DcR3, DR3, DR5, TNFR1, OPG, και ΟΧ40) και συνδετήρες θάνατο (π.χ., FasL, φως, TL1A, TRAIL, και LTA) μοιράζονται λειτουργικά παρόμοια πεδία, ιδίως μεταξύ των 6 μελών της οικογένειας TNFR [13], χρησιμοποιήσαμε διάφορες προσεγγίσεις για να διερευνήσει τη δέσμευση και την αλληλεπίδραση του DcR3 με συνδέτη που επάγει απόπτωση TNF που σχετίζονται με (TRAIL). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το DcR3 δεν συνδέεται μόνο προς FasL, TL1A (Vegi), και το φως [14], [15], [16], [17], αλλά επίσης να TRAIL, όπως αποδεικνύεται από τα αποτελέσματα από διάφορες δοκιμασίες, συμπεριλαμβανομένης και της δέσμευσης Biacore, κυτταρομετρία ροής, ανοσοκατακρήμνιση, κηλίδωση Western, και συνδεδεμένη με ένζυμο ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA). Κακοήθη παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα εκφράζουν ένα υψηλό επίπεδο DcR3, το οποίο μπορεί να ρυθμίζεται προς τα κάτω από DCR3 siRNA ή φάρμακα χημειοθεραπείας, όπως είναι η γεμσιταβίνη. Ο συνδυασμός του DcR3 siRNA με TRAIL ή γεμσιταβίνη ενισχύει σε μεγάλο βαθμό την αποπτωτική διαδικασία

in vitro

και επιβραδύνει την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

, υποδηλώνοντας ότι η προς τα κάτω ρύθμιση της εξωκυττάριας αντιαποπτωτικών DcR3 μπορεί να ενισχύσει αντικαρκινική θεραπεία. Αυτό ισχύει ιδιαίτερα για επιθετικές καρκίνο του παγκρέατος, η οποία χρησιμοποιεί DcR3 ως το μέσο για την εξέλιξη της.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και τα αντιδραστήρια

Δύο ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές , AsPC-1 και MiaPaCa-2, και μια κυτταρική γραμμή καρκινώματος κόλου, SW480, ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σαν καλλιέργειες μονο-στρώμα σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 μg /ml στρεπτομυκίνης και 100 U /ml πενικιλίνης στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα. DcR3 που σχετίζονται με αντιδραστήρια που παρέχονται από BioPowerTech (Tuscaloosa, AL). Η γεμσιταβίνη αγοράστηκε από το φαρμακείο του Πανεπιστημίου του Ρότσεστερ Medical Center (Rochester, ΝΥ). Το siRNA για DcR3 συντέθηκε στο Ολοκληρωμένο DNA Technologies, Inc. (Coralville, ΙΑ). Ανασυνδυασμένα FasL και TRAIL και τα αντισώματα τους αγοράστηκαν από R &? D Systems (Minneapolis, ΜΝ) και BioLegend, Inc. (San Diego, CA). Πρωτεΐνη Α Sepharose σφαιρίδια αγοράστηκαν από την Pharmacia (Uppsala, Sweden). Αντι-διασπάται πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) πολύκλωνα αντισώματα αγοράστηκαν από Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, ΜΑ) και αντι-γλυκεραλδεϋδη 3-φωσφορική αφυδρογονάση (GAPDH) πολυκλωνικό αντίσωμα αγοράστηκε από Santa Cruz, Inc. (Santa Cruz, CA).

Biacore δοκιμασία

Η πρόσδεση της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης TRAIL σε άνθρωπο DcR3 αναλύθηκε σε ένα όργανο Biacore 3000 (Biacore Inc., Piscataway, New Jersey). DcR3 ήταν ομοιοπολικά συζευγμένο σε κύτταρα ροής αισθητήρα Biacore (CM5 τσιπ) μέσω ομάδων αμίνη χρησιμοποιώντας Ν-αιθυλο-Ν ‘- (διμεθυλαμινοπροπυλ) καρβοδιιμίδιο /Ν-υδροξυηλεκτριμίδιο. Διάφορες αραιώσεις του TRAIL (1 έως 2048 ηΜ) διέρχεται μέσω του συζευγμένου κύτταρο ροής και κενό επιφάνεια σε 20 μΙ /λεπτό για έναν συνολικό όγκο 70 μΙ. Η ποσότητα της δεσμευμένης πρωτεΐνης προσδιορίζεται κατά το πλύσιμο του κυττάρου ροής με ρυθμιστικό ΗΒδ-ΕΡ (10 mM HEPES [ρΗ 7,4], 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA, 0,005% Surfactant Ρ20). Για να αναγεννηθεί η επιφάνεια ροής-κυττάρου, οι συνδεδεμένες πρωτεΐνες εκπλύθηκαν με 20 mM ΝαΟΗ. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη LIGHT αραιωμένο σε ρυθμιστικό ΗΒδ-ΕΡ (1 έως 512 ηΜ) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Οι σύνδεσης, αποσύνδεσης, και σταθερές ισορροπίας προσδιορίστηκαν με κινητική πρόγραμμα αξιολόγησης στο λογισμικό Bia Αξιολόγησης (Biacore, Inc.) χρησιμοποιώντας ένα 1:01 πρότυπο δέσμευσης και την παγκόσμια μέθοδο ανάλυσης.

ανάλυση δέσμευσης κυττάρων-επιφάνειας

AsPC-1 και MiaPaCa-2 κύτταρα επωάστηκαν με ή χωρίς ανασυνδυασμένη DcR3 (5 μg /ml), TRAIL (5 μg /ml), ή ποντικού μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-TRAIL (1 μg /ml) σε οι ίδιες ή διαφορετικές σωλήνες για 1 ώρα στους 4 ° C, που ακολουθείται από βιοτινυλιωμένο μονοκλωνικό αντίσωμα DcR3 (0,5 μg /ml), και στη συνέχεια ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC), συζευγμένης στρεπταβιδίνης δευτερογενές αντίσωμα για 1 ώρα στους 4 ° C. Μετά την πλύση, το δεσμευμένο DcR3 στην κυτταρική επιφάνεια ανιχνεύτηκε με FACStarPlus (BD Inc., Franklin Lakes, NJ). Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως το ποσοστό των θετικώς χρωματισμένων κυττάρων.

Ανοσοκαθίζηση και στύπωμα Western

Η φυσική σύνδεση των DcR3 με TRAIL εξετάστηκε με ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) και κηλίδωση Western σε 3 διαφορετικές ρυθμίσεις. Για να εξεταστεί η αλληλεπίδραση μεταξύ 2 καθαρές πρωτεΐνες ανασυνδυασμού, 100 μΙ μίγματος DcR3 με TRAIL (1 μg /ml) κατακρημνίστηκε είτε με αντι-DcR3 ή αντι-TRAIL (3-5 μg) με 20 μΙ πολτού σφαιριδίων πρωτεΐνης Α. Μετά την πλύση, το δεσμευμένο σύμπλεγμα DcR3-TRAIL στα σφαιρίδια εκλούστηκε με 30 μΙ 1Χ μη μετουσιωμένη Laemmli ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος, σε ηλεκτροφόρηση σε ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλθειικού νατρίου πολυακρυλαμιδίου 12% (SDS-PAGE), μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, ανιχνεύθηκε με βιοτινυλιωμένο αντι-TRAIL ή αντι-DcR3 (1-2 μg /ml) που ακολουθείται από στρεπταβιδίνη (SA) -HRP, και οπτικοποιήθηκε με ένα ευαίσθητο υπόστρωμα χημειοφωταύγειας (Pierce, Rockford, IL). Για την ανίχνευση διαλυτό σύμπλοκο DcR3-TRAIL σε μέσα κυτταρικής καλλιέργειας και το σύμπλοκο στη μεμβράνη στη κυτταρικής λύσης, τα δείγματα με κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (50 μg /ml του PMSF, 1 μg /ml απροτινίνης, leupetin, και πεπστατίνη) καθαρίστηκαν με πρωτεΐνη Ένα σφαιρίδια και στη συνέχεια επωάστηκαν με είτε αντι-DcR3 ή αντι-TRAIL σε 4 ° C όλη τη νύκτα ενώ ανακινείται ήπια. Το δεσμευμένο σύμπλεγμα DcR3-TRAIL στα σφαιρίδια υποβλήθηκε σε κηλίδωση Western με έναν τρόπο παρόμοιο με αυτόν που περιγράφεται παραπάνω.

ELISA-σαν δοκιμασία δέσμευσης

Η σύνδεση του DcR3 με TRAIL εξετάστηκε με ένα τροποποιημένο ELISA. Τα φρέατα επικαλύφθηκαν με ανασυνδυασμένο FasL ή TRAIL (100 μΙ 1 μg /ml). Αφού οι πλάκες πλύθηκαν με ρυθμιστικό πλύσης (0.01% Tween 20 σε PBS) και αποκλείστηκαν με 5% ΡΒδ-Τ (5% Tween 20 σε PBS), 100 μΙ ανασυνδυασμένης DcR3 (1 μg /ml) με ή χωρίς ανασυνδυασμένη TRAIL ή FasL (10-20 μg /ml, για τον ανταγωνισμό) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά την πλύση, βιοτινυλιωμένο-DcR3 αντίσωμα (0,2 ng /ml) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάζονται στους 37 ° C για 1 ώρα? Μετέπειτα, 100 μΙ 1:4000 υπεροξειδάσης στρεπταβιδίνης-ραφανιδικής (SA-HRP) προστέθηκε και επωάστηκε στα φρεάτια για 45 λεπτά στους 37 ° C, πλύθηκαν, εμφανιζόμενα με 3, 3 ‘, 5, 5’ τετραμεθυλοβενζιδίνη (ΤΜΒ), και διαβάζονται σε ένα μήκος κύματος 450 nm. Στην αντίστροφη, οι πλάκες επικαλύφθηκαν με DcR3 (100 μΐ 2 μg /ml) και στη συνέχεια επωάστηκαν με ανασυνδυασμένο FasL ή TRAIL (100 μΐ 1 μg /ml) με ή χωρίς DcR3 (20-50 μg /ml, για τον ανταγωνισμό) , που ακολουθείται από βιοτινυλιωμένο αντι-FasL ή αντι-TRAIL (0,5 μg /ml), SA-HRP, ΤΜΒ και διαβάστηκαν σε Α

450.

ELISA για DcR3

DcR3 ήταν ποσοτικώς μετριέται, όπως περιγράφηκε προηγουμένως 17]. Δεδομένου DcR3 είναι μία εκκρινόμενη πρωτεΐνη, χρησιμοποιήθηκε 100 μΙ μέσου καλλιέργειας. Εν συντομία, αυτό επωάστηκε όλη τη νύχτα με μια πλάκα ELISA επικαλυμμένη με αντι-DcR3 McAb (2 μg /ml) στους 4 ° C. Μετά διάφορα πρωτεΐνες ξεπλυθεί, το δεσμευμένο DcR3 ανιχνεύθηκε με βιοτινυλιωμένο αντι-DcR3 McAb και SA-HRP και οπτικοποιούνται με υπόστρωμα ΤΜΒ. Η άγνωστη συγκέντρωση του δείγματος προσδιορίστηκε από την πρότυπη καμπύλη, η οποία υπολογίστηκε ταυτόχρονα.

Ελάττωση του DcR3 με μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA)

Μικρές παρεμβαίνει αλληλουχίες RNA για ανθρώπινη DcR3 σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το BLOCK -Είναι RNAi Designer (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Η αλληλουχία siRNA ήταν 5′- CGCUGCAGCCUCUUGAUGGAGAUGUCC-3 ‘, και η αλληλουχία siRNA ελέγχου ήταν 5′-AGGUAGUUCCAGAACUGCGUGUAGUGG-3’. Αυτά συντέθηκαν χημικά για παροδική knockdown DcR3 σε κυτταρική καλλιέργεια. Επιπλέον, παρόμοιες αλληλουχίες εισήχθησαν στον φορέα έκφρασης pSilencer για ένα σταθερό εκφραστής χαμηλής DcR3. Η επιμόλυνση διεξήχθη με αντιδραστήριο Lipofectamine LTX (Invitrogen Life Technologies) και των μέσων ενημέρωσης Opti-ΜΕΜ, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα με παροδική knockdown του DcR3 χρησιμοποιήθηκαν εντός 3 ημερών. Οι σταθερές επιμολύνσεις επιλέχθηκαν σε 50 μg /ml υγρομυκίνης Β Τα επιζώντα κύτταρα συνενώθηκαν για να αποφευχθεί παραλλαγή αποικία και τη χρήση για

in vivo μελέτη

.

Δοκιμασίες απόπτωσης

τα αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν με 3 δοκιμασίες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 24-48 ώρες και χρωματίστηκαν με αννεξίνη V /ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) για αποπτωτικά κύτταρα ή σταθερό σε 75% αλκοόλη που ακολουθείται από χρώση ΡΙ για το κλάσμα υπο-G1, σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο από τους κατασκευαστές. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε για διασπασμένης ΡΑΚΡ. Τα συλλεγέντα κύτταρα λύθηκαν με 1% ρυθμιστικό διάλυμα λύσης ΝΡ-40-Tris που περιέχει ένα κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης, και η συγκέντρωση πρωτεΐνης του προϊόντος λύσης προσδιορίστηκε με τη μέθοδο BCA (Pierce, Rockford, IL). Πρωτεΐνη (30 μg) φορτώθηκε επί 10% SDS-PAGE, ηλεκτροφόρηση, μεταφέρθηκε σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, επωάστηκαν με 0.5 μg /ml του αντι-διασπασμένη PARP ή αντι-GAPDH (ως έλεγχος φόρτωσης) που ακολουθείται από αντι-κουνελιού-ΗΚΡ και με ECL υπόστρωμα χημειοφωταύγειας.

ηθική των ζώων

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρή συμφωνία με και εγκρίθηκε από το Πανεπιστήμιο του Ρότσεστερ (Rochester, NY) Θεσμική Φροντίδα ζώων και Επιτροπής Χρήση (IACUC ), το Πανεπιστήμιο Επιτροπής των ζώων Πόρων (UCAR), όπως περιγράφεται στο

Εγχειρίδιο για την Υπεύθυνη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου

. Όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία και να περιορίσουν τον αριθμό των ζώων. Τυχόν ζώα που έδειξε σημάδια αδυναμίας και αφυδάτωση λόγω της θεραπείας έλαβε υγρή διατροφή τροφίμων. Ζώα που συνέχισαν να εμφανίζουν σημάδια αδυναμίας υποβλήθηκαν σε ευθανασία μέσω ανώδυνα αυχενική εξάρθρωση.

Η ανάπτυξη του όγκου σε γυμνά ποντίκια

επιμολύνσεων Control ή επιμολύνσεις με χαμηλή έκφραση DcR3 (2 × 10

6 σε 0,2 ml φυσιολογικού ορού) εγχύθηκαν υποδορίως στα πίσω πόδια του αθυμικών γυμνών ποντικών (ηλικίας 5-6 εβδομάδων) με βελόνα 27.5-gauge. Οι όγκοι αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 7 ημέρες (περίπου 0,1 cm

3) πριν από τη θεραπεία. Ποντικοί που φέρουν όγκους που σχηματίζεται είτε από επιμολυντές ελέγχου ή επιμολύνσεις με χαμηλή έκφραση DcR3 χωρίστηκαν τυχαία σε 2 ομάδες (8 ποντικοί /ομάδα), υποβλήθηκε σε επεξεργασία με φυσιολογικό ορό ως έλεγχο ή γεμσιταβίνη (IV 100 mg /kg) δύο φορές την εβδομάδα για 4 εβδομάδες. Για την καμπύλη ανάπτυξης του όγκου, το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε δύο φορές την εβδομάδα με παχύμετρο. Οι όγκοι του όγκου υπολογίστηκαν σύμφωνα με τον τύπο

(L x W2) /2 από

τη μέτρηση του μήκους του όγκου (L) και το πλάτος (W). Στο τέλος του πειράματος, οι όγκοι αφαιρέθηκαν και ζυγίστηκαν. Μια ELISA χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί το επίπεδο DcR3 σε ομογενοποίημα όγκου (30 μg). Κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε για DcR3, TRAIL, και διασπασμένη PARP.

Στατιστικές αναλύσεις

Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD) από τουλάχιστον 3 προσδιορισμούς, εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά. Οι διαφορές μεταξύ των ή μεταξύ των ομάδων ελέγχου και θεραπείας προσδιορίσθηκαν με του Student

t-

δοκιμή ή ανάλυση διακύμανσης (ANOVA).

P

& lt?. 0.05 αναφέρεται η στατιστική σημαντικότητα

Αποτελέσματα

DcR3 δεσμεύεται με TRAIL

TRAIL είναι δεσμευμένη σε μεμβράνη συνδέτη του θανάτου με χαμηλά επίπεδα υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας, και DcR3 είναι μία εκκρινόμενη υποδοχέα δόλωμα. Αν και έχουν FasL, TL1A, και το φως έχουν ταυτοποιηθεί ως συνδέτες του DcR3 [14], [15], [16], [17], [18], η αλληλεπίδραση του DcR3 με TRAIL δεν έχει μελετηθεί με μεγάλη λεπτομέρεια. Επειδή μετοχές TRAIL λειτουργικά παρόμοια πεδία με FasL, TL1A, και το φως, εμείς εικάζουν ότι DcR3, το οποίο συνδέεται με FasL, TL1A, και το φως, μπορεί επίσης να συνδεθεί με TRAIL.

Για να προσδιορίσετε αν DcR3 δεσμεύεται με TRAIL, εμείς διεξάγεται κατάσταση της ανάλυσης δέσμευσης τέχνη Biacore. Η ανασυνδυασμένη καθαρή DcR3 ομοιοπολικά συνδεδεμένο στην επιφάνεια του τσιπ ροής, και το καθαρό ανασυνδυασμένο TRAIL και LIGHT (ως θετικός μάρτυρας) ξεπλύθηκαν μέσα από την επιφάνεια σε διάφορες συγκεντρώσεις. Το Σχήμα 1 δείχνει την καμπύλη δεσμεύσεως του TRAIL να DcR3 σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (1 – 2.048 ηΜ). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, αν και η ισορροπία ελέγχου σταθερά (

K

eq

) του ανασυνδυασμένου ανθρώπινου LIGHT να DcR3 ήταν 13.2 ηΜ, η σταθερά του ρυθμού σύνδεσης (

K

α

) και σταθερό ρυθμό αποσύνδεση (

K

δ

) για ανασυνδυασμένη ανθρώπινη TRAIL να DcR3 ήταν 1,97 × 10

4 1 /κα και 1,04 × 10

-3 1 /s, αντίστοιχα, και η

K

eq

ήταν 52,8 nM, υποδεικνύοντας δέσμευση μεταξύ TRAIL και DcR3? Ωστόσο, η συγγένεια ήταν χαμηλότερη από εκείνη του φωτός για να DcR3.

δοκιμασίες Biocore, κυτταρομετρία ροής, στύπωση Western, ELISA και-όπως προσδιορισμοί δέσμευσης εκτελέστηκαν για να προσδιοριστεί η φυσική αλληλεπίδραση μεταξύ DcR3 και TRAIL. (Α) Ανάλυση Biacore. Η καμπύλη δέσμευσης του TRAIL να DcR3 προσδιορίστηκε σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (1 – 2.048 ηΜ). Ο έλεγχος

K

eq

της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης LIGHT να DcR3 ήταν 13,2 nM, ενώ η

K

eq

του TRAIL να DcR3 ήταν 52,8 nM. (Β) Η κυτταρομετρία ροής για DcR3 με TRAIL στην κυτταρική επιφάνεια. Αιωρούμενα κύτταρα AsPC-1 επωάστηκαν πρώτα με PBS, TRAIL (5 μg /ml) χωρίς (διαδρομή 2) ή με DcR3 (λωρίδα 4), ανασυνδυασμένη DcR3 (λωρίδα 3), ή ποντικού αντι-TRAIL MAb (1 μg /ml) με DcR3 (λωρίδα 5). Στη συνέχεια, 5 μg /ml βιοτινυλιωμένου αντι-DcR3 προστέθηκε για να προσδιοριστεί η σύνδεση του DcR3 στην επιφάνεια των κυττάρων με κυτταρομετρία ροής. (Γ και Δ) Η κυτταρομετρία ροής για τους εκτιθέμενους TRAIL. Η γεμσιταβίνη προστέθηκε σε AsPC-1 (0-1000 ηΜ) ή MiaPaCa-2 (0-100 ηΜ) κύτταρα για να διεγείρουν την έκφραση του TRAIL. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν επίσης σε αγωγή με PBS, 10 ηΜ siRNA DcR3 (για τη μείωση της πρόσδεσης και συγκάλυψης του TRAIL), ή επιπλέον ανασυνδυασμένη DcR3 (για να εμποδίσει την προσπέλαση του αντι-TRAIL) για την ανίχνευση TRAIL με κυτταρομετρία ροής. (Ε και F) Κοινός εντοπισμός των DcR3 και TRAIL. AsPC-1 κύτταρα που κατεργάζονται χωρίς (ως μάρτυρας) ή με 500 ηΜ γεμκιταβίνης (για την ενίσχυση της έκφρασης του TRAIL) βάφτηκαν με αντι-TRAIL-ΡΕ και αντι-DcR3-FITC. Doublestained κύτταρα αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (G έως L) Ανοσοκαθίζηση και στύπωμα Western για πολύπλοκες DcR3-TRAIL. 70-kDa σύμπλοκο DcR3-TRAIL σε 100 μΐ καθαρού μίγματος DcR3 και TRAIL (G και Η), λύμα (Ι και J), ή μέσα καλλιέργειας (ΙΑ και ΙΒ) κυττάρων AsPC-1 συνελήφθη με McAb αντι-DcR3 ( G, Ι, Κ) ή αντι-TRAIL (H, J, L) McAb και ακινητοποιείται με 30 μΙ σφαιριδίων πρωτεΐνης Α. Το συγκρότημα των McAb-DcR3-TRAIL εκλούστηκε με ρυθμιστικό Laemmli και υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western με βιοτινυλιωμένο αντι-TRAIL (G, Ι, Κ) ή αντι-DcR3 (H, J, L) που ακολουθείται από SA-HRP και ανιχνευτή ECL. (Μ και Ν) ανταγωνισμός πρόσδεσης μεταξύ ελεύθερης και ακινητοποιημένα μορφές DcR3 και TRAIL. M: Μετά από 100 μΙ 1 μg /ml ανασυνδυασμένου TRAIL ή FasL ακινητοποιήθηκε σε ένα τριβλίο ELISA, 1 μg /ml του DcR3 προστέθηκε χωρίς (χωρίς ομάδα ανταγωνισμός) ή με 10 μg /ml του TRAIL ή FasL (ομάδα ανταγωνισμού) ή βραστό TRAIL ή FasL (χωρίς έλεγχο πρωτεΐνη λειτουργίας), που ακολουθείται από βιοτινυλιωμένο αντι-DcR3 και SA-HRP και υποστρώματος ΤΜΒ. Ν: DcR3 ακινητοποιήθηκε σε μια πλάκα ELISA. TRAIL και FasL χρησιμοποιήθηκαν ως συνδέτες χωρίς ή με βρασμένο ή λειτουργικές 10 μg /ml του TRAIL ή FasL στη παρουσία του DcR3, που ακολουθείται από βιοτινυλιωμένο αντι-TRAIL ή αντι-FasL, και SA-HRP και ΤΜΒ υποστρώματος.

για να καθοριστεί εάν DcR3 δεσμεύεται με TRAIL, εμείς προεπωάστηκαν AsPC-1 ανθρώπινου παγκρεατικού καρκινικά κύτταρα με ή χωρίς ανασυνδυασμένη DcR3, TRAIL, ή αντι-TRAIL McAb, και στη συνέχεια χρωματίζονται τα με βιοτινυλιωμένο αντι-DcR3 που ακολουθείται από στρεπταβιδίνη-ΡΙΤΟ. Η κυτταρομετρία ροής (Σχήμα 1 Β) έδειξαν ότι, ενώ βιοτινυλιωμένο αντι-DcR3 και στρεπταβιδίνη-ΡΙΤΟ και μόνο αποτέλεσμα σε μικρή χρώση DcR3, ανασυνδυασμένη DcR3 μπορούσε να συνδεθεί με την επιφάνεια του κυττάρου και να ανιχνευθεί με αντι-DcR3. Λόγω του ανταγωνισμού μεταξύ της ελεύθερης TRAIL και TRAIL δεσμευμένη σε μεμβράνη, ανασυνδυασμένο TRAIL μειωμένη δεσμευτικός DcR3 κυτταρικής επιφάνειας. Αυτή η δέσμευση μειώθηκε επίσης με προ-επώαση με αντι-TRAIL, η οποία μπλοκάρει την προσβασιμότητα των DcR3 να είναι δεσμευμένη σε μεμβράνη TRAIL. Μαζί, τα στοιχεία δείχνουν ότι η ανασυνδυασμένη DcR3 δεσμεύεται με TRAIL στην επιφάνεια των κυττάρων AsPC-1.

Για να παρατηρήσουμε καλύτερα την αλληλεπίδραση μεταξύ TRAIL και DcR3, χρησιμοποιήσαμε γεμσιταμπίνη, μια πρώτης γραμμής antipancreatic φάρμακο για τον καρκίνο και είναι γνωστό TRAIL επαγωγέα, να ρυθμίζουν προς τα πάνω TRAIL. Λόγω διαφορών ευαισθησία φαρμάκου, τα κύτταρα AsPC-1 (Σχ 1C) απαιτούνται 10-φορές υψηλότερο επίπεδο της γεμσιταβίνης για να αυξηθεί η έκφραση του TRAIL, σε σύγκριση με MIAPaCa-2 κύτταρα (Σχ 1D). Υποθέσαμε ότι η διαλυτή DcR3 θα μάσκα TRAIL στην κυτταρική επιφάνεια? Έτσι, η μείωση του DcR3 θα μείωνε την συγκάλυψη και να ενισχύσει την χρώση των εκτιθέμενων TRAIL. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, χρησιμοποιήσαμε την προσέγγιση DcR3 siRNA. Η μείωση του DcR3 μειωμένη συγκάλυψης του TRAIL και την αύξηση της προσβασιμότητας των αντι-TRAIL σε κύτταρα AsPC-1 (σχήμα 1Γ), ενώ τα siRNA ελέγχου δεν έχει ένα τέτοιο αποτέλεσμα. Ομοίως, υποθέσαμε ότι η αυξημένη DcR3 που περιβάλλει τα κύτταρα θα ενισχύσει την συγκάλυψη και τη μείωση της προσβασιμότητας των αντι-TRAIL με TRAIL. Η ανασυνδυασμένη DcR3 προστέθηκε στα κύτταρα, προκαλώντας έτσι μειωμένη χρώση TRAIL όπως ανιχνεύεται με κυτταρομετρία ροής (Σχήμα 1 C). Ένα παρόμοιο μοτίβο παρατηρήθηκε σε MiaPaCa-2 (Σχ 1D), υποδηλώνοντας ότι το φαινόμενο της απόκρυψης TRAIL με DcR3 είναι σύνηθες στη δοκιμή κυτταρική γραμμή. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν σθεναρά την άποψη ότι DcR3 συνδέεται με TRAIL στην κυτταρική επιφάνεια.

Για να προσδιοριστεί περαιτέρω η σύνδεση του DcR3 να TRAIL, χρησιμοποιήσαμε γεμσιταβίνη να προκαλέσει την υπερέκφραση του TRAIL [19], [20] και πρόσθεσε ανασυνδυασμένη DcR3. Διπλή χρώση με αντι-TRAIL-ΡΕ (κόκκινο) και αντι-DcR3-FITC έδειξε μια ενισχυμένη colocalization (Σχήμα 1 F), σε σύγκριση με τον έλεγχο (Σχήμα 1 Ε), γεγονός που υποδηλώνει ότι DcR3 συνδέεται φυσικώς με TRAIL.

Για να επιβεβαιώσετε τη φυσική σύνδεση των DcR3 με TRAIL, πραγματοποιήσαμε ανοσοκαταβύθιση και κηλίδωση Western. FasL, ένας γνωστός συνδετήρας για DcR3, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το αντι-DcR3-σταματούν συγκρότημα DcR3-TRAIL (περίπου 70 kDa MW υπό συνθήκες ήπια μετουσίωση) θα μπορούσε να ανιχνευθεί με αντι-TRAIL σε ένα μίγμα καθαρού ανασυνδυασμένου DcR3 και TRAIL (Σχήμα 1G), λύμα (Σχ 1θ) ή ρυθμισμένα μέσα (Εικ 1K) των κυττάρων AsPC-1 που εκφράζεται τόσο DcR3 και TRAIL. Παρομοίως, το σύμπλοκο αντι-TRAIL-σταματούν DcR3-TRAIL μπορούσε να ανιχνευθεί με αντι-DcR3 στις ίδιες ρυθμίσεις 3 (Σχ 1Η, 1J, και 1 λίτρο). Ως side-by-side θετικός έλεγχος, FasL εμφάνισε ένα μοτίβο παρόμοιο με εκείνο του αντι-FasL-σταματούν DcR3-FasL σύμπλοκο ανιχνεύθηκε με αντι-DcR3 (Εικόνα 1G, 1Ι, και 1K), η οποία υποστηρίζει σθεναρά την άποψη ότι TRAIL και FasL συνδέονται με DcR3. Αξίζει να σημειωθεί ότι, το σύμπλοκο DcR3-TRAIL που σχηματίζεται όχι μόνο σε μια καθαρή κατάσταση πρωτείνης (Εικ 1G και 1Η), αλλά και σε ένα φυσικό κατάσταση στη μορφή δεσμευμένη σε μεμβράνη (σε κυτταρόλυμα, Σχήμα 1Θ και 1J) και στην εκκριτική μορφή (σε μέσα , Σχήμα 1Κ και 1L). Οι ζώνες του συμπλόκου DcR3-TRAIL σε μέσα ήταν πολύ πιο λεπτά από τις ζώνες σε κυτταρόλυμα, υποδεικνύοντας ότι το σύμπλοκο ήταν συνδεδεμένη με τη μεμβράνη. Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με αυτά που λαμβάνονται μέσω κυτταρομετρίας ροής.

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η σύνδεση των DcR3 με TRAIL, πραγματοποιήσαμε μια ELISA-σαν δοκιμασία. Όταν TRAIL ή FasL επιστρώθηκε σε πλάκες ELISA, η πρόσδεση του DcR3 σε αυτές συνδετήρες θα μπορούσαν να ανιχνευθούν με αντι-DcR3 και μειώνεται με την προσθήκη ελεύθερου ανασυνδυασμένου TRAIL ή FasL, η οποία ανταγωνίζεται με DcR3 για το ακινητοποιημένο TRAIL ή FasL (Σχ 1Μ) . Σε αντίθεση, όταν DcR3 επικαλύφθηκε σε πλάκες ELISA, η ανασυνδυασμένη TRAIL ή FasL συνδέεται προς ακινητοποιημένο DcR3 και ανιχνεύθηκε με αντι-TRAIL ή αντι-FasL, η οποία επίσης εν μέρει αποκλειστεί από την ελεύθερη μορφή του DcR3 (Εικόνα 1 Ν).

σε όλες τις δοκιμές, το σύμπλοκο FasL-DcR3 υπηρέτησε ως side-by-side θετικού ελέγχου και έδειξε ένα μοτίβο παρόμοιο με εκείνο του συμπλόκου DcR3-TRAIL (Σχήμα 1G, 1Ι, 1Κ. 1L και 1Μ), ισχυρά υποστηρίζοντας ότι το TRAIL είναι πράγματι ένα νέο συνδέτη του DcR3.

Μεταβολή DcR3 προσβεβλημένων γεμσιταβίνης επαγόμενη απόπτωση

Για να μελετηθεί η βιολογική λειτουργία του DcR3 σε καρκίνο του παγκρέατος, μετρήσαμε το επίπεδο DcR3 με ένα ποσοτική ELISA για DcR3 [21] σε AsPC-1 και MiaPaCa-2 παγκρεατικού καρκίνου κύτταρα. Σε σύγκριση με SW480, μια ανθρώπινη κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος κόλον που είναι γνωστό ότι εκφράζουν υψηλά επίπεδα DcR3, σε σύγκριση με άλλες 13 κυτταρικές γραμμές [22], τα κύτταρα AsPC-1 και MiaPaCa-2 είχε ένα ακόμα υψηλότερο επίπεδο DcR3 (Εικόνα 2 Α), η οποία είναι συνεπής με τις άλλες εκθέσεις [23], [24]. Τόσο DcR3 και TRAIL εκφράζεται σε υψηλό επίπεδο σχετικά με τα ίδια κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι αντιαποπτωτικού και προ-αποπτωτικών μορίων είναι ισορροπημένη σε υψηλό επίπεδο για την αντιμετώπιση κάθε άλλο. Η φυσική έκφραση υψηλών επιπέδων και των δύο μορίων καθιστά τη μελέτη της αλληλεπίδρασης τους πολύ ευκολότερη.

(Α) Έκφραση DcR3 σε AsPC-1, MiaPaCa-2, και τα κύτταρα SW480 (ως θετικός μάρτυρας). Το επίπεδο DcR3 σε 100 μΐ ρυθμισμένων μέσων από κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (4 ml) μετρήθηκε με ELISA. (Β και Γ) γεμσιταβίνη μειωμένη έκφραση DcR3. AsPC-1 και MiaPaCa-2 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με γεμκιταβίνη στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 48 ώρες. Το επίπεδο DcR3 μετρήθηκε σε 100 μΙ μέσου από κάθε ομάδα. (D) siRNA γκρέμισε έκφραση DcR3. Κύτταρα (1 χ 10

5) σε πλάκες 6-φρεατίων μορφομετατράπηκαν με 10 ηΜ siRNA DcR3 ή τον έλεγχο siRNA σε Transfectin LTX (6,25 μΙ /φρεάτιο). Μετά από 24 ώρες, DcR3 σε μέσα καλλιέργειας μετρήθηκε με ELISA.

Η

Για να προσδιοριστεί η διαδραστική αποτέλεσμα του DcR3 και TRAIL σε καρκινικά κύτταρα, γεμσιταμπίνη και siRNA για DcR3 χρησιμοποιήθηκαν για τη ρύθμιση του επιπέδου του DcR3. Τα κύτταρα AsPC-1 και MiaPaCa-2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διαφορετικές δόσεις γεμσιταβίνης για 48 ώρες, και το επίπεδο του DcR3 στα μέσα ενημέρωσης μετρήθηκε με ELISA. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η γεμσιταβίνη μειωμένη DcR3 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο και στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2Β και C). Μια παρόμοια μείωση παρατηρήθηκε με siRNA (Σχήμα 2D).

Εάν η λειτουργία της γεμσιταβίνης μειωμένη DcR3 είναι να γείρει την πλάστιγγα προς την απόπτωση, τότε η προσθήκη DcR3 θα πρέπει να αντιστρέψει γκεμσιταμπίνης απόπτωση. Έτσι, AsPC-1 και MiaPaCa-2 κύτταρα κατεργάστηκαν με διαφορετικές δόσεις γεμσιταβίνης με ή χωρίς ανασυνδυασμένη DcR3 για 48 ώρες, και στη συνέχεια τα αποπτωτικά κύτταρα μετρήθηκαν με χρώση Annexin V. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το 5-8% των κυττάρων ήταν αποπτωτικά στον έλεγχο, τα οποία αυξήθηκαν σε περίπου 30% στην ομάδα γεμσιταβίνη. Αυτό gemcitabine απόπτωση μειώθηκε με την προσθήκη ανασυνδυασμένης DcR3 (0, 0.5, 1, και 2 μg /ml) σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 3Α και 3Β). Ομοίως, η gemcitabine επαγόμενη αύξηση της δραστικότητας κασπάσης 3 αντιστράφηκε με DcR3 (Εικόνα 3C και 3D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το DcR3 διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην αναστολή της απόπτωσης και ότι η gemcitabine επαγόμενη μείωση του DcR3 μπορεί να σχετίζεται με αντικαρκινική δράση του.

γεμσιταβίνη προστέθηκε σε μέσα μαζικής ενημέρωσης των AsPC-1 (500 ηΜ) ή MiaPaCa-2 κύτταρα (50 ηΜ) επωάστηκαν με 0, 0,5, 1, ή 2 μg /ml ανασυνδυασμένης DcR3 για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε κυτταρομετρία ροής για το κλάσμα υπο-G1 (Α και Β) ή μία δοκιμασία ενζύμου για δραστικότητα κασπάσης 3 (Γ και Δ). Η γεμσιταβίνη-ενεργοποιείται απόπτωση μειώθηκε με την προσθήκη DcR3 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (

P

& lt? 0,01).

Η

Η ελαττωμένη DcR3 με siRNA προωθείται TRAIL-μεσολαβούμενη απόπτωση σε vitro

για να ελέγξετε εάν η αποκάλυψη του TRAIL μπορούσε να αυξήσει την προσβασιμότητα της με τον υποδοχέα της και να ενισχύσει αυτή την οδό του θανάτου, εξετάσαμε την επίδραση της DcR3 σε TRAIL-απόπτωση. Ο κατακερματισμός DNA (υπο-G1) δοκιμασία έδειξαν ότι όταν τα κύτταρα AsPC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με FasL ή LIGHT συν ελέγχου siRNA ή DcR3 siRNA, απόπτωση δεν αυξήθηκε σημαντικά. Ωστόσο, όταν υποβάλλεται σε επεξεργασία με TRAIL και DcR3 siRNA, κύτταρα AsPC-1 επέδειξαν μια δραματική αύξηση στην απόπτωση, σε σύγκριση με κύτταρα που κατεργάζονται με TRAIL συν ελέγχου siRNA (Εικόνα 4Α). κύτταρα MIAPaCa-2 εμφάνισαν ένα παρόμοιο μοτίβο (Σχήμα 4C). Η ενισχυμένη απόπτωση επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από την αυξημένη διασπασμένη PARP, όπως προσδιορίζεται με κηλίδωση Western (Σχήμα 4Β και 4D). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι μειώνεται DcR3 θα μπορούσε να ενισχύσει σε μεγάλο βαθμό την επίδραση προαποπτωτική του TRAIL σε αυτά τα 2 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (σε σύγκριση με FasL και LIGHT), ενώ DcR3 χρησιμοποιείται από αυτά τα κύτταρα για να αντισταθμίσει την επίδραση των προαποπτωτικά TRAIL.

AsPC-1 ή MiaPaCa-2 κύτταρα μορφομετατράπηκαν με 10 ηΜ siRNA ελέγχου ή DcR3 siRNA, αντίστοιχα. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ανασυνδυασμένη FasL, το φως, ή TRAIL (100 ng /ml για AsPC-1 και 20 ng /ml για κύτταρα MiaPaCa-2) για 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε κυτταρομετρία ροής για το κλάσμα υπο-G1 (Α και C) ή κηλίδωση Western για διασπασμένης ΡΑΚΡ (Β και D). DcR3 siRNA ενισχύεται σημαντικά TRAIL-επαγώμενη απόπτωση (

P

& lt? 0,05).

Η

DcR3 επηρεάζονται gemcitabine απόπτωση που διαμεσολαβείται από in vitro

DcR3 siRNA και gemcitabine μειωθεί ο επίπεδο έκφρασης του DcR3 (Σχήμα 3 και 4). Θελήσαμε να προσδιοριστεί εάν περαιτέρω προς τα κάτω ρύθμιση του DcR3 μέσω του συνδυασμού αυτών των 2 παράγοντες θα μπορούσαν να ενισχύσουν την προ-αποπτωτικών αποτέλεσμα, σε σύγκριση με ένα μόνο παράγοντα μόνο. Αφού τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με είτε siRNA ή μόνα τους ή σε συνδυασμό γεμσιταβίνη, μετρήθηκαν κατακερματισμού του DNA και διασπασμένη PARP. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ενώ μόνος γεμσιταβίνης προκάλεσε αυξημένη απόπτωση (Σχήμα 5Α και 5C) και διασπάται επίπεδα PARP (Σχήμα 5Β και 5D), ο συνδυασμός της με siRNA αυξηθεί περαιτέρω απόπτωση και διασπάται επίπεδα PARP (Σχήμα 5). Χωρίς μια προ-αποπτωτικών συνδέτη με το οποίο να δεσμεύει και την εξουδετέρωση, DcR3 siRNA μόνος δεν είχε καμία επίδραση? Ωστόσο, όταν TRAIL ρυθμίζεται αυξητικά με gemcitabine, η μείωση του DcR3 μείωσε την κάλυψη του TRAIL, προωθώντας έτσι την απόπτωση.

AsPC-1 ή MiaPaCa-2 κύτταρα μορφομετατράπηκαν με 10 ηΜ siRNA ελέγχου ή DcR3 siRNA, αντίστοιχα . Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με γεμκιταβίνη (250 ή 25 ηΜ, αντίστοιχα) για 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε κυτταρομετρία ροής για το κλάσμα υπο-G1 (Α και C) ή κηλίδωση Western για διασπασμένης ΡΑΚΡ (Β και D). Ο συνδυασμός του DcR3 siRNA και gemcitabine ενίσχυσε σημαντικά την προ-αποπτωτικών αποτέλεσμα.

Η

Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με αυτά στο Σχήμα 3. Σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα που φαίνονται στα Σχήματα 1 και 4, τα δεδομένα δείχνουν ότι η πρόσδεση DcR3 για TRAIL μειώνει TRAIL επαγόμενη απόπτωση και προστατεύει τα κύτταρα του όγκου, τα οποία θα μπορούσαν να ευθύνονται για την ανθεκτικότητα των όγκων στην αγωγή TRAIL.

η ελαττωμένη DcR3 βελτίωσε την χημειοθεραπευτική επίδραση στην ανάπτυξη του όγκου in vivo

Ενθαρρυμένος από υποσχόμενος

in vitro

αποτελέσματα, θέλαμε να προσδιοριστεί εάν η μείωση του DcR3 θα μπορούσε να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας

in vivo.

AsPC-1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα φορέα έκφρασης θηλαστικού που περιείχε siRNA να knockdown την έκφραση του DcR3 και μια κασέτα για επιλογή G418. Τα συγκεντρωμένα κύτταρα διάνυσμα ψευδο-διαμόλυνση (ως μάρτυρας), ή DcR3 siRNA επιμολυσμένα κύτταρα με χαμηλή έκφραση DcR3 (επιβεβαιώθηκε με ELISA) ενέθηκαν σε γυμνά ποντίκια, και τα καθιερωμένα όγκοι (60 mm3) μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με γεμσιταβίνη.