Αφηρημένο

Μια πρωτεΐνη που απομονώνεται από το φλοιό του

Crataeva Tapia

(CrataBL) είναι τόσο ένας αναστολέας πρωτεάσης φυτό Kunitz-τύπου και λεκτίνη. Έχουμε προσδιορίσει την αλληλουχία αμινοξέων και τρισδιάστατη δομή του CrataBL, καθώς χαρακτηρίζεται από επιλεγμένα βιοχημικές και βιολογικές ιδιότητες. Βρήκαμε δύο διαφορετικές ισομορφές CrataBL απομονώθηκε από την αρχική πηγή, που διαφέρουν στις θέσεις 31 (Pro /Leu)? 92 (Ser /Leu)? 93 (Ιλ /Thr)? 95 (Arg /Gly) και 97 (Leu /Ser). CrataBL έδειξαν σχετικά ασθενή ανασταλτική δράση έναντι της θρυψίνης (K

ΙΑΡΡ = 43 μΜ) και ήταν πιο ισχυρό κατά του Παράγοντα Χα (Κ

ΙΑΡΡ = 8,6 μΜ), αλλά δεν ήταν δραστική ενάντια σε ένα αριθμό άλλων πρωτεασών. Έχουμε επιβεβαιώσει ότι CrataBL περιέχει δύο θέσεις γλυκοζυλίωσης και σχηματίζει ένα διμερές σε υψηλή συγκέντρωση. Οι κρυσταλλικές δομές υψηλής ανάλυσης από δύο διαφορετικές κρυσταλλικές μορφές της ισομορφής II επαλήθευσε την β-τριφυλλόσχημο φορές της CrataBL και έχουν δείξει την παρουσία διμερή που αποτελούνται από δύο σχεδόν πανομοιότυπα μόρια κάνει εκτεταμένες επαφές (~645 A

2). Η δομή διαφέρει από αυτή των πιο στενά συνδεόμενες πρωτεΐνες από την έλλειψη του Ν-τερματικού β-φουρκέτας. Σε πειράματα με στόχο τη διερεύνηση των βιολογικών ιδιοτήτων του CrataBL, έχουμε δείξει ότι η προσθήκη 40 μΜ της πρωτεΐνης για 48 ώρες προκάλεσε μέγιστη αναστολή ανάπτυξης σε δοκιμασία ΜΤΤ (47% των κυττάρων DU145 και το 43% των κυττάρων PC3). Η απόπτωση των DU145 και κυτταρικές σειρές PC3 επιβεβαιώθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας αννεξίνη V FITC και ιωδιούχο προπίδιο χρώση /. Η θεραπεία με CrataBL είχε ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση του μιτοχονδριακού κυτοχρώματος

γ

και στην ενεργοποίηση της κασπάσης-3 σε DU145 και PC3 κύτταρα

Παράθεση:. Ferreira RDS, Zhou D, Ferreira JG, Σίλβα MCC , Σίλβα-Λούκα RA, Mentele R, et al. (2013) Κρύσταλλο Δομή

Crataeva Tapia

Bark Πρωτεΐνη (CrataBL) και η επίδρασή της στην ανθρώπινη καρκίνο του προστάτη κυτταρικών γραμμών. PLoS ONE 8 (6): e64426. doi: 10.1371 /journal.pone.0064426

Επιμέλεια: Enrique Pérez-Payá, Centro de Investigacion Principe Felipe και IBV-CSIC, Ισπανία

Ελήφθη: 17 Δεκ 2012? Αποδεκτές: 15 του Απριλίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 18 Ιουνίου 2013

Copyright: © 2013 Ferreira et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρήση η APS υποστηρίχθηκε από το Υπουργείο Ενέργειας, Γραφείο της Επιστήμης, Γραφείο των Βασικών Επιστημών Ενέργειας των ΗΠΑ στο πλαίσιο της συμβάσεως αριθ W-31-109-Eng-38. Οι συγγραφείς είναι ευγνώμονες προς κάπες, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Τεχνολογικό (CNPq) και Σάο Πάολο Ίδρυμα Ερευνών (FAPESP) (Διαδικασία 09 /53.766 έως 5) για την παροχή οικονομικής στήριξης. Το έργο αυτό υποστηρίζεται επίσης εν μέρει από το εσωτερικό ερευνητικό πρόγραμμα του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας (NIH), Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Κέντρο Έρευνας για τον Καρκίνο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ένας μεγάλος αριθμός των πρωτεϊνών χαρακτηρίζονται από β-τριφυλλοειδές φορές τους [1]. Τα μέλη αυτού του μεριδίου υπερ δομικά χαρακτηριστικά, αλλά όχι κατ ‘ανάγκη άλλες ιδιότητες και βιολογικός ρόλος τους μπορεί να είναι πολύ διαφορετικές [2]. Εξέχουσα θέση μεταξύ αυτών είναι αναστολείς της πρωτεάσης φυτό του τύπου Kunitz, που ονομάζεται Kunitz-P ή Kunitz-STI αναστολείς [2], [3]. Αυτές οι πρωτεΐνες αναστέλλουν πρωτίστως πρωτεάσες σερίνης, αν και ορισμένα επίσης αναστέλλουν κυστεΐνης και ασπαρτικού πρωτεασών [4]. Οι αναστολείς Kunitz-Ρ χαρακτηρίζεται από μοριακή μάζα περίπου 20.000 Da (για ολόκληρη την πρωτεΐνη ή έναν τομέα), χαμηλή περιεκτικότητα σε υπολείμματα κυστεΐνης, και μία ή δύο αντιδραστικές θέσεις που αποτελούν τη βάση της ανασταλτικής δράσης τους. Ωστόσο, ορισμένα δομικά συγγενείς πρωτεΐνες β-τριφυλλοειδές δεν αναστολείς πρωτεάσης καθόλου, αλλά παρουσιάζουν ποικίλες άλλες ιδιότητες, για παράδειγμα πρόσδεσης [5], τροποποίηση γεύση (μιρακουλίνη) χλωροφύλλη [6], σύνδεση με υποδοχείς κυτοκίνης (IL-1β) [7 ], ριβόσωμα δηλητηρίαση (ρικίνη) [8] ή υδατάνθρακες δέσμευσης, γεγονός που επιβεβαιώνεται από το

Clitocybe nebularis

λεκτίνη, CNL [9].

λεκτίνες φυτών είναι πρωτεΐνες που έχουν τουλάχιστον ένα μη καταλυτικό περιοχή που δεσμεύεται αντιστρεπτά και ειδικώς μονο- ή ολιγοσακχαρίτες [10], [11]. Λόγω αυτών των ιδιοτήτων, οι εν λόγω πρωτεΐνες που χρησιμοποιείται στο χαρακτηρισμό των γλυκοσυζευγμάτων και σε κυτταρική επιφάνεια ή μελέτες αρχιτεκτονική κυττάρου-κυττάρου [12], [13]. Λίγα αναστολείς πρωτεάσης επίσης δείχνουν δραστικότητα λεκτίνης, ένα παράδειγμα που παρέχεται από τον αναστολέα απομονωμένο από την επιδερμίδα του χελιού, που ονομάστηκε χελιού-CPI-1 [14]. Troncoso et al. [15] απομόνωσαν ένα αναστολέα με ιδιότητες λεκτίνη από το

Peltophorum dubium

σπόρους που μειώνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων λεμφώματος ποντικού Nb2.

Crataeva Tapia

(επίσης γνωστή ως

Crateva Tapia

) ανήκει στην οικογένεια Capparaceae που βρίσκεται στη βορειοανατολική Βραζιλία. Μία πρωτεΐνη από το

Crataeva tapia

φλοιός έχει καθαριστεί χρησιμοποιώντας αντιστραφεί μικκύλια σε ισοοκτάνιο [16] και μέσω χρωματογραφικών διαδικασιών [17]. Named CrataBL (

Crataeva tapia

Bark λεκτίνη), αυτή η πρωτεΐνη αποδείχθηκε ότι διαθέτει κάποια εξειδίκευση για πρόσδεση γλυκόζη και γαλακτόζη [17]. Ένας αριθμός των βιολογικών ιδιοτήτων του έχουν χαρακτηριστεί, συμπεριλαμβανομένων καθυστέρηση στο σχηματισμό θρόμβου, αλλοιώνοντας την ενδογενή οδό της πήξης του καταρράκτη [18]. Επιπλέον, CrataBL δείχθηκε ότι εμφανίζουν αντι-φλεγμονώδη, αναλγητική [19], εντομοκτόνες [17], και κατά των όγκων [19] δραστηριότητες.

Ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο συχνή μορφή καρκίνου στους άνδρες [20], με DU145 και PC3 είναι οι πλέον εκτεταμένα μελετηθεί καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές που χρησιμεύουν ως

in vitro

μοντέλα για μελέτες θεραπείας του καρκίνου [21], [22], [23]. Ο καρκίνος του προστάτη συνδέεται με ένα υψηλό επίπεδο έκφρασης των πρωτεασών [24] και γλυκοπρωτεϊνών [25], καθιστώντας CrataBL ένα δυνητικά χρήσιμο εργαλείο για μελέτες που περιλαμβάνουν κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, λόγω του συνδυασμού των ιδιοτήτων που περιλαμβάνουν τόσο την αναστολή της πρωτεάσης και δεσμεύσεως υδατανθράκων.

Στην εργασία αυτή, προσδιορίσαμε την αλληλουχία αμινοξέων και την τρισδιάστατη δομή του CrataBL και διερευνήθηκε επίσης μια σειρά από βιοχημικές δραστηριότητες, τα συγκρίνει με τις ιδιότητες των άλλων μελών αυτής της υπεροικογένειας. Στη συνέχεια, χαρακτηρίσαμε την επίδραση του CrataBL στην ανάπτυξη και τη σταθερότητα των κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη στον άνθρωπο.

Υλικά και Μέθοδοι

Απομόνωση CrataBL

Απομόνωση

της πρωτεΐνης έγινε σύμφωνα με την διαδικασία του Araújo et al. [17]. Εν συντομία, 10% (w /v) εκχυλίσματα από

Crataeva tapia

φλοιός κλασματοποιήθηκαν με 30-60% θειικό αμμώνιο. Το κλάσμα που περιέχει την πρωτεΐνη υποβλήθηκε σε διαπίδυση έναντι 10 mM φωσφορικού κιτρικού ρυθμιστικού διαλύματος ρΗ 5,5 και εφαρμόστηκε σε μία στήλη ΟΜ-κυτταρίνης έχει εξισορροπηθεί με το ίδιο ρυθμιστικό. Προσροφημένο πρωτεΐνη εκλούστηκε με ένα ρυθμιστικό διάλυμα εξισορρόπησης που περιέχει 0.5 Μ NaCl και το περιεχόμενο της μόνο κορυφή υποβλήθηκαν σε χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους σε στήλη Superdex 75, εξισορροπημένη σε 0.15 Μ NaCl χρησιμοποιώντας μια ΔKTA καθαριστής (GE Healthcare, Uppsala, Σουηδία). Αυτό ακολουθήθηκε από υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) επί στήλης C18, για να επιβεβαιωθεί η ομοιογένεια του δείγματος. Οι εκλούσεις παρακολουθήθηκαν στα 280 nm.

Η συγκέντρωση πρωτεΐνης και υδατάνθρακα δοκιμασίες

Ο προσδιορισμός πρωτεΐνης διεξήχθη όπως περιγράφεται από τους Lowry et al. [26] χρησιμοποιώντας αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) ως πρότυπο. Η περιεκτικότητα σε σάκχαρα CrataBL προσδιορίστηκε με τη μέθοδο φαινόλης-θειικού οξέος της Masuko et al. [27], με μαννόζη σε συγκεντρώσεις 2, 4, 6, 8, και 10 μg ως πρότυπο.

MALDI-TOF /MS ανάλυση

Η μοριακή μάζα του CrataBL αναλύθηκε με MALDI-TOF /MS. 1 μL CrataBL (2 mg /mL) προστέθηκε σε 1 μι α-κυανο-4-υδροξυκινναμωμικού οξέως (10 mg /ml) διαλύματος μήτρας, στίγματα πάνω σε ένα από ανοξείδωτο χάλυβα πλάκα MALDI στόχου και ξηραίνεται σε θερμοκρασία δωματίου πριν την ανάλυση. Τα φάσματα μάζης ελήφθησαν με ένα όργανο Bruker Daltonics Microflex LT (Billerica, USA) που λειτουργούν σε γραμμική, τρόπο θετικού ιόντος, προηγουμένως βαθμονομηθεί με ινσουλίνη, ουβικιτίνη, κυτόχρωμα C, και η μυοσφαιρίνη. Για την ανάλυση της πρωτεΐνης, τα φάσματα μάζας αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες παραμέτρους μέσο: καθυστέρηση παλμική ιόν εξόρυξη 30 ns, η τάση πηγής ιόντων ενός, 20 kV, τάση πηγή ιόντων δύο, 18.65 kV, και πηγή ιόντων τάσης φακός 7,1 kV. Για κάθε δείγμα, φάσματα μάζας αποκτήθηκαν με τη συσσώρευση 50 βολές λέιζερ στο 50% της ισχύος λέιζερ στην περιοχή m /z του 8000 με 25000 Da.

Δημοτικό δομή CrataBL

προσδιορισμός της αλληλουχίας του φυσική πρωτεΐνη διεξήχθη με αποικοδόμηση Edman. [28] Το δείγμα μειώθηκε, αλκυλιωμένα, και στη συνέχεια υποβάλλονται σε πέψη με θρυψίνη, χυμοθρυψίνη, Asp-Ν, και Lys-C ενδοπεπτιδάσες (βαθμός αλληλουχίας, Roche, Germany). Τα θραύσματα που προκύπτουν από την κατεργασία με ενδοπεπτιδάσες καθαρίστηκαν σε 1 × 150 mm στήλη Jupiter Proteo 90Α (Phenomenex, Aschaffenburg, Γερμανία) σε ένα ρυθμό ροής 0,1 mL /min, με χρήση ακετονιτριλίου (0-60%) με 0,1% ( ν /ν) τριφθοροξικό οξύ επί 40 λεπτά. Διεξήχθη αλληλούχιση σε ένα αυτόματο αλληλουχητή αέριας φάσης (492cLC? Applied Biosystems, Foster City, USA). Τα γλυκοσυλιωμένα πεπτίδια αναλύθηκαν με φασματομετρία μάζας για τον προσδιορισμό της μοριακής μάζας των τμημάτων υδατανθράκων. ομοιότητες ακολουθία αξιολογήθηκαν με το πρόγραμμα BLAST με τη βάση δεδομένων πρωτεϊνών NCBI [29]. Οι αλληλουχίες ευθυγραμμίστηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα MULTALIN [30].

δοκιμασίες αναστολής Enzyme

Η ανασταλτική δραστικότητα των CrataBL έναντι πρωτεασών μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ειδικά χρωμογόνα ή φθορισμογόνα υποστρώματα σε πλάκες μικροτιτλοδότησης 96-φρεατίων στους 37 ΝΤΟ. Τα ένζυμα (ανθρώπινο Παράγοντα Χα, βόεια τρυψίνη, χυμοτρυψίνη βοοειδούς, ανθρώπινη καλλικρεΐνη πλάσματος (HuPK), χοίρεια παγκρεατική καλλικρεϊνη (POPk), ανθρώπινη ελαστάση ουδετεροφίλου (ΗΝΕ), ανθρώπινη πλασμίνη, και παπαΐνη) προ-επωάστηκαν είτε με CrataBL ή με διαλύτη για 10 λεπτά. Οι αντιδράσεις ξεκίνησαν με την προσθήκη των υποστρωμάτων, και το χρώμα ή φθορισμός παρακολουθήθηκαν συνεχώς στα 405 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο (Packard, SpectraCount), ή σε 380/460 nm χρησιμοποιώντας Hitachi F-2000 φασματοφθορόμετρο (Tokyo, Japan), αντίστοιχα, για 30 λεπτά, και διακόπτεται με την προσθήκη 50 μL του 30% (ν /ν) οξικό οξύ. Ενζυματικές δραστηριότητες αναλύθηκαν στα ακόλουθα ρυθμιστικά διαλύματα (τελικές συγκεντρώσεις): ανθρώπινο παράγοντα Χα (21 ηΜ σε 0,02 Μ Tris-HCl, ρΗ 7.4 που περιέχει 0.14 Μ NaCl, 5,0 mM ΟαΟ

2 και 0,1% αλβουμίνη βόειου ορού? 0,57 mM Βοο -Ile-Glu-Gly-Arg-AMC)? βόεια θρυψίνη (40 nm σε 0.1 Μ Tris-HCl, ρΗ 8,0 που περιέχει 0,02% (ν /ν) CaCl

2? 0,8 mM Bz-Arg-pNan)? χυμοθρυψίνη βοοειδών (88 ηΜ σε 0,05 Μ Tris-HCl, ρΗ 8,0? 0,8 mM Suc-Phe-pNan)? HuPK (14,7 ηΜ σε 0,1 Μ Tris-HCl, ρΗ 8.0 που περιέχει 0.5 Μ NaCl? 0,4 mM Η-D-Pro-Phe-Arg-pNan)? POPk (2,6 ηΜ σε 0,1 Μ Tris-HCl, ρΗ 9.0? 0.16 mM HD-Val-Leu-Arg-pNan)? ΗΝΕ (1,3 ηΜ σε 0,05 Μ Tris-HCl, ρΗ 7.0 που περιέχει 0.5 Μ NaCl? 0,88 mM MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNan)? ανθρώπινη πλασμίνη (3.5 ηΜ σε 0,1 Μ Tris-HCl, ρΗ 7.4 που περιέχει 0.2 Μ NaCl? 0,9 mM HD-Val-Leu-Lys-pNan) και παπαΐνη (87 ηΜ σε 0,1 Μ Να

2HPO

4, ρΗ 6,3 που περιέχει 0,4 Μ NaCl, 0,01 Μ EDTA? 0.4 mM Ζ-Phe-Arg-pNan). Οι φαινόμενες K

ΙΑΡΡ τιμές προσδιορίστηκαν με υπαγωγή των πειραματικών σημείων στην εξίσωση για βραδέως στενή σύνδεση [31] με τη βοήθεια του προγράμματος Grafit, έκδοση 4.0 (Erithacus Software, Staines, UK) [32].

Αντιδραστική προσδιορισμός θέση με χρωματογραφία συγγένειας σε θρυψίνη-Sepharose

ένα δείγμα που περιέχει 1,8 mg πρωτεΐνης σε 0.1 Μ Tris-HCl ρυθμιστικό ρΗ 8,0 εφαρμόσθηκε σε μία στήλη 1,0 ml θρυψίνη-Sepharose εξισορροπημένη με το ίδιο ρυθμιστής. Ο αναστολέας εκλούστηκε με 0,5 Μ ΚΟΙ /ΗΟΙ, ρΗ 2,0 και διατηρείται σε αυτό το ρΗ μέχρι το Ν-τερματικό βήμα προσδιορισμού.

κρυστάλλωση Protein

Ένα εξαιρετικά καθαρισμένο δείγμα πρωτεΐνη συγκεντρώνονται από Superdex 75 στήλη υποβλήθηκε σε διαπίδυση σε ρυθμιστικό διάλυμα που αποτελείται από 20 mM Tris ρΗ 8,0, 100 mM NaCl, και 3% γλυκερόλη, και στη συνέχεια συμπυκνώθηκε σε 8,5 mg /mL χρησιμοποιώντας μονάδες φυγοκεντρικής φίλτρο (Millipore, Billerica, ΜΑ). Οι αρχικές δοκιμές κρυστάλλωσης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα ρομπότ Phoenix (άρθρο Robbins Instruments, Mountain View, CA). Ένας αριθμός των επισκέψεων ελήφθησαν από πολλές διαφορετικές οθόνες κρυστάλλωση [JCSG (Qiagen, Valencia, CA), Crystal ΗΤ οθόνη, Index (Hampton Research, Aliso Viejo, CA), και Wizard1-2 (Emerald Biosystems, Bedford, ΜΑ)]. κρύσταλλοι ποιότητα περίθλασης λήφθηκαν από τις οθόνες D12 JCSG-CORE-II (0.2 Μ Li

2SO

4, 30% PEG3350) και G8 (0.16 Μ θειικό αμμώνιο, 0.08 Μ οξικό νάτριο ρΗ 4,6, 20% PEG4000, 20 % γλυκερόλη). Κρύσταλλοι εμφανίστηκαν τη δεύτερη ημέρα και μεγάλωσε στο πλήρες μέγεθος μέσα σε μερικές ημέρες στους 20 ° C.

X-ray συλλογής και επεξεργασίας δεδομένων

δεδομένα περίθλασης συλλέχθηκαν κατά τη Νοτιοανατολική Περιφερειακή Συνεργατική Ομάδα Πρόσβασης (SER-CAT) beamline 22-ID στην Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory. Μονοκρύσταλλοι μεταφέρθηκαν σε ένα κρυοπροστατευτικό διάλυμα (μητρικό υγρό με επιπλέον 10-20% γλυκερίνη) για περίπου 2 λεπτά και στη συνέχεια έγιναν φλας καταψύχθηκαν στους 100 Κ σε ένα ρεύμα υγρού αζώτου. Ένας κρύσταλλος από την κατάσταση της G8 JCSG-CORE-II (που ονομάζεται έντυπο Ι) περίθλαση ακτίνων Χ για την επίλυση των 1.5 Å. δεδομένα περίθλασης αναπροσαρμόζονται, ολοκληρωμένη, και κλιμακώνεται με το πρόγραμμα XDS [33]. Ο κρύσταλλος ανήκει στην ομάδα χώρου

C

2 με παραμέτρους μοναδιαίας κυψελίδας α = 114.9 Α, b = 46.2 Α, ο = 71,5 Α, β = 103,4 ° και περιέχει ένα διμερές CrataBL στην ασύμμετρη μονάδα. Ο εκτιμώμενος συντελεστής Matthews είναι 2.26 Å

3 Da

-1, που αντιστοιχεί σε περιεκτικότητα σε διαλύτες 45,5%. Ένας κρύσταλλος από την κατάσταση D12 JCSG-CORE-II (ονομάζεται μορφή II) περίθλαση ακτίνων Χ για την επίλυση του 1,75 Å. δεδομένα περίθλασης επίσης σε επεξεργασία με το πρόγραμμα XDS. Ο κρύσταλλος ανήκει επίσης στην ομάδα χώρου

C

2, αλλά με διαφορετικές παραμέτρους μοναδιαίας κυψελίδας, α = 95,6 Α, b = 76.3 Α, ο = 62,3 Α, β = 120,1 °, με ένα μόνο διμερές CrataBL στην ασύμμετρη μονάδα. Ο εκτιμώμενος συντελεστής Matthews είναι 2.66 Å

3 Da

-1, που αντιστοιχεί σε περιεκτικότητα σε διαλύτες 53,9%. Τα στατιστικά στοιχεία επεξεργασίας δεδομένων για τις δύο κρυσταλλικές μορφές παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.

Η

Προσδιορισμός της δομής και φινέτσα

Η δομή των CrataBL αρχικά προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δεδομένα περίθλασης της κρυσταλλικής μορφής Ι και η προκύπτουσα συντεταγμένες χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια ως πρότυπο εκκίνησης για τη μοριακή αντικατάσταση με δεδομένα που συλλέγονται για την κρυσταλλική μορφή II. Η δομή του CrataBL λύθηκε με μοριακή αντικατάσταση με το πρόγραμμα Phaser [34], [35] χρησιμοποιώντας τη δομή του υδατοδιαλυτού πρωτεΐνη χλωροφύλλης (ΠΠ ID: 2DRE) ως πρότυπο εκκίνησης. Η τελευταία πρωτεΐνη επελέγη λόγω υψηλότερη ταυτότητα της πρωτεύουσας δομής της με CrataBL (& gt? 30%). Μια μοναδική λύση που εκπροσωπούν τα δύο μόρια στην ασύμμετρη μονάδα βρέθηκε για τα δεδομένα μεταξύ 20,0 και 2,5 Α, με ένα κέρδος Log-Πιθανότητα 122,3. Η προκύπτουσα χάρτη πυκνότητας ηλεκτρονίων ήταν πλήρως ερμηνεύσιμη, επιβεβαιώνοντας την ορθότητα της λύσης. Περαιτέρω επεξεργασία έγινε με REFMAC5 [36] και PHENIX [34], χρησιμοποιώντας όλα τα δεδομένα μεταξύ 20 και 1,5 Α, μετά την αναίρεση 2% των τυχαία επιλεγμένων αντανακλάσεις (1172 συνολικά) για τον υπολογισμό του R

δωρεάν [37]. Ισότροπα ατομικούς παράγοντες θερμοκρασία ήταν εκλεπτυσμένο, με τις παραμέτρους TLS προστεθεί στα τελικά στάδια της φινέτσας. Μετά από αρκετούς γύρους περαιτέρω αυτοματοποιημένων φινέτσα και χειροκίνητη διόρθωση χρησιμοποιώντας φαλαρίδα [38], το δομικό μοντέλο τελικά εξευγενισμένα σε ένα R-συντελεστή 17,3% και Ρ

απαλλαγμένο από 20,8%. Η δομή του κρυστάλλου μορφής II λύθηκε με Phaser και τη μορφή που συντονίζει ως πρότυπο εκκίνησης? βελτίωση της διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα πρωτόκολλο παρόμοιο με εκείνο που αναφέρθηκε για κρυσταλλική μορφή I. Το τελικό μοντέλο τελειοποιήθηκε στο 1,75 ψήφισμα A, με αποτέλεσμα σε ένα R-συντελεστή 18,5% και Ρ

απαλλαγμένο από 23,2%. Οι στατιστικές τελειοποίηση των δομών του CrataBL στις δύο κρυσταλλικές μορφές φαίνονται στον Πίνακα 1. Οι δομές συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το διακομιστή Νταλί [39] με το σύνολο των Τράπεζα Δεδομένων Πρωτείνης δομές με λιγότερο από 90% ταυτότητα αλληλουχίας.

δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας

κυτταρικές σειρές.

Το κυτταρικές σειρές DU145 (ΗΤΒ-81 ™) και PC3 (CRL-1435 ™) αγοράστηκαν από ATCC®. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στο Park Memorial Institute Roswell (RPMI) μέσα συμπληρωμένα με 10% (ν /ν) αδρανοποιημένο με θερμότητα ορό εμβρύου μόσχου (FBS), 100 μg /mL στρεπτομυκίνης και 100 IU /mL πενικιλίνη, στους 37 ° C σε μια ατμόσφαιρα 5% CO

2. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με την τροποποιημένη χρωματομετρική δοκιμασία που χρησιμοποιεί 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) (Sigma Aldrich, St. Louis, USA). DU145 ή PC3 απλώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (ΤΡΡ, Trasadingen, Ελβετία) με πυκνότητα 5.0 χ 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο για 24 ώρες. Ακολούθως τα κύτταρα κατεργάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις CrataBL (5, 10, 20, και 40 μΜ) ή αναστολέας τρυψίνης σόγιας (SBTI) (5, 25, 50, 100 μΜ) παρασκευάζεται εντός μέσου RPMI στους 37 ° C σε μία ατμόσφαιρα 5% CO

2. Μετά από 24, 48 και 72 ώρες καλλιέργειας, 10 μL ΜΤΤ (5 mg /mL σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο, PBS) προστέθηκαν στα φρεάτια (2 ώρες, 37 ° C), ακολουθούμενη από την απομάκρυνση του μέσου και προσθήκη 100 μι /φρεάτιο διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO) (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) για τη διαλυτοποίηση των κρυστάλλων φορμαζάνης. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 540 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο (Packard, SpectraCount). Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν.

ανάλυση κυτταρικού θανάτου με κυτταρομετρία ροής

κύτταρα PC3 (1 × 10

5 κύτταρα) σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (ΤΡΡ, Trasadingen

DU145 και , Switzerland) για 24 ώρες για την πλήρη πρόσφυση. Οι εκβαθύνσεις ακολούθως πλένονται τρεις φορές με μέσο RPMI χωρίς FBS (κατά περιόδους επώασης 15 λεπτών στους 37 ° C και 5% CO

2). Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες σε RPMI μέσο χωρίς FBS για τον συγχρονισμό του κυτταρικού κύκλου. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CrataBL (40 μΜ) για 24 και 48 ώρες σε RPMI χωρίς FBS στους 37 ° C και 5% CO

2. Στο τέλος του κάθε επώαση, τα κύτταρα απομακρύνθηκαν από την πλάκα χρησιμοποιώντας διάλυμα τρυψίνης-ΕϋΤΑ (Cultilab, Campinas, Βραζιλία) [40], μεταφέρθηκαν σε Cytometry σωλήνες, πλένεται με 500 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος σύνδεσης (BD kit PharMingen), φυγοκεντρείται, και επαναιωρήθηκαν σε 50 μL του ίδιου ρυθμιστικού που περιέχει επίσης 3 μί Annexin V-FITC και 5 μί ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ). Το μίγμα της αντίδρασης επωάστηκε για 30 λεπτά στο σκοτάδι και στη συνέχεια 300 μL του ίδιου ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης προστέθηκε σε κάθε σωλήνα και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (FACSCalibur, Βϋ, San Diego, USA) [41], [42].

Ανάλυση του μιτοχονδριακού κυτοχρώματος απελευθέρωσης C

DU145 και τα κύτταρα PC3 σπάρθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες 13-mm (5 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο), τοποθετήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και επωάζονται για 24 ώρες στους 37 ° C και 5% CO

2 για την πλήρη τήρηση. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάζονται στο μέσο RPMI χωρίς FBS για 24 ώρες, ακολουθούμενη από την κατεργασία με 40 μΜ CrataBL στα μέσα RPMI χωρίς FBS και επωάζονται στους 37 ° C και 5% CO

2 για 12 ώρες. Στο τέλος της επεξεργασίας, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και τα μιτοχόνδρια σημάνθηκαν με Mitotracker Deep Red 633 (1:500) (Molecular Probes) για 20 λεπτά στο σκοτάδι και σταθεροποιήθηκαν με 2% (ν /ν) παραφορμαλδεϋδη σε PBS για 15 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν και πάλι τρεις φορές με PBS που περιέχει 0,01 Μ γλυκίνη και έπειτα διαπερατά με 0.01% σαπωνίνη για 15 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν για 2 ώρες με το πρωτογενές αντίσωμα, αντι-κυτοχρώματος c ποντικού (1:400) (R &? D Systems), που ακολουθείται από χρώση για 40 λεπτά με το δευτερεύον αντίσωμα, ποντικού αντι-IgG συζευγμένο με Alexa Fluor 488 (1:500) (Invitrogen, CA, USA). Οι πυρήνες των κυττάρων σημάνθηκαν με την DAPI φθοροφόρο (1:3000) (Invitrogen, CA, USA) για 30 λεπτά και κατόπιν στερεώνεται στο ολισθαίνει με 7 μι Fluoromount G (Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Sciences). Οπτικοποίηση και μετρήσεις των slides φθορισμού πραγματοποιήθηκαν σε ένα συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης Carl Zeiss LSM780 μοντέλο λέιζερ, 63 × στόχος, χρησιμοποιώντας βύθιση έλαιο και ένα αριθμητικό άνοιγμα 1,43. Το πρόγραμμα που χρησιμοποιείται για την απόκτηση της εικόνας ήταν Zen 2010.

κασπάσης 3 δραστικότητα με κυτταρομετρία ροής

DU145 και PC3 κύτταρα (1 χ 10

5 κύτταρα) σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο από ένα 6 -Καλά πλάκα (ΤΡΡ, Trasadingen, Switzerland) που περιέχει μέσο RPMI συμπληρωμένο με 10% FBS για την πρόσφυση. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με RPMI μέσο χωρίς FBS και επωάστηκαν για 24 ώρες. Εικοσιτέσσερις ώρες αργότερα το μέσο αντικαταστάθηκε με 40 μΜ CrataBL και περαιτέρω επωάστηκαν για 48 ώρες στους 37 ° C και 5% CO

2. Στο τέλος της επεξεργασίας, τα κύτταρα απομακρύνθηκαν από την πλάκα χρησιμοποιώντας ένα διάλυμα θρυψίνης-ΕϋΤΑ (Cultilab, Campinas, Βραζιλία) [40], μεταφέρθηκαν σε κυτταρομετρία σωλήνες και σταθεροποιήθηκαν με 100 μι 2% (ν /ν) παραφορμαλδεϋδη για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν μετά από φυγοκέντρηση σε 200 μι 0,01% γλυκίνης σε PBS και επωάστηκαν για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα κατόπιν επαναιωρήθηκαν και πάλι σε 200 μΙ 0,01% σαπωνίνη σε PBS και επωάστηκαν για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, τα κύτταρα επωάστηκαν με 10 μι της διασπασμένης κασπάσης 3 AlexaFluor 488-συζευγμένο αντίσωμα (BD, San Diego, USA) για 40 λεπτά. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (FACSCalibur – BD, San Diego, USA)

Στατιστική ανάλυση

Οι διαφορές μεταξύ των μέσων τιμών αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από δοκιμή του Tukey. Τιμές θεωρήθηκαν σημαντικές όταν *

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt? 0,01? ***

σ

& lt?. 0.001

Δεδομένα εναπόθεση

Οι ατομικές συντεταγμένες και παράγοντες δομής έχουν κατατεθεί με την Τράπεζα Δεδομένων Πρωτεϊνών, www.rcsb.org (ΠΠ κωδικούς ένταξη 4IHZ και 4II0 για κρυσταλλικές μορφές Ι και ΙΙ, αντίστοιχα). Τα στοιχεία της αλληλουχίας της πρωτεΐνης που αναφέρονται εδώ θα εμφανίζονται στις UniProt Γνωσιακή υπό τους αριθμούς προσχώρησης B8WI86 και C0HJA4.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Καθαρισμός CrataBL και την αξιολόγηση των δραστηριοτήτων της

CrataBL είναι μία βασική πρωτεΐνη (ρΐ & gt? 10) που θα μπορούσαν να καθαρίζονται κατά σχετικά απλό τρόπο [17]. Τα αρχικά βήματα που εμπλέκονται εκχύλισης σε 0.15 Μ NaCl και χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων σε CM-Cellulose (Σχήμα 1Α). χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους σε μία στήλη Superdex 75 (Σχήμα 1 Β) επέτρεψε τον καθαρισμό της πρωτεΐνης σε μία ομογενή μορφή κατάλληλη για δομικές μελέτες, με μία μόνο κύρια κορυφή ορατή μετά από χρωματογραφία αντίστροφης φάσης σε στήλη C

18 στήλη HPLC (Σχήμα 1C ). Φυσική πρωτεΐνη μεταναστεύει κυρίως σαν ένα ομοδιμερές στη συγκέντρωση που χρησιμοποιείται στις δοκιμές κρυσταλλώσεως (βλέπε παρακάτω).

(Α) Το κλάσμα 30-60% υποβλήθηκε σε ιονανταλλακτική χρωματογραφία σε CM κυτταρίνης εξισορροπημένη με 10 mM φωσφορικού κιτρικό ρυθμιστικό (PCB), ρΗ 5.5. Δύο κλάσματα mL συλλέχθηκαν με ταχύτητα ροής 0,3 mL /min. Ένα βέλος δείχνει την έκλουση με 10 mM φωσφορικού κιτρικού ρυθμιστικού διαλύματος, ρΗ 5,5, που περιέχει 0,5 Μ NaCl? (Β) Χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους σε Superdex 75 εξισορροπημένη με 0,15 Μ NaCl σε ρυθμό ροής 0,5 mL /min. (Γ) Το κλάσμα πρωτεΐνη εκλούσθηκε με μία γραμμική βαθμίδωση (5-100%) του 90% ακετονιτρίλιο σε 0.1% TFA σε νερό Milli-Q (διαλύτης Β) με ρυθμό ροής 0,7 mL /min (

t

= 0,1 min, 5% Β?

t

= 5 λεπτά, 5% Β?

t

= 30 λεπτά, 40% Β?

t

= 50 λεπτά , 50% Β?

t

= 60 min, 100% Β?

t

= 65-68 λεπτά, 0% Β)

Η

λεκτίνη και αιμοσυγκολλητικό. δραστηριότητες CrataBL σημειώθηκαν προηγουμένως [17] και οι ιδιότητες αυτές δεν έχουν αναλυθεί περαιτέρω. Ωστόσο, έχουμε αξιολογήσει την ικανότητα του CrataBL να λειτουργεί ως αναστολέας πρωτεάσης. Βρήκαμε ότι θα μπορούσε να αναστέλλει βόεια θρυψίνη και Παράγοντα Χα, αλλά όχι άλλα πεπτιδάσες σερίνη συμπεριλαμβανομένων χυμοθρυψίνη, την πλασμίνη, την ανθρώπινη ουδετερόφιλη ελαστάση, η ανθρώπινη καλλικρεΐνη πλάσματος, παγκρεατικής καλλικρεΐνης χοίρου, ή ένα παπαΐνη πρωτεάση κυστεΐνης (Πίνακας 2). K

ΙΑΡΡ, που υπολογίζεται χρησιμοποιώντας την εξίσωση που περιγράφεται από τους Morrison et al. [32], ήταν 43 μΜ για θρυψίνη και 8,6 μΜ για τον Παράγοντα Χα, υποδεικνύοντας ότι CrataBL είναι ένας σχετικά ασθενής αναστολέας, πολύ λιγότερο ισχυρά από ό, τι μερικά άλλα αναστολέων που ανήκουν στην ίδια οικογένεια που είναι συχνά νανομοριακή ακόμη picomolar [43], [ ,,,0],44].

Η

Δημοτικό δομή, γλυκοζυλίωση, και βιοχημικές ιδιότητες των CrataBL

Η κύρια δομή του ώριμου CrataBL αποτελείται από ένα μόνο πολυπεπτίδιο μακρύ 164 ή 165 αμινοξέων, παρούσα σε τουλάχιστον δύο διακριτές ισομορφές, που διαφέρουν στις θέσεις 31 (Pro /Leu)? 92 (Ser /Leu)? 93 (Ιλ /Thr)? 95 (Arg /Gly) και 97 (Leu /Ser) (Σχήμα 2). Το Ο-τερματικό Gly165 μπορεί να υπάρχει μόνο σε ένα κλάσμα των μορίων. Η παρουσία των πέντε υπολείμματα κυστεΐνης έδειξε μία πιθανότητα σχηματισμού δύο ενδομοριακών δισουλφιδικών δεσμών, η παρουσία των οποίων επιβεβαιώθηκε με τις κρυσταλλικές δομές (βλέπε παρακάτω).

Μια σύγκριση της αλληλουχίας αμινοξέων του ισόμορφου Ι του CrataBL με οι αλληλουχίες των δομικώς παρόμοιων πρωτεϊνών, όπως καθορίζεται με το πρόγραμμα Dali [39]. Τα υπολείμματα κυστεΐνης που φαίνεται στο μαύρα κουτιά και είναι πολύ συντηρημένες αμινοξέα επισημαίνονται με γκρι. Υπόλειμμα θέσεις Ρ1 και Ρ1 », μεταξύ των οποίων εμφανίζεται η πρωτεολυτική διάσπαση, σημειώνονται στο τετραγωνίδιο. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν θέσεις γλυκοζυλίωσης στην CrataBL. Η αλληλουχία του ισόμορφου II διαφέρει σε θέσεις 31 (Pro /Leu)? 92 (Ser /Leu)? 93 (Ιλ /Thr)? 95 (Arg /Gly) και 97 (Leu /Ser).

Η

Araújo et al. [17] υπολόγισε την μοριακή μάζα CrataBL σε περίπου 21 KDa σε SDS-PAGE και έδειξαν με χρώση Schiff ότι η πρωτεΐνη είναι γλυκοζυλιωμένη. Περαιτέρω ανάλυση γλυκοζυλίωσης με προσδιορισμό φασματομετρία και αλληλουχία πρωτεΐνης μάζα έδειξε την παρουσία Ν-συνδεδεμένων ολιγοσακχαριτών σε Asn27 και Asn57. MALDI-TOF MS ανάλυση της μοριακής μάζας της φυσικής πρωτεΐνης έδωσε μία αιχμή σε m /z 20388, με ένα ώμο σε περίπου 19.700 (Μ + Η)

+, υποδεικνύοντας την παρουσία ενός ισόμορφου. Μια πρόσθετη αιχμή του 10.229 οφείλεται σε μοριακό ιόν (Μ + 2Η)

+ (Σχήμα 3). Η μέθοδος φαινόλης-θειικού οξέος [27] χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η συγκέντρωση του υδατάνθρακα στην πρωτεΐνη, υποδεικνύοντας ~ 6% περιεκτικότητα σε υδατάνθρακες.

Η

Η μοριακή μάζα των μονάδων υδατάνθρακα εκτιμήθηκαν από τις διαφορές μεταξύ των φασματομετρία μάζας των γλυκοζυλιωμένα πεπτίδια και οι αλληλουχίες αμινοξέων τους. Στην περίπτωση της Asn57, το μοριακό βάρος φαίνεται να είναι 1170 Da, ενώ στο Asn27, ανιχνεύθηκαν πρόσθετα σήματα από 162 Da ή περισσότερο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Οι αλληλουχίες και των δύο ισομορφών του CrataBL δείχνουν υψηλή ομοιότητα με μία ποικιλία πρωτεϊνών με β-τριφυλλοειδές φορές (Σχήμα 2), συμπεριλαμβανομένων των αναστολέων Kunitz τύπο από την STI (αναστολέας τρυψίνης σόγιας) οικογένεια [45]. Τέτοιοι αναστολείς λειτουργία με σφικτά σύνδεση προς πρωτεάση στόχο τους και εισάγοντας αντιδραστικά τους βρόχο στην ενεργό θέση της, μερικές φορές επίσης ενεργεί ως βραδεία υποστρώματα [2].

Η θέση του ενεργού κέντρου του CrataBL προσδιορίστηκε με χρωματογραφία σε θρυψίνη -Sepharose σε 0,1 Μ Tris-HCl, ρΗ 8.0. Μετά τη σύνδεση με το υποστήριγμα, ο αναστολέας κρατήθηκε για 30 λεπτά στη στήλη και στη συνέχεια εκλούεται με 0.5 Μ ΚΟΙ /ΗΟΙ ρΗ 2,0 και διατηρείται στο ρΗ αυτό. Θρυψίνη συνδεδεμένη με Sepharose υδρολύει ειδικά τον αναστολέα στην αντιδραστική θέση και το δείγμα κρατήθηκε σε συνθήκες που επιλέγονται για να αποφευχθεί η εκ νέου απολίνωση του πεπτιδικού δεσμού. Η προκύπτουσα τροποποιημένη πρωτεΐνη υποβλήθηκε σε καθορισμό αλληλουχίας και των δύο Ν-τερματικά αμινοξέα βρέθηκαν στο έκλουσμα, ένας από αυτούς που αντιστοιχούν στο Ν-τερματικό Ala1 του άθικτου αναστολέα, ενώ το άλλο θα μπορούσε να χαρακτηριστεί ως Ser59. Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι το τελευταίο υπόλειμμα θα πρέπει να είναι παρόν στη θέση του Ρ1 ‘, όπως ορίζεται από τους Schechter και Berger [46], έτσι Ser58 πρέπει να καταλαμβάνουν τη θέση Ρ1. Οι πιο ισχυροί αναστολείς θρυψίνης συνήθως περιέχουν ένα βασικό υπόλειμμα (Lys ή Arg, όπως Arg63 σε STI [44], [45]) στη θέση Ρ1. Μόνο λίγα γνωστοί αναστολείς Kunitz-Ρ έχουν Ser στη θέση Ρ1 [47], αλλά έχει βρεθεί ότι η παρουσία σερίνης στη Ρ1 ‘ενισχύει τις αλληλεπιδράσεις με θρυψίνη [48]. Η παρατηρούμενη θέση διάσπασης CrataBL αντιστοιχεί στην αντιδραστική βρόχο στην πλειονότητα των γνωστών αναστολέων τύπου Kunitz-P, όπως STI [44] (Εικόνα 4).

Μια σύγκριση της αλληλουχίας αμινοξέων του ισόμορφου Ι των CrataBL με τις ακολουθίες της BvTI – αναστολέα θρυψίνη καθαρισμένο από το

Bauhinia variegata

? BuXI – αναστολέας του παράγοντα Xa από

Bauhinia ungulata

? ECTI – αναστολέα θρυψίνη καθαρισμένο από το

Enterolobium contortisiliquum θρυψίνη αναστολέα

[42], [43]. Τα υπολείμματα κυστεΐνης που φαίνεται στο γκρι και είναι άκρως συντηρημένα αμινοξέα επισημαίνονται σε μαύρο χρώμα. Υπόλειμμα θέσεις Ρ1 και Ρ1 ‘, μεταξύ των οποίων λαμβάνει χώρα η πρωτεολυτική διάσπαση, σημειώνονται σε κουτιά. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν θέσεις γλυκοζυλίωσης σε CrataBL.

Η

Κρυσταλλική δομή του CrataBL

Η τρισδιάστατη δομή του CrataBL προσδιορίστηκε σε δύο μορφές κρυστάλλων. Και οι δύο από αυτούς ήταν στο χώρο της ομάδας

C

2 και περιείχε δύο μόρια στην ασύμμετρη μονάδα, αλλά οι παράμετροι μοναδιαίας κυψελίδας και κρυστάλλινα συσκευασίας ήταν διαφορετικά. Οι δομές και εξευγενισμένα σε συγκριτικά υψηλή ανάλυση, 1,5 Α για κρυσταλλική μορφή Ι και 1,75 Α για κρυσταλλική μορφή II, με αποδεκτές γεωμετρικές παραμέτρους (Πίνακας 1). Τα τελικά μοντέλα ήταν πλήρης για όλες τις τέσσερις ανεξάρτητες μόρια με κατάλοιπα 1-164 εντοπιστεί. Η παρουσία πολύ καλά καθορισμένων Ο-τερματικό καρβοξυλικό σε μόριο Α της κρυσταλλικής μορφής Ι υποδηλώνει ότι η τελευταία υπόλειμμα Ser164 και ότι Gly165, αν και σημειώνονται στην πρωτοταγή δομή, δεν ήταν παρούσα στο κρυσταλλωμένο πρωτεΐνης (Σχήμα 5). Αν και, όπως αναφέρθηκε παραπάνω, CrataBL απομονωθούν από φυσική πηγή του είναι ένα μίγμα ισομορφών, φαίνεται ότι κυρίως μόρια ισόμορφου Ι κρυστάλλωση, αφού η πυκνότητα ηλεκτρονίων που αντιστοιχεί στα υπολείμματα που διέφεραν μεταξύ των δύο ισομορφών ήταν αρκετά σαφής. Εκτεταμένες γλυκοζυλίωση σε Asn27 σημειώθηκε, με έως τέσσερις μονάδες υδατανθράκων που συνδέονται με αυτό το υπόλειμμα να είναι ορατή. Η καλύτερη πυκνότητα ήταν παρούσα στο μόριο Α της κρυσταλλικής μορφής Ι, όπου μπορούσε να παρατηρηθεί το τυπικό μοτίβο φυτό-τύπου γλυκοζυλίωση [Manβ1-4GlcNAcβ1-4 (Fucα1-3) ΟΙοΝΑοβ-Αδη] [49]. Οι υδατάνθρακες ήταν λιγότερο καλά διαταχθεί σε άλλα μόρια των δύο κρυσταλλικών μορφών. Ένα αδύναμο πυκνότητα που θα μπορούσε να αντιστοιχεί σε έναν υδατάνθρακα δεσμεύεται να Asn57 σε κρυσταλλική μορφή που δεν επιτρέπει τη σωστή μοντελοποίηση. Σε κρυσταλλική μορφή II, ωστόσο, η πυκνότητα δίπλα στο Asn57 ήταν αρκετά σαφής και αφέθηκε μοντελοποίηση ενός ομοιοπολικά συνδεδεμένη ΟΙοΝΑο. Δύο δισουλφιδικοί δεσμοί έγιναν από Cys33-Cys80 και Cys126-133, ενώ Cys74 ήταν παρούσα σε όλα τα μόρια με τη μορφή σουλφενικού οξέος.

Η 2F

του στοιχείου

γ χάρτης περίγραμμα σε 1,2 σ επίπεδο. Το σχήμα της πυκνότητας που αντιστοιχεί στο Ο-τερματικό καρβοξυλικό άλας δείχνει σαφώς ότι Gly165, παρόλο που απαντώνται στην ακολουθία, δεν είναι παρούσα στο ισομορφή που σχηματίζει το κρύσταλλο. Σχήμα που παρασκευάζονται με PyMol [69].

Η

Η πτυχή της CrataBL αποτελείται από ένα β-τριφυλλόσχημο, χαρακτηριστική για αυτή την οικογένεια πρωτεϊνών. Zhang et al.